KR100944486B1

KR100944486B1 - 흰민들레로부터 타락신산을 분리하는 방법 및 타락신산을유효성분으로 함유하는 항암제

Info

Publication number: KR100944486B1
Application number: KR1020030027791A
Authority: KR
Inventors: 이용섭; 이경태; 김형자
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2003-04-30
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2010-03-03
Also published as: KR20040093917A

Abstract

본 발명은 흰민들레로부터 하기 화학식 1로 표시되는 타락신산을 분리하는 방법 및 타락신산을 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 흰민들레를 알콜로 추출하는 단계; 2) 단계 1의 추출물을 디클로로메탄으로 추출하는 단계; 3) 단계 2의 추출물을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; 4) 단계 3의 추출물을 컬럼에 적용하여 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르를 분리하는 단계; 및 5) 단계 4에서 분리된 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르를 가수분해하는 단계를 포함하는 화학식 1로 표시되는 타락신산을 분리하는 방법 및 타락신산을 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 타락신산은 암 세포의 증식을 억제하고, 세포의 분화를 유도하기 때문에 암을 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용할 수 있다.

<화학식 1>

Description

흰민들레로부터 타락신산을 분리하는 방법 및 타락신산을 유효성분으로 함유하는 항암제{Method for preparing taraxinic acid from Taraxacum coreanum Nakai and anticancer agent containing taraxinic acid as an effective ingradient}

도 1은 타락신산을 농도별로 처리했을때의 HL-60 세포의 증식을 억제하는 정도를 나타낸 그래프이다.

■:무처리, ●: 타락신산 15 μM 처리,

◆: 타락신산 30 μM 처리, ▲: 타락신산 60 μM 처리

도 2는 타락신산이 HL-60 세포의 세포막 표면 항원인 CD14 및 CD66b의 발현에 미치는 정도를 분석한 FACS 결과이다.

본 발명은 타락신산을 포함하는 항암제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 민들레로부터 분리한 타락신산을 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것이다.

세포의 증식(proliferation)과 자연사(apoptosis), 분화(differentiation) 간의 불균형은 악성 세포의 증식을 야기한다. 최근 세포군의 동력학에 대한 종양 생물학의 이해를 기초로 하는 세포의 분화와 자연사의 유도 방법이 암의 예방 및 치료를 위한 새로운 접근방법으로 부상하고 있다. 암을 자연사시키는 것과 마찬가지로 악성(malignant) 또는 전악성(premalignant) 세포들을 성숙된 세포 또는 정상세포와 같은 세포로 분화시키는 것은 암을 예방하는데 유용하게 적용될 수 있다. 따라서, 세포의 분화를 유도하는데 효과가 있는 화합물은 암을 치료하거나 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

많은 종류의 암들은 세포의 비정상적인 분화 혹은 분화의 중지에 의해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 암의 특징을 이용하여 암세포에만 특이적으로 작용하는 암세포 분화 유도물질에 의한 항암제 개발연구가 활발히 진행되고 있다. 세포의 분화와 증식은 서로 상반되는 관계가 있으며 분화가 빨리 진행될수록 증식은 저해를 받고, 증식이 진행될수록 분화가 저해를 받는다. 세포의 분화는 세포의 성숙단계에 있어 필수과정이지만, 암세포의 경우는 이 분화과정이 정지되고 세포증식단계에만 머물러 있으면서 이러한 세포들이 계속 축적된다(H. P. Koeffler et al., Blood, 62, 709-721, 1983).

급성 골수구성 백혈병 환자에서 분리된 HL-60 세포주는 세포 및 분자 수준에서의 분화 연구에 유용한 세포주이다. 뿐만 아니라, 최근에는 HL-60 세포의 분화를 유도하는 것으로 알려진 인터페론(interferon), 레티노이드류(retinoids) 및 비 타민 D₃(1α,25-dihyroxyvitamin D₃)등의 물질들을 백혈병 치료에 이용하려는 시도가 이루어지고 있다(P. E. Harris et al., Cancer Research, 45, 3090-3095, 1985; H. P. Koeffler et al., Cancer Research, 44, 5624-5628; V. K. Ostem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 2610-2614, 1987).

한편, 흰민들레(Taraxacum coreanum Nakai)의 건초는 전통약물로서 오랫동안 이뇨제, 항염치료에 이용되어져 왔다(안덕균, 한국본초도감, 134-135, 1998). 1970년대에 흰민들레의 화학적 성분에 대한 연구로는 앱시닉산(abscisic acid)과 필수 오일(essential oils)에 관한 연구보고가 있었으나(김재길, 원색천연약물대사전(상권), 77, 1974; 중약대사전(4), 2414-2420, 1985), 그 이후로는 흰민들레에 존재하는 활성성분에 대한 연구가 진행되지 않았다.

이에 본 발명자들은 암의 예방 및 치료에 유용한 물질을 개발하기 위하여 연구하던 중, 흰민들레의 에틸 아세테이트 추출물에서 분리된 타락신산이 다양한 암세포주에 대해 증식 억제 효과를 보이며, 특히 인체 백혈병 세포주의 분화를 강력하게 유도하는 활성이 있음을 확인하고, 따라서 상기 타락신산이 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 흰민들레로부터 타락신산을 분리하는 방법 및 상기 타락신산을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 흰민들레로부터 화학식 1로 표시되는 타락신산을 분리하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 타락신산을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) 흰민들레를 알콜로 추출하는 단계;

2) 단계 1의 추출물을 디클로로메탄으로 추출하는 단계;

3) 단계 2의 추출물을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계;

4) 단계 3의 추출물을 컬럼에 적용하여 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르를 분리하는 단계; 및

5) 단계 4에서 분리된 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르를 가수분해하는 단계를 포함하는 화학식 1로 표시되는 타락신산을 분리하는 방법을 제공한다.

상기 단계 1에 있어서, 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 메탄올인 것이 바람직하다.

상기 단계 3에 있어서, 에틸 아세테이트로 추출하는 것은 단계 2에서 추출하여 수득된 물층을 에틸 아세테이트로 수회 추출하는 단계이다.

상기 단계 4에 있어서, 컬럼은 실리카겔 및 세파덱스 컬럼을 사용할 수 있으며, 단계 3에서 수득된 에틸 아세테이트 층을 증발하여 얻은 분획을 이용하여 전개용매로 분리한다. 상기 단계 4를 거친 후 분리된 화합물은 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르(taraxinic acid β-D-glucopyranosyl ester)이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 민들레로부터 추출한 에틸 아세테이트 층을 증발하여 얻은 분획을 실리카겔을 이용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatography, 2×30 ㎝)에 통과시켜 분리하였다. 이때, 디클로로메탄/메탄올/물 혼합용매(100/10/0.5 → 40/10/1 →70/30/3)를 전개용매로 사용하여 칼럼으로부터 용출시켜 4개의 분획으로 나누었다. 상기 수득된 분획 중 두번째 분획을 메탄올을 전개용매로 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼으로 전개시킨 후, 다시 디클로로메탄/메탄올/물(100/20/1.5)을 전개용매로 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 전개시켜 무색 결정의 화합 물인 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르을 분리하였다.

상기 단계 5에 있어서, 가수분해는 단계 4에 의해 분리된 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르에 베타-글루코시다제(beta-glucosidase)를 첨가함으로써 수행되며, 이때 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르가 타락신산으로 전환된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르를 NaOAc 버퍼(pH 5.2)에 녹인 후, 베타-글루코시다제를 가하여 37℃에서 이틀 동안 보관하였다. 상기 반응액으로부터 침전물을 여과한 후, 클로로포름으로 추출하고 용매를 증발하여 얻은 잔사를 이용해 TLC(thin layer chromatography)를 수행한 결과, 타락신산을 분리할 수 있었다.

본 발명의 타락신산은 다양한 암세포주인 P388(마우스 백혈병 세포주), L-1210(마우스 백혈병 세포주), SNU-C5(인간대장암 세포주), HL-60(인간 골수성 백혈병 세포주), U-937(인간 조직상 임파종 세포주), HepG2(인간 간암 세포주)에 대하여 세포증식 억제효과를 나타낸다(도 1 참조). 또한, 본 발명의 타락신산은 급성 골수구성 백혈병 환자에서 분리된 HL-60 세포에 대해 증식 억제효과를 보임과 함께 니트로블루 테트라졸리움 환원시험, 에스터라제 활성, 대식세포 활성, 형태학적 변화, CD14과 CD66b 표면 항원의 발현 시험을 통해 세포의 분화를 강력하게 유도함을 확인하였다(표 2 및 도 2 참조). 따라서, 본 발명의 타락신산은 다양한 종류의 암 세포의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 타락신산은 임상투여 시에 경구 또는 비경구로투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 타락신산을 실제 임상투여 시에는 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과랍제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 타락신산에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로즈(sucrose), 또는 락토오즈(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 액상 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 타락신산의 유효용량은 1 ~ 50 mg/kg 이고, 바람직하게는 5 ~ 20 mg/kg 이며, 하루에 1 ~ 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 타락신산을 유효성분으로 함유하는 항암제는 다양한 암을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있으며, 바람직하게는 백혈병을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 타락신산은 경구독성 시험에서 랫트에서 500 mg/kg까지 독성을 나타내지 않으므로 경구투여 최소 치사량(LD50)이 500 mg/kg 이상인 안전한 화합물이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 흰민들레로부터 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르의 분리

경기도 남양주시에서 채집한 흰민들레(Taraxacum coreanum Nakai) 전초를 음지에서 건조한 후 잘게 세절하였다. 상기 세절한 민들레 850 g을 20 ℓ의 메탄올에 침지시켜 상온에서 4 내지 5일 동안 추출한 후 여과하였다. 3번에 걸쳐 추출한 메탄올 용액을 40℃에서 회전 농축기로 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다. 흰민들레의 메탄올 추출물을 물 1 ℓ에 현탁시킨 후 디클로로메탄(CH₂Cl₂) 600 ㎖로 3회 추출하였고, 수득된 물층을 에틸 아세테이트(EtOAc) 600 ㎖로 3회 추출하였다. 상 기 수득된 에틸 아세테이트 층을 증발시켜 얻은 분획 6.0 g을 실리카겔을 이용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatography, 2 ×30 ㎝)에 통과시켜 분리하였다. 이때, 디클로로메탄/메탄올/물 혼합용매(100/10/0.5 →40/10/1 →70/30/3)를 전개용매로 사용하여 칼럼으로부터 용출시켜 4개의 분획으로 나누었다. 상기 수득된 분획 중 두번째 분획을 메탄올을 전개용매로 사용하여 세파덱스 LH-20으로 전개시킨 후, 다시 디클로로메탄/메탄올/물(100/20/1.5)을 전개용매로 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 전개시켜 무색 결정의 화합물을 분리하였다.

분리된 상기 화합물의 화학적 특성은 하기와 같으며, 이를 동정한 결과, 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르(taraxinic acid β-D-glucopyranosyl ester)임을 알 수 있었다(Hansel et al., Phytochemistry, 19, 857-861, 1980).

<타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르의 화학적 특성>

녹는점: 85-90℃,

¹H NMR(600 MHz, CDCl₃): δ 6.18(d, 1H, J = 3.6 Hz), 5.84(dd, 1H, J = 12.8, 3.7 Hz), 5.63(d, 1H, J = 3.3 Hz), 5.53(d, 1H, J = 7.7 Hz), 4.98(dd, 1H, J = 10.2, 1.3 Hz), 4.73(dd, 1H, J = 10.24, 8.7 Hz), 3.84(dd, 1H, J = 12.0, 1.5 Hz), 3.68(dd, 1H, J = 12.0, 4.4 Hz), 3.30~3.50(m, 4H), 3.32(m, 1H), 2.90(m, 1H), 2.72(m, 1H), 2.03~2.41(m, 5H), 1.63(s, 3H),

IR_max(KBr): 3400(OH), 1755(lactone C=O), 1725(C=O), 1630 (C=C) cm^-1

<실시예 2> 타락신산(taraxinic acid)의 제조

상기 실시예 1에서 분리한 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르 36.4 mg을 5 ㎖의 NaOAc 버퍼(pH 5.2)에 녹인 후, 3.4 mg의 베타-글루코시다제(beta-glucosidase)를 가하여 37℃에서 이틀 동안 보관하였다. 상기 반응액으로부터 침전물을 여과한 후, 클로로포름으로 추출하고 용매를 증발하여 얻은 잔사를 이용해 TLC를 수행하였다.

그 결과, 하기와 같은 ¹H NMR 스펙트럼 결과를 갖는 화합물을 분리하였으며, 이를 동정한 결과 타락신산임을 알 수 있었다(Hansel et al., Phytochemistry, 19, 857-861, 1980).

<타락신산의 ¹H NMR 스펙트럼 결과>

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ 6.27(d, 1H, J=3.6 Hz), 5.81(dd, 1H, J=12.4, 4.0 Hz), 5.53(d, 1H, J=3.2 Hz), 4.93(br d, 1H, J=10.2 Hz), 4.61(m, 1H), 3.43(m, 1H), 2.93(m, 1H), 2.58(m, 1H), 2.42-1.93(m, 6H), 1.64(s, 3H)

<실시예 3> 타락신산의 암세포주에 대한 세포독성 효과

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 얻은 타락신산 및 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르가 암세포주에 대해 독성효과를 가지는지 확인하였다. 구체적으로, 암세포주로서 마우스 백혈병 세포주인 P388(한국 세포주 은행), 마우스 백혈병 세포주인 L-1210(한국 세포주 은행), 인간 대장암 세포주인 SNU-C5(한국 세포주 은행), 골수성 백혈병 세포주인 HL-60(한국 세포주 은행), 인간 조직상 임파종 세포주인 U-937(한국 세포주 은행), 인간 간암 세포주인 HepG2(한국 세포주 은행)를 각각 10% FBS(Life Technologies, Inc), 100 유니트/㎖ 페니실린(Life Technologies, Inc), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트(Life Technologies, Inc)가 포함된 RPMI 배지(Life Technologies, Inc)를 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소가 공급되는 습기있는 환경에서 배양하였다. 배양후 원심분리 또는 스크래퍼를 이용하여 상기 각 암세포들을 수득한 후, 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지 100 ㎕에 넣어 각 웰당 1 ×10⁵세포수가 되도록 96 웰 플레이트에 분주하였다. 타락신산 및 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켰으며, 모든 실험에서 DMSO의 농도는 0.1%를 초과하지 않도록 하였다.

세포 배양후 하룻밤 경과한 뒤, 0 내지 200 μM 이상의 다양한 농도의 시료를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양후 세포들을 한차례 세척한 후, 5 ㎎/㎖의 MTT(β-Glycosidase, 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl -tertazolium bromide)(Sigma Chemical Co.)를 함유하고, FBS가 없는 배지 50 ㎕를 첨가하였으며, 37℃에서 4시간 배양하였다. 배양후 배지를 제거한 뒤, 상기 MTT 반응으로 세포내에서 형성된 포마잔 블루(formazan blue)를 녹이기 위해 DMSO 100 ㎕를 넣었다. 이후, 540 nm에서 흡광도를 측정한 뒤 IC₅₀ 값을 계산하여 타락신산 및 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르가 암세포에 대해 갖는 증식억제 효과를 구하였다. IC₅₀값은 화합물을 처리하지 않았을 때에 비하여 세포의 숫자가 50% 감소효과를 나타내는 농도(IC₅₀)를 의미하며, 3회 수행한 값의 평균값으로 나타내었다.

그 결과, 타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르는 처리 농도가 200 μM까지 높아져도 세포독성을 나타내지 않는 반면에, 타락신산은 다양한 암세포주에 대하여 34.5~135.9 μM 농도에서 암세포의 성장을 억제하였다(표 1). 따라서, 타락신산에 글루코실 에스테르 그룹이 없을 때에 효과적으로 항암효과를 나타냄을 알 수 있었다.

암세포주	IC₅₀(μM)
암세포주	타락신산	타락신산 베타-글루코피라노실 에스테르
P-388	67.5	>200
L-1210	59.4	>200
U-937	46.5	>200
HL-60	34.5	>200
SNU-C5	115.8	>200
HepG2	135.9	>200

<실시예 4> 타락신산의 HL-60 세포에 대한 증식 억제효과

타락신산이 HL-60 세포에 대해 가지는 증식 억제효과를 분석하고자 하였다. 구체적으로, HL-60 세포를 10% FBS, 100 유니트/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트가 포함된 RPMI 배지, 37℃, 5% 이산화탄소가 공급되는 습기있는 환경에서 배양하였다. 세포는 1 ×10⁵세포수/㎖의 농도로 2~3일 간격으로 개대 배양을 하면서 보관하였다. DMSO에 용해시킨 타락신산을 0, 15, 30 및 60 μM 농도로 상기 배양된 세포에 첨가한 후 1 내지 4일 동안 배양하였다. 세포 배양후 세포의 생존율을 트라이판 블루 익스클루전 방법(trypan blue exclusion)으로 측정하였다(이경태 등, Biol. Pharm. Bull., 24, 1117-1121, 2001). 실험은 3회 수행하였고, 실험 결과는 3회 실험에 따른 평균 및 표준편차로 나타내었다.

그 결과, 처리한 타락신산의 농도 및 처리 시간 의존적으로 HL-60 세포의 성장이 저해되었다. 타락신산의 HL-60 세포에 대한 증식 저해 효과는 15 μM 및 30 μM로 처리했을 때 뚜렷하게 나타났으며, 이 농도에서의 세포 독성은 관찰되지 않았다(도 1).

<실시예 5> 타락신산의 세포 분화 유도 효과

타락신산이 세포 분화를 유도하는지를 확인하기 위해 HL-60 세포의 세포 분화 유도 물질로 알려진 비타민 D₃를 이용하여 세포 분화 유도 효과를 비교하였다. 세포 분화 유도 실험으로는 하기에 기재된 바와 같이 니트로블루 테트라졸리움 환원시험(nitroblue tetrazolium reduction test), 대식세포 활성 테스트(phagocytosis test), 에스터라제 활성 측정(esterase activity test) 및 CD14과 CD66b 표면 항원의 발현 분석을 수행하였다. 타락신산을 0, 15 또는 30 μM 농도로 처리한 HL-60 세포를 이용하여 농도별 세포 분화 유도 효과를 분석하였으며, 비교군으로는 비타민 D₃(1α,25(OH)2D3)(Sigma Chemical Co.)를 0.02 μM 농도로 처리한 HL-60 세포를 이용하였다. 모든 결과는 3회 수행한 평균값으로 나타내었다.

1) 니트로블루 테트라졸리움 환원시험

15 μM 또는 30 μM 농도로 타락신산을 처리한 HL-60 세포에 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, 이하 "NBT"라 약칭함)(Sigma Chemical Co.) 1.0 ㎎/㎖을 처리한 후 37℃에서 30분간 배양시켜 NBT를 포마잔(formazan)으로 환원시키는 정도를 측정하였다. 포마잔을 형성하게 하는 자극제로 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)(Sigma Chemical Co.)를 사용하였다.

그 결과, 15 μM 및 30 μM 농도의 타락신산으로 처리한 HL-60 세포의 약 28.9% 및 79.7%가 NBT에 염색되어 타락신산을 처리하지 않은 세포가 NBT에 13.2% 염색되는 것에 비해 NBT에 의해 염색되는 세포의 수가 증가함을 알 수 있었다. 또한, 비교 약물인 비타민 D₃(20 nM)는 58.4%가 염색되었다(표 2).

2) 대식세포 활성 테스트

타락신산을 처리한 HL-60 세포 1 ×10⁶ 세포수/㎖을 0.2% 라텍스 파티클(latex particles, 평균 지름 0.81 μM)을 포함하고, 혈청이 없는 RPMI 1640 배지에 현탁시킨 후 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 한 번 세척한 후 10개 이상의 라텍스 파티클을 함유하는 세포를 대식성(phagocytic) 세포로 하여 그 수를 세었다.

그 결과, 타락신산을 처리한 세포의 대식세포 활성은 뚜렷하게 증가하였다(표 2).

3) 에스터라제 활성 측정

15 μM 또는 30 μM 농도로 타락신산을 처리한 HL-60 세포는 α-나프틸 아세테이트 에스터라제(α-naphthyl acetate esterase) 키트(Sigma Chemical Co.) 및 나프톨 AS-D 클로로아세테이트 에스터라제(naphthol AS-D chloroacetate esterase) 키트(Sigma Chemical Co.)를 이용하여 제조사의 방침에 따라 에스터라제 활성을 측정하였다.

HL-60 세포에 타락신산을 처리한 결과, α-나프틸아세테이트 에스테라제 활성은 증가하였으나, 나프틸 AS-D 클로로 아세테이트 에스테라제 활성에 미치는 영향은 상대적으로 미미하였다(표 2).

화합물	처리농도 (μM)	NBT 감소율 (%)	나프틸 AS-D 클로로아세테이트 에스터라제 활성(%)	α-나프틸 아세테이트 에스터라제 활성(%)	대식세포 활성 (%)
타락신산	-	13.2 ±0.8	12.0 ±0.8	11.0 ±0.9	2.7 ±0.5
	15	28.9 ±1.1*	13.8 ±0.9	39.6 ±2.8*	22.4 ±1.0*
	30	79.7 ±2.5*	14.9 ±0.2	75.1 ±5.3*	36.9 ±1.8*
비타민 D₃	0.02	58.4 ±5.4*	10.5 ±3.2	49.6 ±4.8*	40.4 ±3.5*

상기에서 *는 유효적으로 값이 증가함을 나타낸다.

4) CD14과 CD66b 표면 항원의 발현 분석

타락신산을 처리한 HL-60 세포(2 ×10⁵ 세포수/㎖)를 수득하여 차가운 PBS로 두 번 헹구어 주었다. 그 다음 FITC가 붙어있는 항-CD14 항체(Pharmingen) 또는 항-CD66b 항체(Pharmingen)를 처리하여 얼음 위에서 30분간 방치한 후 다시 PBS로 두 번 헹구어 주었다. 항체가 붙어 있는 세포를 형광 유세포분석기(FACS, Fluorescent-Activated Cell Sorter)로 정량하였다.

그 결과, 타락신산을 처리하면 세포막 표면 항원인 CD66b에는 아무런 변화가 없으나, CD14이 발현이 유의적으로 증가하였다(도 2). 이와 같은 결과는 HL-60 세포가 다세포/대식세포로 분화 유도됨을 증명하는 것이다.

상기 결과를 통해 타락신산은 HL-60 세포의 분화를 효과적으로 유도함을 알 수 있었다. 또한, 이와 같은 결과는 타락신산이 인간 백혈병세포들을 단핵세포/대 식세포(monocyte/macrophage)로 분화 유도함을 제시한다. 따라서, 본 발명의 타락신산은 백혈병을 포함한 다양한 암을 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 흰민들레로부터 분리한 본 발명의 타락신산은 다양한 암세포에 대해 증식 억제 효과를 보이며, 세포의 분화를 강력하게 유도하는 활성이 있어 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims

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하기 화학식 1로 표시되는 타락신산을 유효성분으로 함유하는 항암제.

<화학식 1>
제 5항에 있어서, 암은 백혈병, 대장암, 간암 및 임파종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제.
제 6항에 있어서, 암은 백혈병인 것을 특징으로 하는 항암제.
제 5항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 타락신산의 유효용량은 1 내지 50 ㎎/㎏인 것을 특징으로 하는 항암제.
제 8항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 타락신산의 유효용량은 5 내지 20 ㎎/㎏인 것을 특징으로 하는 항암제.