WO2019212140A1 - 항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 꿩의 바람꽃, 인동속 식물 및 두릅 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 꿩의 바람꽃, 인동속 식물 및 두릅 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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백주연
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Definitions

  • the present invention is the windflower of the pheasant ( Anemone raddeana ) and the genus plants ( Lonicera species) relates to a composition for preventing or treating cancer comprising the extract, more particularly anticancer baramkkot of pheasant containing a high concentration of saponins and honeysuckle plant extracts or Aralia (Aralia It relates to a composition for the prevention or treatment of cancer of the pheasant and the plant extract of Pheasant further comprising elata ) or Pulsatilla sp.
  • Cancer is scientifically referred to as neoplasia and is characterized by uncontrolled cell growth, and abnormal cell growth forms cell masses called tumors that infiltrate surrounding tissues and, in severe cases, It may also spread to other organs. Cancer affects all tissues and organs of the body with varying degrees of prevalence.
  • the types of cancer are classified according to the tissue and organ where the cancer cells first originated, or classified according to the shape and origin of the cancer cells. Commonly, lung cancer, stomach cancer, colorectal cancer, cervical cancer, etc. are referred to as the first cancer organ. In terms of developmental origin, it is also classified into connective tumor, epithelial tumor, and adenocarcinoma. The most common cancer in Korea was thyroid cancer, followed by stomach cancer, colon cancer, and lung cancer.
  • the treatment of cancer is divided into active treatment that removes solidified cancer tissue or kills cancer cells and palliative therapy that minimizes side effects by delaying the progression of cancer cells.
  • active treatment that removes solidified cancer tissue or kills cancer cells
  • palliative therapy that minimizes side effects by delaying the progression of cancer cells.
  • surgery, chemotherapy, and radiation therapy can be used to remove tumors or to treat cancer cells with chemicals and radiation.
  • the side effects of active therapy are relatively high, so it is possible to select a treatment that slows the progression of cancer cells to reduce the side effects and improve the quality of life.
  • anticancer drugs are chemotherapy belonging to active therapies, and include cytotoxic anticancer drugs that kill cancer cells as toxic substances, and target anticancer drugs that selectively act on cancer cells and neovascularization around tissues (Jung, Geun Young, 2016). .
  • Saponin is a generic name of glycoside widely distributed in the plant kingdom. It is a genus of Ranunculus, Araliaceae, Dioscoreaceae, Leguminosae, Cucurbitaceae, and Compositae. ), Rosaceae, Liliaceae, Rubiaceae, Rhamnaceae, Caryophyllaceae.
  • Saponins contain aglycones of the steroid, steroid alkaloid, or triterpene skeletons, usually with one or more sugar chains attached to the non-sugars (Bachran, C.). , et al., 2008). Saponins vary depending on the structure of the non-sugar moiety, the number of sugar side chains attached, and the type of sugar. Saponins in which sugar is bound to only one functional group of the non-sugar part are called monodesmosides, and saponins in which sugar is bound to two functional groups are called bisdesmosides.
  • Saponin has been reported to have various effects on cancer cells as an anticancer or immune adjuvant.
  • the first study was reported on the prolonged survival effects of saponin Quil A in a 1976 model of spontaneous leukemia (Ebbesen, P., et al., 1976). Later, studies were conducted on tumor cells of various saponins, including ginseng saponins and shiho saponins.
  • Dios god (dioscin) is Polygonatum in polyester and natum cup Lance Asia nenseu Pamp.
  • saponins where 28 is a free acid group, exist in small amounts in nature, and most exist in the form of glycosyl ester groups. Therefore, in order to obtain saponin having free acid groups, the 28th anti-cancer agent has to hydrolyze the ester group.
  • the present inventors prepared an extract containing a high concentration of anticancer saponin from the wind flower and genus plants of pheasant in the course of studying the anticancer saponins of various plants, and confirmed that the obtained extract shows excellent anticancer activity By this, the present invention could be completed.
  • Korean Patent No. 1218340 discloses a composition for treating cancer, which includes a gold silver coin extract containing saponin
  • US Patent Application Publication No. 2004-0067263 discloses a method for producing a wind flower extract of pheasant containing a survey phonine.
  • a composition for treating cancer comprising the same, but the composition is different from the composition comprising a wind flower and a genus plant extract of pheasant containing a high concentration of anticancer saponin of the present invention.
  • 0628334 discloses a method for producing saponins with increased anticancer effect by enzymatic hydrolysis of saponins of Baekduong, but the wind flower and the same plant of pheasant containing a high concentration of anticancer saponins of the present invention and its Anticancer effects are not described.
  • An object of the present invention is a pheasant ( Anemone raddeana ) and genus plants ( Lonicera ) of pheasant containing high concentration of anticancer saponin species) and to provide a composition for the prevention or treatment of cancer comprising the extract and a method for producing the same.
  • the present invention comprises the steps of i) putting distilled water in the plant and grinding to prepare a plant itself medium; ii) adding an organic solvent to the plant to prepare a plant extract; iii) mixing the plant extract of step 2 with the plant self medium of step 1 and fermenting with stirring at 37 ° C .; iv) 4 steps of fractionating by adding an organic solvent to the fermentation product obtained through the fermentation of the three steps; v) 5 steps of securing the eluate by adding the fractions of step 4 to column chromatography; And vi) 6 step of drying the fraction obtained by adding an organic solvent to the eluate of step 5 and fractionating; Pheasant Flower ( Anemone raddeana ) and Perennial Plant ( Lonicera) species) relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, including the extract as an active ingredient.
  • the wind flower and the genus plant extract of the pheasant are Korean pale flowers ( Pulsatilla koreana ) Self-cultivation medium, Korean Pasqueflower Extract or Aralia elata ) may further include one or more selected from extracts.
  • the wind flower and genus plant extract of the pheasant may be 15 to 110 times the content of anti-cancer saponin.
  • the anti-cancer saponin is hederagenin 3-O- ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) - ⁇ -L-lamnopyranosyl- (1 ⁇ 2) - ⁇ -L-arabinopyranoside (Hederagenin 3-O- ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) - ⁇ -L-rhamnopyranosyl- ( 1 ⁇ 2) - ⁇ -L-arabinopyranoside), oleanolic acid 3-O- ⁇ -L-lamnopyranosyl- (1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-glucopyranosyl (1 ⁇ 4)]- ⁇ -L -Oleanolic acid 3-O- ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-glu
  • the cancer may be solid cancer.
  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of cancer comprising the extract of Pheasant and the genus Phosphorus as an active ingredient, i. 1 step of manufacturing; ii) adding an organic solvent to the plant to prepare a plant extract; iii) mixing the plant extract of step 2 with the plant self medium of step 1 and fermenting with stirring at 37 ° C .; iv) 4 steps of fractionating by adding an organic solvent to the fermentation product obtained through the fermentation of the three steps; v) 5 steps of securing the eluate by adding the fractions of step 4 to column chromatography; And vi) 6 step of drying the fraction obtained by adding an organic solvent to the eluate of step 5 and fractionating; It can be prepared through.
  • the wind flower of the pheasant is available as the plant itself medium or plant extract.
  • Lonicera species Lonicera sp.
  • Lonicera sp. is a perennial plant belonging to the genus Caprifoliceae, Lonicera japonica , Lonicera macranthoides , Lonicera fulvotomentosa ), and hemorageenin 3-O- ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) - ⁇ -L- rhamno , an anticancer saponin Pyranosyl- (1 ⁇ 2) - ⁇ -L-arabinopyranoside (Hederagenin 3-O- ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) - ⁇ - It is known to contain L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 2) - ⁇ -L-arabinopyranoside).
  • the genus plants can be used for all genus plants including anticancer saponin.
  • honeysuckle contains flavonoids, iridoids, saponins, and other phenolic compounds, of which iridoids have been found to be the main constituents (Kim, JS, et al., 2009) It has been reported that gold and silver coins have antiviral, antibacterial, anti-endotoxin, anti-inflammatory, immunopotentiating and anticancer activity (Yun, KJ, et al, 2012).
  • the genus plants are available in the plant itself medium or plant extracts.
  • the first step of the plant itself medium is the first step of grinding the blender by adding distilled water to the plant; And pulverizing the primary pulverized product by applying ultrasonic waves to the secondary pulverized product.
  • the production of the plant itself medium can be used for all plants containing a hydrolase and saponin in plant cells, and more specifically, Rannunculaceae, Araliaceae, Dioscoreaceae, Legumes (Leguminosae) , But not limited to Cucurbitaceae, Compositae, Rosaceae, Liliaceae, Rubiaceae, Rhamnaceae, Caryophyllaceae, and the like. Do not.
  • Pulsatilla koreana Chinese Pulsatilla chinensis ), thin-leaved pasqueflower ( Pulsatilla cernua ), pheasant's wind flower ( Anemone raddeana ), arthropod ( Aralia elata ), vine ( Akebia) quinata ), genus plant ( Lonicera species) and at least one species selected from the group consisting of Patrinia scabiosifolia .
  • it is one or more selected from the group consisting of Korean pasqueflower, pheasant wind flower, perennial plant and creeper vine, and more preferably one or more selected from the group consisting of Korean pasqueflower and pheasant wind flower.
  • the windflower of the pheasant is one or more selected from the group consisting of Korean pasqueflower, pheasant wind flower, perennial plant and creeper vine, and more preferably one or more selected from the group consisting of Korean pasqueflower and pheasant wind flower.
  • the windflower of the pheasant is one or more selected from the group consisting of Korean pasqueflower, pheasant wind flower, perennial plant and creeper vine, and more preferably one or more selected from the group consisting of Korean pasqueflower and pheasant wind flower.
  • the windflower of the pheasant is one or more selected from the group consisting of Korean pasqueflower, pheasant wind flower, perennial plant and creeper vine, and more
  • Plants used in the production of the plant itself medium may be used, such as roots, leaves, fruits, seeds. Preferably it is the root of a plant, a pulp. Seeds containing a large amount of vegetable oil are complicated to remove plant oil, and in the case of plant leaves containing chlorophyll or wax, hydrolase may be inactivated during the process of removing chlorophyll or wax. There may be a problem.
  • the plant extract of step 2 may be an extract of the plant extracted with one or more solvents selected from the group consisting of C1 to C4 lower alcohol, acetone, ethyl acetate and hexane, wherein the lower alcohols of C1 to C4 are methanol, ethanol , Propanol, isopropanol, butanol and the like.
  • the plant extract may be a fraction obtained by adding an organic solvent to the concentrated solution of the extract extracted from the plant extracted with one or more solvents selected from the group consisting of C1 to C4 lower alcohol, acetone, ethyl acetate and hexane.
  • Plants that can be used in the preparation of the plant extracts are available to all plants, including saponins, Ranunculus (Arnuculaceae), Araliaceae, (Dioscoreaceae), Legumes (Leguminosae), Cucurbitaceae, Asteraceae (Compositae), Rosaceae, Liliaceae, Rubiaceae, Rhamnaceae, Caryophyllaceae plant extracts, but is not limited thereto.
  • Pulsatilla koreana Chinese Pasqueflower ( Pulsatilla chinensis ), Fine Leaf Pasqueflower ( Pulsatilla cernua ), Pheasant's Windflower ( Anemone raddeana ), Aralia elata ), Creeper ( Akebia) quinata ), Lonicera species and Patrinia scabiosifolia ) at least one member selected from the group consisting of extracts. More preferably, it is at least one selected from the group consisting of wind flower of Pheasant, persimmon plant, Korean Pasqueflower, and arbor extract, and most preferably the genus plant extract.
  • the organic solvent may be C1 to C4 lower alcohol, ethyl acetate, hexane and acetone.
  • the lower alcohol of C1 to C4 may be methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol and the like.
  • the fermentation of the third step is to convert the glycosyl ester group at position 28 of the saponin present in the plant into a free acid group by hydrolyzing the glycosyl ester group, thereby converting it to anticancer saponin having high anticancer activity.
  • hydrolase present in the plant's own medium the glycosyl ester group of saponin present in the plant's own medium and plant extract is hydrolyzed and converted to anticancer saponin.
  • the column chromatography of five steps is silica gel column chromatography, HP-20 column chromatography, RP-18 column chromatography, LH-20 LH-20 column chromatography, high-performance liquid chromatography, high-performance liquid chromatography, reverse phase HPLC and the like can be selected and used.
  • the organic solvent of step 4 or step 6 may be C1 to C4 lower alcohol, ethyl acetate, hexane and acetone.
  • the lower alcohol of C1 to C4 may be methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol and the like.
  • the wind flower and genus plant extract of the pheasant may be 15 to 110 times the content of anti-cancer saponin.
  • the content of the anti-cancer saponin is a pheasant of pheasant containing a high concentration of anti-cancer saponin prepared by the production method of the present invention on the basis of the anti-cancer saponin content of the wind flower of the pheasant and the plant of the same genus without fermentation process and The rate of increase of anticancer saponin of extracts containing the plant extracts of the genus is analyzed.
  • the anti-cancer saponin is hederagenin (hederagenin), oleanolic acid (oleanolic acid), betulinic acid (betulinic acid), 23-hydroxy betulinic acid (23-hydroxybetulinic acid) as a non-glycone (aglycone), No. 28 It may be monodesmosides having a free acidic functional group in position.
  • hederagenin 3-O- ⁇ -L-ramnopyranosyl- (1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4)]- ⁇ -L-arabinofyranoside Hederagenin 3-O- ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4)]- ⁇ -L-arabinopyranoside
  • hederagenin 3-O- ⁇ -D-glucose Pyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) - ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 2) - ⁇ -L-arabinofyranoside Hederagenin 3- O- ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) - ⁇ -L-rhamnopyr
  • the wind flower and the genus plant extract of the pheasant may further include one or more selected from the plant itself medium or plant extract containing saponin.
  • the additional plant itself medium may be any plant medium containing saponin, more specifically, Ranunculaceae, Araliaceae, Dioscoreaceae, Legumeno (Leguminosae), Cucurbitaceae It may be, but is not limited to, the plant itself, which is included in Compositae, Rosaceae, Liliaceae, Rubiaceae, Rhamnaceae, Caryophyllaceae, and the like.
  • Pulsatilla koreana or Pulsatilla chinensis are at least one plant itself medium selected from the group consisting of. More preferably, it is at least one plant itself medium selected from the group consisting of Korean Pasqueflower and Crushed Vinegar, and most preferably Korean Pasqueflower itself.
  • the additional plant extracts may further include plant extracts including saponins, Ranunculuaceae, Araliaceae, Dioscoreaceae, Legume (Leguminosae), Cucurbitaceae, It may be, but is not limited to, plant extracts included in Compositae, Rosaceae, Liliaceae, Rubiaceae, Rhamnaceae, Caryophyllaceae, and the like.
  • Pulsatilla koreana Chinese Pasqueflower ( Pulsatilla chinensis ), Fine Leaf Pasqueflower ( Pulsatilla cernua ), Aralia elata , Creeper Akebia quinata ), genus plant ( Lonicera spicese) and matari ( Patrinia scabiosifolia ) extract is one or more selected from the group consisting of. More preferably, it is at least one selected from Korean pale flowers and arbor extract.
  • composition comprising the wind flower and genus plant extract of the pheasant as an active ingredient may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may further include an existing anticancer agent.
  • the anticancer agent may use all currently used anticancer agents. It is preferably a plant-derived anticancer agent, more preferably vinblastine, vincristine, vinorelvine, paclitaxel, docetaxel, camptothecin, topotecan (topotecan), irinotecan, velotecan, podophyllotoxin, etoposide, teniposide, deoxypodophyllotoxin, bupleurotoxin bupleurotoxin, cymarilic acid, most preferably deoxypodophyllotoxin, bupleurotoxin, and cymarilic acid.
  • a plant-derived anticancer agent more preferably vinblastine, vincristine, vinorelvine, paclitaxel, docetaxel, camptothecin, topotecan (topotecan), irinotecan, velotecan, podophyllotoxin, etoposide, teniposide,
  • the deoxypodophyllotoxin, bupleurotoxin and cymarilic acid are anticancer agents having angiogenesis inhibitory activity, and when treated with the composition of the present invention, anticancer activity is significantly increased. do.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable excipient or carrier in the windflower and perennial plant extract of the pheasant.
  • the pharmaceutical composition may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods. .
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, and the like in the windflower and persimmon plant extracts of the pheasant of the present invention. , Sucrose or lactose, gelatin and the like are mixed. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition will vary depending on the age, sex, weight of the subject to be treated, the particular disease or pathology to be treated, the severity of the disease or pathology, the route of administration and the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of skill in the art and generally dosages range from 0.01 mg / kg / day to approximately 2000 mg / kg / day. More preferred dosage is 0.1 mg / kg / day to 500 mg / kg / day. Administration may be once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition may be administered to mammals such as rats, livestock, humans, and the like by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine mucosal or cerebrovascular injections.
  • the cancer also known as a malignant tumor, is an agglomerate that has grown abnormally by autonomous overgrowth of body tissues, and is a disease that grows rapidly while infiltrating surrounding tissues and spreads or spreads to various parts of the body to be life-threatening.
  • Means including carcinoma and sarcoma (sarcoma).
  • the cancer may be solid cancer.
  • composition comprising the wind flower and the genus plant extract of the pheasant as an active ingredient may be a health functional food.
  • the health functional food may include food supplements additives that are food acceptable in the wind flower and perennial plant extract of the pheasant.
  • the health functional food includes the form of tablets, capsules, pills or liquids, and the food to which the extract of the present invention can be added, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, Health functional foods.
  • the present invention is a Pheasant ( Anemone raddeana ) and a genus of plants ( Lonicera ) containing high concentrations of anticancer saponin
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cancer comprising the extract and a method for producing the same, wherein the saponins contained in the extracts of the wind flower and the plant of the genus Pheasant are converted to anti-cancer saponins having high anticancer activity, thereby increasing
  • the extract containing was prepared, it was confirmed that the prepared extract exhibits excellent anticancer activity.
  • the anti-cancer saponin of the present invention is expected to be able to use the wind flower and genus plant extract of the pheasant containing a high concentration in the drug for cancer treatment.
  • Figure 1 shows the results of confirming the anticancer activity of the composition comprising the wind flower and the genus plant extract of the pheasant of the present invention as an active ingredient.
  • the target plants include Korean Pasqueflower, a plant that contains saponins of heparagen and oleanolic acid, the non-sugar part of saponin-containing plants ( Pulsatilla koreana ), Chinese Pasqueflower ( Pulsatilla chinensis ), Fine leaf pasqueflower ( Pulsatilla cernua ), Pheasant's Windflower Anemone raddeana ), Aralia elata ), Creeper Vine ( Akebia quinata ), Matari ( Patrinia scabiosifolia ), Homogeneous Plant ( Lonicera species, Lonicera sp.).
  • Korean pale flowers, Chinese pale flowers, thin leaf pale flowers, pheasant's wind flower, and matari roots, leafed leaves, vines are seeds or flesh, and the genus plants are flowers of honeysuckle.
  • the thin leaf pasqueflower extract (5.9g) was obtained by the same method as 1) Chinese pasqueflower extract manufacturing method of Experimental Example 1-1 using the thin leaf pasqueflower root.
  • Matari extract (4.0 g) was obtained in the same manner as in 1) Preparation of Chinese Pasqueflower Extract of Experimental Example 1-1.
  • the obtained methanol extract was concentrated to a volume of about 200 ml, 200 ml of hexane was added to the concentrated extract, shaken for 10 minutes, and the mixture was left alone to separate the produced methanol layer to obtain a primary methanol fraction. 200 mL of hexane was added to the obtained primary methanol fraction, shaken for 10 minutes, and the resulting methanol layer was separated to obtain a secondary methanol fraction. The obtained secondary methanol fraction was concentrated to dryness to obtain a solid. 70 ml of 100% (v / v) ethanol was added to the obtained solid, mixed for 30 minutes, and filtered to separate only the ethanol layer. The separated ethanol layer was dried to obtain the extract (3.7g).
  • the resultant was filtered using filter paper to separate only the methanol layer, and 500 ml of 95% (v / v) methanol was added to the remaining plants, and the mixture was refluxed for 4 hours to further separate the methanol layer, and then mixed with the existing methanol layer to obtain a methanol extract. .
  • the obtained methanol extract was concentrated to a volume of about 300 ml, 300 ml of hexane was added to the concentrated extract, shaken for 10 minutes, and left as it was to remove the hexane layer, and only the methanol layer was separated.
  • the separated methanol layer was dried under reduced pressure to obtain a dried product, and 70 ml of 100% (v / v) ethanol was added to the dried product, mixed, left for a predetermined time, and filtered to separate only the ethanol layer.
  • the separated ethanol layer was dried to obtain an scabine extract (4.4 g).
  • a gold and silver flower of Lonicera japonica was used as a genus plant.
  • 300 g of 95% (v / v) methanol was mixed with 100 g of gold and silver, pulverized with a blender and refluxed for 3 hours using an extractor. After reflux, the resultant was filtered using filter paper to separate only the methanol layer. The remaining plant was added with 300 ml of 100% (v / v) methanol and refluxed for 3 hours to further separate the methanol layer and mixed with the existing methanol layer to obtain a methanol extract. .
  • the obtained methanol extract was concentrated to about 200 ml, 200 ml of hexane was added to the concentrated extract, shaken for 10 minutes, and the resulting hexane layer was removed. The methanol layer was separated to obtain a primary methanol fraction. 200 mL of hexane was added to the obtained primary methanol fraction, shaken for 10 minutes, and the resulting methanol layer was separated to obtain a secondary methanol fraction. The obtained secondary methanol fraction was concentrated to dryness to obtain a solid. 70 ml of 100% (v / v) ethanol was added to the obtained solid, mixed for 30 minutes, and filtered to separate only the ethanol layer. The separated ethanol layer was dried to obtain a plant extract (3.9 g).
  • Saponins present in plants are mainly present as glycosides.
  • saponins containing hederagenin, oleanolic acid, betulinic acid, and 23-hydroxybetulinic acid as non-sugar parts have glycosyl acid groups at position 28. It exists in the form of a glycosyl ester group, and in order to obtain anticancer saponin, the ester group must be hydrolyzed. In the case of hydrolysis using chemical methods, the saponin structure may be affected, and the separation step may be complicated, thereby reducing economic efficiency.
  • the ester group was used to be hydrolyzed by a hydrolase present in the plant, and the plant itself medium was referenced with reference to the technical contents described in the registered Korean Patent No. 0628334 of the inventor. Was prepared.
  • Plants for the production of the plant itself medium can be used as a medium for all the plants used in Experimental Example 1.
  • seeds containing a large amount of vegetable oil, such as vine seeds are complicated to remove the vegetable oil, and in the case of arbor leaves, hydrolysing enzymes are used during the process of removing chlorophyll or wax. Can be inactivated.
  • the Korean pasqueflower root, pheasant root and prickly vine flesh were used.
  • the fresh Korean Pasqueflower roots were washed with water and peeled into small pieces.
  • 200 g of distilled water cooled to 4 ° C. was added to 100 g of finely chopped Korean pasqueflower roots, and pulverized with a blender.
  • the pulverized product pulverized with a blender was sonicated for 10 minutes at a high frequency using an ultrasonic pulverizer to prepare a Korean pasqueflower itself.
  • the crushed pulp was harvested before it was still split. 200 g of distilled water cooled to 4 ° C. was added to 100 g of crushed pulp of crushed pulp.
  • the pulverized product pulverized with a blender was ultrasonicated at high frequency for 5 to 10 minutes using an ultrasonic grinder to prepare a crushed vine itself.
  • An extract containing a high concentration of anticancer saponin of the present invention was prepared using the plant extract prepared in Experimental Example 1 and the plant itself medium. At this time, the plant itself medium was prepared and used immediately before use.
  • Example 1-1 Windflower of pheasant and Manual velocity Plant extract manufacturer
  • the obtained concentrate was made into a dried form using a desiccator, and then mixed with 70 ml of 100% (v / v) ethanol in the dried matter, left for a predetermined time, and then filtered using a filter paper to filter only the ethanol layer.
  • the separated ethanol layer was placed in a container without bacterial pyrogen and dried to obtain 5.4 g of dry matter.
  • the collected eluate was deposited on a silica gel plate, dried and sprayed with 10% (v / v) sulfuric acid and heated to 150 ° C. to confirm that a pink color appeared. Only the eluate, which appeared pink, was concentrated to dryness. 20 ml of 100% (v / v) ethanol was added to the dried material, mixed and left for a certain time, and then filtered using a filter paper to separate only the ethanol layer. The separated ethanol layer was dried in a container without bacterial pyrogen to prepare a wind flower and a genus plant extract (0.98 g) containing a high concentration of anticancer saponin of the present invention.
  • Example 1-2 Pheasant's Wind, Manual velocity Plant and Arthropod Extract Manufacturer
  • the obtained concentrate was made into a dried form using a desiccator, and then mixed with 100 ml of 100% (v / v) ethanol in the dried matter, left for a predetermined time, and then filtered using a filter paper to separate only the ethanol layer. .
  • the dried ethanol layer was dried to form a dry matter, and then 70 ml of 100% (v / v) ethanol was added and mixed again to repeat the above process to separate only the ethanol layer.
  • the separated ethanol layer was placed in a container without bacterial pyrogen and dried to obtain 7.9 g of dried matter.
  • Example 1-1 Using 2 g of the dried matter, the same method as the diion HP-20 column of Example 1-1 was performed to obtain a wind flower, anthropomorphic plant, and an extract of the pheasant containing the high concentration of anticancer saponin of the present invention (1.09 g ) was prepared.
  • Example 1-3 Pheasant's Wind, Manual velocity Manufacture of Plant and Korean Pasqueflower Extract
  • the obtained concentrate was made into a dried form using a desiccator, and then mixed with 100 ml of 100% (v / v) ethanol in the dried matter, left for a predetermined time, and then filtered using a filter paper to separate only the ethanol layer. .
  • the separated ethanol layer was placed in a container without bacterial pyrogen and dried to obtain 8.1 g of dried material.
  • Example 1-1 Using 2 g of the dried matter, the same method as the diion HP-20 column of Example 1-1 was performed to extract the wind flower, the genus plant, and the Korean Pasqueflower (1.09) of the pheasant containing the anticancer saponin at high concentration. g) was prepared.
  • Wind flower extract 2 was prepared.
  • Example 1-1 Human genus plant extract (Lj extract) of Experimental Example 1-1 was prepared by comparing the human genus plant extracts of the comparative target through the remaining process except the fermentation process of Example 1-1.
  • Example 1-1 Through the rest of the process except for the fermentation of Example 1-1 to prepare a wind flower and the genus plant extract of the pheasant of comparison.
  • Anticancer saponins to be identified are 1) hederagenin 3-O- ⁇ -L-ramnopyranosyl- (1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4)]- ⁇ -L- Arabinopyranoside (Hederagenin 3-O- ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4)]- ⁇ -L-arabinopyranoside; hereinafter referred to as H-gra) 2) hederagenin 3-O- ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 3) - ⁇ -L-ramnopyranosyl- (1 ⁇ 2 - ⁇ -L-arabinopyrano
  • compositions were prepared to confirm anticancer effects through simultaneous administration of extracts containing high concentrations of anticancer saponins of the present invention and existing anticancer agents.
  • DPT Deoxypodophyllotoxin
  • the solid cancer refers to a form in which cancer cells grow and form agglomerates, and there are various types of solid cancers.
  • the solid cancer-induced mouse model prepared by transplanting a cancer cell line subcutaneously in a mouse which is used to support the effect of solid cancer treatment.
  • Cancer growth inhibition rate was calculated according to the following formula 1, the results of confirming the cancer growth inhibition rate 7 days and 14 days after drug administration are shown in Table 3 and FIG.
  • % Cancer growth inhibition ((average cancer volume of negative control-mean cancer volume of dose) / average cancer volume of negative control) ⁇ 100
  • the cancer growth inhibition rate was It was higher than when only the extracts of Examples 1-1 to 1-3 were administered, and it was confirmed that the number of mice in which transplanted cancer cells completely disappeared was increased.
  • the composition comprising the wind flower and the genus plant extracts of the pheasant of the present invention or the composition further comprising the arrang or Korean pasqueflower extract is an excellent anticancer
  • the extract having excellent activity and excellent anticancer activity has an increased anticancer saponin content of Hg (1 ⁇ 4) g (1 ⁇ 3) ra, O-gra and Hg (1 ⁇ 3) ra. there was.
  • the anticancer activity can be increased when the anticancer agent is administered together with the extract of the present invention.
  • Example 1-2 of the present invention 20 g of the extract of Example 1-2 of the present invention was mixed with 175.9 g of lactose, 180 g of potato starch, and 32 g of colloidal silicic acid, respectively. 10% gelatin solution was added to the mixture, which was then ground and passed through a 14 mesh sieve. It was dried and the mixture obtained by adding 160 g of potato starch, 50 g of talc and 5 g of magnesium stearate was made into a tablet.
  • 100 mg of the extract of Example 1-2 of the present invention was dissolved in 100 ml of saline, and filtered using a filter paper capable of removing bacteria to prepare an injection solution.

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Abstract

본 발명은 항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana) 및 인동속 식물(Lonicera species) 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물 또는 두릅(Aralia elata)이나 할미꽃(Pulsatilla sp.) 추출물 등을 추가로 포함하는 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물에 함유되어 있는 사포닌을 항암 활성이 높은 항암성 사포닌으로 전환시켜 항암성 사포닌이 고농도로 함유된 추출물을 제조하였고, 제조한 추출물이 우수한 항암 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명의 항암성 사포닌이 고농도로 함유된 추출물을 암 치료용 의약품 개발에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 꿩의 바람꽃, 인동속 식물 및 두릅 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조 방법
본 발명은 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana) 및 인동속 식물(Lonicera species) 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물또는 두릅(Aralia elata)이나 할미꽃(Pulsatilla sp.) 추출물 등을 추가로 포함하는 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물의 암 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
암은 학문적으로는 신생물(neoplasia)이라고 불리며, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 비정상적인 세포 성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다. 암은 다양한 정도의 유병률로 신체의 모든 조직 및 장기에 영향을 미친다.
암의 종류는 처음 암 세포가 발생한 조직 및 장기에 따라 분류하기도 하고, 암 세포의 모양과 발생 기원에 따라 분류하기도 한다. 흔히 폐암, 위암, 대장암, 자궁경부암 등은 암이 처음 생긴 장기를 기준으로 일컫는다. 또한 발생 기원 측면에서는 크게 결체조직성 종양, 상피성 종양, 선암 등으로 구분되기도 한다. 우리나라에서 가장 많이 발생한 암은 갑상선암으로 나타났고, 이어서 위암, 대장암, 폐암의 순으로 발병률이 높다.
암의 치료는 장기에 고형화 된 암 조직을 제거하거나 암 세포를 죽이는 적극적인 치료요법과 암 세포의 진행을 지연시켜 부작용을 최소화하는 완화요법으로 구분된다. 암 발생 초기 단계의 경우 수술, 항암화학적요법, 방사선치료 등을 통해 종양을 제거하거나 화학약물 및 방사선 등으로 암 세포를 죽이는 치료방법을 선택할 수 있다. 그러나 말기 암 환자의 경우 적극적인 치료요법에 의한 부작용이 상대적으로 크기 때문에 암 세포의 진행을 늦추어 부작용을 줄이고 삶의 질을 높이는 치료법을 선택할 수 있다. 일반적으로 항암제는 적극적인 치료요법에 속하는 항암화학요법을 말하며, 암 세포를 독성물질로 사멸시키는 세포독성항암제, 암세포 및 조직주변의 신생혈관에 선택적으로 작용하는 표적항암제 등을 포함한다(정근영, 2016).
대부분의 항암제는 빠르게 성장, 분열하는 암 세포에 작용하여 효과를 나타내는 약제로서, 성장 분열이 빠른 일부 정상 세포도 공격하여 부작용을 일으키고, 아직까지 완벽하게 암을 치료할 수 있는 치료제는 개발되지 않았다. 따라서, 암의 치료와 관련하여 우수한 항암 효과를 가진 치료제의 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.
사포닌(saponin)은 식물계에 널리 분포하는 배당체(glycoside)의 총칭으로, 미나리아재비과(Ranunculaceae), 두릅나무과(Araliaceae), 마과(Dioscoreaceae), 콩과(Leguminosae), 박과(Cucurbitaceae), 국화과(Compositae), 장미과(Rosaceae), 백합과(Liliaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 석죽과(Caryophyllaceae) 등에 많이 함유되어 있다.
사포닌은 스테로이드(steroid), 스테로이드 알칼로이드(steroid alkaloid) 혹은 트리터펜(triterpene) 골격의 비당부분(aglycone)을 가지고 있으며, 비당부분에 보통 한 개 이상의 당쇄(sugar chains)가 붙어 있다(Bachran, C., et al., 2008). 사포닌은 비당부분의 구조와 붙어 있는 당 측쇄의 수와 당의 종류에 따라 다양성을 나타낸다. 당이 비당부분의 한쪽 기능기에만 결합되어 있는 사포닌을 모노데스모사이드(monodesmoside)라 하고, 당이 두 개 기능기에 결합되어 있는 사포닌은 비스데스모사이드(bisdesmoside)라 한다.
사포닌은 항암제 혹은 면역 보조제로서 암세포에 다양한 효과를 가지고 있는 것으로 보고되었다. 최초의 연구는 1976년 자발성 백혈병 발생 마우스 모델에서 사포닌 Quil A의 생존기간 연장 효과에 대한 보고였다(Ebbesen, P., et al., 1976). 이후, 인삼 사포닌과 시호 사포닌을 비롯한 다양한 사포닌의 종양세포에 대한 연구들이 실시되었다. 디오스신(dioscin)은 둥굴레속 폴리고나툼 잔란스시아넨스 Pamp.(Polygonatum zanlanscianense Pamp.)의 뿌리로부터 분리한 사포닌으로 자궁경부암 세포의 세포사멸을 유도하였고, 스밀라시나 아트로퍼푸래(Smilacina atropurpurea)의 근경에서 분리된 디오스신은 여러 종류의 암 세포주에 강력한 세포독성을 나타낸다. 또 다른 사포닌인 사이코사포닌(saikosaponin)은 시호속 식물의 트리터펜계 사포닌 성분으로, 사이코사포닌-a는 간암 세포주에 대해 강력한 증식 억제 효과 및 인간 유방암 세포주에 대한 세포 사멸 촉진 효과가 있으며, 사이코사포닌-b는 간암세포에 대한 세포 독성을 보였으며, 자귀나무(Alibiza julibrissin) 수피로부터 분리된 사포닌인 줄리브로사이드(julibrosides) 및 이의 유도체들은 간암, 자궁경부암, 유방암 세포주에 세포 독성을 보였다. 또한, 대두 유래 사포닌 및 인삼 유래 사포닌, 호주산 아카시아 나무(Acacia victroiae)로부터 분리된 사포닌인 아비신(avicins) 등이 항암 활성을 나타내고 있음이 밝혀졌다(Bachran, C., et al., 2008).
Bang, S.C., et al., 2005에서는 한국할미꽃 뿌리로부터 17종의 사포닌을 분리하였고, 이중 6개의 사포닌의 암에 대한 항암성을 확인하였다. 또한, 6개의 사포닌 구조를 분석한 결과, 헤데라게닌(hederagenin), 올레아놀릭산(oleanolic acid), 베툴린산(betulinic acid), 23-히드록시베툴린산(23-hydroxybetulinic acid)을 비당부분으로 하고 있으며, 28번 위치에 자유 카르복실산(free carboxyl)기를 가지고 있고, 3번 위치에는 람노피라노실(1→2)아라비노피라노실(rhamnopyranosyl(1→2)arabinopyranosyl)기와 결합되어 있는 모노데스모사이드들임이 확인되었다.
그러나 28번이 자유산기인 사포닌은 자연 상태에서 소량 존재하며, 대부분이 글리코실 에스터(glycosyl ester)기 형태로 존재한다. 따라서 항암성이 있는 28번이 자유산기를 갖는 사포닌을 얻기 위해서는 에스터(ester)기를 가수분해시켜야 한다.
이에, 본 발명자들은 다양한 식물의 항암성 사포닌을 연구하는 과정에서 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물로부터 항암성 사포닌의 함량이 고농도로 함유된 추출물을 제조하였고, 제조한 추출물이 우수한 항암 활성을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 한국등록특허 제1218340호에는 사포닌이 함유된 금은화 추출물을 포함하는 암 치료용 조성물이 기재되어 있고, 미국공개특허 제2004-0067263호에는 조사포닌이 포함된 꿩의 바람꽃 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물이 기재되어 있으나, 본 발명의 항암성 사포닌이 고농도로 함유된 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 포함하는 조성물과는 그 구성이 차이가 있다. 또한, 한국등록특허 제0628334호에는 백두옹의 사포닌을 효소 가수분해시켜 항암 효과가 증가된 사포닌 제조 방법이 기재되어 있으나, 본 발명의 항암성 사포닌이 고농도로 함유된 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 및 이의 항암 효과는 기재되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 항암성 사포닌을 고농도로 포함하는 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana) 및 인동속 식물(Lonicera species) 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 i) 식물에 증류수를 넣고 분쇄하여 식물 자체 배지를 제조하는 1단계; ii) 식물에 유기 용매를 가하여 식물 추출물을 제조하는 2단계; iii) 상기 1단계의 식물 자체 배지에 상기 2단계의 식물 추출물을 혼합하고 37℃에서 교반하면서 발효시키는 3단계; iv) 상기 3단계의 발효를 통해 얻은 발효물에 유기용매를 가하여 분획하는 4단계; v) 상기 4단계의 분획물을 컬럼 크로마토그래피에 가하여 용출액을 확보하는 5단계; 및 vi) 상기 5단계의 용출액에 유기용매를 가하여 분획하여 얻은 분획물을 건조하는 6단계; 를 통해 제조된 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana) 및 인동속 식물(Lonicera species) 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 1단계의 식물 자체 배지는, 식물에 증류수를 가하여 믹서기로 1차 분쇄하는 단계; 및 상기 1차 분쇄물을 초음파를 가하여 2차 분쇄하는 단계; 를 통해 제조될 수 있다.
상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물은 한국할미꽃(Pulsatilla koreana) 자체 배지, 한국할미꽃 추출물 또는 두릅(Aralia elata) 추출물에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물은 항암성 사포닌의 함량이 15~110배 증가된 것일 수 있다.
상기 항암성 사포닌은 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside), 올레아놀릭산 3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(Oleanolic acid 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranoside) 및 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 약학 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 암은 고형암 일 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물은 i) 식물에 증류수를 넣고 분쇄하여 식물 자체 배지를 제조하는 1단계; ii) 식물에 유기 용매를 가하여 식물 추출물을 제조하는 2단계; iii) 상기 1단계의 식물 자체 배지에 상기 2단계의 식물 추출물을 혼합하고 37℃에서 교반하면서 발효시키는 3단계; iv) 상기 3단계의 발효를 통해 얻은 발효물에 유기용매를 가하여 분획하는 4단계; v) 상기 4단계의 분획물을 컬럼 크로마토그래피에 가하여 용출액을 확보하는 5단계; 및 vi) 상기 5단계의 용출액에 유기용매를 가하여 분획하여 얻은 분획물을 건조하는 6단계; 를 통해 제조될 수 있다.
상기 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana)은 미나리아재비과 바람꽃속에 속하는 여러해살이풀로, 중국, 극동러시아 및 우리나라에 분포하고 있다. 꿩의 바람꽃의 주요 활성성분으로는 올레아난형 트리테르페노이드 및 그 배당체 등이 알려져 있고, 항염, 항종양, 진통, 항경련 등의 약리학적 활성이 있음이 알려져 있다(Sun, Y.X., et al., 2011).
상기 꿩의 바람꽃은 식물 자체 배지 또는 식물 추출물로 이용가능하다.
상기 인동속 식물(Lonicera species, Lonicera sp.)은 인동과(Caprifoliceae)에 속하는 다년생 식물로, 인동덩굴(Lonicera japonica), 회전모인동덩굴(Lonicera macranthoides), 황갈모인동덩굴(Lonicera fulvotomentosa) 등이 있으며, 항암성 사포닌인 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside)을 함유하고 있음이 알려져 있다.
상기 인동속 식물은 항암성 사포닌을 포함하는 인동속 식물들 모두 사용가능하다. 바람직하게는 인동덩굴(Lonicera japonica), 회전모인동덩굴(Lonicera macranthoides), 황갈모인동덩굴(Lonicera fulvotomentosa)이고, 더 바람직하게는 인동덩굴이다.
상기 인동덩굴의 줄기를 인동등 또는 금은등이라하고, 꽃을 금은화라고 하며, 민간이나 한방에서 약재로 사용되고 있다. 인동덩굴에는 플라보노이드(flavonoid), 이리도이드(iridoid), 사포닌 및 기타 페놀(phenol)성 화합물들이 포함되어 있고, 이중, 이리도이드 성분이 주요 성분임이 밝혀져 있으며(Kim, J.S., et al., 2009), 금은화가 항바이러스, 항균, 항내독소, 소염, 면역증강, 항암 활성이 있음이 보고되었다(Yun, K.J., et al, 2012).
상기 인동속 식물은 식물 자체 배지 또는 식물 추출물로 이용가능하다.
본 발명의 '식물 자체 배지'는 식물체가 발효를 위한 배지가 되면서 발효 기질로도 사용되는 방식을 말하는 것으로, 식물로부터 사포닌 배당체를 분리하는 과정에서 식물 세포 내에 존재하는 가수분해효소(hydrolase)에 의해 사포닌의 에스터(ester)기가 가수분해 되는 것을 이용한 것이다.
상기 1단계의 식물 자체 배지는 식물에 증류수를 가하여 믹서기로 1차 분쇄하는 단계; 및 상기 1차 분쇄물을 초음파를 가하여 2차 분쇄하는 단계;를 통해 제조할 수 있다.
상기 식물 자체 배지 제조는 식물 세포 내에 가수분해효소가 존재하고 사포닌을 함유하는 식물 모두 이용 가능하며, 보다 자세하게는 미나리아재비과(Ranunculaceae), 두릅나무과(Araliaceae), 마과(Dioscoreaceae), 콩과(Leguminosae), 박과(Cucurbitaceae), 국화과(Compositae), 장미과(Rosaceae), 백합과(Liliaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 석죽과(Caryophyllaceae) 등에 포함되는 식물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 한국할미꽃(Pulsatilla koreana), 중국할미꽃(Pulsatilla chinensis), 가는잎할미꽃(Pulsatilla cernua), 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana), 두릅(Aralia elata), 으름덩굴(Akebia quinata), 인동속 식물(Lonicera species) 및 마타리(Patrinia scabiosifolia)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다. 더 바람직하게는 한국할미꽃, 꿩의 바람꽃, 인동속 식물 및 으름덩굴로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 더욱 바람직하게는 한국할미꽃 및 꿩의 바람꽃으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 가장 바람직하게는 꿩의 바람꽃이다.
상기 식물 자체 배지 제조 시 이용되는 식물체는 뿌리, 잎, 열매, 종자 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 식물체의 뿌리, 과육이다. 식물 유(oil)를 다량으로 함유하는 종자류의 경우에는 식물 유를 제거하는 과정이 복잡하고, 엽록소 또는 왁스를 포함하는 식물 잎의 경우에는 엽록소 또는 왁스를 제거하는 과정 동안에 가수분해효소가 불활성화 될 수 있는 문제점이 있을 수 있다.
상기 2단계의 식물 추출물은 식물을 C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등일 수 있다.
또한, 상기 식물 추출물은 식물을 C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물을 농축한 농축액에 유기용매를 가하여 분획한 분획물 일 수 있다.
상기 식물 추출물 제조 시 이용할 수 있는 식물은 사포닌을 포함하는 식물 모두 이용 가능하며, 미나리아재비과(Ranunculaceae), 두릅나무과(Araliaceae), 마과(Dioscoreaceae), 콩과(Leguminosae), 박과(Cucurbitaceae), 국화과(Compositae), 장미과(Rosaceae), 백합과(Liliaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 석죽과(Caryophyllaceae) 등에 포함되는 식물 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 한국할미꽃(Pulsatilla koreana), 중국할미꽃(Pulsatilla chinensis), 가는잎할미꽃(Pulsatilla cernua), 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana), 두릅(Aralia elata), 으름덩굴(Akebia quinata), 인동속 식물(Lonicera species) 및 마타리(Patrinia scabiosifolia) 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다. 더 바람직하게는 꿩의 바람꽃, 인동속 식물, 한국할미꽃 및 두릅 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 가장 바람직하게는 인동속 식물 추출물이다.
상기 유기용매는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 헥산 및 아세톤 등일 수 있다. 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등 일 수 있다.
상기 3단계의 발효는 식물에 존재하는 사포닌의 28번 위치의 글리코실 에스터(glycosyl ester)기를 가수분해하여 자유산기를 가지도록 함으로써 항암 활성이 높은 항암성 사포닌으로 전환시키는 것으로, 상기 가수분해는 상기 식물 자체 배지에 존재하는 가수분해효소(hydrolase)를 이용하여 식물 자체 배지 및 식물 추출액 내에 존재하는 사포닌의 글리코실 에스터기를 가수분해시켜 항암성 사포닌으로 전환시키는 것이다.
상기 5단계의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), HP-20 컬럼 크로마토그래피(HP-20 column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(High-performance liquid chromatography), 역상 컬럼 고성능 액체 크로마토그래피(reverse phase HPLC) 등에서 선택하여 사용할 수 있다.
상기 4단계 또는 상기 6단계의 유기용매는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 헥산 및 아세톤 등일 수 있다. 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등 일 수 있다.
상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물은 항암성 사포닌의 함량이 15~110배 증가된 것일 수 있다.
상기 항암성 사포닌의 함량은 발효 과정을 거치지 않은 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물의 항암성 사포닌 함량을 기준으로 하여 본 발명의 제조 방법으로 제조된 항암성 사포닌을 고농도로 함유하고 있는 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 포함하고 있는 추출물의 항암성 사포닌의 증가율을 분석한 것이다.
상기 항암성 사포닌은 헤데라게닌(hederagenin), 올레아놀릭산(oleanolic acid), 베툴린산(betulinic acid), 23-히드록시베툴린산(23-hydroxybetulinic acid)을 비당부분(aglycone)으로 하고 있으며, 28번 위치에 자유산기(free acidic functional group)를 가지고 있는 모노데스모사이드(monodesmoside)들 일 수 있다. 바람직하게는 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranoside), 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside), 올레아놀릭산 3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(Oleanolic acid 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranoside) 및 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고, 더 바람직하게는 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드, 올레아놀릭산 3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드 및 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다.
상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물은 사포닌을 포함하는 식물 자체 배지 또는 식물 추출물에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 추가 가능한 식물 자체 배지는 사포닌을 함유하는 모든 식물 자체 배지일 수 있으며, 보다 자세하게는 미나리아재비과(Ranunculaceae), 두릅나무과(Araliaceae), 마과(Dioscoreaceae), 콩과(Leguminosae), 박과(Cucurbitaceae), 국화과(Compositae), 장미과(Rosaceae), 백합과(Liliaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 석죽과(Caryophyllaceae) 등에 포함되는 식물 자체 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 한국할미꽃(Pulsatilla koreana), 중국할미꽃(Pulsatilla chinensis), 가는잎할미꽃(Pulsatilla cernua), 두릅(Aralia elata), 으름덩굴(Akebia quinata), 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana), 인동속 식물(Lonicera species) 및 마타리(Patrinia scabiosifolia)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 식물 자체 배지이다. 더 바람직하게는 한국할미꽃 및 으름덩굴로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 식물 자체 배지이며, 가장 바람직하게는 한국할미꽃 자체 배지이다.
상기 추가 가능한 식물 추출물은 사포닌을 포함하는 식물 추출물을 추가로 포함할 수 있는 것으로, 미나리아재비과(Ranunculaceae), 두릅나무과(Araliaceae), 마과(Dioscoreaceae), 콩과(Leguminosae), 박과(Cucurbitaceae), 국화과(Compositae), 장미과(Rosaceae), 백합과(Liliaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 석죽과(Caryophyllaceae) 등에 포함되는 식물 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 한국할미꽃(Pulsatilla koreana), 중국할미꽃(Pulsatilla chinensis), 가는잎할미꽃(Pulsatilla cernua), 두릅(Aralia elata), 으름덩굴(Akebia quinata), 인동속 식물(Lonicera spicese) 및 마타리(Patrinia scabiosifolia) 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다. 더 바람직하게는 한국할미꽃 및 두릅 추출액에서 선택되는 1종 이상이다.
상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 기존 항암제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 항암제는 현재 사용되는 항암제를 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 식물 유래 항암제이고, 더 바람직하게는 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 비노렐빈(vinorelvine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 캄프토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 벨로테칸(belotecan), 포도필로톡신(podophyllotoxin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 데오시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin), 부플레우로톡신(bupleurotoxin), 시마릴릭산 (cymarilic acid)이고, 가장 바람직하게는 데오시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin), 부플레우로톡신(bupleurotoxin), 시마릴릭산(cymarilic acid)이다.
상기 데오시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin), 부플레우로톡신(bupleurotoxin), 시마릴릭산(cymarilic acid)은 신생혈관 억제 활성을 가지는 항암제로, 본 발명의 조성물과 함께 처리할 경우, 항암 활성이 현저히 증가된다.
상기 약학적 조성물은 상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물에 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 점막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 암은 악성 종양(malignant tumor)이라고도 하며, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리로서, 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하게 되는 질환을 의미하며, 암종(carcinoma)과 육종(sarcoma)을 포함한다.
상기 암은 고형암일 수 있다. 바람직하게는 위암, 간암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 전립선암, 고환암, 식도암, 담도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 전립선암, 부신암, 흉선종, 중피종, 신장암, 뇌암, 중추신경계종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 건강기능식품일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 톳 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana) 및 인동속 식물(Lonicera speceies) 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물에 함유되어 있는 사포닌을 항암 활성이 높은 항암성 사포닌으로 전환시켜 항암성 사포닌이 고농도로 함유된 추출물을 제조하였고, 제조한 추출물이 우수한 항암 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 항암성 사포닌이 고농도로 함유된 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 암 치료용 의약품 개발에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 항암 활성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실험예 1. 식물 추출물 및 식물 자체 배지 제조>
대상 식물로는 사포닌 함유 식물 중 비당부분이 헤데라게닌, 올레아놀릭산으로 된 사포닌을 함유하는 식물인 한국할미꽃(Pulsatilla koreana), 중국할미꽃(Pulsatilla chinensis), 가는잎할미꽃(Pulsatilla cernua), 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana), 두릅(Aralia elata), 으름덩굴(Akebia quinata), 마타리(Patrinia scabiosifolia), 인동속 식물(Lonicera species, Lonicera sp.)을 선택하였다.
상기 식물들 중 한국할미꽃, 중국할미꽃, 가는잎할미꽃, 꿩의 바람꽃 및 마타리는 뿌리를, 두릅은 잎을, 으름덩굴은 종자 또는 과육을, 인동속 식물은 인동덩굴의 꽃인 금은화를 이용하였다.
실험예 1-1. 식물 추출물 제조
1) 중국할미꽃( Pulsatilla chinensis ) 추출물( Pc 추출물)
중국할미꽃 뿌리를 분쇄기에 넣고 분쇄하여 분말로 만들었다. 중국할미꽃 뿌리 분말 100g에 70%(v/v) 메탄올 500㎖을 가하고 교반하면서 4시간 동안 환류하였다. 환류 후 여과지를 이용해 여과시켜 여과액을 분리하여 보관하였고, 여과 후 남은 식물체에는 70%(v/v) 메탄올 500㎖을 가하고 4시간 동안 환류하여 추가의 여과액을 분리하여 기존 여과액과 혼합하여 70%(v/v) 메탄올 추출액을 확보하였다. 확보한 추출액을 감압 건조하여 건조물 형태로 만들었고, 건조물에 95~100%(v/v) 에탄올 70㎖을 넣어 혼합한 후, 여과하여 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 에탄올 층을 건고하여 중국할미꽃 추출물(6.4g)을 확보하였다.
2) 가는잎할미꽃 ( Pulsatilla cernua ) 추출물( Pcer 추출물)
가는잎할미꽃 뿌리를 이용하여 상시 실험예 1-1의 1) 중국할미꽃 추출물 제조 방법과 동일한 방법으로 가는잎할미꽃 추출물(5.9g)을 확보하였다.
3) 꿩의 바람꽃 ( Anemone raddeana ) 추출물( Ar 추출물)
꿩의 바람꽃 뿌리를 이용하여 상시 실험예 1-1의 1) 중국할미꽃 추출물 제조 방법과 동일한 방법으로 꿩의 바람꽃 추출물(4.1g)을 확보하였다.
4) 마타리 ( Patrinia scabiosifolia ) 추출물( Ps 추출물)
마타리 뿌리를 이용하여 상시 실험예 1-1의 1) 중국할미꽃 추출물 제조 방법과 동일한 방법으로 마타리 추출물(4.0g)을 확보하였다.
5) 두릅( Aralia elata ) 추출물( Ae 추출물)
4월 말에 채취한 어린 두릅 잎을 음건하고 이를 잘게 썰고, 이 중 100g에 95~100%(v/v) 메탄올 300㎖을 혼합하고 믹서기로 분쇄한 다음 추출기를 이용하여 교반하면서 5시간 동안 환류하였다. 환류 후 여과지를 이용해 여과시켜 메탄올 층만 분리하였고, 남은 식물체에는 95%(v/v) 메탄올 300㎖을 가하고 5시간 동안 환류하여 메탄올 층을 추가로 분리하여 기존 메탄올 층과 혼합하여 메탄올 추출액을 확보하였다. 확보한 메탄올 추출액의 부피가 200㎖정도가 되도록 농축하고, 농축한 추출액에 헥산 200㎖을 가하여 10분간 흔들어주고 그대로 방치하여 생성된 메탄올 층만을 분리하여 1차 메탄올 분획물을 확보하였다. 확보한 1차 메탄올 분획물에 다시 헥산 200㎖을 가하여 10분간 흔들어주고 그대로 방치하여 생성된 메탄올 층을 분리하여 2차 메탄올 분획물을 확보하였다. 확보한 2차 메탄올 분획물을 농축 건조하여 고형분을 얻었다. 얻은 고형분에 100%(v/v) 에탄올 70㎖을 넣어 혼합하고 30분 동안 방치한 후에 여과하여 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 에탄올 층을 건고하여 두릅 추출물(3.7g)을 확보하였다.
6) 으름덩굴( Akebia quinata ) 추출물( Aq 추출물)
으름덩굴 종자 100g에 헥산 400㎖을 혼합하고 믹서기로 분쇄한 다음, 분쇄물을 방치하여 헥산 층만을 분리하였다. 분리한 헥산 층을 여과하여 헥산을 제거하고, 헥산이 제거된 식물체에 95%(v/v) 메탄올 400㎖을 가하고 추출기를 이용하여 교반하면서 4시간 동안 환류하였다. 환류 후 여과지를 이용해 여과시켜 메탄올 층만 분리하였고, 남은 식물체에는 95%(v/v) 메탄올 500㎖을 가하고 4시간 동안 환류하여 메탄올 층을 추가로 분리하여 기존 메탄올 층과 혼합하여 메탄올 추출액을 확보하였다. 확보한 메탄올 추출액의 부피가 300㎖정도가 되도록 농축하고, 농축한 추출액에 헥산 300㎖을 가하여 10분간 흔들어주고 그대로 방치하여 생성된 헥산 층을 제거하고, 메탄올 층만을 분리하였다. 분리한 메탄올 층을 감압 건조하여 건고물을 얻었고, 얻은 건고물에 100%(v/v) 에탄올 70㎖을 넣어 혼합하고 일정시간 동안 방치한 후에 여과하여 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 에탄올 층을 건고하여 으름덩굴 추출물(4.4g)을 확보하였다.
7) 인동속 식물( Lonicera sp .) 추출물( Lj 추출물)
인동속 식물로 인동덩굴(Lonicera japonica)의 꽃인 금은화를 이용하였다. 금은화 100g에 95%(v/v) 메탄올 300㎖을 혼합하고 믹서기로 분쇄한 다음 추출기를 이용하여 3시간 동안 환류시켰다. 환류 후 여과지를 이용해 여과시켜 메탄올 층만 분리하였고, 남은 식물체에는 100%(v/v) 메탄올 300㎖을 가하고 3시간 동안 환류하여 메탄올 층을 추가로 분리하여 기존 메탄올 층과 혼합하여 메탄올 추출액을 확보하였다. 확보한 메탄올 추출액이 200㎖ 정도가 되도록 농축하고, 농축한 추출액에 헥산 200㎖을 가하여 10분간 흔들어주고 그대로 방치하여 생성된 헥산 층을 제거하고, 메탄올 층만을 분리하여 1차 메탄올 분획물을 확보하였다. 확보한 1차 메탄올 분획물에 다시 헥산 200㎖을 가하여 10분간 흔들어주고 그대로 방치하여 생성된 메탄올 층을 분리하여 2차 메탄올 분획물을 확보하였다. 확보한 2차 메탄올 분획물을 농축 건조하여 고형분을 얻었다. 얻은 고형분에 100%(v/v) 에탄올 70㎖을 넣어 혼합하고 30분 동안 방치한 후에 여과하여 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 에탄올 층을 건고하여 인동속 식물 추출물(3.9g)을 확보하였다.
실험예 1-2. 식물 자체 배지 제조
식물에 존재하는 사포닌은 주로 배당체로 존재한다. 특히나, 헤데라게닌(hederagenin), 올레아놀릭산(oleanolic acid), 베툴린산(betulinic acid), 23-히드록시베툴린산(23-hydroxybetulinic acid)을 비당부분으로 하는 사포닌들은 28번 위치의 산기가 글리코실 에스터(glycosyl ester)기 형태로 존재하고 있어, 항암성 사포닌을 얻기 위해서는 에스터기를 가수분해시켜야 한다. 화학적인 방법을 이용하여 가수분해시키는 경우에는 사포닌 구조에 영향을 줄 수 있고 분리 단계가 복잡하여 경제성이 떨어진다. 이에, 식물로부터 사포닌 배당체를 분리하는 과정에서 에스터기가 식물 내에 존재하는 가수분해효소에 의해 가수분해되는 것을 이용하였고, 본 발명인의 등록된 한국등록특허 제0628334에 기재된 기술 내용을 참조로 하여 식물 자체 배지를 제조하였다.
식물 자체 배지 제조를 위한 식물은 상기 실험예 1에 사용한 식물을 모두 배지로 이용할 수 있다. 그러나 으름덩굴 종자와 같은 식물유(oil)를 다량으로 함유하는 종자류는 식물유를 제거하는 과정이 복잡하며, 두릅 잎의 경우에는 엽록소(chlorophyll) 또는 왁스(wax) 등을 제거하는 과정 동안에 가수분해 효소가 불활성화 될 수 있다. 이에, 본 발명에서는 한국할미꽃 뿌리, 꿩의 바람꽃 뿌리 및 으름덩굴 과육을 이용하였다.
1) 한국할미꽃( Pulsatilla koreana ) 자체 배지( Pk 배지)
신선한 한국할미꽃 뿌리를 물로 세척하고 껍질을 벗겨 잘게 썰었다. 잘게 썬 한국할미꽃 뿌리 100g에 4℃로 냉각시킨 증류수 200㎖을 넣고 믹서기로 분쇄하였다. 믹서기로 분쇄한 분쇄물을 초음파 분쇄기를 이용하여 고주파에서 10분간 초음파 처리하여 한국할미꽃 자체 배지를 제조하였다.
2) 꿩의 바람꽃 ( Anemone raddeana ) 자체 배지( Ar 배지)
꿩의 바람꽃 뿌리를 이용하여 상시 실험예 1-2의 1) 한국할미꽃 자체 배지 제조 방법과 동일한 방법으로 꿩의 바람꽃 자체 배지를 제조하였다.
3) 으름덩굴( Akebia quinata ) 자체 배지( Aq 배지)
으름덩굴 과육은 아직 갈라지기 전에 수확한 것을 이용하였다. 으름덩굴 과육 100g에 4℃로 냉각시킨 증류수 200㎖을 넣고 믹서기로 분쇄하였다. 믹서기로 분쇄한 분쇄물을 초음파 분쇄기를 이용하여 고주파에서 5~10분간 초음파 처리하여 으름덩굴 자체 배지를 제조하였다.
< 실시예 1. 항암성 사포닌이 고농도로 함유되어 있는 추출물 제조>
상기 실험예 1에서 제조한 식물 추출물 및 식물 자체 배지를 이용하여 본 발명의 항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 추출물을 제조하였다. 이때, 식물 자체 배지는 사용 전에 바로 제조하여 이용하였다.
실시예 1-1. 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물 제조
상기 실험예 1-2의 2) 꿩의 바람꽃 자체 배지(Ar 배지)에 상기 실험예 1-1의 7) 인동속 식물 추출물(Lj 추출물) 3.9g을 혼합한 후, 37℃에서 교반하면서 2시간 동안 발효시켰다. 발효물은 실온으로 식히고 95%(v/v) 메탄올 400㎖을 첨가하여 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 교반 후 여과지를 이용해 여과액을 분리하여 보관하고, 여과 후 남은 고형물에 95%(v/v) 메탄올 400㎖을 첨가하여 상기와 같은 방법으로 반응시킨 후 여과액을 얻었고, 2번에 걸쳐 얻은 여과액을 혼합하고 농축하여 농축액을 얻었다. 얻은 농축액은 데시케이터(desicator)를 이용하여 건고물 형태로 만든 후, 건고물에 100%(v/v) 에탄올 70㎖을 넣어 혼합하고 일정 시간 동안 방치한 다음에 여과지를 이용해 여과하여 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 에탄올 층을 세균성발열물질(pyrogen)이 없는 용기에 넣고 건고하여 건고물 5.4g을 얻었다.
상기 건고물 2g을 증류수 10㎖로 용해시키고 20분 동안 방치한 후, 여과지로 여과하여 여과액을 확보하였다. 확보한 여과액을 물로 안정화시킨 디아이온 HP-20 흡착수지(diaion HP-20 resin) 300g이 충전되어 있는 컬럼(컬럼크기 5×80㎝)에 가하여 흡착시켰다. 증류수 1500㎖을 2시간에 걸쳐 통과시켜 컬럼을 세척한 다음 20%(v/v) 메탄올 300㎖과 90%(v/v) 메탄올 1000㎖을 순차적으로 가하여 용출하였고, 용출액을 20㎖씩 포집하였다. 포집한 용출액을 실리카겔 판에 점적한 후 말리고 10%(v/v) 황산을 분무하고 150℃로 가열하여 분홍색을 띄는지 확인하였다. 분홍색이 나타나는 용출액만을 모아 농축 건고하고, 건고물에 100%(v/v) 에탄올 20㎖을 넣어 혼합하고 일정 시간 동안 방치한 다음에 여과지를 이용해 여과하여 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 에탄올 층은 세균성발열물질(pyrogen)이 없는 용기에 넣고 건고하여 본 발명의 항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물(0.98g)을 제조하였다.
실시예 1-2. 꿩의 바람꽃, 인동속 식물 및 두릅 추출물 제조
상기 실험예 1-2의 2) 꿩의 바람꽃 자체 배지(Ar 배지)에 상기 실험예 1-1의 7) 인동속 식물 추출물(Lj 추출물) 3.9g과 5) 두릅 추출물(Ae 추출물) 3.7g을 혼합한 후, 37℃에서 교반하면서 2.5시간 동안 발효시켰다. 발효물은 실온으로 식히고 95%(v/v) 메탄올 500㎖을 첨가하여 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 교반 후 여과지를 이용해 여과액을 분리하여 보관하고, 여과 후 남은 고형물에 95%(v/v) 메탄올 500㎖을 첨가하여 상기와 같은 방법으로 반응시킨 후 여과액을 얻었고, 2번에 걸쳐 얻은 여과액을 혼합하고 농축하여 농축액을 얻었다. 얻은 농축액은 데시케이터를 이용하여 건고물 형태로 만든 후, 건고물에 100%(v/v) 에탄올 100㎖을 넣어 혼합하고 일정 시간 동안 방치한 다음에 여과지를 이용해 여과하여 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 에탄올 층을 건고하여 건고물 형태로 만든 후, 다시 100%(v/v) 에탄올 70㎖을 넣어 혼합하여 상기 과정을 반복하여 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 에탄올 층을 세균성발열물질이 없는 용기에 넣고 건고하여 건고물 7.9g을 얻었다.
상기 건고물 2g을 이용하여 상기 실시예 1-1의 디아이온 HP-20 컬럼과 동일한 방법을 수행하여 본 발명의 항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 꿩의 바람꽃, 인동속 식물 및 두릅 추출물(1.09g)을 제조하였다.
실시예 1-3. 꿩의 바람꽃, 인동속 식물 및 한국할미꽃 추출물 제조
상기 실험예 1-2의 1) 한국할미꽃 자체 배지(Pk 배지)에 상기 실험예 1-1의 3) 꿩의 바람꽃 추출물(Ar 추출물) 4.1g과 7) 인동속 식물 추출물(Lj 추출물) 3.9g을 혼합한 후, 37℃에서 교반하면서 2.5시간 동안 발효시켰다. 발효물은 실온으로 식히고 95%(v/v) 메탄올 500㎖을 첨가하여 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 교반 후 여과지를 이용해 여과액을 분리하여 보관하고, 여과 후 남은 고형물에 95%(v/v) 메탄올 500㎖을 첨가하여 상기와 같은 방법으로 반응시킨 후 여과액을 얻었고, 2번에 걸쳐 얻은 여과액을 혼합하고 농축하여 농축액을 얻었다. 얻은 농축액은 데시케이터를 이용하여 건고물 형태로 만든 후, 건고물에 100%(v/v) 에탄올 100㎖을 넣어 혼합하고 일정 시간 동안 방치한 다음에 여과지를 이용해 여과하여 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 에탄올 층을 세균성발열물질이 없는 용기에 넣고 건고하여 건고물 8.1g을 얻었다.
상기 건고물 2g을 이용하여 상기 실시예 1-1의 디아이온 HP-20 컬럼과 동일한 방법을 수행하여 본 발명의 항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 꿩의 바람꽃, 인동속 식물 및 한국할미꽃 추출물(1.09g)을 제조하였다.
< 비교예 1. 비교 대상의 항암성 사포닌이 함유되어 있는 추출물 제조>
비교예 1-1. 한국할미꽃 추출물 1 제조
상기 실험예 1-2의 1) 한국할미꽃 자체 배지(Pk 배지)를 제조 후, 상기 실시예 1-1의 발효 과정을 제외한 나머지 과정을 통해 비교 대상의 한국할미꽃 추출물 1을 제조하였다.
비교예 1-2. 한국할미꽃 추출물 2 제조
상기 실험예 1-2의 1) 한국할미꽃 자체 배지(Pk 배지)를 37℃에서 교반하면서 2시간 동안 발효시킨 후, 이후 과정은 상기 실시예 1-1과 동일한 방법을 이용하여 비교 대상의 한국할미꽃 추출물 2를 제조하였다.
비교예 1-3. 꿩의 바람꽃 추출물 1 제조
상기 실험예 1-2의 2) 꿩의 바람꽃 자체 배지(Ar 배지)를 제조 후, 상기 실시예 1-1의 발효 과정을 제외한 나머지 과정을 통해 비교 대상의 꿩의 바람꽃 추출물 1을 제조하였다.
비교예 1-4. 꿩의 바람꽃 추출물 2 제조
상기 실험예 1-2의 2) 꿩의 바람꽃 자체 배지(Ar 배지)를 37℃에서 교반하면서 2시간 동안 발효시킨 후, 이후 과정은 상기 실시예 1-1과 동일한 방법을 이용하여 비교 대상의 꿩의 바람꽃 추출물 2를 제조하였다.
비교예 1-5. 인동속 식물 추출물 제조
상기 실험예 1-1의 7) 인동속 식물 추출물(Lj 추출물)을 상기 실시예 1-1의 발효 과정을 제외한 나머지 과정을 통해 비교 대상의 인동속 식물 추출물을 제조하였다.
비교예 1-6. 한국할미꽃 및 꿩의 바람꽃 추출물 제조
상기 실험예 1-2의 1) 한국할미꽃 자체 배지(Pk 배지)에 상기 실험예 1-1의 3) 꿩의 바람꽃 추출물(Ar 추출물) 4.1g을 혼합한 후, 37℃에서 교반하면서 2시간 동안 발효시키고, 이후 과정은 상기 실시예 1-1과 동일한 방법을 이용하여 비교 대상의 한국할미꽃 및 꿩의 바람꽃 추출물을 제조하였다.
비교예 1-7. 한국할미꽃 및 인동속 식물 추출물 제조
상기 실험예 1-2의 1) 한국할미꽃 자체 배지(Pk 배지)에 상기 실험예 1-1의 7) 인동속 식물 추출물(Lj 추출물) 3.9g을 혼합한 후, 37℃에서 교반하면서 2시간 동안 발효시키고, 이후 과정은 상기 실시예 1-1과 동일한 방법을 이용하여 비교 대상의 한국할미꽃 및 인동속 식물 추출물을 제조하였다.
비교예 1-8. 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물 제조
상기 실시예 1-1의 발효 과정을 제외한 나머지 과정을 통해 비교 대상의 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 제조하였다.
< 실험예 2. 추출물 내 항암성 사포닌 함량 확인>
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 추출물 내에 존재하는 항암성 사포닌의 함량을 확인하기 위해 고성능 액체 컬럼 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 수행하였다. 확인하고자 하는 항암성 사포닌은 1) 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β -D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranoside; 이하 H-gra라 함), 2)　헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside; 이하 H-g(1→4)g(1→3)ra라 함), 3) 올레아놀릭산 3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(Oleanolic acid 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranoside; 이하 O-gra라 함) 및 4) 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside; 이하 H-g(1→3)ra라 함)로 선택하였다.
상기 실시예 1 및 비교예 1의 각각의 추출물 10㎎을 HPLC용 메탄올 3.5㎖로 용해시키고, 0.45㎛의 필터를 통과시켜 여과액을 얻었다. 여과액 50㎕를 Spheriorb® S5ODS 컬럼에 주입하고 1.5㎖/분 유속으로 아세토니트릴(acetonitrile):증류수(3.4:6.6→4:6[v/v])의 농도구배로 조건으로 HPLC를 수행하였다. 그 결과 머무름 시간(retention time) 26.5분에서 H-g(1→4)g(1→3)ra 사포닌 피크가, 43.5분에서 H-gra 사포닌 피크가 나타났다. 또한, 상기와 같은 조건으로 HPLC를 수행하되, 용출 용매를 아세토니트릴:증류수(4.3:5.7[v/v]) 등용매 조건으로 수행하여 머무름 시간 18.5분에서 H-g(1→3)ra 사포닌 피크가, 27.1분에서 O-gra 사포닌 피크가 나타났다. 상기 각각의 사포닌에 해당되는 피크를 분석하여 각 추출물에 포함되어 있는 항암성 사포닌의 함량을 분석하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2019002861-appb-T000001
상기 표 1에서는 나타내지 않았으나, 상기 실험예 1-1의 식물 추출물을 실험예 1-2의 식물 자체 배지와 각각 혼합하여 실시예 1과 같이 가수분해 반응시키면 상기 표 1의 항암성 사포닌의 함량이 증가하는 것을 확인하였다.
< 실시예 2. 항암성 사포닌이 고농도로 함유되어 있는 추출물 및 항암제가 포함되어 있는 조성물 제조>
본 발명의 항암성 사포닌이 고농도로 함유되어 있는 추출물과 기존 항암제의 동시 투여를 통한 항암 효과를 확인하기 위해 조성물을 제조하였다.
항암제로는 데옥시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin, DPT)을 이용하였다. DPT 30㎎을 95%(v/v) 에탄올 100㎖에 녹이고, 이중 1㎖을 다시 95%(v/v) 에탄올 99㎖과 혼합하여 3㎍/㎖의 DPT용액을 만들었다. 이 용액을 DPT 원액으로 하였다.
또한, 상기 실시예 1-1 내지 실시예 1-3의 항암성 사포닌이 고농도로 함유되어 있는 추출물 10㎎을 생리식염수 9㎖로 용해시킨 후, 상기 3㎍/㎖의 DPT 1㎖와 혼합하여 하기 표 2의 실시예 2-1 내지 실시예 2-3의 조성물 제조하였다.
Figure PCTKR2019002861-appb-T000002
< 실험예 3. 항암 활성 확인>
상기 실시예 1 및 비교예 1의 항암성 사포닌을 고농도로 함유하는 추출물과 실시예 2의 항함성 사포닌이 고농도로 함유되어 있는 추출물 및 항암제가 포함되어 있는 조성물의 항암 활성을 확인하기 위해 고형암 유발 마우스 모델을 이용하였다.
상기 고형암은 암 세포가 자라면서 덩어리를 이룬 형태를 일컫는 것으로, 다양한 고형암의 종류가 존재한다. 그러나 고형암의 종류에 따른 항암 활성을 모두 확인하기 위해서는 시간 및 비용 측면에서 곤란성이 있다. 이에, 많은 연구자들이 고형암 치료 효과를 뒷받침하는 데 사용하고 있는 마우스의 피하에 암 세포주를 이식하여 제조한 고형암 유발 마우스 모델을 이용하였다.
체중이 20~23g인 4주령의 BDF1 수컷 마우스를 22±2℃, 65±5% 습도 조건으로 사육하였다. 사육한 실험군 당 5마리씩 무작위적으로 나뉘었고, BDF1 마우스의 왼쪽 앞 겨드랑이 피하에 고형암 유발을 위한 암 세포주로 루이스 폐암종 세포(lewis lung carcinoma cell, LLC)를 마우스 당 1×106개 세포를 이식하고, 24시간 동안 사육하였다. 24시간 후에 상기 실시예 1 및 비교예 1의 추출물 또는 실시예 2의 추출물 및 항암제가 포함되어 있는 조성물을 추출물의 투여량이 10㎎/㎏/일이 되도록 하여 2주간 복강 주사하였다.
이때, 암 세포를 이식하고, 추출물을 처리하지 않은 마우스 군을 음성대조군으로 하였고, 음성대조군의 암 부피가 약 2㎤ 정도 되었을 때부터 암 크기를 측정하였다. 암 성장 저해율은 하기 식 1에 따라 계산하였고, 약물 투여 후 7일 및 14일째의 암 성장 저해율을 확인한 결과를 하기 표 3 및 도 1에 나타내었다.
[식 1]
암 성장 저해율(%) = ((음성대조군의 평균 암 부피-투약군의 평균 암 부피)/음성대조군의 평균 암 부피)×100
Figure PCTKR2019002861-appb-T000003
상기 표 3 및 도 1에서 보여주듯이, 상기 실시예 1-1 내지 실시예 1-3 및 비교예 1-1 내지 비교예 1-8의 추출물의 양을 동일하게 투여한 경우, 투여 후 14일째의 암 성장 저해율이 실시예 1-1 내지 실시예 1-3의 추출물을 투여한 경우가 비교예 1-1 내지 비교예 1-8의 추출물을 투여한 경우보다 현저히 우수하다는 것을 확인하였고, 실시예 1-2 및 실시예 1-3의 추출물을 투여한 경우에는 이식한 암세포가 완전히 소멸된 마우스가 있음을 확인하였다.
또한, 실시예 1-1 내지 실시예 1-3의 추출물에 항암제로 이용하고 있는 DPT를 혼합한 상기 실시예 2-1 내지 실시예 2-3의 조성물을 투여한 마우스의 경우에는 암 성장 저해율이 실시예 1-1 내지 실시예 1-3의 추출물만 투여한 경우보다 높았으며, 이식한 암세포가 완전히 소멸된 마우스의 수도 증가한 것을 확인하였다.
상기 실험예 2 및 실험예 3의 결과를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 포함하는 조성물 또는 이들의 추출물에 두릅 또는 한국할미꽃 추출물을 추가로 포함하는 조성물이 우수한 항암 활성을 가지고 있고, 이러한 항암 활성이 우수한 추출물에는 H-g(1→4)g(1→3)ra, O-gra 및 H-g(1→3)ra의 항암성 사포닌의 함량이 증가되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 추출물에 기존 항암제를 함께 투여하는 경우 항암 활성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 항암성 사포닌을 고농도로 함유하고 있는 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물을 이용하여, 항암 활성이 우수한 항암제를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
< 제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 실시예 1-2의 추출물 20g을 각각 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 실시예 1-2의 추출물 100㎎을 생리식염수 100㎖에 용해하고, 세균을 제거할 수 있는 여과지를 이용하여 여과하여 주사액제를 제조하였다.

Claims (7)

  1. i) 식물에 증류수를 넣고 분쇄하여 식물 자체 배지를 제조하는 1단계;
    ii) 식물에 유기 용매를 가하여 식물 추출물을 제조하는 2단계;
    iii) 상기 1단계의 식물 자체 배지에 상기 2단계의 식물 추출물을 혼합하고 37℃에서 교반하면서 발효시키는 3단계;
    iv) 상기 3단계의 발효를 통해 얻은 발효물에 유기용매를 가하여 분획하는 4단계;
    v) 상기 4단계의 분획물을 컬럼 크로마토그래피에 가하여 용출액을 확보하는 5단계; 및
    vi) 상기 5단계의 용출액에 유기용매를 가하여 분획하여 얻은 분획물을 건조하는 6단계;
    를 통해 제조된 꿩의 바람꽃(Anemone raddeana) 및 인동속 식물(Lonicera species) 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 1단계의 식물 자체 배지는,
    식물에 증류수를 가하여 믹서기로 1차 분쇄하는 단계; 및
    상기 1차 분쇄물을 초음파를 가하여 2차 분쇄하는 단계;
    를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물은 한국할미꽃(Pulsatilla koreana) 자체 배지, 한국할미꽃 추출물 또는 두릅(Aralia elata) 추출물에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    상기 꿩의 바람꽃 및 인동속 식물 추출물은 항암성 사포닌의 함량이 15~110배 증가된 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항암성 사포닌은 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside), 올레아놀릭산 3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(Oleanolic acid 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranoside) 및 헤데라게닌 3-O-β-D-글루코피라노실-(1→3)-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노사이드(Hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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