KR100703597B1

KR100703597B1 - 타크린 유도에 의한 ＨｅｐＧ2 세포의 세포독성에 대한간보호 활성을 지닌 곰피 추출물 또는 그로부터 분리한플로로탄닌류를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR100703597B1
Application number: KR1020050056848A
Authority: KR
Inventors: 최재수; 윤나영; 김윤철; 남택정
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2005-06-29
Filing date: 2005-06-29
Publication date: 2007-04-16

Abstract

본 발명은 타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 대한 간 보호 활성을 갖는 곰피 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류의 화합물을 함유하는 간 보호 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 곰피 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류의 화합물은 타크린 (tacrine) 유도에 의한 간암세포주 Hep G2 세포의 세포독성을 효과적으로 방지하므로, 상기 조성물은 간독성 물질에 의한 간보호 약학조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

곰피, 간 세포독성 저해, 플로로탄닌류, 화합물, 간 보호제, 약학 조성물.

Description

타크린 유도에 의한 ＨｅｐＧ2 세포의 세포독성에 대한 간보호 활성을 지닌 곰피 추출물 또는 그로부터 분리한 플로로탄닌류를 함유하는 조성물{Composition comprising phlorotannins or the extract of Ecklonia stolonifera Okamura having hepatoprotective effect on Hep G2 cell cytotoxicity induced with tacrine}

본 발명은 곰피 조추출물, 비극성용매 가용 추출물 또는 그로부터 분리된 하기 화학식 1 내지 5로 표시되는 플로로탄닌류 (phlorotannins)의 화합물을 함유하는, 간독성 물질에 의한 간보호 약학조성물에 관한 것이다.

타크린 (1,2,3,4-tetrahydro-9-aminoacridine hydrochloride)은 아세틸콜린에스테라아제 (acetylcholinesterase, AChE)의 억제자이며, 신경전달매개체의 중요한 역할을 한다. 또한 알츠하이머 질환, 중증근무력증, 녹내장, 그리고 약리분야에서 신경제로 인한 부작용 회복 치료에 중점을 두고 있다(Doucet-Personeni et al., J. Med. Chem., 44, pp3203-3215, 2001). 타크린(tacrine)이 알츠하이머 질환 치료 를 위해 미국에서 처음으로 승인된 약물이기는 하지만, 장기간 치료 용량으로 약물을 복용하면 환자의 30~50%가 변형 혈청 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나아제 (glutamate pyruvate transaminase, GPT) 활성과 함께 가역적인 간독성을 나타내었다(Pan et al., Planta Med., 68, pp217-220, 2002). 또한, 타크린에 의한 간독성은 Hep G2 세포, 인간 간암 세포주에서 활성산소종 (ROS)의 생성에 관여한다고 생각된다(Osseni et al., Toxicol. in Vitro, 13, pp683-688, 1999). 많은 연구에서, 세스퀴테르펜 (sespuiterpenes), 쿠마린 (coumarins), 디아릴헥타노이드 (diarylheptanoids), 페놀성 화합물 등이 타크린 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 관한 간보호 활성을 나타낸다고 보고하였다(Song et al., Phytother. Res., 17, pp563-565, 2003; Oh et al., Planta Med., 68, pp748-749, 2002a; Planta Med., 68, pp463-464, 2002b; Cho et al., Planta Med., 67, pp750-751, 2001). 비록 많은 연구가 수행되었지만, 해조류 추출물인 곰피의 간보호효과와 활성 성분에 대한 연구는 밝혀지지 않고있다.

간보호 활성에 관한 연구는 주로 두 가지 경로에 초점을 맞추어 이루어진다 ; 한가지는 사염화탄소 (CCl₄), 아세트아미노펜 (acetaminophen), 티오아세트아마이드 (thioacetamide), 타크린 (tacrine), 그리고 루브라톡신 B (rubratoxin B)와 과산화수소 (H₂O₂)와 같은 독성 간독소의 해독반응 뿐만 아니라, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 (superoxide dismutase), 카탈라아제 (catalase), 그리고 글루타치온 퍼록시다아제 (glutathione peroxidase)와 같은 신체 항산화 방어계를 함께 평가하는 것이고 다른 하나는 간손상에 의해 방출된 혈청 글루타메이트 피루베이트 아미노기전이효소 (serum glutamate pyruvate transaminase, GPT)와 혈청 글루타메이트 옥살로아세테이트 아미노기전이효소 (serum glutamate oxaloacetate transaminase, GOT)를 포함하는 혈청조절효소의 수준과 활성을 평가하는 것이다. 시토크롬 P450 시스템과 관련된 사염화탄소 (CCl₄) 물질대사인 트리클로로메틸 프리 라디칼 (trichloromethyl free radical, CCl₃·)과 트리클로로메틸 퍼록시 라디칼 (trichloromethyl peroxy radicals, CCl₃OO·) 같은 자유 라디칼 (free radicals)에 대한 소거 그리고/또는 억제활성은 산화 방지에 대한 세포기관과 세포막에서의 간보호 활성과 연관지을 수 있을 것이다(Hsiao et al., J. Agric. Food Chem., 51, pp3302-3308, 2003 ; Song et al., J. Agric. Food Chem., 51, pp1571-1577, 2003).

곰피 (Ecklonia stolonifera Okamura)는 한국과 일본 등지에 분포하는 다년생의 다시마과에 속하는 갈조류로서 해안선을 따라 2~10 m 수심에서 자라며, 오래전부터 다시마, 미역 등과 함께 식용으로 이용되어져 왔다. 전통적으로 해조류는 항마취제, 항염증제, 습진, 통풍, 담석 등의 치료에 민간요법으로 사용되어오고 있다(Hoppe, HA., Marine Algae "In Pharmaceutical Science" vol.2, p9, 1982). 곰피의 성분으로는 플로로글루시놀 (phloroglucinol) (Lee JH. et al., Arch. Pharm. Res., 19, pp223-227, 1996), 플로로탄닌류 (phlorotannins) (Taniguchi K. et al., Nippon Suisan Gakkaishi, 57, pp2065-2071, 1991) 및 엑클로니아락톤류 (ecklonialactones) (Kurata K. et al., Chem. Lett., pp267-270, 1989; Kurata K. et al., Phytochemistry, 33, pp155-159, 1993)가 알려져 있다.

후쿠야마 등은 디벤조-1,4-디옥신 환 (dibenzo-1,4-dioxin ring)을 가진 플로로탄닌류는 항-플라스민 저해제 (anti-plasmin inhibitors) 작용을 한다고 보고하였으며(Fukuyama Y. et al., Chem. Pharm. Bull., 37, pp349-353, 1989 ; Fukuyama Y. et al., Chem. Pharm. Bull., 37, pp2438-2440, 1989 ; Fukuyama Y. et al., Chem. Pharm. Bull., 38, pp133-135, 1990 ; Fukuyama Y. et al., Chem. Lett., 739-742, 1985; Nakayama Y. et al., Agric. Biol. Chem., 53, pp3025-3030, 1989) 또한, 메틸-α-리놀레이트 (methyl-α-linolenate)의 산화 유도기를 연장시켜주는 효과가 나타났으며, 이는 플로로글루시놀 (phloroglucinol)의 중합도가 낮을수록 효과가 크다고 보고하였다 (Nakamura T. et al., Fish. Sci., 62, pp923-926,1996). 이와 반대로 플로로탄닌류의 중합도와 극성이 클수록 해양 초식동물의 섭식 저해 효과 (Hay ME. et al., Ann. Rev. Ecol. Syst., 19, pp111-145, 1988 ; Taniguchi K. et al., Nippon Suisan Gakkaishi, 57, pp2065-2071, 1991 ; Altena A. et al., Biochem. Syst. Ecol., 20, pp493-499, 1992 ; Boettcher AA. et al., Ecology, 74, pp891-903 1993 ; Targett NM. et al., Oecologia, 103, pp170-179, 1995)가 있는 것으로 보고되었다. 또한, 플로로탄닌류 중 플로로푸코푸로엑콜 A (phlorofucofuroeckol A)는 적조의 원인이 되는 미세조류에 대한 알지시달 효과 (algicidal effect)가 가장 큰 것으로 보고되었다(Nagayama K. et al., Aquaculture, 218, pp601-611, 2003).

그러나, 플로로탄닌류의 간독성에 대한 보호효과에 대해서는 아직까지 보고된 바는 없다. 따라서, 본 발명자는 타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 대한 간보호 활성을 갖는 새로운 추출물 및 플로로탄닌류의 화합물을 곰피에서 분리, 동정한 후, 그 보호 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 대한 간보호 활성을 갖는 새로운 추출물 및 화합물로서, 곰피 추출물 또는 이로부터 분리한 플로로탄닌류의 화합물을 함유하는, 간독성 물질로부터 간을 보호하는 약학조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 타크린 유도에 의한 간세포의 세포독성에 대한 간보호 활성을 갖는 곰피(Ecklonia stolonifera Okamura) 추출물 또는 그로부터 분리한 플로로탄닌류 화합물을 제공한다.

본 발명은 상기 곰피 추출물(Ecklonia stolonifera Okamura) 또는 이로부터 분리한 플로로탄닌류 화합물을 유효성분으로 함유하는, 간독성 물질에 의한 간손상을 예방 및 치료하기 위한 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 간독성물질로는 타크린, 알코올, 사염화탄소 (CCl₄), 아세 트아미노펜 (acetaminophen), 티오아세트아마이드 (thioacetamide), 타크린 (tacrine), 그리고 루브라톡신 B (rubratoxin B)와 과산화수소 (H₂O₂) 등을 포함한다.

상기 플로로탄닌류 화합물은 플로로글루시놀(phloroglucinol), 엑크스토로놀(eckstolonol), 엑크스토로놀 펜타아세테이트(eckstolonol pentaacetate), 엑콜(eckol), 플로로푸코푸로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A), 디엑콜(dieckol)로 이루어진 화합물군으로부터 선택된 하나 또는 하나이상의 화합물을 포함한다.

상기 곰피 추출물은 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물로써, 조추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물을 포함하며, 비극성용매 가용추출물은 n-헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매로, 바람직하게는 에틸 아세테이트로 추출한 것을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 곰피로부터 조추출물, 비극성용매 가용추출물 및 이로부터 분리되는 플로로탄닌류의 화합물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 곰피 조추출물은 곰피를 동결건조 후 마쇄하여 분말화 한 후, 곰피 건조 중량의 약 3 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 에탄올로 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 20 내지 70 ℃의 추출 온도에서 약 0.5시간 내지 2일, 바람직하게는 1 시간 내지 1일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 연속 추출하여 수득한 후, 감압여과하고 여액을 진공회전농축기로 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 40 내지 70 ℃에서 감압농축하여 물, 저급알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 곰피 조추출물을 수득할 수 있다.

상기 곰피 조추출물은 물에 현탁한 후, n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올 순으로 용매를 이용하여 추출하여 본 발명의 곰피 비극성용매 가용 추출물, 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 곰피 조추출물 즉, 곰피 에탄올추출물에 n-헥산: 물: 메탄올을 일정 비율, 바람직하게는 10: 9: 1로 혼합하여 n-헥산가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 다시 상기 수가용성 분획물을 디클로로메탄으로 추출하여 수가용성 분획물 및 디클로로메탄 가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 에틸 아세테이트를 가하여 에틸 아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 마지막으로 상기 수가용성 분획물을 부탄올로 추출하여 부탄올가용성 분획물과 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

상기 비극성 용매 가용성 분획물에 대하여 실리카겔 칼럼 크로마토크래피(SiO₂ column chromatography)를 수행할 수 있으며, 에틸 아세테이트 : 메탄올의 혼합용매, 바람직하게는 에틸 아세테이트: 메탄올의 50: 1의 혼합용매로 시간당 일정용량, 바람직하게는 1000 ㎖의 속도로 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 F1 부터 F10까지 10개의 분획물을 수득할 수 있다.

상기 F1 분획물은 다시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 헥산 : 에틸 아세테이트 1:1의 혼합용매로 분리한 후, 칼럼 크로마토그래피에서 농도기울기 용출로 20 % ~ 100 % 메탄올 용액을 사용하여 분리하고, 세파덱스로 정제하여 상기 1 내지 6의 화학식으로 표시되는 화합물을 분리 및 동정할 수 있다.

본 발명은 곰피로부터 조추출물, 비극성용매 가용추출물 및 이로부터 분리되는 플로로탄닌류의 화합물을 분리, 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 간독성물질에 대해 상기 방법으로 수득된 곰피 추출물 및 그로부터 분리된 상기 플로로탄닌류 (phlorotannins)의 화합물을 함유하는 간보호 약학조성물을 제공한다.

상기에서 수득된 곰피 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류 화합물의 간독성물질에 대한 간보호 약학조성물로써의 효능을 조사하기 위하여, 간암세포주인 Hep G2 세포에서 알츠하이머 질환의 치료에 사용하는 타크린으로 유발된 세포독성에 대한 간보호효과를 측정해 본 결과, 본 발명에 따른 곰피 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류의 화합물이 Hep G2의 세포독성에 대한 간보호효과가 효과적으로 나타남을 확인하였다.

본 발명의 곰피 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류 화합물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 곰피 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류의 화합물을 함유 하는, 간독성물질에 대한 간보호 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.5 % ~ 50 %중량으로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라 틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 곰피 조추출물의 제조

본 발명에 사용한 곰피는 부산시 기장군 대변연안 앞 바다에서 채집하여 사용하였다. 곰피는 동결건조 후 마쇄하여 얻은 분말 3 ㎏을 에탄올 10 ℓ를 넣고 70 ℃에서 일정시간 간격(12h, 6h, 3h)으로 3회 반복하여 환류냉각 추출한 후 여지(와트만사, 미국)로 감압여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 40 ℃에서 에탄올을 제거한 후 추출된 잔사로서 곰피 조추출물 700 g을 수득하였으며, 이 중 2 g을 취하여 세포독성에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 2. 곰피 헥산 가용 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 곰피 조추출물 700 g에 헥산 : 물 : 메탄올 = 10: 9: 1의 혼합용매 4 ℓ를 가하여 혼합한 후 3~4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 ℓ 및 헥산가용성 분획물 2 ℓ를 얻은 후 헥산가용성 분획물을 건조하여 헥산가용 추출물 27.93 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이 중 2 g을 취하여 세포독성에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 3. 곰피 디클로로메탄 가용 추출물의 제조

상기 실시예 2에서 얻은 수가용성 분획물 2 ℓ에 디클로로메탄 2 ℓ를 가하여 혼합한 후 3~4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 ℓ 및 디클로로메탄 가용성 분획물 2 ℓ를 얻은 후, 이 디클로로메탄 가용성 분획물을 건조하여 디클로로메탄 가 용 추출물 25.58 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이 중 2 g을 취하여 세포독성에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 4. 곰피 에틸아세테이트 가용 추출물의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 수가용성 분획물 2 ℓ에 에틸아세테이트 2 ℓ를 가하여 혼합한 후 3~4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 ℓ및 에틸아세테이트 가용성 분획물 2 ℓ를 얻은 후, 이 에틸아세테이트 분획물을 건조하여 에틸아세테이트 가용 추출물 24.99 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이 중 2 g을 취하여 세포독성에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 5. 곰피 부탄올 가용 추출물의 제조

상기 실시예 4에서 얻은 수가용성 분획층 2 ℓ에 부탄올 2 ℓ를 가하여 혼합한 후 3～4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 ℓ및 부탄올 가용성 분획물 2 ℓ를 얻은 후, 수가용성 분획물 및 부탄올 가용성 분획물을 건조하여 수가용 추출물 및 부탄올 가용 추출물 99.59 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이 중 2 g을 취하여 세포독성에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 6. 플로로탄닌류 화합물의 분리

상기 실시예 4의 곰피 에틸아세테이트 가용 추출물 99.59 g을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 이 때 전개용매로서 에틸 아세테이트 : 메탄올의 50 :1의 혼합용매를 사용하였고, 고정상으로는 키에셀 겔 60 (Kiesel gel 60, 230-400 메쉬)을 사용하여 시간당 1000 ㎖씩 분획을 수행하여 10개의 하부분획물로 나눈 후, 각각의 분획물의 활성을 측정하여 그중 가장 활성이 뛰어난 F1 분획물을 용매로는 헥산 : 에틸 아세테이트= 1:1의 혼합용매를 사용하였고, 고정상으로는 키에셀 겔 60 (Kiesel gel 60, 230-400 메쉬)을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행한 다음, RP-18 CC를 고정상으로 리크로프렙 (Lichroprep, Merck사, Germany)을 사용하고, 용매로는 20 % ~ 100 % 메탄올 용액을 사용하여 농도 기울기 용출로 분리한 다음, 세파덱스 LH-20 (st. Louis, MO, 시그마 사)로 정제하여 하기 기재한 바와 같은 플로로탄닌류의 화합물인 1 내지 6을 분리하였다. 각각의 화합물을 핵자기공명 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 기기 및 질량분석기 (Mass Spectrometer, MS) 등과 같은 각종 분석기기로 분석한 결과는 하기와 같다

(1) 화합물 1 : 플로로글루시놀(phloroglucinol)

물질의 성상: 흰색 분말.

물질의 분자식: C₆H₆O₃.

EI-MS : m/z (R. int): 126(100) [M⁺].

IR (KBr) cm-1: 3481, 1617, 1499, 1419.

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): 5.78(3H, s).

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): 160.9, 96.3.

(2) 화합물 2 : 엑크스토로놀(eckstolonol)

물질의 성상: 미흰색 분말.

물질의 분자식: C₁₈H₁₀O₉.

HRFAB-MS: Found, m/z 370.0324 [M]⁺, Calcd for C₁₈H₁₀O₉, m/z 370.0325.

IR (KBr) cm-1: 3243, 1635, 1518, 1494, 1396, 1281, 1243, 1207, 1154, 1118, 1089, 1012, 810.

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆): 9.77(C1-OH), 9.64(C9-OH), 9.60 (C6-OH), 9.27(C3-OH), 9.26(C11-OH), 6.10(1H, s, H-7), 6.04(1H, d, J=2.81 Hz, H-2), 6.01(1H, d, J=2.66 Hz, H-10), 5.84(1H, d, J=2.66 Hz, H-4), 5.82(1H, d, J=2.66 Hz, H-12).

¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d ₆): 153.3(C-3), 153.0(C-11), 146.1(C-1), 146.0(C-9), 142.1(C-4a), 141.7(C-12a), 140.1(C-6), 137.2(C-7a), 131.6(C-13b), 125.9(C-5a), 122.7(C-8a), 122.5(C-13a), 122.3(C-14a), 98.8(C-2, 10), 97.6(C-7), 93.9(C-4, 12).

(3) 화합물 2a : 엑크스토로놀 펜타아세테이트(eckstolonol pentaacetate)

IR (KBr) cm-1: 1769, 1506, 1477, 1371, 1193, 1079, 1021, 885. EI-MS m/z (R. int.): 580(M⁺, 21), 538(45), 496(47), 454(72), 412(52), 370(100), 341(30).

¹H-NMR (400 MHz, CDC_l3 + DMSO-d ₆): 1.59(3H, s), 1.61(3H, s), 1.64(3H, s), 1.65(3H, s), 1.73(3H, s), 5.80(1H, s), 5.96(1H, d, J=2.62 Hz), 5.97(1H, d, J=2.62 Hz), 6.00(1H, d, J=2.62 Hz), 6.02(1H, d, J=2.62 Hz).

(4) 화합물 3 : 엑콜(eckol)

물질의 성상: 무정형 분말.

물질의 분자식: C₁₈H₁₂O₉.

양성 FAB-MS m/z: 372 [M]⁺.

¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD): 5.93(3H, s), 5.94(2H, s), 6.13(1H, s).

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): 162.4, 160.7, 150.0, 147.7, 147.6, 144.7, 143.8, 139.0, 126.1, 125.3, 125.1, 100.3, 99.9, 98.2, 96.3, 95.9.

(5) 화합물 4 : 플로로푸코푸로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A )

물질의 성상: 무정형 분말.

물질의 분자식: C₃₀H₁₈O₁₄.

양성 FAB-MS m/z: 602 [M]⁺.

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): 6.63(1H, s), 6.40(1H, s), 6.26(1H, s), 5.97(2H, d, J=2.08 Hz), 5.94(1H, t, J=1.88 Hz), 5.92(1H, t, J=1.98 Hz), 5.88(2H, d, J=2.08 Hz).

¹³C-NMR(100 MHz, CD₃OD): 162.67, 162.64, 161.00, 160.97, 153.99, 152.50, 151.96, 149.07, 149.03, 146.74, 144.71, 139.19, 136.15, 128.89, 125.86, 125.56, 123.17, 106.15, 106.11, 100.78, 100.22, 98.60, 98.48, 97.03, 96.24, 96.21.

(6) 화합물 5 : 디엑콜(dieckol)

물질의 성상: 무정형 분말.

물질의 분자식: C₃₆H₂₁O₁₈. 양성

FAB-MS m/z: 742 [M]⁺.

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): 6.15(1H, s), 6.13(1H, s), 6.09(2H, s), 6.06(1H, d, J=2.85 Hz), 6.05(1H, d, J=2.85 Hz), 5.98(1H, d, J=2.76 Hz), 5.95(1H, d, J=2.76 Hz), 5.92(3H, s).

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): 162.67, 160.95, 158.61, 156.81, 155.33, 153.19, 148.14, 148.09, 147.92, 147.71, 145.10, 144.95, 144.20, 144.10, 139.44, 139.27, 127.28, 127.00, 126.46, 126.41, 125.67, 125.45, 125.38, 100.67, 100.56, 100.30, 100.19, 98.47, 97.02, 96.65, 96.57, 96.17.

실험예 1. 타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 대한 곰피 조추출물 및 각 용매 분획물의 간보호 활성

타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 대한 곰피 조추출물 및 각 용매 분획물의 간보호 활성 실험은 Benoit (Benoit GG et al., Biochem Pharmacol., 7(53), pp423-427, 1997) 등의 방법을 약간 변형하여 측정하였다.

먼저 Hep G2 세포 (인간 간암세포, American Type Culture Collection)를 10% heat-inactivated FBS, 페니실린 (penicillin) G 100 IU/ml, 스트렙토마이신 (streptomycin) 100 ㎍/㎖을 첨가한 RPMI에서 배양 (37 ℃, 50% CO₂)한 후 세포 수를 세어 2×10⁵ 세포수/웰(well) 이 되도록 희석하였다. 각 웰에 2×10⁵ 세포수/웰 농도로 100 ㎕씩 접종하고 세포 독성을 평가하기 위해 기존배지를 1 mM 타크린 (tacrine)을 넣은 배지로 교체 또는 타크린을 넣지 않은 기존배지 (control)을 넣어 3시간 배양 (37 ℃, 50% CO₂)하였다. 배양한 플레이트 (plate)에 각 농도별 (0.1, 1, 10, 50, 그리고 100 ㎍/㎖) 실시예 1에서 수득한 곰피 조추출물 (에탄올 추출물) 및 실시예 2 내지 5에서 수득한 각 용매 분획물을 넣어 배양한 후, 흡광도 (550 nm)를 측정하였다. 간보호 활성은 하기의 수학식 1으로 구하였으며 세포독성 에 대한 % 저해율로 표현하였다. 실리빈 (Silybin)을 양성대조군으로 사용하였고 선회귀방정식을 사용하여 통계처리 하였다.

% 저해율 = 1-(시료의 흡광도- 대조군 흡광도)/표준 흡광도 ×100

그 결과, 표 1에서 나타낸 바와 같이 에틸아세테이트 가용성 분획물에서 IC₅₀치가 195.2 ㎍/㎖로 탁월한 활성을 나타내었다.

시료	IC₅₀ (㎍/㎖)
곰피 조추출물	198.1
곰피 n-헥산 가용성 분획물	>300
곰피 디클로로메탄 가용성 분획물	>300
곰피 에틸 아세테이트 가용성 분획물	195.2
곰피 부탄올 가용성 분획물	>300
곰피 수가용성 분획물	>300
실리빈	50.0

실험예 2. 타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 대한 5가지 플로로탄닌류 화합물의 간보호 활성저해 효과

타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 대한 상기 실시예 6에서 수득된 5가지 플로로탄닌류 화합물의 간보호 활성을 상기 실험예 1과 같은 방법으로 실시하여, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

하기 표 2에서 알 수 있는 것처럼, 5가지 플로로탄닌류 화합물중에서 플로로글루시놀 (phloroglucinol, 화합물 1), 엑콜 (eckol, 화합물 3) 및 디엑콜 (dieckol, 화합물 5)은 100 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 효과가 없었으나 엑크스토로놀 (eckstolonol, 화합물 2)과 플로로푸코푸로엑콜 A (phlorofucofuroeckol A, 화합물 4)은 Hep G2 세포에서 타크린 (tacrine) 유도 세포독성에 대한 간보호 활성이 대조화합물인 실리빈과 유사하게 강력한 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다.

화합물	IC₅₀ (㎍/㎖)
플로로글루시놀 (1)	>100
엑크스토로놀 (2)	62.0
엑콜 (3)	>100
플로로푸코푸로엑콜 A(4)	79.2
디엑콜 (5)	>100
실리빈	50.0

비교예 1. 타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 대한 여러 가지의 해초류의 간보호 활성 효과

타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성에 대한 여러 가지의 해초류의 간보호 활성을 실험예 1의 방법을 이용하여 측정해 보았고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

하기 표 3에서 알 수 있는 것처럼, 녹조류 2종, 갈조류 10종, 홍조류 6종에서 유일하게 곰피에서 IC₅₀치가 198.1 ㎍/㎖로서 타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포에서 세포독성에 대한 간보호 활성 효과를 나타내었다.

IC₅₀(㎍/㎖)
녹조류	실파래(Enteromorpha crinita)	>300
녹조류	구멍갈파래(Ulva pertusa Kjellman)	>300
갈조류	톳(Hizikia fusiformis)	>300
	다시마(Laminaria japonica)	>300
	모자반(Sargassum fulvellum)	>300
	지충이(Sargassum thunbergii (Mertens) O. Kuntze)	>300
	곰피(Ecklonia stolonifera Okamura)	198.1
	괭생이모자반(Sargassum horneri)	>300
	뜸부기(Pelvetia siliquosa)	>300
	미역(Undaria pinnatifida)	>300
	모자반종(Sargassum species)	>300
	지충이(Sargassum thunbergii)	>300
홍조류	돌가사리(Gigartina tenella)	>300
	부채살(Gymnogongrus flabelliformis)	>300
	진두발(Chondrus ocellatus)	>500
	개도박(Pachymeniopsis lanceolata)	>300
	서실(Chondria crassicaulis)	>300
	김(Porphyra tenera)	>300
대조군	실리빈	50.0

하기에 상기 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

본 발명의 곰피 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류의 화합물은 타크린 (tacrine) 유도에 의한 Hep G2 세포의 세포독성을 효과적으로 방지하므로, 간독성 물질에 의한 간보호 약학조성물로 사용할 수 있다.

Claims

엑크스토로놀(eckstolonol) 또는 플로로푸코푸로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A)를 유효성분으로 함유하는 타크린에 의한 간손상 예방 및 치료용 약학조성물.
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