KR100543897B1

KR100543897B1 - 치자 추출물 및 치자로부터 분리된 신규 화합물 및 그 용도

Info

Publication number: KR100543897B1
Application number: KR1020030036482A
Authority: KR
Inventors: 이용섭; 진창배; 이재열; 김형자; 서선희; 송윤선
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2003-06-05
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2006-01-23
Also published as: KR20040105183A

Abstract

본 발명은 활성산소 소거활성 및 항바이러스활성을 가지는 치자 추출물, 그로부터 분리된 신규한 화합물 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 물 또는 유기용매로 추출되며, 유효성분으로 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트, 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 3,5-O- 디카페오일퀴닉산 및 4,5-O-디카페오일퀴닉산을 포함하는 활성산소소거활성 및 항바이러스활성을 나타내는 치자추출물. 그로부터 분리된 신규 화합물에 관한 것이다.

본 발명에 의한 치자 추출물 및 분리된 신규화합물들은 DPPH 자유라디칼, 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 등의 활성산소 소거활성이 우수하여 활성 산소에 의한 질병을 치료 및 예방하는데 뛰어난 효과가 있으며, 인간면역결핍바이러스의 인티그라제에 대한 저해 활성 및 항바이러스활성도 높아 AIDS 등 바이러스성 질환의 치료에 응용될 수 있다.

치자, 활성산소 소거활성, 인티그라제(integrase), 항바이러스활성, AIDS,

Description

치자 추출물 및 치자로부터 분리된 신규 화합물 및 그 용도{Gardeniae Fructus Extract and Compounds Isolated Therefrom and their use}

본 발명은 활성산소 소거활성 및 항바이러스활성을 가지는 치자 추출물, 그로부터 분리된 신규한 화합물 및 그 용도에 관한 것으로 더욱 구체적으로는 물 또는 유기용매로 추출되며, 유효성분으로 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트, 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 에틸 3-O -카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 3,5-O- 디카페오일퀴닉산 및 4,5-O-디카페오일퀴닉산을 포함하는 활성산소소거활성 및 항바이러스활성을 나타내는 치자추출물 및 그로부터 분리된 신규 화합물 및 그들의 용도에 관한 것이다.

안정한 상태로 존재하던 산소가 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학 반응과 같은 환경적 및 생화학적 요인 등에 의해 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 (superoxide radical, O₂·^-), 히드록실 라디칼 (hydroxyl radical, OH^-), 과산화수 소 (hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중항산소 (singlet oxygen, ¹O₂)등과 같이 반응성이 큰 활성산소 (reactive oxygen species: ROS)로 전환되면 인체의 세포구성 성분인 단백질, 지질 및 DNA등을 비가역적으로 파괴할 수 있다. 이러한 활성산소의 작용은 체내 방어기구인 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제 (catalase), 퍼옥시다아제 (peroxidase), 글루타치온 (glutathione) 등의 항산화성 효소 및 비타민 C (vitamin C, ascorbic acid), 비타민 E (tocopherol)등의 항산화 물질의 작용에 의하여 최소화 될 수 있다. 그러나, 이러한 생체 방어력에 이상이 생기거나 과도한 활성산소에 노출될 경우에는, 잔여 또는 과잉의 활성산소가 생체에 치명적인 산소독성을 일으키고, 세포구성 성분인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴를 유도하여 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파키슨병과 같은 뇌질환, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병을 일으킨다(Cross 등, Ann. Intern. Med., 1987, 107, 526; Alderson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988 , 85, 2706).

이와 같이, 산화적 스트레스가 노화를 비롯하여 각종 질환을 일으키는 중요한 원인임이 밝혀지면서 생체 내 활성산소를 효과적으로 제거하는 활성산소소거제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 활성 산소종을 조절할 수 있는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제 (catalase), 퍼옥시다아제 (peroxidase), 글루타치온 (glutathione) 등의 항산화성 효소 및 비티민 C (vitamin C, ascorbic acid), 비타민 E (vitamin E), 토코페롤 (tocopherol) 등의 천연물 유래의 저분자 활성산소 소거제에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다. 또한, 합성활성산소 소거제로는 BHA (butylated hydroxy anosole), BHT (butylated hydroxy toluene) 및 NDGA (nordihydroguaiaretic acid) 등도 많이 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다.

그러나 합성된 활성산소 소거제는 생체 내에서 독성을 나타내어 알러지와 종양 등을 발생시킬 수 있는 단점이 있다. 따라서, 천연 활성산소 소거제의 개발이 더욱 요구되나, 현재까지 알려진 천연 활성산소 소거제는 합성 활성산소 소거제에 비하여 안전하지만 그 효력이나 생산비용 면에서 합성 활성산소 소거제를 능가하지 못하고 있는 문제점이 있다. 따라서 활성산소 소거활성이 탁월하면서 보다 안전하고 생산비용이 저렴한 새로운 천연활성산소 소거제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 인간면역결핍바이러스(이하 HIV라 한다)는 주로 사람의 임파구를 공격하는 바이러스로서 외피(envelope)로 둘러싸여 있으며, 유전물질인 RNA 게놈 (genome)을 DNA로 전사시킨 후 숙주세포의 DNA에 삽입시키는 특성을 가지고 있어 레트로바이러스로 불려지기도 한다. HIV 구조는 가장 내부에 유전정보인 RNA와 역전사효소 (reverse transcriptase)가 존재하고, 이 RNA와 역전사효소는 껍질 단백질에 의해 둘러싸여 있으며, 그 바깥쪽에는 gp120과 gp41으로 불리는 당단백질을 포함하는 지질막이 보호막을 형성하고 있으며, gp120는 바이러스가 T-세포를 인식하여 침투하는데 결정적 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

항HIV약제의 약리효과는 주로 HIV의 생활주기를 저해함으로써 가능 하며, 크게 1) 바이러스의 당단백질인 gp120과 숙주세포의 CD4 수용체간의 작용을 저해하거나, 2) 바이러스의 RNA를 프로바이러스 DNA로 바꾸는데 관여하는 역전사효소를 저해하거나, 3) 바이러스의 조절단백질 (viral regulatory protein, tat, rev)의 작용을 저해하거나, 4) 바이러스의 전구단백질의 분해저해, 5) 바이러스의 당단백질 성숙을 위하여 올리고당의 포도당 또는 만노스를 분해하는 효소인 포도당 분해효소 (glucosidase) 또는 만노즈 분해효소(mannosidase)의 작용을 저해하는 것을 들 수 있다.

현재까지 개발된 HIV 저해제로는, 상기 2)와 같은 역전사효소 저해작용을 갖는 약제로서 디데옥시시티딘 (DDC), 디데옥시이노신 (DDI), AZT (zidobudine, azidothymidine), 덱스트란 설페이트 (dextran sulfate), 펩타이드 T, 리바비린 (ribavirin), 카스타노스퍼민(castanospermine), 지엘큐 223 (GLQ 223), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 단백질 분해효소 저해제 등이 있으나 부작용 등의 문제점으로 인해 아직도 효과적인 AIDS치료약으로 쓰이지 못하고 있는 실정이다.

예를 들면, AZT는 AIDS 치료에 어느 정도 효과적인 약물이지만 6개월 이상 치료하면 AZT 내성 HIV-1 균주가 나타나서 약효가 더 이상 나타나지 않고, 과립구감소증과 빈혈 등 심각한 부작용이 있으며, 이외에도 두통, 구역, 불면증 등의 중추신경계 부작용이 있다.

또한, AIDS 치료제로서 조건부 허가를 받은 DDI도 췌장염, 말초심경장해와 같은 심각한 부작용이 나타나므로 AZT에 대해 효과를 나타내지 않거나, 독성 등으 로 AZT의 사용이 중단된 환자에게만 처방이 가능하다.

또 다른 치료제로서 HIV의 프로테아제 저해제가 있다. 프로테아제 저해제는 HIV가 외피 단백질과 효소들이 모두 붙어있는 gag 단백질 과 gag-pol 단백질과 같은 전구 단백질형태를 만든 후, 자체내의 프로테아제에 의해 분해하어 외피 단백질과 프로테아제, 역전사효소 및 인티그라제 (integrase) 등을 제조하고, 이 과정에서 프로테아제를 억제하면 바이러스의 복제가 중단되는 것을 기초하여 개발된 것이다. 단백질 분해효소 억제제로서는 사퀴나비르 (saquinavir), 리토나비르 (ritonavir), 인디나비르 (indinavir) 등이 개발되어 AIDS 환자의 치료제로 사용하고 있다. 그러나 이 또한 당뇨병, 용혈, 출혈, 과지방혈증, 지방대사 장해 등의 부작용을 가지며, 치료제를 장기간 복용해야 하기 때문에 치료제에 대한 내성주가 출현하여 심각한 문제를 일으키고 있다.

아직도 HIV 감염자와 ADIS 환자는 세계적으로 급격하게 증가하고 있으며, 이들의 치료를 위해서는 기존의 치료제보다 부작용이 적고, 복용이 간편하며 기존의 치료제에 대하여 내성을 나타내는 유전자 부위에 대하여 내성주가 생성되지 않는 값싼 약제의 개발이 요구되고 있다. AIDS 치료제로 개발된 역전사효소 저해제나 단백질분해효소 억제제의 부작용과 내성주에 대한 문제를 해결하기 위해서 기존치료제와 다른 작용기전에 의한 치료제의 개발이 활발하게 진행되고 있다. 인티그라제(integrase)는 HIV 복제에 필수효소 중 하나이나 이 효소를 저해할 수 있는 치료제가 아직 개발되고 있지 않으므로, HIV의 인티그라제 저해활성을 보임으로써 항HIV 효능을 가지는 AIDS 치료제를 개발하기 위하여 천연물로부터 인티그라제 저 해제를 탐색하였다.

치자 (Gardeniae Fructus)는 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하는 치자나무(Gardenia jasmoides Ellis) 또는 그 밖의 동속식물의 열매로 예로부터 식품의 착색제로 사용되어왔다. 한방에서는 소염, 이뇨, 지혈. 해열, 진정, 항균, 담즙분비, 간장염치료약으로 황달, 토혈 등에 이용하고 있으며, 진정약으로 응용되고 있다. 치자의 약리 작용으로는 담즙분비촉진작용과 약물성 간장해에 대한 보호 작용 등이 보고되었으며 (Yamauchi 등 Plant Med. 1974, 25, 219, 285; 김강원 등 생약학회지 1994, 25, 368), 혈청 트리글리세라이드 (triglyceride), 인지질, 지질과산화물, 혈당, 유리 지방산을 감소시키며 (Kimura 등 Chem. Pharm. Bull. 1982, 30, 4444), 위운동 억제, 긴장감소를 나타나고 (Aburada 등 J. Pharm. Dyn. 1980, 3, 423), 혈중 빌리루빈 (bilirubin)양의 상승을 억제하며, 동맥경화 예방등의 효과가 있다고 보고 되어있다 (Gainer 등 Experimentia 1975, 31, 548; Nishizawa 등 Chem. Pharm. Bull. 1987, 35, 2133).

그러나, 치자의 활성산소 소거활성 효과는 추정되나 활성산소 소거활성을 나타내는 치자의 성분에 관한 상세한 연구는 이루어지지 않은 상태였다.

이에 본 연구자들은 다양한 식물에 함유된 성분 중에서 활성산소 소거활성을 나타내는 물질을 연구하던 중, 치자추출물이 활성산소 소거활성 및 항바이러스활성이 탁월함을 발견하고, 또한 일련의 용매추출법과 크로마토그라피를 이용하여 활성 을 가진 물질을 추적한 결과 퀴닉산 유도체와 플라보노이드 계열 및 이리도이드 (iridoid) 계열의 화합물, 페놀릭 화합물을 포함하여 15개의 물질들을 분리하였으며, 상기 화합물들이 활성산소 소거활성 및 항바이러스활성이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 활성산소 소거활성 및 항바이러스활성이 탁월하고 안전한 치자 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 치자로부터 상기 추출물을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 추출물로부터 활성 물질을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 치자 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 활성 물질을 유효성분으로 함유하는, 활성산소 소거활성 및 항바이러스활성을 가지는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 물 또는 유기용매로 추출되며, 유효성분으로 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트, 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 3,5-O-디카페오일퀴닉산 및 4,5-O-디카페오일퀴닉산을 포함하는 활성산소 소거활성 및 항바이러스활성을 나타내는 치자추출물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

치자에 물 또는 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 C_1~3의 저급 알코올, 60 ~ 100 %의 C_1~3의 저급 알코올 수용액, 아세톤, 에틸 아세테이트, 디클로메탄 및 이들의 혼합액 등의 유기용매을 사용하여 추출할 수 있다. 치자의 에틸아세테이트 추출물은 치자를 직접 에틸아세테이트로 추출하여 제조할 수도 있으나, 먼저 알콜로 추출한 후에 그 추출물로부터 에틸 아세테이트를 가하여 분획하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치자 추출물의 바람직한 제조방법은 다음과 같다.

(1)치자에 60 - 100 % 메탄올, 에탄올 또는 아세톤을 가하여 추출하는 추출단계; (2)상기 추출단계에서 수득되는 알콜 추출물을 여과한 후, 감압 농축시키는 농축단계; (3)상기 농축단계에서 수득되는 농축물에 일정량의 물을 가하여 현탁시키는 단계; 및 (4)상기 현탁단계에서 수득되는 현탁액에 에틸아세테이트를 가하여 에틸 아세테이트층을 분획하는 분획단계를 포함하여 제조된다.

상기 (1)의 추출단계는 치자를 잘게 절단하거나 분말화하여 그대로 사용하거나 냉동 건조시킨 후, 치자 1 ㎏당 60 ~ 100%의 메탄올 또는 60 ~ 100%의 에탄올 또는 아세톤을 0. 1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 0.5 내지 1.0 ℓ의 양으로 가하고 상 온에서 4 내지 5 일 동안 방치하여 후술되는 활성성분을 알콜 용매로 추출하는 단계이다. 이 과정은 필요에 따라 3회 이상 반복할 수 있다.

상기 (2)의 농축단계는 상기 추출단계에서 수득되는 알콜 추출물을 여과한 후 감압 증발시켜, 후속 조작이 용이하도록 용량이 감소된 농축물을 얻는 단계이다.

상기 (3)의 현탁단계는 농축물 1 ㎏당 1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 1.5 내지 2.0 ℓ의 물을 가하여 현탁시켜 후속 분획 단계에서 후술되는 활성성분이 쉽게 유기층으로 전이되도록 하는 단계이다.

상기 (4)의 분획단계는 현탁단계에서 수득되는 현탁액에 에틸 아세테이트 (EtOAc) 0.1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 1.0 내지 1.5 ℓ로 충분히 추출하여 에틸아세테이트 분획물을 얻을 수 있다.

본 발명의 치자 추출물의 활성성분은 다음과 같다.

본 발명의 치자 추출물은 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트 (methyl 5-O-caffeoyl-4-O-sinapoylquinate) (화학식 1, 이하 '화합물' 1이라함), 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트 (methyl 3,5-O-dicaffeoyl-4-O-(3-hydroxy-3-methyl)glutaroylquinate] (이하 '화합물' 2이라함), 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트 (ethyl 5-O-caffeoyl-4-O-sinapoylquinate) (이하 '화합물' 3이라함), 메틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트 (methyl 3-O-caffeoyl-5-O-sinapoylquinate) (이하 '화합물' 4이라함), 에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트 (ethyl 3-O-caffeoyl-5-O-sinapoylquinate) (이하 '화합물' 5이라함), 3,5-O-디카페오일퀴닉산 (3,5-O-dicaffeoylquinic acid) (화학식 7, 이하 '화합물' 10이라함), 4,5-O-디카페오일퀴닉산 (4,5-O-dicaffeoylquinic acid) (이하 '화합물' 11이라함)을 주요 활성성분으로 포함하고, 그 외 바닐릭산 4-O-β-D-(6'-시나포일)글루코피라노사이드 (vanillic acid 4-O-β-D-(6'-sinapoyl)glucopyranoside) (화학식 5, 이하 '화합물' 6이라함), 클로로제닉산 에틸 에스테르 (chlorogenic acid ethyl ester) (이하 '화합물' 7이라함), 콰르세틴 (quercetin) (화학식 6, 이하 '화합물' 8이라함), 콰르세틴 3-O-글루코사이드 (quercetin 3-O-glucoside) (이하 '화합물' 9이라함), 제니포시딕산 (geniposidic acid) (화학식 8, 이하 '화합물' 12이라함), 제니포사이드 (geniposide) (이하 '화합물' 13이라함), 카페산 (caffeic acid) (화학식 9, 이하 '화합물' 14이라함), 시네픽산 (sinapic acid) (이하 '화합물' 15이라함)을 포함한다. 이중 화합물 1 ~ 6은 신규 화합물이다.

상기 화합물 1 ~ 5 및 화합물 7의 구조식을 표 1에 나타내었다.

여기서, R₁은 수소, 메틸 또는 에틸기이고, R₂, R_3,R₄는 수소, 카페오일기, 시나포일기 또는 (3-히드록시-3-메틸)글루타로일기이다. 바람직하게는, R₁은 메틸 또는 에틸이고, R₂는 수소 또는 카페오일이고, R₃는 수소, 시나포일 또는 (3-히드록시-3-메틸)글루타로일이며, R₄는 카페오일 또는 시나포일이다. 더욱 바람직하게는 상기 화학식에서 다음의 치환기를 갖는 화합물에 관한 것이다. 이를 표 1에 나타내었다.

	R₁	R₂	R₃	R₄
화합물1(메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트)	CH₃	H	시나포일	카페오일
화합물2(메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트)	CH₃	카페오일	(3-히드록시-3-메틸)글루타로일	카페오일
화합물3(에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트)	C₂H₅	H	시나포일	카페오일
화합물4(메틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트)	CH₃	카페오일	H	시나포일
화합물5(에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트)	C₂H₅	카페오일	H	시나포일
화합물7 (클로로제닉산 에틸 에스테르)	C₂H₅	H	H	카페오일

상기 카페오일기의 구조는 다음 화학식 2와 같고, 시나포일기는 화학식 3과 같으며, (3-히드록시-3-메틸)글루타로일기는 화학식 4와 같다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

바닐릭산 4-O-β-D-(6'-시나포일)글루코피라노사이드 (화합물 6)의 구조식은 화학식 5에 나타내었다.

콰르세틴 (화합물 8) 및 콰르세틴 3-O-글루코사이드 (화합물 9)의 구조식은 화학식 6 및 표 2에 나타내었다.

[화학식 6]

	R
화합물8	H
화합물9	글루코스

3,5-O-디카페오일퀴닉산 (화합물 10), 4,5-O-디카페오일퀴닉산 (화합물 11)의 구조식은 화학식 7 및 표 3에 나타내었다.

[화학식 7]

	R₁	R₂	R₃
화합물10	카페오일	H	카페오일
화합물11	H	카페오일	카페오일

제니포시딕산(화합물 12), 제니포사이드(화합물 13)를 화학식 8에 나타내었다.

[화학식 8]

상기 화학식 8에서 화합물 12는 R이 수소이며, 화합물 13은 R이 메틸기를 갖는다.

카페산(화합물 14), 시네픽산(화합물 15)을 화학식 9에 나타내었다.

[화학식 9]

상기 화학식 9에서 화합물 14는 R₁과 R₂가 모두 수소이며, 화합물 15는 R₁이 메틸기이고, R₂가 메톡실기 (methoxy group)를 갖는다.

본 발명의 상기 화합물 1 내지 15의 분리방법을 상세히 설명하면 다음과 같 다.

치자의 에틸아세테이트 추출물에 대하여 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 (Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로써 항산화 효과를 갖는 성분들을 분리 및 정제할 수 있다. 칼럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있는데, 특히 세파덱스, RP-18 또는 실리카겔을 충진제로 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 적절히 조합하여 수행하는 것이 가장 바람직하다.

상기의 칼럼 크로마토그래피 과정을 통해 치자의 에틸 아세테이트 추출물로부터 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트, 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 바닐릭산 4-O-β-D-(6'-시나포일)글루코피라노사이드와 클로로제닉산 에틸 에스테르, 콰르세틴, 콰르세틴 3-O-글루코사이드, 3,5-O-디카페오일퀴닉산, 4,5-O-디카페오일퀴닉산, 제니포시딕산, 제니포사이드, 카페산, 시네픽산을 분리할 수 있었다.

특히, 화학식 1의 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트, 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트 및 화학식 5의 바닐릭산 4-O-β-D-(6'-시나포일)글루코피라노 사이드는 본 발명에서 신규로 발견된 화합물로서, 뛰어난 활성산소 소거활성 및 항바이러스활성을 보인다.

또한 치자에 물 또는 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 C_1~3의 저급 알코올, 60 ~ 100 %의 C_1~3의 저급 알코올 수용액, 아세톤, 에틸 아세테이트, 디클로메탄 및 이들의 혼합액 등의 유기용매을 사용하여 추출하여, 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트, 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 3,5-O- 디카페오일퀴닉산 및 4,5-O-디카페오일퀴닉산 등의 활성성분을 포함하는 치자추출물은 자유라디칼, 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼등의 활성산소의 소거 활성이 뛰어나고, 지질과산화물 생성 효과 또한 뛰어나며, HIV의 복제에 필수적인 효소인 인티그라제에 대하여 높은 저해활성을 보이며, HIV의 일종인 HIV-1의 증식을 억제하는 항바이러스활성을 보인다. 상기의 항바이러스활성은 HIV의 인티그라제 저해활성을 보임으로써 나타내는 것으로 판단된다.

또한, 본 발명은 상기 치자 추출물 및 상기 치자 추출물에서 분리된 신규의 천연화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

상기한 바와 같이 본 발명에 따른 치자의 추출물 및 이로부터 분리된 화합물 1 내지 15가 활성산소 소거활성 및 항바이러스활성을 나타내므로, 이들을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 활성산소에 의해 유발되는 질병의 치료 및 예방 또는 바이러스의 일종인 HIV에 의한 질환의 치료 및 증상완화에 매우 유용하게 사용 될 수 있다.

본 발명에 따른 천연화합물은 또한 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염에는 알칼리금속 수산화물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨), 알칼리금속 중탄산염 (예: 중탄산나트륨, 중탄산칼륨), 알칼리금속 탄산염 (예: 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘)등과 같은 무기염기와 1차, 2차 3차 아민 아미노산과 같은 유기염기가 포함된다. 본 발명의 화합물들은 또한 용매화물, 특히 수화물의 형태일 수 있다. 수화는 상기 화합물을 분리하는 동안 일어날 수 있거나, 또는 화합물의 흡습성으로 인해 시간이 경과함에 따라 일어날 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.

이와 같은 임상투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또 는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 활성산소에 의한 세포구성성분의 산화에 의해 유발되는 질병의 치료, 증상의 완화 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 질병으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 노화 (aging), 암 (cancer), 복합성 동맥경화 (multiple atherosclerosis), 관절염, 파킨슨병 (Parkinson's disease), 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 혈관장애, 고지혈증, 심근경색 또는 뇌경색 등이 포함된다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 HIV 바이러스에 의해 유발되는 질병 예를 들면 에이즈 등의 치료 또는 증상의 완화 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체와 함께 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캅셀, 새세이 또는 기타 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭씨르, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 주사용 용액 또는 현탁액, 연고제, 크림제, 겔제 또는 로숀제 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸 하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 치자의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 1 내지 15의 유효량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏이다. 바람직하게는 500 내지 5,000 ㎎의 범위가 통상적이며, 일부 질환에 따라 더 높은 일일 투여량이 요구될 수 있다. 또한, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 연령, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명은 치자 추출물 및 이로부터 분리된 유효성분을 포함하는 활성산소 소거활성을 가지는 식품 첨가물을 제공한다.

본 발명에 따른 치자 추출물 및 이로부터 분리된 천연화합물은 활성산소 소거활성이 우수하여 활성산소에 의한 식품의 산화에 의해서 일어나는 식품의 냄새나 풍미의 변화, 유지의 산패, 그리고 식품의 변색을 효과적으로 방지할 수 있다. 따라서 상기 치자 추출물 및 이로부터 분리된 천연화합물을 종래의 각종 식품류에 배합함으로써 이들 식품류를 보존하거나 식품의 신선도 및 품질을 장기간에 걸쳐 유지하기 위해 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 치자 추출물 및 이로부터 분리된 유효성분을 포함하는 활성산소 소거활성을 가지는 화장품 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장품 조성물은 치자 추출물 및 이로부터 분리된 유효성분을 그대로 사용하거나 또는 필요에 따라 희석하여 사용할 수 있다. 상기 치자 추출물 및 이로부터 분리된 유효성분은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로숀제 및 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있다. 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알코올, 프로필렌글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸알코올 및 유동 파라핀 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장품 조성물은 피부의 산화에 의한 손상, 예를 들면, 반점 (갈색반), 주근깨, 피부균열, 자외선 손상 (햇볕에 탐)등을 예방하는데 매우 유용하며, 화장품 자체의 산화를 방지함으로써 화장품의 품질을 유지하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하에서 본 발명을 실험예 및 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 기술적 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 치자추출물의 제조

치자는 2000년 6월 17일 한약방에서 구입하여 실험에 이용하였다. 잘 건조된 생약 3.0 ㎏에 18.4 ℓ의 메탄올을 가하여 실온에서 4~5일 동안 냉침하여 여과하였고, 용매는 40℃ 이하에서 감압 건조하여 메탄올 추출물을 만들었다. 이를 3번 반복 실험한 결과 총 메탄올 추출물 500.4 g을 얻었다. 메탄올추출물 500.4 g을 3000 ㎖의 물에 현탁시키고, 2500 ㎖의 디클로로메탄 (CH₂Cl₂, 2500 ㎖ x 3), 에틸 아세테이트 (EtOAc, 2500 ㎖ x 3) 그리고 부탄올 (BuOH, 2500 ㎖ x 3)로 용매 극성에 따라 순차적으로 각각 3회씩 반복 추출하여 각각의 용매 분획으로 나누었다.

[실시예 2] 치자추출물의 제조

잘 건조된 생약 3.0 kg에 7.5 ℓ의 에틸 아세테이트을 가하여 실온에서 4~5일 동안 냉침하여 여과하였고, 용매는 40℃ 이하에서 감압 건조하여 에틸 아세테이트추출물을 준비하였다.

[실시예 3] 치자의 에틸 아세테이트분획으로부터 활성산소 소거활성물질의 분리

실시예 1에서 수득한 치자의 에틸 아세테이트 분획 25 g을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피(메탄올)를 실시하여 얻어진 분획들은 순상 실리카겔 TLC (전개용매: 디클클로메탄-메탄올-물=70:10:1)로 관찰한 후, 유사한 극성을 갖는 화합물끼리 모아 EA~EJ의 10개의 소 분획을 얻었고, 소 분획 EF4 260.0 ㎎을 역상 실리카젤 칼럼 크로마토그래피 (Cat. No.:13900)를 실시하였다. 사용한 용매는 40 % 메탄올이며, 분리 정도에 따라 역상 실리카겔 TLC (전개용매: 메탄올-물=40:60)로 확인하여 5개의 소 분획 (EF4-6~EF4-10)으로 나누었다. 소 분획 EF4-8은 분취용 역상 TLC를 이용하여 60% 메탄올을 전개용매로 사용하여 화합물 8 (4.0 ㎎)과 화합물 9 (5.15 ㎎)를 순수하게 얻었다. 소 분획 ED 10.2 g을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 (에탄올)를 실시하여 얻은 ED1~ED18의 소 분획중 ED5 분획 185.95 ㎎을 다시 메탄올을 전개용매로 사용하여 세파덱스 칼럼 크로마토그래피를 실시하고, 그 중 ED5b 분획 30.65 ㎎을 분취용 역상 HPLC (10% 아세토니트릴)를 실시하여 화합물 13 (14.1 ㎎)을 분리하였다. 소 분획 ED5b16 분획 18.5 ㎎을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 (메탄올)를 실시하여 화합물 12 (5.99 ㎎)를 얻었다. 소 분획 ED8분획 1.46 g을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 (에탄올)를 실시하여 ED8a-ED8h의 8개의 소 분획을 얻었고, ED8e분획 779 ㎎을 다시 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 (에탄올)를 실시하여 10개의 소 분획으로 나누었다. 이 중 ED8e4 분획을 분취용 역상 TLC(60% 메탄올)를 실시하여 화합물 6 (4.3 ㎎)을 얻었다. 소 분획 ED8e분획 779 ㎎을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피(에탄올)를 실시하여 10개의 소 분획을 얻었으며, 분획 ED8e5d (131.3 ㎎)를 도요펄 (에탄올)을 이용한 정제와 분취용 역상 TLC (40% 메탄올)를 실시하여 화합물 15 (4.7 ㎎)을 얻었다. 소 분획 ED9e3 779.4 ㎎을 실리카젤을 이용한 칼럼 크로마토그래피 (디클클로메탄-메탄올-물=60:10:1→30:10:1.5)를 실시하여 화합물 1(97.12 ㎎)을 분리하였으며, ED9분획 1.86 g을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 (에탄올)를 실시하여 얻은 10개의 소 분획 중 소 분획 ED9e5 32.3 ㎎을 분취용 역상 TLC (64% 메탄올)를 이용하여 화합물 4 (6.0 ㎎)를 얻을 수 있었으며, 소 분획 ED9e8 149.1 ㎎으로부터 화합물 14 (35.0 ㎎)를 얻을 수 있었다. 소 분획 ED9g 290.3 ㎎으로부터 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (디클클로메탄-메탄올-물=40:10:1)와 분취용 역상 TLC (60% 메탄올)를 이용하여 화합물 2 (6.8 ㎎)를 얻을 수 있었다. 소 분획 ED10분획 3.03 g을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 (에탄올)를 실시하여 얻은 13개의 소 분획 중, ED10c분획 37.5 ㎎을 분취용 RP-18 TLC (64% 메탄올)를 실시하여본 화합물 7 (4.3 ㎎)을 얻었으며, 소 분획 ED10d2 분획 51.1 ㎎을 분취용 역상 TLC (64% 메탄올)를 실시하여 화합물 5 (6.4 ㎎)와 화합물 3 (5.7 ㎎)을 얻었다. 소 분획 EF분획 805 ㎎을 역상 실리카젤을 이용한 칼럼 크로마토그래피 (30%→50% 메탄올)를 실시하여 EF1~EF9의 9개의 소 분획을 얻었고, 이 중 EF3 분획 129.9 ㎎을 역상 실리카젤을 이용한 칼럼 크로마토그래피 (30%→50% 메탄올)를 실시하여 1.57 ㎎의 화합물 10 (4.76 ㎎)을 얻었다. EF4 분획 268 ㎎을 역상 실리카젤을 이용한 칼럼 크로마토그래피 (40% 메탄올)를 실시하여 화합물 11 (16.85 ㎎)을 얻었다.

[실시예 4] 신규 화합물 1의 구조결정

적외선 (IR)분광기 측정시 시료는 KBr과 혼합하여 사용하였으며, MeOH 용액에서 선광도 [α]^D를 측정하였다. 300 MHz (¹H)와 75 MHz (¹³C)의 NMR 스펙트럼을 측정하였고 각 피크의 화학 시프트 (chemical shift)는 내부 표준물질인 트리메틸실란에 대한 상대값으로 나타내었다. 수득한 화합물 약 5 ㎎을 메탄올-d ₄(99.5%) 500 ㎕에 용해시키고 탄소 핵자기 공명스펙트럼을 측정하면 특징적인 화합물들의 피크를 나타내었다.

본 발명의 화합물 1의 화학적 특성은 다음과 같다.

Pale yellow amorphous powder;

[α]¹⁹ _D -238.7°(c 1.45, MeOH);

FABMS (negative-ion mode) m/z 607 [M-1]^-;

HRFABMS (negative-ion mode) m/z obsd. 607.1078 (calcd. for 607.1088, C₃₀H₂₃O₁₄);

¹H-NMR (CD₃OD, 300 ㎒): δ 2.01(1H, dd, J=6.2, 13.99 ㎐, H-6), 2.14(3H, ddd, J=6.86, 3.38, 14.03 ㎐, H-2,6), 3.62 (3H, s, OMe), 3.70 (6H, s, 2xOMe), 4.26 (1H, m, H-5), 5.02 (1H, dd, J=3.01, 8.18 ㎐, H-4), 5.04 (1H, dd, J=6.34, 14.18 ㎐, H-3), 6.05 (1H, d, J =15.88 ㎐, H-2'), 6.29 (1H, d, J=15.86 ㎐, H- 2"), 6.63 (2H, d, J=8.19 ㎐, H-8'), 6.76 (2H, bs, H-5", H-9"), 6.80 (1H, dd, J=1.92, 8.27 ㎐, H-9'), 6.84(1H, d, J=1.97㎐, H-5') 7.38 (1H, d, J=15.89 ㎐, H-3'), 7.52 (1H, d, J=17.72 ㎐, H-3").

¹³C-NMR (CD₃OD, 75 ㎒): δ 38.8 (C-6), 39.0 (C-2), 53.5 (OMe), 57.2 (2x OMe), 69.1 (C-3), 69.5 (C-3), 75.4 (C-4), 76.2 (C-1), 107.3 (C-5", 9"), 114.9 (C-2'), 115.6 (C-5'), 116.0 (C-2"), 116.9 (C-8'), 123.5 (C-9'), 127.0 (C-4"), 127.9 (C-4'), 140.0 (C-7"), 147.2 (C-6'), 148.1 (C-3'), 148.2 (C-3"), 149.8 (C-6", 8"), 150.2 (C-7'), 168.3 (C-1'), 168.8 (C-1"), 175.6 (COOMe).

¹H-NMR 스펙트럼에서 1개의 카페오일기와 1개의 시나포일 (sinapoyl)기가 확인되었고, 퀴닉산의 4번과 5번의 수소 피크가 저자장으로 이동하였으므로, 이들의 히드록실 (hydroxy)기가 치환되었음을 알 수 있었고, δ3.62에서 메톡시 (methoxy) 피크가 관찰되었으므로 퀴닉산의 메틸 에스테르 (methyl ester)임을 추정할 수 있었다. 에이치엠비씨 (HMBC) 스펙트럼에서 시나포일기에서 기인하는 카르보닐 (carbonyl) 탄소와 4번 위치의 수소, 카페오일기에서 기인하는 카르보닐 탄소와 5번 수소사이의 상관관계 (correlation)가 관찰되었고, 퀴닉산의 1번 위치의 카르보닐 탄소와 메톡실기에 기인한 수소 피크와의 상관관계가 보이므로, 이 화합물은 5번과 4번의 히드록실기가 각각 카페오일과 시나포일이 치환된 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트 (methyl 5-O-caffeoyl-4-O-sinapoylquinate)로 동정하였다 (Nishizawa 등, Chem. Pharm. Bull. 1988, 36, 87).

[실시예 5] 신규 화합물 2의 구조결정

실시예 4와 동일한 조건하에서 화합물 2에 관한 실험을 수행하였다.

본 발명의 화합물 2의 화학적 특성은 다음과 같다.

Pale yellow amorphous powder;

[α]²⁰ _D -129.6°(c 0.30, MeOH);

FABMS (negative-ion mode) m/z 607 [M-1]^-;

¹H-NMR (CD₃OD, 300 ㎒): δ 1.21 (3H, s, CH₃), 2.07-2.25 (4H, m, H-2, H-6), 2.30-2.52 (4H, m, 2xCH₂), 3.61 (3H, s, OMe), 5.18 (1H, dd, J=3.2, 6.67 ㎐, H-4), 5.32 (1H, br d, J=3.9 ㎐, H-3), 5.50 (1H, m, H-5), 6.13 (1H, d, J=15.9 ㎐, H-2'), 6.22 (1H, d, J=15.9 ㎐, H-2"), 6.65 (1H, d, J=8.4 ㎐, H-8'), 6.69 (1H, d, J=8.2 ㎐, H-8"), 6.86 (1H, dd, J=1.96, 8.21 ㎐, H-9'), 6.88 (1H, dd, J=1.91, 8.17 ㎐, H-9"), 6.96 (1H, d, J=1.83 ㎐, H-5'), 6.99 (1H, d, J=1.82 ㎐, H-5"), 7.41 (1H, d, J=14.5 ㎐, H-3'), 7.51 (1H, d, J=14.5 ㎐, H-3").

¹³C-NMR (CD₃OD, 75 ㎒): δ 26.9 (CH₃), 35.3 (C-6), 36.3 (C-2), 46.2 (C-2'"), 46.5 (C-4'") 52.1 (OMe), 68.2 (C-5), 68.3 (C-3), 69.8 (C-4), 70.1 (C-3'"), 73.4 (C-1), 113.4 (C-2'), 113.9 (C-2"), 114.0 (C-5'), 114.1 (C-5"), 115.4 (C-8"), 115.5 (C-8'), 122.2 (C-9"), 122.3 (C-9'), 126.5 (C-4"), 126.8 (C-4'), 145.8 (C-6"), 145.9 (C-6'), 146.6 (C-3"), 146.9 (C-3'), 148.7 (C-7"), 148.9 (C-7'), 166.5 (C-1'), 167.3 (C-1"), 170.4 (C-1'"), 174.7 (COOMe), 178.4 (C-5'").

¹H-NMR에서 아로마틱 (aromatic) 영역에서 2분자의 카페오일기의 피크가 관찰되었으며, 고자장 영역에서도 2개의 메틸렌 (CH₂)피크와 1개의 메틸 (CH₃) 피크, δ 3.61에서 메톡실 피크가 관찰되었다. 퀴닉산의 3,4,5번 수소가 전부 저자장쪽으로 이동함을 보여, 이 화합물은 3,4,5번이 2개의 카페오일과 알리파틱 (aliphatic)으로 치환된 퀴닉산 메틸 에스테르로 추정할 수 있었다. ¹³C-NMR에서 δ 170.4, 174.7에서 카르보닐기의 피크와 178.4에서 치환체가 없는 산 (free acid)의 피크가 관찰되었다. 에이치엠큐씨 (HMQC)에서 각각의 정확한 피크를 규명할 수 있었고, HMBC 스펙트럼으로부터 각 치환체의 위치를 파악할 수 있었다. 즉, δ5.32에서의 3번 수소와 δ 5.50에서의 5번 수소는 δ 166.5와 167.3에서의 카르보닐 탄소와 상관관계가 관찰되어 두개의 카페오일기는 퀴닉산의 3번과 5번에 치환되었음을 알 수 있었고, δ 3.61에서 메톡실 피크와 δ 2.07-2.25에서의 2번과 6번 수소는 δ 174.7에서의 1번 위치의 카르보닐 탄소와 상관관계가 관찰되어 메톡실기 는 1번에 에스테르결합을 하고 있음을 알 수 있었다. 또한, δ 5.18에서의 4번 수소와 δ 2.30-2.52에서의 메틸렌수소 (H-2'")는 δ 170.4 (C-1'")에서의 카르보닐피크와 상관관계가 나타나고 있어 3-히드록시-3-메틸글루타릭산이 퀴닉산의 4번에 치환하고 있음을 알았다. δ 178.4 (C-5'")의 free acid 피크는 δ 2.30에서의 메틸렌 피크 (H-4'")와 상관관계가 나타나 (3-히드록시-3-메틸 )글루타릭산의 끝부분에 위치한 free acid의 카르복실산에서 기인한 것임을 알았다. 따라서 본 화합물은 3번과 5번이 각각 카페오일기로 치환되었으며, 4번 위치가 (3-히드록시-3-메틸)글루타릭산[(3-hydroxy-3-methyl)glutaric acid]이 치환된 구조인 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트 (methyl 3,5-O-dicaffeoyl-4-O-(3-hydroxy-3-methyl)glutaroylquinate)로 규정하였다 (Nishizawa 등, Chem. Pharm. Bull. 1988, 36, 87).

[실시예 6] 신규 화합물 3의 구조결정

실시예 4와 동일한 조건하에서 화합물 3에 관한 실험을 수행하였다.

본 발명의 화합물 3의 화학적 특성은 다음과 같다.

Pale yellow amorphous powder;

[α]²⁰ _D -225.9°(c 0.29, MeOH);

FABMS (negative-ion mode) m/z 607 [M-1]^-;

¹H-NMR (CD₃OD, 300 ㎒): δ 1.18 (3H, s, -CH₃), 2.02 (1H, dd, J =6.3, 13.8 ㎐, H-2), 2.15-2.26 (3H, m, H-2, 6), 3.78 (6H, s, 2xOMe), 4.08 (2H, m, -CH₂), 4.27 (1H, br d, J=2.6, 5.39 ㎐, H-3), 5.06 (1H, dd, J=2.85, 8.15 ㎐, H-4), 5.49 (1H, br dd, J=7.4, 13.3 ㎐, H-5), 6.09 (1H, d, J=15.83 ㎐, H-2'), 6.35 (1H, d, J=15.83 ㎐, H-2"), 6.66 (1H, d, J=8.16 ㎐, H-8'), 6.76 (2H, br s, H-5", H-9"), 6.82 (1H, dd, J=1.52, 8.23 ㎐, H-9'), 6.90 (1H, d, J=1.67 ㎐, H-5') 7.43 (1H, d, J=15.86 ㎐, H-3'), 7.57 (1H, d, J=15.84 ㎐, H-3").

¹³C-NMR (CD₃OD, 75 ㎒): δ 13.3 (CH₃), 37.3 (C-2), 37.6 (C-6), 55.8 (2xOMe), 61.7 (CH₂), 67.7 (C-3), 68.1 (C-5), 74.0 (C-4), 74.8 (C-1), 105.9 (C-5", 9"), 113.4 (C-2'), 114.1 (C-5'), 114.5 (C-2"), 115.5 (C-8'), 122.1 (C-9'), 125.5 (C-4"), 126.4 (C-4'), 138.7 (C-7"), 145.9 (C-6'), 146.7 (C-3'), 146.8 (C-3"), 148.4 (C-6", 8"), 149.1 (C-7'), 167.0 (C-1'), 167.4 (C-1"), 175.7 (COOMe).

¹H-NMR 스펙트럼에서 1개의 카페오일기와 1개의 시나포일기가 확인되었고, 퀴닉산의 4번과 5번의 수소 피크가 저자장으로 이동하였으므로, 4번과 5번의 히드록실기에 치환되었음을 알 수 있었고, δ 1.18과 4.08에서 에틸피크가 관찰되었으 므로 퀴닉산의 에틸에스테르임을 추정할 수 있었다. 에이치엠비씨 (HMBC) 스펙트럼에서 확인한 결과 시나포일의 카르보닐 탄소와 4번 위치의 수소, 카페오일의 카르보닐 탄소와 5번 수소사이의 상관관계가 관찰되었고, 퀴닉산의 1번 위치의 카르보닐 탄소와 에틸기에 기인한 수소 피크와의 상관관계가 보이므로, 이 화합물은 5번과 4번의 위치의 히드록실기가 각각 카페오일기와 시나포일기로 치환된 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트 (ethyl 5-O-caffeoyl-4-O-sinapoylquinate)로 동정하였다 (Nishizawa 등, Chem. Pharm. Bull. 1988, 36, 87).

[실시예 7] 신규 화합물 4의 구조결정

실시예 4와 동일한 조건하에서 화합물 4에 관한 실험을 수행하였다.

본 발명의 화합물 4의 화학적 특성은 다음과 같다.

Pale yellow amorphous powder;

[α]²¹ _D -148.0°(c 0.30, MeOH);

FABMS (negative-ion mode) m/z 607 [M-1]^-;

¹H-NMR (CD₃OD, 300 ㎒): δ 1.93-2.09 (4H, m, H-2, H-6), 3.49 (3H, s, OMe), 3.66 (6H, s, 2xOMe), 3.77 (1H, dd, J=3.17, 6.66 ㎐, H-4), 5.10 (1H, br d, J=㎐, H-3), 5.19 (1H, m, H-5), 6.02 (1H, d, J=15.9 ㎐, H-2'), 6.27 (1H, d, J=15.88 ㎐, H-2"), 6.57 (1H, d, J=8.15 ㎐, H-8'), 6.71 (2H, s, H-5", H-9"), 6.76 (1H, dd, J=1.98, 8.21 ㎐, H-9'), 6.84 (1H, d, J=1.97 ㎐, H-5'), 7.35 (1H, d, J=15.89 ㎐, H-3'), 7.48 (1H, d, J=15.88 ㎐, H-3").

¹³C-NMR (CD₃OD, 75 ㎒): δ 34.7 (C-2), 35.8 (C-6), 52.0 (OMe), 55.8 (2x OMe), 68.8 (C-4), 71.1 (C-5), 71.2 (C-5), 73.7 (C-1), 105.9 (C-5", 9"), 113.8 (C-2'), 114.1 (C-5'), 115.3 (C-2"), 115.5 (C-8'), 122.1 (C-9'), 125.8 (C-4"), 126.6 (C-4'), 138.5 (C-7"), 145.9 (C-6'), 146.2 (C-3"), 146.4 (C-3'), 148.5 (C-6", 8"), 148.8 (C-7'), 167.0 (C-1'), 167.6 (C-1"), 174.6 (COOMe).

¹H-NMR상에서 1개의 카페오일기와 1개의 시나포일기가 확인되었고, 퀴닉산의 3번과 5번 위치의 수소가 저자장으로 이동하였으므로, 이들의 히드록실기에 치환체가 치환되었음을 알 수 있었고, δ 3.49에서 메톡실기가 관찰되어, 이 화합물의 퀴닉산의 메틸 에스테르임을 확인하였다. HMBC의 스펙트럼에서 퀴닉산의 5번 위치의 수소와 시나포일기에서 기인하는 카르보닐 탄소가 상관관계가 나타나고, 카페오일기에서 기인하는 카르보닐 탄소와 퀴닉산의 3번 수소사이의 상관관계가 관찰되어 시나포일기는 5번에 치환되어있고 카페오일기는 3번에 치환하고 있음을 알 수 있었다. 또한, 퀴닉산의 1번 위치의 카르보닐 탄소와 메톡실기의 수소 피크와의 상관관계가 보여 메톡실기는 1번의 카르복실산에 에스테르 결합을 하고 있음을 알 수 있었다. 따라서 이 화합물은 3번과 5번의 히드록실기가 각각 카페오일과 시나포일 로 치환된 메틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트 (methyl 3-O-caffeoyl-5-O-sinapoylquinate)로 동정하였다 (Nishizawa 등, Chem. Pharm. Bull. 1988, 36, 87).

[실시예 8] 신규 화합물 5의 구조결정

실시예 4와 동일한 조건하에서 화합물 5에 관한 실험을 수행하였다.

본 발명의 화합물 5의 화학적 특성은 다음과 같다.

Pale yellow amorphous powder;

[α]²¹ _D -133.7°(c 0.32, MeOH);

FABMS (negative-ion mode) m/z 607 [M-1]^-;

¹H-NMR (CD₃OD, 300 ㎒): δ 1.18 (3H, s, CH₃), 2.06 - 2.22 (4H, m, H-2, 6), 3.78 (6H, s, 2xOMe), 3.90 (1H, dd, J=2.93, 6.35 ㎐, H-4), 4.07 (2H, m, CH₂), 5.23 (1H, br d, J=3.35 ㎐, H-3), 5.33 (1H, m, H-5), 6.10 (1H, d, J=15.92 ㎐, H-2'), 6.39 (1H, d, J=15.88 ㎐, H-2"), 6.70 (1H, d, J=8.15 ㎐, H-8'), 6.83 (2H, s, H-5", H-9"), 6.88 (1H, br d, J=1.62 ㎐, H-9'), 6.95 (1H, d, J=1.97 ㎐, H-5') 7.48 (1H, d, J=15.89 ㎐, H-3'), 7.61 (1H, d, J=15.88 ㎐, H-3").

¹³C-NMR (CD₃OD, 75 ㎒): δ 13.3 (CH₃), 34.6 (C-2), 35.8 (C-6), 55.8 (2xOMe), 61.6 (CH₂), 68.8 (C-4), 70.8 (C-5), 71.1 (C-3), 73.6 (C-1), 105.9 (C-5", 9"), 113.8 (C-2'), 114.1 (C-5'), 115.3 (C-2"), 115.5 (C-8'), 122.0 (C-9'), 125.8 (C-4"), 126.6 (C-4'), 138.5 (C-7"), 145.9 (C-6'), 146.2 (C-3"), 146.8 (C-3'), 148.5 (C-6", 8"), 148.8 (C-7'), 167.0 (C-1'), 167.6 (C-1"), 174.2 (COOMe).

¹H-NMR상에서 1개의 카페오일기와 1개의 시나포일기가 확인되었고, 퀴닉산의 3번과 5번 위치의 수소가 저자장으로 이동하였으므로, 이들의 히드록실기에 치환체가 치환되었음을 알 수 있었고, δ 1.18과, 4.07에서 에틸기에서 기인한 피크가 관찰되어 이 화합물은 퀴닉산의 에틸 에스테르임을 추정하였다. HMBC의 스펙트럼에서 시나포일기의 카르보닐탄소와 5번 위치의 수소, 카페오일기의 카르보닐 탄소와 3번 수소사이의 상관관계가 관찰되었고, 퀴닉산의 1번 위치의 카르보닐 탄소와 에톡실 (ethoxy)기에서 기인한 수소 피크와의 상관관계가 보이므로, 이 화합물은 3번과 5번의 히드록실기가 각각 카페오일기과 시나포일기로 치환된 에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트 (ethyl 3-O-caffeoyl-5-O-sinapoylquinate)로 동정하였다 (Nishizawa 등, Chem. Pharm. Bull. 1988, 36, 87).

[실시예 9] 신규 화합물 6의 구조결정

실시예 4와 동일한 조건하에서 화합물 6에 관한 실험을 수행하였다.

본 발명의 화합물 6의 화학적 특성은 다음과 같다.

Pale yellow amorphous powder;

[α]²¹ _D -34.9°(c 0.22, MeOH);

FABMS (negative-ion mode) m/z 607 [M-1]^-;

¹H-NMR (CD₃OD, 300 ㎒): δ 3.34 (1H, d, J=8.9 ㎐, H-4') 3.39 (1H, t, J=8.8, ㎐, H-3'), 3.50 (1H, t, J=2.03, 7.4 ㎐, H-2'), 3.69 (1H, dd, J=2.3, 6.2㎐, H-5'), 4.28 (1H, dd, J=6.9, 11.9 ㎐, H-6'), 4.47 (1H, dd, J=2.07, 11.9 ㎐, H-6'), 4.93 (1H, d, J=7.3 ㎐, H-1'), 6.32 (1H, d, J=15.8 ㎐, H-2"), 6.8 (2H, s, H-5", 9"), 7.08 (1H, d, J=8.4 ㎐, H-5), 7.45 (1H, d, J=1.9 ㎐, H-2), 7.50 (1H, dd, J=1.91, 6.8 ㎐ H-2), 7.54 (1H, d, J=15.8 ㎐, H-3").

¹³C-NMR (CD₃OD, 75 ㎒): δ 56.7 (OMe), 56.9 (2xOMe), 64.7 (C-6'), 71.7 (C-4'), 74.8 (C-2'), 75.7 (C-5'), 77.8 (C-3'), 102.0 (C-1'), 106.9 (C-5", 9"), 114.4 (C-6), 115.7 (C-2"), 116.5 (C-5), 124.5 (C-2), 126.5 (C-4"), 127.3 (C-1), 139.6 (C-7"), 147.3 (C-3"), 149.5 (C-6", 8"), 150.3 (C-4), 168.8 (COOMe), 170.16 (COOH).

¹H-NMR 스펙트럼에서 저자장 영역에서 1개의 시나포일기와 1개의 바닐릭산 (vanillic acid)에 의한 피크와 δ 3.34-4.47에서 당에 기인한 피크가 관찰되었으며, δ 4.93에서 글루코스 (glucose)의 아노머릭 수소 (anomeric proton)에서 기인한 짝지움 상수 (coupling constant)가 J=7.3 ㎐로 관찰되어, 이 화합물은 β배열 (configuration)을 갖는 배당체로 추정되었다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서 당의 아노머릭 탄소가 δ 102.0으로 저자장으로 이동하여 관찰되었으며, 에스테르에서 기인하는 카르보닐탄소 피크와 치환체가 없는 산의 카르보닐 탄소 피크가 관찰되었다. 이들의 결합구조를 규명하기 위하여, HMBC, ¹H-¹H 톡씨 (TOCSY)등의 스펙트럼과 문헌을 비교 검토해본 결과, 이 화합물은 바닐릭산의 4번 위치에 글루코스가 결합되어있고, 글루코스의 6번 위치에 시나포일기가 에스테르결합을 하는 바닐릭산 4-O-β-D-(6'-O-시나포일)글루코피라노사이드 [vanillic acid 4-O-β-D-(6'-O-sinapoyl)glucopyranoside]로 동정하였다 (Conrad 등, Natural Product Ltters 2001, 15, 35).

[실험예 1] 치자 추출물 및 분리된 화합물들의 자유라디칼 소거효과

1) 실험 방법

자유라디칼 소거 (free radical scavenging)작용 (Blois 등, Nature, 1958, 181, 1199)은 100 μM 1,1-디페닐-2-피크릴 히드라질 (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl; DPPH) 에탄올 용액 190 ㎕에 실시예 1 에서 분획한 치자 추출물 및 실시예 3에서 분리한 각 화합물들의 에탄올 용액 10 ㎕를 가해 30분 동안 37 ℃에서 반응시킨 후, 515 nm에서 흡광도를 측정하여 자유라디칼 소거효과를 IC₅₀ 값으로 구하였다.

IC₅₀은 자유라디칼 소거 효과를 계산하여 50% 억제효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)를 의미한다.

실시예 1에서 분획한 치자 추출물 및 실시예 3에서 분리한 각 화합물들과 기존 소거제 아스코르빈산 (비타민 C), 알파-토코페롤 (비타민 E), 레스베라트롤 (resveratrol)등의 항산화제들의 자유라디칼 소거효과를 비교하여 결과를 표 4에 제시하였다. 제시되는 데이터는 3회 실시 평균값이다.

시험물질	자유라디칼 소거효과 (IC ₅₀ , ㎕/ml)
메탄올 추출물	>50
디클로로메탄 분획	>50
에틸아세테이트 분획	14.02 ±1.25
부탄올 분획	>50
물 분획	>50
화합물1	8.25 ±0.17
화합물2	4.39 ±0.02
화합물3	6.08 ±0.06
화합물4	8.5 ±0.36
화합물5	9.52 ±0.31
화합물6	22.67 ±0.44
화합물7	7.1±0.42
화합물8	5.88 ±0.71
화합물9	16.56 ±1.04
화합물10	5.64 ±0.11
화합물11	5.89±0.21
화합물12	>50
화합물13	>50
화합물14	3.22 ±0.08
화합물15	6.94 ±1.06
아스코르빈산 (비타민 C)	5.53 ±0.13
α-토코페롤 (비타민 E)	9.42 ±0.26
레스베라트롤 (resveratrol)	17.05 ±1.08

표 4에서 알 수 있는 바와 같이 치자의 에틸 아세테이트 분획 및 그로부터 분리한 화합물들은 높은 자유라디칼 소거활성을 나타내고 있다.

실시예 1에서 분획한 치자 추출물 및 실시예 3에서 분리한 각 화합물들의 자유라디칼 소거효과를 기존의 활성산소 소거제과 비교한 결과, 치자의 메탄올 추출물과 부탄올 분획의 자유라디칼 소거효과는 레스베라트롤이나 아스코르빈산 (비타민 C)의 자유라디칼 소거효과와 유사한 효과를 나타나고 있다. 또한, 에틸 아세테이트 분획과 에틸 아세테이트로부터 분리한 화합물 대부분은 α-토코페롤 (비타민 E)보다 우수한 효과를 보이고 있음을 알 수 있다.

[실험예 2] 치자 추출물 및 분리된 화합물들의 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이 드음이온라디칼(O₂ ^-)의 소거 효과

1) 실험 방법

잔틴 (Xanthine)과 잔틴 옥시다제 (xanthine oxidase, XOD)의 반응으로 생성되는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 (superoxide anion radical)의 생성을 억제시키는 효능을 평가하기 위하여 토다 등 (Toda, et al., Planta, Med. 57:8, 1991)의 방법을 하기와 같이 수행하였다.

즉, 0.1 mM 잔틴, 0.1 mM EDTA, 50 ㎍/㎖ 소혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA), 25 mM 니트로블루 테트라졸린 (Nitroblue tetrazolium, NBT)과 40 mM Na₂CO₃용액, 각 농도별로 희석한 시험 화합물 용액, 그리고 1.4 x 10^-3 단위 XOD를 포함하는 최종부피가 200 ㎕인 용액을 혼합하여 25 ℃에서 20분간 반응시켰다. 상기 반응용액에 6 mM CuCl₂ 6.6 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 생성된 포마잔 (formazan)을 560 ㎚에서 흡광도를 측정하여 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 소거효과를 비교한 결과를 IC₅₀ 값으로 구하였다. IC₅₀은 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 소거 효과를 계산하여 50% 억제효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)를 의미한다.

실시예 1에서 분획한 치자 추출물과 실시예 3에서 분리한 각 화합물의 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거효과를 기존의 활성산소 소거제인 아스코르빈산 (비타민 C), 알파-토코페롤 (비타민 E), 레스베라트롤 (resveratrol)의 효과와 비교한 결과를 표 5에 나타내었다. 제시되는 데이터는 3회 실시 평균값이다.

시험물질	잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 (superoxide anion radical, O₂ ·^-) 소거효과 (IC₅₀, μg/ml)
메탄올 추출물	36.14 ±8.43
디클로로메탄 분획	>50
에틸아세테이트 분획	1.46 ±0.32
부탄올 분획	18.03 ±3.23
물 분획	47.39 ±4.32
화합물1	1.8 ±0.43
화합물2	2.28 ±0.23
화합물3	2.04 ±0.27
화합물4	2.16 ±0.31
화합물5	2.69 ±0.09
화합물6	46.32 ±3.5
화합물7	0.97 ±0.02
화합물8	>50
화합물9	3.41 ±0.27
화합물10	2.90 ±0.14
화합물11	3.29 ±0.42
화합물12	>50
화합물13	>50
화합물14	0.54 ±0.03
화합물15	12.97 ±3.12
아스코르빈산 (비타민 C)	>50
α-토코페롤 (비타민 E)	>50
레스베라트롤 (resveratrol)	>50

표 5에 보인바와 같이, 치자 메탄올 추출물과 메탄올 추출물로부터 분획한 에틸 아세테이트 분획의 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 소거효과를 기존의 소거제들과 비교한 결과, 치자의 메탄올 추출물과 메탄올 추출물로부터 분획한 에틸 아세테이트 분획 그리고 부탄올 분획이 매우 높은 활성을 나타내고 있음 을 알 수 있었으며, 에틸 아세테이트분획은 특별히 높은 활성을 나타내고 있음을 확인할 수 있다. 또한, 에틸 아세테이트로부터 분리한 화합물 대부분에서 높은 활성산소 소거활성을 나타내고 있었으며, 특히 화합물 7과 14의 효과는 상당히 우수하게 나타나고 있으며, 6종의 신규 화합물들 또한 우수한 효과를 나타내고 있어 이들이 항산화 효과의 주성분임을 입증하고 있다. 이들 화합물 외에 다른 화합물들도 항산화효과를 나타내고 있음을 알 수 있다. 그러나 기존의 항산화제로 알려진 화합물 대부분은 효과가 없음을 알 수 있다.

[실험예 3] 치자 추출물 및 분리된 화합물들의 지질과산화물 생성 억제 효과

1) 실험 방법

치자 추출물 및 분리된 화합물들의 지질과산화물 생성 억제 효과를 실험하였다. 지질과산화물은 여러 산화반응에 의해 지질이 과산화 되어 생성되는 물질로, 각종 반응성이 큰 활성산소와 자유 라디칼 (free radical) 등이 불포화 지방산이 다량 함유된 세포막의 인지질을 산화시켜 세포막에 지질과산화물이 생성된다. 세포막에 지질과산화물이 축적되면 세포막의 유동성과 기능성이 저하되어 세포기능이 저해되고 세포구조가 변화되는 등 조직상에 국소적인 장애가 생긴다. 치자 추출물 및 분리된 화합물들의 지질과산화물 생성 억제 효과를 다음과 같이 측정하였다.

에이에이피에이치 (AAPH) [2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)디히드로클로라이드, 2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride]에 의한 리놀렌산 (linoleic acid)의 산화작용을 억제시키는 효능을 평가하기 위해 라메트 등 (Ramette, 등 J. Chem. Edu. 1963, 40, 71)의 페릭 티오시아네이트 방법 (Ferric thiocyanate assay)을 수정하여 실시하였다.

즉, 3 ㎎/㎖ 리놀렌산, 15 ㎎/㎖ Tween-20, 0.2 M 나트륨 포스페이트 완충용액 (pH7.0), 1.7 mM AAPH를 혼합하여 만든 용액에 에탄올에 희석한 시료용액을 최종부피가 300 ㎕ 되도록 혼합하여 37 ℃에서 150분간 반응시켰다. (반응용액중 각 시료의 최종농도는 3.125 ㎍/㎖였다). 상기 반응용액 0.1 ㎖와 30% 암모늄 티오시아네이트 (ammonium thiocyanate) 0.1 ㎖, 2x10^-2M 염화제이철 (FeCl₂) 0.1 ㎖를 혼합하여 3분후에 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)로 500 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 실시예 1에서 분획한 치자 추출물과 실시예 3에서 분리한 각 화합물의 지질과산화물 생성 억제율 (A, %)을 이하의 공식으로 구하고 그 결과를 표 6에 나타내었다. 기존 소거제인 아스코르빈산 (비타민 C), 알파-토코페롤 (비타민 E), 레스베라트롤및 트롤록스의 효과와 비교한 결과를 표 6에 나타내었다. 제시되는 값은 3회 평균값이다.

A (%) = 시험물질 시료의 반응흡광도/대조군의 반응흡광도 x 100

시험물질	지질과산화물 생성 억제율 (%)
메탄올 추출물	23.5
디클로로메탄 분획	1.6
에틸아세테이트 분획	49.9
부탄올 분획	31.1
물 분획	3.7
화합물1	56.0
화합물2	52.0
화합물3	54.9
화합물4	54.7
화합물5	53.8
화합물6	38.4
화합물7	51.1
화합물8	54.2
화합물9	49.9
화합물10	51.5
화합물11	51.7
화합물12	4.8
화합물13	2.0
화합물14	54.1
화합물15	38.1
아스코르빈산 (비타민 C)	44.1
α-토코페롤 (비타민 E)	61.2
레스베라트롤 (resveratrol)	39.1
트롤록스 (Trolox)	61.6

표 6에서 보이는 바와 같이, 치자 메탄올 추출물과 메탄올 추출물로부터 분획한 에틸 아세테이트 분획에서 높은 활성을 보여주고 있으며, 부탄올 분획에서 유의성이 있는 활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다. 또한, 에틸 아세테이트로부터 분리한 화합물 대부분에서 높은 활성을 보여주고 있는데 이는 항산제로 잘 알려진 여러 화합물과 유사한 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다. 따라서 치자 추출물 및 분리된 화합물들은 대조물질과 비교할 만한 지질과산화 저해활성을 나타내었다.

[실험예 4] 효소활성 측정 및 활성억제제 검색

인티그라제의 활성을 측정하기 위해서, 바이러스 DNA의 끝 부분 염기배열과 같은 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 인티그라제의 엔도뉴클레오타이드 절단활성 (endonucleolytic cleavage activity)를 측정하여 결정하였다. 측정에 사용한 올리고뉴클레오타이드 A (5'TGTGGAAAATCTCTAGCAGT3')의 3' 말단을 다음과 같이 표식하였다. 5 ㎕ (100 ng)의 올리고뉴클레오타이드 A를 10 X 키나제 완충액 (0.5 M TrisHCl, pH 8.0, 0.1 M MgCl₂, 50 mM DTT, 1 mM EDTA) 4 ㎕, ³²P-ATP (5 mCi/㎖) 30 ㎕ 와 T4 DNA 폴리뉴클레오타이드 키나제 (10 unit/㎕) 1 ㎕ 에 넣고 37 ℃에서 30 분간 반응하고 1 ㎕의 0.5 M EDTA를 넣고 85 ℃에서 15 분간 가열하였다. 상보적 올리고뉴클레오타이드 B (5'ACTGCTAGAGATTTTCCACA3') 10 ㎕ (200 ng)을 넣고 끓는 물 속에 담근 후, 하룻밤 동안 천천히 식혔다. 반응하지 않은 ³²P-ATP는 Sephadex G25 칼럼을 이용해서 분리하여 제거하였다. 먼저 미리 충진된 칼럼에 존재하는 용액을 버리고, TEN (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) 5 ㎖ 로 겔을 세척하고, 상층에 반응물 (약 52 ㎕)를 마이크로피펫으로 로딩하고, 용출액을 한 분획에 2 방울씩 (약 100 ㎕) 모았다. 반응물이 완전히 흡수된 후, 200 ㎕ 의 TEN으로 두 번 세척하고, 4 ㎖의 TEN으로 세척하였다. 각 분획 1 ㎕를 와트만 여과지에 점적하고 방사능 양을 측정하여 표식된 올리고뉴클레오타이드 위치를 확인하였다.

절단활성은 3 pmol의 표식된 올리고뉴클레오타이드 기질과 30 pmol의 인티그 라제를 10 ㎕의 10 mM TrisHCl, 1 mM MnCl₂에 넣고 34 ℃에서 90 분간 반응시켰다. 반응은 4 ㎕의 반응종료용액을 넣어 종료시키고, 2-4 ㎕의 반응물을 20% 폴리아크릴아미드 서열분석용 겔에 로딩하여 20 염기의 기질이 18염기로 전환된 것을 측정하였다. 이 반응의 최적조건을 알기 위하여 반응 완충액의 조성과 2가 금속이온의 종류와 농도를 달리하여 절단분석을 반복적으로 시행하여 가장 적합한 반응조건을 확립하고, 이를 토대로 효소활성 발현의 저해제로 작용할 수 있는 화합물들의 존재하에 반응을 수행하여 그 활성의 감소를 측정하여 저해제를 탐색하였다.

[실험예 5] 치자 추출물로부터 분리한 화합물들의 HIV 인티그라제 저해효과

치자 아세트산에틸로부터 분리한 화합물들의 인간면역결핍바이러스 인티그라제에 대한 저해활성을 관찰하였다. 이들 화합물들의 인간면역결핍바이러스 인티그라제에 대한 저해활성은 방사선 동위원소를 화합물내에 포함하고 있는 올리고 뉴클레오타이드 기질이 면역결핍바이러스 인티그라제에 의해 분해되는 것을 본 화합물이 얼마나 저해하는가, 즉 효소반응 후 얻어진 반응 부산물을 전기영동하여 얻어진 젤에 대한 오토라디오그라피 (autoradiography)를 실시하여 결정하였다 (Oh 등, Mol. Cells, 1996, 6, 96). 치자추출물로부터 분리한 화합물들의 인간면역 결핍 바이러스 인테그레이즈에 대한 저해효과 결과를 IC₅₀ 값으로 나타낸 결과를 표 7에 나타내었다. IC₅₀은 억제효과를 계산하여 50% 저해효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)를 의미한다.

시험물질	IC ₅₀ (μg/ml)
화합물1	19.4 ±2.1
화합물2	20.1 ±5.1
화합물3	43.5 ±3.9
화합물4	23.6 ±6.8
화합물5	47.4 ±4.5
화합물6	>100
화합물7	44.5± 7.1
화합물8	-
화합물9	-
화합물10	5.9 ±2.1
화합물11	5.4 ±2.6
화합물12	>100
화합물13	>100
화합물14	-
화합물15	-
치커릭산 (L-chicoric acid)^a	7.4 ±3.3
커쿠민 (curcumin)	51.3 ±3.5

^a치커릭산 (L-chicoric acid)은 알려진 문헌에 따라서 제조하여 사용했다 (King 등, Journal of Medicinal Chemistry 1999, 42, 497).

본 발명의 치자 추출물로부터 분리된 화합물들의 인티그라제 저해효능을 비교하기 위하여 대조약물로 기존에 항바이러스 물질로 잘 알려진 치커릭산 (L-chicoric acid)과 커쿠민 (curcumin)을 사용하였다.

실시예 3에서 분리한 각 화합물들의 항HIV효과를 비교한 결과, 치자의 아세트산에틸 분획로부터 분리한 화합물 대부분 우수한 항HIV활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다.

[실험예 6] 항바이러스 활성 및 세포독성 시험

본 발명의 치자 추출물로부터 분리한 화합물들의 항바이러스활성효과를 알아보기 위하여 공지된 방법 (Tanaka 등, J. Med. Chem., 1991, 34, 349)에 따라 다음과 같이 시험관내 HIV-1 억제효과 시험을 실시하였다. 숙주세포로서 MT-4세포를 사용하여 본 발명의 화합물이 바이러스에 감염된 MT-4세포의 세포독성을 저해하는 정도를 조사하였다.

배양 배지에 MT-4세포를 1x10⁴ 세포/㎖의 농도로 분산시킨 다음, 500 TCID₅₀ (세포의 50%가 감염되는 농도)/웰이 되도록 HIV-1을 접종하였다. 접종 즉시 본 발명의 추출물 및 추출물로부터 분리된 화합물의 시료가 들어있는 편편한 미세역가판에 세포분산액을 100 ㎕씩 옮기고 약 4일내지 5일간 37 ℃에서 배양한 후, MTT방법을 이용하여 항바이러스 활성을 판정하였다. 동시에, mock-감염된 숙주세포의 생존성을 MTT방법으로 측정함으로써 세포독성도 판정하였다. 참고화합물로는 치커릭산 (L-chicoric acid)과 커쿠민 (curcumin)를 대조 약물로 사용하여 약효검색을 시행하였다. 치자의 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리한 화합물들의 HIV 세포라인에서의 저해효과를 표 8에 나타내었다.

화합물	EC_{50 (}㎍/㎖)^a	CC₅₀ (㎍/㎖)^b	S.I.^c
화합물10	100	123.79	1.20
치커릭산 (L-chicoric acid)	54.33	>150	>2.76
커쿠민 (curcumin)	>0.32	0.32	<1

^a EC₅₀ ; HIV-1의 증식을 50% 억제하는 농도

^bCC₅₀; MT-4 세포에 대한 50% 세포손상 농도

^c선택도; Selectivity Index (CD₅₀/ED₅₀)

치자의 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리한 화합물들의 항바이러스효과를 치커릭산 (L-chicoric acid)과 커쿠민 (curcumin)을 대조 약물로 사용하여 약효검색을 시행한 결과 화합물 10이 HIV cell line에서도 EC₅₀가 100 ㎍/㎖로 커쿠민 (curcumin) 및 치커릭산 (L-chicoric acid)보다는 효과가 약하게 나타나지만 커쿠민은 강한 독성을 나타내고 있는 반면에 화합물 10은 유효농도 이상에서 독성을 나타내고 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 치자 추출물 및 그로부터 분리된 신규 화합물들은 다음과 같은 효과를 가진다.

1. DPPH 자유라디칼, 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼등의 활성산소 소거활성이 우수하며 지질 과산화물 생성 억제율이 뛰어나다. 따라서 본 발명의 치자 추출물 및 그로부터 분리된 신규 화합물은 그 활성산소 소거활성이 뛰어나고 안전하며 치자로부터 대량 분리가 가능하여 저렴하게 생산할 수 있으므로, 이들을 유효성분으로 포함한 약학 조성물들은 활성 산소에 의한 질병 즉 노화 (aging), 암 (cancer), 복합성 동맥경화 (multiple atherosclerosis), 관절염, 파킨슨병 (Parkinson's disease), 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 혈관장애, 고지혈증, 심근경색 또는 뇌경색 및 피부노화등을 치료 및 예방하는데 유효하게 사용할 수 있다. 또한, 식품이나 화장품 등에 배합하면 식품이나 화잠품등의 제품의 가치를 높일 수 있다.

2. HIV 인티그라제 저해 효과 및 HIV-1 억제 효과가 뛰어나, 항 HIV제제, 특히 HIV 인티그라제 저해제로서, 종래의 HIV 치료제인 역전사효소 저해제나 프로티아제 저해제의 문제점인 약물내성이나 부작용이 적은 AIDS치료제로 활용될 수 있다.

Claims

물, 또는 C_1~3의 저급알코올, 에틸아세테이트, 디클로로메탄 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 유기용매로 추출되며,

활성성분으로 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트, 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트, 메틸3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트, 3,5-O- 디카페오일퀴닉산 및 4,5-O-디카페오일퀴닉산을 포함하는 항HIV 활성을 나타내는 치자추출물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 치자추출물이

(1) 치자에 60 - 100% 메탄올, 60 - 100% 에탄올을 가하여 추출하는 추출단계;

(2) 상기 추출단계에서 수득되는 알콜추출물을 여과한 후, 감압 농축시키는 농축단계;

(3) 상기 농축단계에서 수득되는 농축물에 일정량의 물을 가하여 현탁시키는 단계; 및

(4) 상기 현탁단계에서 수득되는 현탁액에 에틸 아세테이트를 가하여 에틸 아세테이트층을 분획하는 분획단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 치자추출물.
하기 화학식 1의 화합물 또는 그 약제학적으로 허용되는 염

화학식 1

상기 화학식 1에서, R₁은 메틸 또는 에틸이고, R₂는 수소 또는 카페오일이고, R₃는 수소, 시나포일 또는 (3-히드록시-3-메틸)글루타로일이며, R₄는 카페오일 또는 시나포일이다.
제 4항에 있어서, 상기 화합물이

(1) 메틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트,

(2) 메틸 3,5-O-디카페오일-4-O-(3-히드록시-3-메틸)글루타로일퀴네이트,

(3) 에틸 5-O-카페오일-4-O-시나포일퀴네이트,

(4) 메틸3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트 또는

(5) 에틸 3-O-카페오일-5-O-시나포일퀴네이트인 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식 5의 바닐릭산 4-O-β-D-(6'-시나포일)글루코피라노사이드 또는 그 약제학적으로 허용되는 염.

화학식 5
삭제
제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 화합물을 유효성분으로 함유하는 노화, 암, 복합성 동맥경화, 관절염, 파킨슨병, 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 혈관장애 질환, 고지혈증, 심근경색 또는 뇌경색의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 1항의 치자추출물 또는 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 화합물을 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료 또는 증상 완화용 약학 조성물.
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