KR100520496B1

KR100520496B1 - 세포사멸 유도작용을 갖는 락톤 화합물

Info

Publication number: KR100520496B1
Application number: KR10-2002-0035558A
Authority: KR
Inventors: 이형규; 권옥경; 안경섭; 민병선; 김미란; 김정희
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-06-25
Filing date: 2002-06-25
Publication date: 2005-10-11
Also published as: KR20040003114A

Abstract

본 발명은 세포사멸 유도작용을 갖는 락톤 화합물에 관한 것으로서, 본 발명의 육박나무로부터 얻어진 락톤 화합물은 세포사멸 활성을 나타내고, 또한 독성이 적어 세포들의 이상 증가와 활성화에 의해 야기되는 면역계 질환이나 뇌질환 등을 포함하는 다양한 난치성 및 만성질환의 치료제 및 치료보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포사멸 유도작용을 갖는 락톤 화합물{LACTONE COMPOUNDS WITH APOPTOSIS-INDUCING ACTIVITY ON CELLS}

본 발명은 육박나무로부터 얻어진 세포사멸 유도작용을 갖는 락톤 화합물에 관한 것으로, 세포들의 이상증가와 활성화에 의해 야기되는 면역계 질환이나 뇌질환 등을 포함하는 다양한 난치성 및 만성질환의 치료제 및 치료보조제로 사용할 수 있는 락톤 화합물에 관한 것이다.

생명체를 구성하고 있는 다양한 종류의 세포들은 여러 경로를 통하여 사멸(死滅)될 수 있다. 1972년에 케어 등[Kerr et al.]에 의해 처음 언급된 세포사멸(apoptosis)은 다세포 생명체의 정상적인 기관의 발달과 조직의 항상성 유지에 필수적인 생리현상 중의 하나로서, 이는 어떤 자극에 대해 반응하는 세포에서 선택적으로 일어나는 대표적인 세포내 작용 메카니즘이다. 구체적으로 세포는 영양분의 고갈, 바이러스, 산소 라디칼 또는 염색체를 손상시키는 약제와 같은 다양한 스트레스에 의해 계획된 죽음을 일으킬 수 있으며, 이러한 세포사멸 현상은 염색제의 응집, 수포 형성, 세포의 응축, 사멸체(apoptotic body) 형성과 같은 특이한 형태적인 변화와 카스파제(caspase) 효소계의 활성화, 핵내 염색체의 분절을 관찰함으로써 알 수 있다 [John D R, Sten O, Boris Z, 2000, J. Structur. Biol. 129, 346∼358; Takeuchi M, Hayakawa A, Takagi K, Hiramatsu K, Shimizu Y, Matsumoto S, Hiramatsu T, Ito Y, Kume H, Suzuki R, Yamaki K, 1999, Apoptosis 4, 461∼468].

세포사멸은 조직의 항상성 유지를 위한 생리적 기능을 수행할 뿐만 아니라 세포사멸의 비정상적인 억제 또는 촉진으로 인한 세포의 증식성 질환 내지는 해당 세포의 소실로 인한 각종 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한 면역반응의 조절기전 중의 하나가 면역담당 세포인 림프구의 세포사멸에 의해 림프구 조직의 항상성을 유지하게 되며, 림프구가 표적세포를 살해하는 과정도 세포사멸에 의해 이루어지게 된다.

최근 세포사멸이 세포 증식과 함께 조직의 항상성 유지에 중요한 역할을 함에 따라 면역질환 및 종양을 비롯한 많은 질환들이 세포사멸의 조절이상으로 발생한다는 새로운 실례가 대두되게 되었다. 따라서 인체의 많은 질환들의 발병기전의 이해 및 이에 따른 치료 방식의 개발을 위해서는 인체 각 조직에서 세포사멸 조절기전에 대한 이해가 큰 관심사로 떠오르게 되었고, 이에 의약학 산업 분야에서의 세포사멸은 부가가치가 높은 부분으로 부상하였다.

최근 사이클로스포린(cyclosporine)[Kitagaki et. al. BBRC, 1996, 222, 77∼77] 및 SB203570[Kankaanranta et. al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1999, 290, 621∼628] 등의 활성이 보고된 바 있으며, 또한 천연물에서는 바이카린이나 바이카레인이 암세포의 세포사멸 유기제로서 항암제로 사용할 수 있다고 보고된 바 있다[PCT/JP93/00614]. 그러나 통상적인 세포사멸 활성을 나타내는 화합물은 대부분 암세포주에 대한 세포사멸 활성을 보고한 것으로 호산구와 같은 염증성세포의 세포사멸 활성과는 다르다.

지난 수년간 기관지 천식이 기도의 임상적인 염증이며 다양한 염증세포들 중 호산구(eosinophil)가 천식환자의 기관지 염증에 중요한 역할을 한다고 알려져 왔다[Barnes P.J., 1992, J. Intern. Med. 231, 451∼461; Busse WW, Nagata M, Sedgwich JB, Eur. Respir. J. 1996, 9(Suppl 2), 132S∼135S; Myra S, Laura M, John S, Christopher H, J. Immunol. 1992, 148(11), 3543∼3549; Gleich GJ, J. Allergy clin. Immunol. 1990, 85(2), 422∼36]. 구체적으로 호산구의 부산물이 표피에 손상을 주거나, 기관지 협착증, 천식환자의 기도에 부종과 점액전과 같은 조직독성을 나타낼 수 있으며, 이러한 과도하게 존재 및 활성화된 호산구를 효과적으로 제어하는 것이 천식 등의 호산구성 질환을 치료하는 데 있어 매우 중요한 것으로 알려지고 있다[Simon HU, Blaser K, 1995, Immun. Today 16, 53-55; Haslett C, 1997, British Med. Bull. 53, 669-683]. 이러한 호산구를 제거하는 치료제로서 글루코코르티코이드(glucocorticoid)나 테오필린(theophiline)등이 알려져 있으며 현재 임상에서 천식치료제로 사용하고 있다. 그러나, 이들은 장기간 복용시 체내 대사 이상이나 백내장 등 여러 스테로이드성 부작용을 나타내는 단점이 있다. 이에 염증성 세포의 세포사멸 활성을 나타내고, 부작용이 적은 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 육박나무(Actinodaphne lancifolia Sieb. et Zucc., Lauraceae)는 한국, 일본, 타이완 등의 산기슭에서 분포하는 쌍떡잎식물 미나리아재비목 녹나무과의 상록활엽 교목으로서, 주로 관상수로 심으며 목재는 기구재나 땔감, 악기등을 만드는데 사용된다. 육박나무의 성분은 라우릴산을 주성분으로 하는 지방산류, 세스퀴로세푸란(sesquirosefuran)과 롱기폴린(longifolin), 란시폴라이드(lancifolide)와 이소란시폴라이드(isolancifolide)가 있으며 약효의 연구는 보고된 것이 없으며, 또한 육박나무를 이용한 호산구 세포사멸 활성에 대한 연구도 아직 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 세포사멸 효과를 가진 물질을 연구하던 중, 육박나무로부터 얻어진 락톤 화합물이 세포사멸 활성을 나타내고, 또한 독성이 적어 세포들의 이상 증가와 활성화에 관련된 면역계 질환이나 뇌질환 등을 포함하는 다양한 난치성, 만성질환의 치료제 및 치료보조제로서의 기능성 식품으로 사용할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 락톤 화합물 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 세포들의 이상 증가와 활성화에 의해 야기되는 질병치료제 및 기능성 식품으로서의 용도를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 육박나무로부터 세포사멸 활성을 나타내는 락톤 화합물을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 락톤 화합물 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 세포들의 이상 증가와 활성화에 의해 야기되는 질병치료제 및 기능성 식품으로서의 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 육박나무로부터 세포사멸 활성을 나타내는 락톤 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 락톤 화합물 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 세포들의 이상 증가와 활성화에 의해 야기되는 질병치료제 및 기능성 식품으로서의 용도를 포함한다.

더욱 구체적으로 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이소란시폴라이드(isolancifolide), 하기 화학식 2로 표시되는 란시폴라이드(lancifolide), 하기 화학식 3으로 표시되는 액티놀라이드 B(actinolide B) 또는 그의 유도체를 유효성분으로 하는 세포들의 이상 증가와 활성화에 의해 야기되는 질병치료제를 포함한다.

상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 락톤 화합물은 그의 유도체도 이용가능하며, 본 발명에서 이용될 수 있는 락톤 화합물의 유도체는 가수분해되어 쉽게 얻을 수 있는 에스테르 형태인 것 등이 있으며, 바람직하게는 C₁∼C₄의 알킬기를 포함한 에스테르이다. 그러나, 상기 유도체는 에스테르 형태로 한정하지 않는다.

상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 락톤 화합물은 다양한 방법으로 제조할 수 있으며, 구체적으로 화학적 합성 또는 식물에서 추출하여 얻을 수 있다.

본 발명의 락톤 화합물은 세포사멸에 대한 활성을 나타내고 있다. 하기 실시 예에서 세포사멸의 유도작용을 알아보기 위하여 형광검출법에 의한 호산구성 세포의 세포사멸 유도작용, 카스파제-3 활성 시험법에 의한 세포사멸 유도작용 및 DNA 분절 시험법에 의한 세포사멸 유도작용을 조사하였다.

그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 이소란시폴라이드(40 μM)에 대해 형광활성(T/C)이 2.12이며, 란시폴라이드(40 μM)의 경우 1.82, 액티놀라이드 B의 경우 2.73으로 모두 형광활성을 나타내었으며, 그 중 특히 란시폴라이드 80 μM에서 활성이 가장 높게 나타났다.

하기 표 2에서 보는 바와 같이, 이소란시폴라이드(40 μM)에 대해 카스파제-3 활성(T/C)이 3.56±0.52이며, 란시폴라이드(40 μM)의 경우 3.92±0.39, 액티놀라이드 B의 경우 1.16±0.08로 모두 카스파제-3 활성을 나타내었으며, 특히 액티놀라이드 B에 비해서 이소란시폴라이드와 란시폴라이드의 활성이 더욱 강하게 나타났다.

또한, 도 4에서 보는 바와 같이, 양성 대조군으로 사용된 캠토세신은 활성이 우수하게 나타났지만 매우 강한 세포독성을 나타내서 장 내피세포 파괴로 인한 설사 조혈작용 저해 치료제로 사용하기 심각한 부작용이 있는 반면에, 본 발명의 락톤 화합물은 우수한 DNA 분절 현상을 유도하는 것을 나타났으며, 특별한 세포독성 관련한 부작용이 관찰되지 않는다.

상기와 같이 본 발명의 락톤 화합물 및 그의 유도체는 세포사멸 활성 효과는 나타낸다. 이로 인해 락톤 화합물은 세포들의 이상 증가와 활성화에 관련된 천식, 관절염, 알레르기, 낭창(lupus), 크론씨병(Crohn's disease), 산화성 방출(oxidative burst) 및 AIDS와 같은 면역계 질환 및 파킨슨씨병, 노인성 치매, 헌팅톤 질병 및 뇌졸중과 같은 뇌질환 등을 포함하는 다양한 난치성, 만성질환의 예방 및 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 락톤 화합물 및 그의 유도체는 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 락톤 화합물 및 그의 유도체는 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 락톤화합물 및 그의 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수용성제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 락톤 화합물의 경우, 0.01∼100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1∼10 ㎎/㎏이며, 하루 1∼3회 투여할 수 있다.

본 발명의 락톤 화합물은 실험용 생쥐에 100 ㎎/㎏ 경구투여시 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구 투여 최소치사랑(LD₅₀)은 100 ㎎/㎏ 이상으로 생체 안정성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 락톤 화합물은 생체에 대해 안정하게 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이소란시폴라이드, 하기 화학식 2로 표시되는 란시폴라이드, 하기 화학식 3으로 표시되는 액티놀라이드 B 또는 그의 유도체를 유효성분으로 하는 세포들의 이상 증가와 활성화에 의해 야기되는 세포들의 이상 증가와 활성화에 의해 야기되는 질병치료 보조용 기능성 식품, 건강보조식품 또는 특수영양식품을 포함한다.

본 명세서에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 상기 락톤 화합물 및 그의 유도체를 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다.

기능성 식품과 구별하여, 본 명세서에서 '건강보조식품' 또는 '특수영양식품'이란, 상기 락톤 화합물을 일반 식품에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 건강식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명에 따른 락톤 화합물 및 그의 유도체를 함유하는 기능성 식품, 건강보조식품 및 특수건강식품의 함량은 사용되는 식품군에 따라 다양하게 변화시킬 수 있으며, 그 함량은 상기 약학적 조성물로의 용도시 측정된 독성 범위내에서 수행한다.

또한, 본 발명은 육박나무로부터 세포사멸 유도작용을 갖는 본 발명의 락톤 화합물을 분리하는 방법을 포함한다.

구체적으로, 육박나무(Actinodaphne lancifolia) 분쇄물을 메탄올 또는 메탄올과 물의 혼합 용매에 용해시켜 추출한 후 감압농축하고 헥산과 에틸아세테이트로 각각 분획하여 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계(단계 1), 및

상기 헥산 분획물을 흡착 크로마토그래피를 수행하여 헥산-에틸아세테이트 혼합액으로 분획하여 화학식 1 내지 3의 락톤 화합물을 얻는 것(단계 2)을 특징으로 하는 분리방법을 포함한다.

단계 1은 먼저 육박나무를 환류 냉각장치하에서 메탄올을 이용하여 가열하며 여러차례 연속적으로 추출하여 메탄올 추출액을 얻은 후 감압농축하여 육박나무 메탄올 추출물을 얻는다. 얻어진 육박나무 메탄올 추출물에 물을 첨가하여 현탁시킨 후 헥산과 에틸아세테이트로 분획하여 각각 분획물을 얻는다.

단계 2는 상기 헥산 분획물을 흡착 크로마토그래피를 수행하여 각각의 락톤 화합물로 추출하는데, 흡착 크로마토그래피는 본 분야의 기술자들에 의해 사용되는 통상적인 모든 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 사용한다. 사용되는 용출용매는 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매를 사용한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 육박나무로부터 락톤 화합물의 분리

건조시켜 약 1 ㎜의 크기로 분쇄한 육박나무 분쇄물 약 1 ㎏을 70℃에서 4 ℓ의 메탄올로 5회 추출하고 추출액을 모아 감압농축하여 200 g의 육박나무 메탄올 추출물을 얻었다. 얻어진 메탄올 추출물을 증류수 1 ℓ에 현탁한 후, 헥산과 에틸아세테이트로 각각 분획하였다.

이 중 헥산층을 감압농축시켜 얻은 헥산 분획물(46 g)을 얻은 후 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 용출용매(헥산:에틸아세테이트=50:1→1:1)로 분획을 하였다. 헥산층을 6개의 분획으로 분리하였고, 분리된 분획들 중 2번째 분획의 일부를 다시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용출용매, 헥산:클로로포름:에틸아세테이트=15:1:1→10:1:1)를 실시하여 5개의 분획으로 분리하였다. 이들 중 3번째 분획을 또 다시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용출용매, 헥산:에틸아세테이트=5:1)로 상기 화학식 1의 화합물(이소란시폴라이드), 화학식 2의 화합물(란시폴라이드) 및 화학식 3의 화합물(액티놀라이드 B)을 얻었다.

<실험예 1> 락톤 화합물의 구조분석

(1) 화학식 1의 이소란시폴라이드 화합물

상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1의 이소란시폴라이드 화합물은 무색의 액상 형태로 클로로포름에는 잘 녹았으나 물에는 녹지 않았다.

적외선 흡수 스펙트럼에서는 3600, 3400, 1780, 1685, 1670, 1262 cm^-1에서 피크, 자외선 흡수 스펙스럼에서는 클로르포름을 용매로 266 nm에서 흡수 피크를 보였다.

질량분석결과, 분자량은 252로 나타났다.

구조식은 질량분석과 핵자기공명 스펙트럼을 이용한 수소, 탄소의 개수를 측정한 결과 C₁₅H₂₄O₃으로 나타났다. 수소 핵자기공명 스펙트럼 분석 결과는 다음에 나타내었다. 기타, ¹³C 핵자기공명 스펙트럼 및 ¹H-¹H COSY의 기기분석방법에 의해 상기 이소란시폴라이드의 구조를 결정하였다.

¹H NMR (300 MHz) (도 1 참조)

δ7.07 (1H, td, J=9.0, 2.0, H-6), 5.25 (1H, br s, H-3), 4.94 (1H, dd, J = 3.0, 1.6, H-1), 4.73 (1H, dd, J = 3.0, 1.3, H-1), 2.47 (2H, m, H-7), 1.27 (14H, m, H-8∼H-14), 0.88 (3H, t, J=7.0, H-15).

(2) 화학식 2의 란시폴라이드 화합물

상기 실시예 1에서 얻은 화학식 2의 란시폴라이드 화합물은 무색의 액상 형태로 클로로포름에는 잘 녹았으나 물에는 녹지 않았다.

적외선 흡수 스펙트럼에서는 3580, 3400, 1780, 1680 cm^-1에서 피크, 자외선 흡수 스펙스럼에서는 클로르포름을 용매로 262 nm에서 흡수 피크를 보였다.

질량분석결과, 분자량은 252로 나타났다. 구조식은 질량분석과 핵자기공명 스펙트럼을 이용한 수소, 탄소의 개수를 측정한 결과 C₁₅H₂₄O₃으로 나타났다. 수소 핵자기공명 스펙트럼 분석 결과는 하기에 나타내었다. 기타, ¹³C 핵자기공명 스펙트럼 및 ¹H-¹H COSY의 기기분석방법에 의해 상기 란시폴라이드의 구조를 결정하였다.

¹H NMR (300 MHz) (도 2 참조)

δ6.69 (1H, td, J = 7.5, 2.0, H-6), 5.11 (1H, br s, H-3), 4.89 (1H, dd, J=3.0, 2.0, H-1), 4.67 (1H, dd, = 3.0, 1.6, H-1), 2.77 (2H, m, H-7), 1.26 (14H, m, H-8∼H-14), 0.88 (3H, t, J=6.6, H-15).

(3) 화학식 3의 액티놀라이드 B 화합물

상기 실시예 1에서 얻은 화학식 3의 액티놀라이드 B 화합물은 무색의 액상 형태로 클로로포름에는 잘 녹았으나 물에는 녹지 않았다.

적외선 흡수 스펙트럼에서는 3430, 1750 cm^-1에서 피크, 자외선 흡수 스펙스럼에서는 클로르포름을 용매로 265 nm에서 흡수 피크를 보였다.

질량분석결과, 분자량은 284로 나타났다. 구조식은 고분해 질량분석과 핵자기공명 스펙트럼을 이용한 수소, 탄소의 개수를 측정한 결과 C₁₆H₂₈O₄으로 나타났다. 수소 핵자기공명 스펙트럼 분석 결과는 다음에 나타내었다. 기타, 탄소 핵자기공명 스펙트럼, ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC 및 NOESY의 기기분석방법과 변형 모셔 방법의 화학적 방법에 의해 상기 액티놀라이드 B의 구조를 결정하였다.

¹H NMR (300 MHz) (도 3 참조)

δ 6.37 (1H, td, J=7.7, 1.2, H-6), 4.47 (1H, br s, H-3), 3.36 (3H, s, H-16), 2.62 (2H, m, H-7), 1.54 (3H, s, H-1), 1.28 (14H, m, H-8∼H-14), 0.80 (3H, t, J=6.7, H-15).

<실험예 2> 락톤 화합물의 형광검출법에 의한 호산구성 세포의 세포사멸 유도작용

본 발명에서 형광검출은 FITC-앤넥신 V/PI(fluoresce isothiocyanate- Annexin V/propidium iodide)을 호산구성 세포인 HL-60 clone15 세포에 이중 염색함으로써 세포의 괴사(necrosis)와 사멸(apoptosis)을 함께 측정하였다. 세포사멸시 절단된 염색체는 PI와 결합하고, 이때 세포막의 바깥쪽에 노출된 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)은 앤넥신 V-FITC라는 형광물질과 결합하므로 앤넥신 V-FITC 킷(BD sciences)의 방법에 의해 세포를 이중염색하여 형광검출기로 측정하였다[Vermes, I. C., Hannen, H., et al. 1995, J. Immunol. Meth. 184, 39-51]. 상기 실시예 1에서 분리한 락톤 화합물에 대한 형광활성을 측정하였고, 그 결과는 대조군에 대한 실험군의 형광활성의 비율(T/C)로 나타내었으며 하기 표 1과 같다.

형광활성에 미치는 락톤 화합물의 효과

	농도(마이크로몰)	형광활성(T/C)
이소란시폴라이드(화학식 1)	40	2.12
이소란시폴라이드(화학식 1)	80	2.58
란시폴라이드(화학식 2)	40	1.82
란시폴라이드(화학식 2)	80	4.16
액티놀라이드 B(화학식 3)	40	1.18
액티놀라이드 B(화학식 3)	80	2.73

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 3 종류의 락톤 화합물은 모두 형광활성이 나타났으며, 그 중에서도 특히 란시폴라이드는 80 μM에서 활성이 높게 나타났다.

<실험예 3> 트리테르펜 화합물의 카스파제-3(caspase-3) 활성 시험법에 의한 세포사멸 유도작용

본 발명에서 검체들의 세포사멸 유도작용은 카스파제-3 활성 측정하여 확인하였다. 최소한 1×10⁵ (in 200 ㎕)의 HL-60 세포를 96웰-플레이트의 각 웰당 분주하고, 검체를 일정 농도로 혼합하여 37℃의 CO₂ 배양기 내에서 16 시간 동안 배양하였다. 이를 3000 rpm의 속도로 원심분리하여 상등액은 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 15 ㎕의 용해 버퍼(lysis buffer)을 첨가하여 잘 혼합한 후 상온에서 10분간 방치하였다. 이 세포 용해액을 취하여 형광측정용 플레이트에 각각 옮긴 후, 100 ㎕의 분석용 버퍼(assay buffer)와 10 ㎕의 카스파제-3 기질(Ac-DEVD-AFC)을 첨가, 혼합하여 37℃에서 2시간 반응시켰으며, 400 ㎚의 발광과 505 ㎚의 흡광을 LS50B 형광측정기(perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT)로 형광활성을 측정하였다[MacFarlane, M., Kelvin, C., 1997, J. Cell Biol., 469-479]. 그 결과는 대조군에 대한 실험군의 형광활성의 비율(T/C)로 나타내었으며 하기 표 2와 같다.

카스파제-3 활성에 미치는 락톤 화합물의 효과

	농도(마이크로몰)	카스파제-3 활성(T/C)
이소란시폴라이드(화학식 1)	40	3.56 ±0.52
란시폴라이드(화학식 2)	40	3.92 ±0.39
액티놀라이드 B(화학식 3)	40	1.16 ±0.08

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 화학식 1, 2 및 3의 화합물이 카스파제-3에 대해 활성을 나타내었으며, 액티놀라이드 B에 비해서 이소란시폴라이드와 란시폴라이드의 활성이 더욱 강하게 나타났다.

<실험예 4> 락톤 화합물의 DNA 분절 시험법에 의한 세포사멸 유도작용

본 발명에서 검체들의 DNA분절 유도현상은 2×10⁶(in 10 ㎖)의 HL-60 clone 15 세포에 검체를 10 μM 농도로 혼합하여 37℃의 CO₂ 배양기 내에서 0, 4, 8, 16시간 동안 배양한 후, 아폽토틱 DNA 래더 킷(Apoptotic DNA ladder kit, Roche)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하여 UV 상에서 DNA 분절현상을 확인하였으며[Kojio et al., FEMS Immuno. and Med. Microbiol. 2000. 29, 275-281; Voytas, D., 1987. Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2. 5], 그 결과는 도 4에 나타난 바와 같다.

도 4에서 보는 바와 같이, 1∼4, 5∼8, 9∼12번이 각각의 이소란시폴라이드(화학식 1), 란시폴라이드(화학식 2), 액티놀라이드 B(화학식 3)의 시간에 따른 세포에 대한 DNA 분절 현상을 나타내는 것이다.

양성 대조군으로 사용한 캠토세신은 기존에 알려진 세포사멸 유도물질이며, 캠토세신은 활성이 우수하게 나타났지만 매우 강한 세포독성을 나타내서 장 내피세포 파괴로 인한 설사 조혈작용 저해 등 치료제로 사용하기에 심각한 부작용이 있는 반면에, 본 발명의 락톤 화합물인 이소란시폴라이드 및 란시폴라이드도 우수한 DNA 분절 현상을 유도하는 것으로 나타났으며, 특별한 세포독성 관련한 부작용이 관찰되지 않아서 사용시 더 안전할 것으로 보인다.

<실험예 5> 급성독성시험

6 주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 3 종류의 락톤 화합물 100 ㎎/㎏/㎖의 용량으로 1회 경구투여 하였다. 실험 물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 락톤 화합물은 모두 랫트에서 각각 100 ㎎/㎏/㎖ 까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 100 ㎎/㎏인 안전한 물질로 판단되었다.

<제조예 1> 분말 및 캡슐제의 제조

락톤 화합물 10 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 결정성 셀룰로오스 3 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 No.5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

상기 분말 및 캡슐제의 구성성분은 다음과 같다.

락톤 화합물 ······················ 10 ㎎

락토오스 ·······················14.8 ㎎

결정성 셀룰로오스 ··················· 3 ㎎

마그네슘 스테아레이트 ················ 0.2 ㎎

<제조예 2> 주사액제의 제조

락톤 화합물 10 ㎎, 만니톨 180 ㎎, Na₂HPO₄·12H₂O 26 ㎎ 및 증류수 2974 ㎎을 혼합하여 주사제를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균처리하였다.

락톤 화합물 ······················ 10 ㎎

만니톨 ························ 180 ㎎

Na₂HPO₄·12H₂O ·· ·················· 26 ㎎

증류수 ······················· 2974 ㎎

<제제예 3> 음료의 제조

락톤 화합물 0.1 g, 분말비타민 E, 젓산철, 산화아연, 니코틴산 아미드, 비타민 A, 비타민 B₁ 및 비타민 B₂를 혼합하여 제조하였다.

상기 음료의 구성성분은 다음과 같다.

락톤 화합물 ······················ 0.1 g

비타민 C ························ 15 g

분말비타민 E ····················· 7.5 g

젓산철 ······················· 19.75 g

산화아연 ························3.5 g

니코틴산아미드 ·····················3.5 g

비타민 A ······················· 0.2 g

비타민 B₁ ·······················0.25 g

비타민 B₂ ······················· 0.3 g

물 ··························· 적량

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 육박나무로부터 얻어진 락톤 화합물은 세포사멸 유도활성이 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 세포사멸 유도작용이 우수한 세포사멸 조절제를 제공하는 효과가 있다. 이러한 효과로 인해 본 발명의 락톤 화합물은 생체내에서 비정상적으로 증식된 세포와 관련된 질환, 즉 면역계 질환이나 뇌질환 등을 포함하는 다양한 난치성, 만성질환의 치료 또는 치료보조 목적에 활용할 수 있으며, 독성이 적어 의약이나 기능성식품 산업에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 이소란시폴라이드의 ¹H NMR을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 란시폴라이드의 ¹H NMR을 나타낸 것이다.

도 3는 본 발명의 액티놀라이드 B의 ¹H NMR을 나타낸 것이다.

도 4은 본 발명에서 DNA 분절현상에 미치는 락톤 화합물의 효과를 나타낸 것이다.

M : 대조군(분자량 Marker)

1 : 이소란시폴라이드 처리후 0시간

2 : 이소란시폴라이드 처리후 4시간

3 : 이소란시폴라이드 처리후 8시간

4 : 이소란시폴라이드 처리후 16시간

5 : 란시폴라이드 처리후 0시간

6 : 란시폴라이드 처리후 4시간

7 : 란시폴라이드 처리후 8시간

8 : 란시폴라이드 처리후 16시간

9 : 액티놀라이드 B 처리후 0시간

10 : 액티놀라이드 B 처리후 4시간

11 : 액티놀라이드 B 처리후 8시간

12 : 액티놀라이드 B 처리후 16시간

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 이소란시폴라이드, 화학식 2로 표시되는 란시폴라이드, 및 화학식 3으로 표시되는 액티놀라이드 B 중에서 선택되는 1 이상의 락톤화합물을 유효성분으로 포함하는 천식치료제.

화학식 1

화학식 2

화학식 3
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3의 화합물이,

육박나무(Actinodaphne lancifolia) 분쇄물을 메탄올 또는 메탄올과 물의 혼합 용매에 용해시켜 추출한 후 감압농축하고 헥산과 에틸아세테이트로 각각 분획하여 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계(단계 1), 및

상기 헥산 분획물을 흡착 크로마토그래피를 수행하여 헥산-에틸아세테이트 혼합액으로 분획하는 단계(단계 2)를 통하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 천식 치료제.