KR100459088B1 - 간세포 보호활성을 나타내는 비자나무의 수피로부터분리한 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 및 이를유효성분으로 함유하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간세포 보호활성을 나타내는 비자나무 (Torreya nucifera)의 수피로부터 분리한 다이벤질부틸락톤 리그난 (dibenzylbutyllactone lignan) 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염과 이를 유효성분으로 함유하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는화학식 1의 구조를 갖는 다이벤질부틸락톤 리그난계 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염과 이들 화합물을 단독으로 또는 혼합하여 함유하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난계 유도체는 간세포 보호활성이 우수하고 간 질환이 간 섬유화로 이행되는 것을 효과적으로 억제하므로 간세포를 보호하고 급·만성 간 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식에서 R¹, R², R³, R⁴및 R⁵는 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 메톡시기이다.

Description

간세포 보호활성을 나타내는 비자나무의 수피로부터 분리한 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용 조성물{DIBENZYLBUTYLLACTONE LIGNAN DERIVATIVES HAVING LIVER CELL PROTECTIVE ACTIVITY WHICH IS PURIFIED FROM TORREYA NUCIFERA CORTEX AND COMPOSITIONS CONTAINING SAME FOR PROTECTING LIVER CELL AND TREATING LIVER DISEASE}

본 발명은 간세포 보호활성을 나타내는 비자나무 (Torreya nucifera)의 수피로부터 분리한 다이벤질부틸락톤 리그난 (dibenzylbutyllactone lignan) 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염과 이를 유효성분으로 함유하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는화학식 1의 구조를 갖는 다이벤질부틸락톤 리그난계 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염과 이들 화합물을 단독으로 또는 혼합하여 함유하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

화학식 1

상기 식에서 R¹, R², R³, R⁴및 R⁵는 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 메톡시기이다.

간 질환은 바이러스, 약물의 오남용에 의한 독성 및 다양한 원인에 의하여 간염의 형태로 발병하는데, 완전히 치유되지 못한 경우에 만성 간염으로 이행되어결국에는 간경변이나 간암으로 진전되는 것으로 알려져 있다. 우리 나라의 경우 음주, 흡연 등으로 인한 잘못된 생활습관 때문에 선진국보다 간 질환에 의한 사망률이 높은 편이다. 또한, 국민의 8 내지 12%인 400만 명 이상이 간염 보균자로 활동성 간염 이환율이 200만 명을 넘을 것으로 추산되고 있어서 간 질환 발병율로 볼 때 후진국의 위치를 벗어나지 못하고 있다. 특히 주목할 만한 사실은 우리 나라 40대 남성의 사망 원인 중 17%로서 가장 높은 사망률을 나타내는 질환이 간 질환이라는 점이다. 따라서, 간 질환은 사회적으로 중요한 위치를 차지하는 중장년층에 발병하여 개인의 사회적 노동력을 무력화시키는 동시에 많은 치료비 지출을 부수적으로 동반시켜 사회·경제적으로 막대한 손실을 유발하기 때문에 새로운 간 질환 치료제 개발의 필요성과 중요성이 더욱 증대되고 있다.

지금까지 우리 나라뿐만 아니라 여러 선진국에서는 간 질환 치료제의 개발에 많은 노력을 기울이고 있으나, 현재 임상에서 사용되고 있는 간 질환 치료제는 인터페론을 제외하고는 장기간의 시장점유를 누린 실리마린 (silymarin) 제제나 오미자 성분에서부터 합성하여 개발된 DDB (비페닐디메틸카르복실레이트, biphenyldimethylcarboxylate)가 식물에서 유래된 간세포 보호제로 시판되고 있으며, 최근 라미부딘이 간염치료제로 알려져 있을 뿐 별다르게 개발된 것이 없는 실정이다. 국내의 경우에는 간 질환자의 수가 많기 때문에 민간에서 유래한 간 보호제가 빈용되고 있으나, 민간 의료에서 사용되는 천연물 유래 간 보호제는 부분적으로 그 민간 약물이 유효성을 나타낸다 하더라도 그 유효 성분의 함량이 미량이고 여타 성분으로부터 발생할 수 있는 부작용의 위험을 내포하고 있다. 따라서 천연물로부터 간 보호활성을 갖는 물질만을 분리하여 그 작용기전을 명확히 밝히는 연구가 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 비자 (榧子,Torreya nucifera)는 주목과 (Taxaceae)에 속하는 상록 침엽교목으로 전세계적으로 우리 나라와 일본에만 제한되어 분포한다. 성장이 너무 느려 나이테가 잘 보이지 않는 것이 특징이며, 우리 나라에서는 천연기념물로 지정되어 보호되고 있다. 비자나무는 식용, 관상용, 공업용, 약용으로 쓰이고 종자는 먹거나 기름을 짜내서 이용한다. 또한, 한방과 민간에서는 과실을 구충, 발모, 건위, 조경, 장출혈 등에 약재로 이용하고 목재는 건축재, 기구재, 선박용재 등에 사용한다 (김태정,한국의 자원식물 Ⅰ, p40, 서울대학교 출판부, 1996; 육창수,아세아 생약도감, p23, 도서출판 경원, 1997). 비자나무의 잎과 종자에서 분리·보고된 성분으로는 세스퀴터페노이드 (sesquiterpenoids, Sakai, T. et al.,Bull. Chem. Soc. Japan, 38:381, 1965), 라브단 (labdane) 계열과 아비에탄 (abietane) 계열 디터페노이드 (diterpenoids, Sayama, Y. et al,Agric. Bio. Chem., 35:1068, 1971; Harrison, L. and Asakawa, Y.,Phytochemistry, 26:1211, 1987), 그리고 플라보노이드 (flavonoids, Kariyone, T. and Sawaka, T.,Ykugaku Zasshi,78:1010, 1958) 등이 있다.

이에 본 발명자들은 천연물로부터 간 질환 치료제로 개발될 수 있는 후보물질을 분리하고자 예의 노력한 결과, 비자나무의 수피로부터 추출한 메탄올 추출물이 유의성 있는 간세포 보호 활성을 나타내고 간 질환의 간 섬유화로의 이행을 효과적으로 억제하므로 간세포를 보호하고 급·만성 간 질환을 예방 및 치료하는데유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 간세포 보호활성을 나타내는 천연물로부터 분리되고, 간세포 보호 및 급·만성 간 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있는 물질을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체를 비자나무 수피의 디클로로메탄 분획으로부터 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리·정제하는 과정을 나타낸 것이고,

도 2는 비자나무 수피로부터 분리·정제된 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 간 섬유화 억제 활성을 측정하기 위하여화학식 2의 악티제닌,화학식 3의 트락실라제닌 및화학식 4의 4'-디메틸트락실라제닌이 간 방사상 세포 (hepatic stellate cells)의 증식에 미치는 영향을 MTT 분석으로 조사한 결과이다.

-◆-; 악티제닌 -■-; 트락실라제닌

-▲-; 4'-디메틸트락실라제닌 -○-; 실리빈

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간세포 보호활성을 나타내는 비자나무 (Torreya nucifera)의 수피로부터 분리한, 하기화학식 1의 구조를 갖는 다이벤질부틸락톤 리그난 (dibenzylbutyllactone lignan) 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 간세포 보호활성을 나타내는 비자나무의 수피로부터 분리한, 하기화학식 1의 구조를 갖는 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.

화학식 1

상기 식에서 R¹, R², R³, R⁴및 R⁵는 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 메톡시기이다. 본 발명에서 더욱 바람직한 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체는 악티제닌, 트락실라제닌 또는 디메틸트락실라제닌이다.

상기 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체는 비자나무의 수피로부터 저급 알콜을 이용하여 통상의 추출방법으로 추출하여 얻을 수 있다.

저급 알콜 추출방법은 건조시킨 비자나무의 수피에 1 내지 5배, 바람직하게는 2 내지 4배의 저급 알콜을 가하고 20 내지 80℃, 바람직하게는 30 내지 40℃로 가열하면서 1 내지 3시간 동안, 바람직하게는 1.5 내지 2시간 동안 초음파 추출하고 냉각 및 여과한 후 회전증발기를 이용하여 감압농축하여 비자나무의 수피로부터 저급 알콜 추출물을 얻으며, 이때 여과 후 남은 잔사에 대하여 여과 과정을 2회 이상 반복하여 실시할 수 있다. 추출용매인 저급 알콜로는 메탄올, 메탄올 수용액, 에탄올, 에탄올 수용액, 노말프로판올, 이소-프로판올, 노말 부탄올, 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 70 내지 100% 메탄올이 가장 바람직하다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 100% 메탄올을 사용하여 비자나무의 수피로부터 메탄올 추출물을 얻는다.

이로부터 얻은 비자나무 수피의 저급 알콜 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, 디클로로메탄 (dichloromethane, CH₂Cl₂)으로 분획하여 디클로로메탄분획과 물 분획을 얻는다. 이때, 디클로로메탄 대신에 클로로포름 또는 에틸 아세테이트 등이 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 비자나무의 수피로부터 추출한 디클로로메탄분획은 사염화탄소 및 갈락토사민으로 독성이 유도된, 일차배양한 흰쥐의 간세포에 대하여 간세포 보호활성을 나타낸다.

간세포 보호활성이 확인된 비자나무 수피의 디클로로메탄분획을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (silica gel column chromatography)를 수행하여 유의성 있게 간세포 보호활성을 나타낸 소분획으로부터 화합물 1, 2 및 3을 각각 분리하였다.

간세포 보호활성이 뛰어난 화합물 1, 2 및 3을 이화학적 및 분광학적으로 분석한 결과, 비자나무 수피의 메탄올 추출물로부터 분리·정제된 화합물은 모두 상기화학식 1의 구조를 갖는 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체로 결정되었다.

다이벤질부틸락톤 리그난 유도체는 하기와 같은 이화학적 및 분광학적 특징을 가지고 있다: 아니스알데하이드-황산 발색시약에 의해 진한 갈색으로 발색하고 드라겐도르프 발색시약에 의해 강한 오렌지색으로 발색한다. IR 스펙트럼에서는 3500 cm^-1의 OH 피크와 1765 cm^-1의 γ-락탐 (γ-lactone) 카보닐기 (carbonylgroup)에 의한 피크가 확인되며, 방향족 C=C 결합에 의한 1600, 1520 cm^-1의 피크들도 관찰된다.¹H-NMR 스펙트럼에서는 4 내지 6개의 방향족 수소들에 의한 피크가 관찰되며 2 내지 5개의 메톡시 그룹에 의한 피크들도 관찰된다. 한편, γ-락탐 링의 메틸렌 수소의 피크는 4.08 ppm과 3.82 ppm 근처에서 이중 중복 (double doublet)으로 나타난다. 이 외에 2.89, 2.84, 2.58, 2.51, 2.44 ppm 근처의 피크들은 특징적인 다이벤질부틸락톤 링의 지방족 수소 피크들을 나타낸다.¹³C NMR 스펙트럼에서는 178 ppm 근처에서 γ-락톤 링의 카보닐 수소의 피크가 나타나며 12개의 방향족 링 탄소의 피크들도 확인된다. γ-락톤 링의 메틸렌 탄소는 71 ppm 근처에서 볼 수 있으며 방향족 메톡시 탄소들은 55 ppm 근처에서 관찰된다.

다이벤질부틸락톤 리그난 유도체로 결정된 각각의 화합물을 구조 분석한 결과, 화합물 1은화학식 2의 구조를 갖는 무색 액상형태의 (-) 악티제닌 (arctigenin)으로, 화합물 2는화학식 3의 구조를 갖는 무색 액상형태의 (-) 트락실라제닌 (traxillagenin)으로, 화합물 3은화학식 4의 구조를 갖는 백색 분말형태의 (-)-4'-디메틸트락실라제닌 (demethyltraxillagenin)으로 확인되었다.

비자나무 수피로부터 분리·정제된 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 약학적으로 허용가능한 염은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다.

산 부가염은 약학적으로 허용가능한유리산 (free acid)을 사용하여 만들 수 있다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열한 후 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산 (maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산 (citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산 (glycollic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산 (glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 하이드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

상기 추출방법에 의해 비자나무의 수피로부터 분리·정제된 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체가 간세포 보호활성 및 간 섬유화 억제활성을 나타내는지 조사하기 위하여 세포실험을 수행하였다. 본 발명에서는 간 손상 방법으로 가장 많이 사용되고 있는 사염화탄소 유도법 (Aniya, Y., et al.,Biol. Pharm. Bull., 23(3): 309-312, 2000) 및 갈락토사민 유도법 (Kiso, Y. et al,J. Nat. Prod., 46:651, 1983b)을 사용하였는데, 흰쥐로부터 분리한 간세포에 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체인 화합물 1, 2 및 3을 각각 투여한 후 사염화탄소 또는 갈락토사민을 처리하여 급성 간세포 독성을 유발시키고 혈청 중 GPT (glutamate pyruvatetransaminase)의 활성을 측정함으로써 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 간세포 보호활성을 측정하였다. 또한, 근섬유아세포로 전이된 간 방사상 세포 (hepatic stellate cells, HSCs)가 간 섬유화 과정에서 가장 핵심적인 역할을 담당하는 세포로 알려져 있으므로 상기 세포의 증식을 억제하게 되면 간 섬유화의 진행을 막을 수 있을 것으로 판단하고 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체인 화합물 1, 2 및 3 각각을 흰쥐로부터 분리하여 근섬유아세포로 전이된 HSCs 세포에 투여한 후 MTT 분석으로 생존율 (증식율)을 측정하여 증식 억제 정도를 관찰하였다.

실험 결과, 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체는 사염화탄소 및 갈락토사민에 의해 세포 독성이 유발된 실험군에서는 유의성 있는 간세포 보호활성을 나타내어 기존에 간 질환 치료제로 사용되고 있는 실리빈과 동등한 수준의 효과를 보였다. 또한, 화합물 1 및 2는 농도 의존적 양상으로 유의성 있게 HSCs의 증식 억제 활성을 보여 동일 농도에서 실리빈의 활성보다 탁월한 증식 억제율을 나타내었다. 그러나, 화합물 3은 HSCs의 증식에 별 영향을 미치지 않았는데, 이로부터 상기화학식 1의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 구조 중 페닐기 (phenyl group)의 4'-C 위치의 메톡실기 (methoxyl group)가 HSCs의 증식억제 활성에 중요함을 알 수 있었다.

상기 결과를 통하여, 비자나무 수피로부터 분리된 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체들인 악티제닌, 트락실라제닌, 4'-디메틸트락실라제닌은 사염화탄소 및 갈락토사민으로 유도되는 독성으로부터 간세포를 보호하는 작용을 나타내며, 만성 간 질환의 간 섬유화 이행에 관여하는 HSCs의 증식을 효과적으로 억제함으로써 간세포를 보호하고 급·만성 간 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기에서 우수한 간 보호작용을 나타내면서도 인체 안전성이 매우 높은 것으로 입증된 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 및 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 약학 조성물은 간세포 보호 및 간 질환 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 대체 치료의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 상기 약학 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조대체 치료, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염의 통상적인 1일 투여량은 0.001 내지 10 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<참조예 1> 흰쥐의 간세포 배양

스프라그-다우리 (Sprague-Dawley)계 흰쥐를 서울대학교 동물사육장에서 공급받아 서울대학교 약학대학 실험동물실에서 사육하였다. 사육장의 환경은 실내온도를 22 ± 5℃로 유지하고 조명시간을 아침 7시에서 저녁 7시로 고정하였으며, 사료는 조단백 23.2%, 조지방 4.0%, 조섬유 6.0%, 조회분 10.0%, 조칼슘 0.6%, 조인 0.4% 등이 함유된 고형사료 (삼양사)를 사용하였다. 흰쥐의 간세포는 베리와 프랜드의 방법 (Berry, M. N. and Friend, D. S.,J. Cell. Biol., 43:506, 1984)을 약간 수정한 2단계 콜라게나아제 (collagenase) 관류법을 이용하여 분리하였다 (Kleiman, H. K. and Hartin, S. R.,Anal. Biochem., 94:308, 1979; Kang, S. Y. et al,Arch. Pharm. Res., 21:718, 1998). 분리한 간세포 현탁액을 5×10⁵세포/㎖ 농도로 희석하여 콜라겐을 미리 도포한 배양 용기에 이식한 후 일정한 습도와 온도가 유지되는 37℃ 배양기에서 공기 (95%)와 CO₂(5%)의 혼합기체를 계속 공급하면서 배양하였다.

<참조예 2> 사염화탄소에 의한 간세포의 독성유도

상기 참조예 1에서와 같이 간세포를 1.5시간 배양한 후 새로운 배양액으로 갈아주고 다시 24시간 동안 배양하여 키소 등의 방법 (Kiso, Y. et al,Planta Med., 49:222, 1983a)을 약간 수정한 방법으로 사염화탄소에 의한 세포독성을 유도하였다 (Kang, S. Y. et al,Arch. Pharm. Res., 21:718, 1998).

<참조예 3> 갈락토사민에 의한 간세포의 독성유도

상기 참조예 1에서와 같이 간세포를 배양한지 1.5시간이 지난 후 배양액을 1.5 mM 갈락토사민 (galactosamine)을 함유한 배양액으로 갈아준 후 14시간 동안세포를 배양하여 세포독성을 유도하였다 (Kiso, Y. et al,J. Nat. Prod., 46:651, 1983b).

<실시예 1> 비자나무 수피로부터 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 분리

(1-1) 비자나무 수피의 메탄올 추출물 제조

건조된 비자나무 수피 3.1 ㎏에 15 ℓ의 100% 메탄올을 가하고 37℃로 가열하면서 2시간 동안 초음파 추출하고 냉각 및 여과한 후 회전증발기를 이용하여 감압농축하여 비자나무 수피의 메탄올 추출물 750 g을 얻었다. 이로부터 얻은 비자나무 수피의 메탄올 추출물 750 g을 증류수에 현탁시킨 후, 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)으로 분획하여 디클로로메탄분획 (120 g)과 물 분획 (610 g)을 얻었다 (도 1).

비자나무의 수피로부터 추출한 디클로로메탄분획을 참조예 1 내지 3에서 사염화탄소 및 갈락토사민으로 독성이 유도된, 일차배양한 흰쥐의 간세포에 처리한 후 상기 참조예 1 및 2의 방법에 따라 간세포 보호활성을 확인하였다.

(1-2) 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 분리

사염화탄소 및 갈락토사민으로 독성이 유도된 간세포에서 간세포 보호활성이 확인된 디클로로메탄분획 (120 g)을 CHCl₃와 MeOH의 혼합용매 (100:1 → 0:1)를 이용한 실리카 겔 컬럼 (120mm×1500mm, silica 1.5kg) 크로마토그래피 (silica gel column chromatography)를 수행하여 15개의 소분획 (A-1 ∼ A-15)으로 나누었다. 이들 중 유의성 있는 간세포 보호활성을 나타낸 A-2와 A-3 소분획을 합쳐 n-헥산 (n-Hexane)과 EtOAc 혼합용매 (50:1 → 0:1)를 이용하여 다시 실리카 겔 컬럼 (50㎜ × 1000 ㎜, silica 450 g) 크로마토그래피를 수행하여 12개의 소분획 (B-1 ∼ B-12)을 얻었다. 상기 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻은 12개의 소분획 중 B-2와 B-3로부터 간세포 보호 활성이 뛰어난 화합물 1, 2 및 3을 각각 분리하였다.

우선, 화합물 1 및 2는 B-2 소분획을 H₂O : MeOH : AcCN = 30 : 50 : 20 혼합용매를 이용하여 2 ㎖/분의 조건으로 HPLC (high peformance liquid chromatography)를 반복 실시함으로써 용출 시간 (retention time) 10.97분과 13.33분에서 각각 (화합물 1; 155 ㎎, 화합물 2; 210 ㎎) 유출되었다. 화합물 3 (151 ㎎)은 B-3 소분획으로부터 조결정으로 석출되어 MeOH로 재결정하여 백색의 분말상으로 정제되었다.

이와 같이 분리·정제된 화합물 1, 2 및 3을 UV, IR, MS, NMR, 선광도 등의 분광학적 방법으로 분석한 결과, 비자나무 수피로부터 분리·정제된 화합물은 모두 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체로서 화합물 1은 (-) 악티제닌 (arctigenin)으로, 화합물 2는 (-) 트락실라제닌 (traxillagenin)으로, 화합물 3은 (-)-4'-디메틸트락실라제닌 (demethyltraxillagenin)으로 확인되었다.

화합물 1; 악티제닌 (4-[3,4-dimethoxybenzyl]-3-[4-hydroxy-3- methoxyben

zyl]-dihydrofuran-2-one)

성상; 무색 액상

분자식; C₂₁H₂₄O₆

[α]¹⁸= -23.5° (c=1 in MeOH)

MS:m/z= 372 [M]⁺, 151, 137

UV λmax nm (log e) : 227, 281

IR max cm^-1: 3500 (OH), 1765 (CO), 1600, 1520 (arom. C=C)

¹H-NMR (400MHz, CDCl₃): d 6.76 (1H, d,J= 7.96, H-5), 6.68 (1H, d,J= 8.05, H-5), 6.58 (1H, d,J= 1.70, H-2), 6.55 (1H, dd,J= 7.97, 1.70, H-6), 6.49 (1H, dd,J= 8.05, 1.78, H-6), 6.40 (1H, d,J= 1.76, H-2), 4.08 (1H, dd,J= 9.00, 7.21, H-9b), 3.82 (1H, dd,J= 9.00, 7.44, H-9a), 2.89 (1H, dd,J= 14.1, 5.32, H-7b), 2.84(1H, dd,J= 14.1, 6.70, H-7a), 2.58 (1H, m, H-7b), 2.51 (1H, m, H-8), 2.49 (1H, m, H-7a), 2.44 (1H, m, H-8, 3.79 (3H, s, OCH₃), 3.76 (3H, s, OCH₃), 3.75 (3H, s, OCH₃)

¹³C NMR(100 MHz, CDCl₃) δ 34.24 (C-6), 37.83 (C-5), 40.70 (C-3), 46.28 (C-2), 55.53 (OMe), 55.57 (OMe), 55.63 (OMe), 71.08 (C-4), 111.04 (C-5"), 111.41 (C-2"), 111.55 (C-2'), 113.98 (C-5'), 120.34 (C-6"), 121.80 (C-6'), 129.26 (C-1'), 130.39 (C-1"), 144.31 (C-4'), 146.54 (C-4"), 147.52 (C-3'), 148.63 (C-3"), 178.63 (C-1)

화합물 2; (-)트락실라제닌 (4-[3,4,5-trimethoxybenzyl]-3-[4- hydroxy-3

-methoxybenzyl]-dihydrofuran-2-one)

성상; 무색 액상

분자식; C₂₂H₂₆O₇

[α]¹⁸-25.6° (c=1 in MeOH)

MS:m/z= 402 [M]+, 181, 137

UV λmax nm (log e) : 229, 280

IR max cm^-1: 3550 (OH), 1760 (CO), 1600, 1520 (arom. C=C).¹H-NMR (400MHz, CDCl₃): d 6.76 (1H, d,J= 7.98, H-5), 6.58 (1H, d,J=1.88, H-2), 6.54 (1H, dd,J= 7.99, 1.87, H-6), 6.12 (2H, s, H-2, 6), 4.11 (1H, dd,J= 9.21, 7.33, H-9b), 3.84 (1H, dd,J= 9.21, 7.57, H-9a), 2.89 (1H, dd,J= 13.9, 5.38, H-7b), 2.85(1H, dd,J= 13.9, 5.38, H-7a), 2.55-2.41 (4H, m, H-7b, H-8 H-7a, H-8), 3.75, 3.74, 3.73 (4OCH₃)

¹³C NMR(100 MHz, CDCl₃) δ 34.45 (C-6), 38.91 (C-5), 40.86 (C-3), 46.53 (C-2), 55.75 (OMe), 56.01 (OMe ×2), 60.83 (OMe), 71.27 (C-4), 105.41 (C-2', C-6'), 111.41 (C-5"), 114.01 (C-2"), 122.01 (C-6"), 129.41 (C-1'), 133.66 (C-1"), 136.67 (C-4'), 144.53 (C-4"), 146.69 (C-3"), 153.26 (C-3', C-5'), 178.67 (C-1)

화합물 3; (-)-4'-디메틸트락실라제닌 (4-[3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzyl]-

3-[4-hydroxy-3-methoxybenzyl]-dihydrofuran-2-one)

성상; 백색 분말

분자식; C₂₁H₂₄O₇

[α]¹⁸ _D: -38.2° (c=1 in CHCl₃)

MS:m/z= 388 [M]⁺, 194, 167, 137

UV λmax = 231, 287

IR max cm^-1: 3500 (OH), 1760 (CO), 1605, 1525 (arom. C=C) :¹H-NMR (300MHz, DMSO-d₆): 6.82 (1H, d,J= 1.71, H-2), 6.75 (1H, d,J= 8.04, H-5), 6.68 (1H, dd,J= 8.04, 1.70, H-6), 6.39 (2H, s, H-2, 6), 4.12 (1H, dd,J= 8.55, 7.21, H-4), 3.89 (1H, dd,J= 8.61, 7.80, H-4), 2.94 (1H, dd,J= 13.89, 5.47, H-5), 2.82 (1H, dd,J= 13.90, 6.50, H-5), 2.69-2.48 (4H, m, H-6 , H-2 , H-6 , H-3), 3.79 (3H, s, OCH₃), 3.76 (3H, s, OCH₃), 3.75 (3H, s, OCH₃)

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 35.61 (C-6), 39.36 (C-5), 42.77 (C-3), 47.48 (C-2), 56.73 (OMe), 57.06 (OMe ×2), 72.11 (C-4), 107.49 (C-2', C-6'), 114.24 (C-5"), 116.13 (C-2"), 123.36 (C-6"), 130.56 (C-1'), 131.06 (C-1"), 135.94 (C-4'), 146.74 (C-4"), 148.80 (C-3"), 149.20 (C-3', C-5'), 179.47 (C-1)

<실시예 2> 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 간세포 보호활성 측정

(2-1) 시료의 제조

상기 실시예 1에서 비자나무 수피로부터 분리·정제된 화합물 1, 2 및 3을 DMSO (최종농도 0.1% 이내)에 용해시킨 후 증류수로 희석하여 10 mM의 농도로 제조한 뒤 이들을 0.22 ㎛ 크기의 밀리포어 막 (millipore membrane, Millex-GV, U.S.A.)을 통과시켜 무균상태로 제조하였다.

(2-2) 사염화탄소 및 갈락토사민에 의한 간세포의 독성유도

참조예 1과 같이 간세포를 1.5시간 배양한 후 참조예 2 및 3의 방법으로 간세포에 사염화탄소 및 갈락토사민을 처리하여 독성을 유발하였다. 이와 같이 사염화탄소 및 갈락토사민에 의하여 독성이 유도된 일차배양한 흰쥐의 간세포를 이용하여 비자나무 수피로부터 분리·정제된 3종의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 간세포 보호 효과를 측정하기 위하여 상기 실시예 (2-1)에서 제조된 각 화합물의 시료를 1, 10 및 50 μM의 농도별로 투여하였다. 이때, 음성 대조군으로는 사염화탄소 또는 갈락토사민으로 독성이 유발되지 않은 흰쥐의 간세포를 사용하였고, 참조군으로는 사염화탄소 또는 갈락토사민으로 독성이 유발되었으나 본 발명의 화합물이 처리되지 않은 흰쥐의 간세포를 사용하였다. 또한, 양성 대조군은 사염화탄소 또는 갈락토사민으로 독성이 유발된 흰쥐의 간세포에 기존의 간 질환 치료제로 사용되고 있는 실리빈 (50 μM)을 처리한 것을 사용하였다.

간세포 보호활성은 독성이 유도된 간세포의 배양액을 취하여 GPT 키트 (영동제약 [주])를 사용하여 레이트만과 프랑켈의 방법 (Reitman, S. and Frankel, S. A.,Am. J. Clin. Pathol., 28:56, 1957)으로 GPT의 활성을 측정하여 결정하였다.구체적으로, 흰쥐로부터 간세포를 분리하여 24시간 동안 배양한 후 이들 화합물들을 농도별로 투여하고 1시간 후에 다시 5 mM 사염화탄소 또는 1.5 mM 갈락토사민을 처리하고 1.5시간 동안 배양하여 세포독성을 유발하였다. 상기 각각의 배양액을 취하여 사염화탄소 또는 갈락토사민으로 독성이 유발된 흰쥐의 간세포로부터 유리된 GPT의 활성을 측정하였고, 그 결과를 하기표 1에 나타내었다.

화합물	농도 (μM)	상대적 보호활성 (%)
		사염화탄소 독성유발	갈락토사민 독성유발
음성 대조군		100 ± 15.5	100.0 ± 14.6
참조군		0.0 ± 15.8	0.0 ± 7.4
화합물 1	1	0.1 ± 7.0	17.7 ± 12.2
	10	47.9 ± 3.9**	13.8 ± 6.9
	50	47.3 ± 5.4**	33.6 ± 4.5**
화합물 2	1	-0.1 ± 19.0	9.2 ± 6.4
	10	38.0 ± 7.5*	15.9 ± 4.3*
	50	60.1 ± 15.5**	36.4 ± 6.9***
화합물 3	1	32.1 ± 6.2*	-0.6 ± 10.8
	10	49.4 ± 5.6**	13.6 ± 3.0*
	50	31.2 ± 9.6*	37.1 ± 5.6***
실리빈	50	53.2 ± 7.4*	67.8 ± 4.0***
* p<0.05 수준에서 참조군으로부터 유의성 있음** p<0.01 수준에서 참조군으로부터 유의성 있음*** p<0.001 수준에서 참조군으로부터 유의성 있음

상기표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 화합물 1, 2 및 3은 사염화탄소에 의해 독성이 유발된 흰쥐의 간세포에서 유의성 있는 간세포 보호활성을 나타내어 50 μM의 농도에서 각각 47.3, 60.1 및 31.2%의 활성을 보였으며, 이는 이미 간 보호효과가 알려진 실리빈과 유사한 정도의 활성을 나타낸 것이다. 또한, 갈락토사민에 의해 독성이 유발된 흰쥐의 간세포에서도 상기 화합물들은 50 μM의 농도에서 각각 33.6, 36.4 및 37.1%로 유의성 있는 간세포보호활성을 나타내었다.

<실시예 3> 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 간 섬유화 억제 활성 측정

간염 바이러스나 간독성 물질에 의해 유발된 간장 질환은 초기에 완치되지 못하면 만성적으로 진행되어 결국에는 간 섬유화 과정을 거쳐 간경화증으로 이행된다. 이러한 간 섬유화 과정에서 핵심적인 역할을 하는 세포로 HSCs (hepatic stellate cells)가 알려져 있다. 즉, 급·만성 간독성에 의해 HSCs가 급속히 증식되면서 근섬유아세포 (myofibroblast) 형태로 전이되는데, 이렇게 전이된 HSCs에 의해 세포외 기질인 콜라겐 (collagen), 프로테오글리칸 (proteoglycan), 히알루로난 (hyaluronan) 등의 생성이 증가되어 간 섬유화가 일어나게 되며 이는 간경화로 진행되는 주 과정이다 (Friedman, S. L. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82:8681, 1985; Gressner, A. M. and Haarmann, R.,Biochem, Biophys. Res. Commun., 151:222, 1988). 그러므로 간 섬유화 과정에서 중요한 역할을 하는 근섬유아세포로 전이된 HSCs의 증식을 억제하게 되면 간 섬유화를 막을 수 있게 될 것이다. 이에 배양된 HSCs을 이용하여 사염화탄소 및 갈락토사민 독성에 대하여 유의성 있는 간세포 보호활성을 나타내는 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 간 섬유화 억제 작용을 하기와 같이 조사하였다.

(3-1) HSCs 배양 및 계대배양

흰쥐의 HSCs는 간세포 분리방법을 수정한 콜라게나아제 (collagenase)와 프로나아제 (pronase)의 관류법 및 2단계 퍼콜 구배 (Percoll gradient) 법을 이용하여 분리하였다 (Vrochides, D. et al,Hepatology, 23:1650, 1996). 분리한 HSCs는 60 ㎜ 배양 접시 (culture dish)에 1×10⁵세포/㎖ 농도로 분주하여 10% 소 태아 혈청 (Fetal bovine serum)과 2 mM 글루타민 (glutamine)이 함유된 DMEM (시그마알드리치사) 배지에 배양하였다. 배양된 HSCs가 컨플루언트 (confluent) 상태에 이르면 이를 0.25% 트립신 (trypsin)/1 mM EDTA를 사용하여 계대배양하였다.

(3-2) 간 섬유화 억제 활성 측정

상기 실시예 (3-1)에서 3회 이상 계대배양하여 근섬유아세포로 전이된 HSCs의 증식억제 작용을 측정함으로써 간 섬유화 억제 활성을 측정하였다. 구체적으로, 근섬유아세포로 전이된 HSCs에 화합물 1, 2 및 3을 각각 1, 10 및 50 μM의 농도로 투여하고 48시간 동안 배양한 후 MTT 분석 (Mosmann, T.,J. Immuno. Methods, 65:55, 1983)을 수행하여 HSCs의 생존율을 측정함으로써 증식억제 정도를 측정하였다. 통계적 유의성을 검토하기 위해 대조군으로부터의 변동을 ANOVA 시험에 의해 판정하였고, P 값이 5% 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 1 및 2는 농도 의존적 양상으로 유의성 있는 HSCs의 증식억제 활성을 보였으며, 50 μM의 농도에서 각각 26.1 및 30.2%의 증식 억제율을 보여 동일한 농도에서의 실리빈 보다 탁월한 HSCs의 증식 억제율을 나타내었다. 화합물 3의 경우에는 HSCs의 증식에 크게 영향을 주지 못하였는데, 이러한 결과로부터 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 구조 중 페닐기 (phenyl group)의 4'-C 위치의 메톡실기 (methoxyl group)가 HSCs의 증식억제 활성에 중요함을 알 수 있다.

한편화학식 1의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<실시예 4> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재 (SPF) SD계 랫트를 사용하여 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에화학식 2의 (-) 악티제닌,화학식 3의 (-) 트락실라제닌 및화학식 4의 (-)-4'-디메틸트락실라제닌을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏/㎖의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 1 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 1 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제제예 1> 시럽제의 제조방법

본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2% (중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

다이벤질부틸락톤 리그난 유도체의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖이 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

(-) 악티제닌 또는 (-) 트락실라제닌 또는 (-)-4'-디메틸트락실라제닌·

염산염 ······················· 2 g

사카린 ······················· 0.8 g

당 ························ 25.4 g

글리세린······················ 8.0 g

향미료 ······················ 0.04 g

에탄올 ·······················4.0 g

소르브산 ······················0.4 g

증류수 ·······················정량

<제제예 2> 정제의 제조방법

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

(-) 악티제닌 또는 (-) 트락실라제닌 또는 (-)-4'-디메틸트락실라제닌·염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

(-) 악티제닌 또는 (-) 트락실라제닌 또는 (-)-4'-디메틸트락실라제닌· 염산염·····················250 g

락토오스 ···················175.9 g

감자전분 ···················180 g

콜로이드성 규산 ················32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ···················160 g

활석 ····················· 50 g

스테아르산 마그네슘 ·············· 5 g

<제제예 3> 주사액제의 제조방법

유효성분 10 ㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

(-) 악티제닌 또는 (-) 트락실라제닌 또는 (-)-4'-디메틸트락실라제닌·염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

(-) 악티제닌 또는 (-) 트락실라제닌 또는 (-)-4'-디메틸트락실라제닌·염산염······················1 g

염화나트륨···················0.6 g

아스코르브산··················0.1 g

증류수·····················정량

상기에서 살펴본 바와 같이, 비자나무 수피로부터 분리·정제된 본 발명의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체인 악티제닌, 트락실라제닌 및 4'-디메틸트락실라제닌은 사염화탄소 및 갈락토사민에 의해 유도되는 독성으로부터 간세포를 보호하는 활성이 뛰어나고, 만성 간장질환의 간 섬유화 이행에 관여하는 HSCs의 증식을 효과적으로 억제함으로써 간세포를 보호하고 급·만성 간 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (7)

1. 하기화학식 1의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 하는 간세포 보호 및 간 질환 치료용 약학 조성물.

   화학식 1

   상기 식에서 R¹, R², R³, R⁴및 R⁵는 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 메톡시기이다.
2. 제 1항에 있어서, 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체가 하기화학식 2의 구조를 갖는 (-) 악티제닌 (arctigenin)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

   화학식 2
3. 제 1항에 있어서, 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체가 하기화학식 3의 구조를 갖는 (-) 트락실라제닌 (traxillagenin)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

   화학식 3
4. 제 1항에 있어서, 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체가 하기화학식 4의 구조를 갖는 (-)-4'-디메틸트락실라제닌 (demethyltraxillagenin)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

   화학식 4
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