KR100475708B1

KR100475708B1 - 크리눔 라티폴리움의 잎으로부터 분리한 항암성 화합물,그의 유도체 및 그를 포함하는 항암제 조성물

Info

Publication number: KR100475708B1
Application number: KR10-2002-0002145A
Authority: KR
Inventors: 안병준
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2002-01-14
Filing date: 2002-01-14
Publication date: 2005-03-10
Also published as: KR20030061981A

Abstract

본발명은 구조식(I) 및 (II)의 화합물들 및 일반식(III)의 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 구조식(I)의 화합물 및/또는 구조식(II)의 화합물을 유효성분으로 하는 함유하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

(I)

(II)

(III)

[식 중, R은 C_1-3 알킬임.

Description

크리눔 라티폴리움의 잎으로부터 분리한 항암성 화합물, 그의 유도체 및 그를 포함하는 항암제 조성물{COMPOUNDS ISOLATED FROM LEAVES OF CRINUM LATIFOLIUM HAVING ANTICANCEROUS ACTIVITY, DERIVATIVES THEREOF, AND COMPOSITION COMPRISING THEM}

본발명은 크리눔 라티폴리움(Crinum latifolium) 잎으로부터 분리한 항암성 화합물, 그의 유도체 및 그를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

수선화과(Amaryllidaceae) Crinum 속에는 한국의 문주란 (Crinum asiaticum var. japonicum Bak) 이외에 전세계에 140여 종이 분포되어 있다. C. latifolium은 월남의 하노이 근교에서 채취한 희귀종이다. 이 식물을 약용으로 사용하였다는 기록은 없으며, 최근 들어 (1989년 경) 월남의 민간인들이 이 식물 잎의 탕제가 자궁암과 전립선암에 유효하다고 주장하고 있다. 그러나 아직 C. latifolium의 항암성에 관한 과학적 연구는 없다. 예비 실험에 의하면 C. latifolium에서 얻은 메탄올 추출물이 인간 배꼽 상피 세포(Human umbilical venous endothelial cell, HUVEC)의 관형성 (tube formation)을 강력히 저해함을 발견하였다. HUVEC의 관형성은 혈관 신생의 초기 단계이며 이를 저해하는 물질은 암조직 내에 형성되는 혈관 신생을 막을 수 있다. 암조직화 과정에서 혈관 형성이 저해되면 암괴의 성장이 불가능해짐으로써 혈관 신생 억제물질은 항암제로써 유망한 물질이 된다(Folkman, J. New England J. Medicine, 285, 1182, 1971).

따라서 본 발명자는 민간에서 항암제로 사용되고 있는 C.latifolium의 잎으로부터 혈관 신생 억제 물질을 분리하고, 그 구조를 확인한 후, 이들의 HUVEC의 관형성 저해 효과를 평가하고, 작용이 좋은 물질을 선택하여 항암 효과를 실험한 결과 항암 효과가 우수함을 발견하여 본발명을 완성하기에 이르렀다.

또한 본발명자는 C.latifolium의 잎으로부터 추출한 물질에 대한 유도체를 실험실적으로 합성하고, 이들에 대해서도 HUVEC 관형성 저해 효과 및 항암 효과를 실험한 결과 일부 물질이 우수한 항암 효과를 나타냄을 발견하였다.

본발명의 첫번째 양상에서, 구조식(I)의 화합물 또는 구조식(II)의 화합물을 제공한다:

(I)

(II)

구조식(I)의 화합물, 즉, 6,7-디메톡시-4- (3-메틸-2-부테노일옥시 메틸)쿠마린 및 구조식(II)의 화합물, 즉 5,6,3'-트리히드록시 -7,8,4'-트리메톡시플라본은 바람직하게는 Crinum latifolium잎으로부터 얻어진다. 본발명자는 Crinum latifolium잎으로부터 얻어진 추출물이 강력한 혈관 신생 억제작용을 가짐을 발견하고, 그 유효성분을 분리하여 그 구조를 확인한 결과 유효성분이 구조식(I)의 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 구조식(II)의 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본임을 밝혀내었고 이 화합물들을 이용하여 항암 실험을 실시하여 유용한 항암 물질임을 발견하였다.

C. latifolium의 잎으로부터의 혈관신생 억제 물질의 분리 및 이 물질의 구조 확인 절차는 다음과 같다.

C. latifolium의 잎으로부터의 혈관신생 억제 물질의 분리

물질 분리는 일반적 방법인 용매 분획과 크로마토그라피 분획을 이용하였다.

간략히 기술하면 건조한 C. latifolium 의 잎을 메탄올로 추출하고 이를 물과 섞은 다음 묽은 염산으로 pH 3-4가 되게 액성을 조절하였다. 여기에 메칠렌 클로라이드(MC)를 가하여 추출하여 극성이 비교적 약한 물질을 얻고 (MC분획), 남은 수용액은 초산에칠(ethyl acetate, EA)로 추출하여 극성이 다소 높은 물질을 분획하였다(EA분획). 위 조작에서 Crinum속에 흔히 함유된 알칼로이드 성분의 대다수는 물층(물분획)에 남아 있다. MC분획은 실리카겔 크로마토그래피를 행하여 분획을 얻고 이들 분획 중 관형성을 저해하는 2개의 분획을 얻고 이들에 대하여 반복적으로 크로마토그라피를 하여 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본을 얻었다.

6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 5,6,3'-트리히드록시

-7,8,4'-트리메톡시플라본의 구조확인

(1) 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린의 구조 결정

항암 활성을 나타내는 두 개의 분획 중 하나의 분획으로부터 정제된 물질에 대해 ¹³C-NMR 및 ¹H-NMR을 측정한 결과 표 1과 같았다.

표 1: 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린의 ¹³C-NMR

(600 MHz) 및 ¹H-NMR(150 MHz) 데이타

표 1의 데이타를 분석한 결과 탄소 17개, 수소 18개로 구성된 물질임을 알 수 있었고, 질량분광 분석 (FAB-CIMS)에서 분자량 318임을 확인하였으므로 이 분자 중에는 산소 6개가 포함되어 있음을 알 수 있다. 질소 함유 물질은 분리과정에서 이미 제거되었다. IR에서 카보닐기가 확인되었으며 ¹³C-NMR에서 카보닐기가 두 개임을 확인할 수 있었다. ¹H-NMR에서 2개의 메톡시기를 확인할 수 있었다.

¹H-NMR상 6.79 ppm 및 6.80 ppm은 이웃 수소가 없고 이웃에 옥시기가 있는 방향족 수소에 해당한다. 6.30 ppm와 5.74 ppm의 두 피크는 a,b-불포화 카보닐 시스템의 2번 수소(카보닐기에 대하여 2번 탄소상에 있는)에 해당한다. 6.30 ppm은 링에 결합된 a,b-불포화 카보닐기의 2번 탄소상의 수소이고 5.74 ppm 은 링 밖에 존재하는 수소로 추정된다. 이들 피크가 이웃 수소를 갖고 있지 않은 것으로 보아 베타-위치에는 수소가 없음을 알 수 있다. 여기까지의 분석을 종합하면 구조 중에는 6,7-디메톡시쿠마린 부분이 들어 있음을 짐작할 수 있었으며, 이는 실제로 소듐 메톡사이드와의 정색 반응에서도 확인되었다.

5.52ppm의 피크는 벤질알콜류의 수소에 대항하며 그러므로 구조중에 옥시메틸기가 존재함을 짐작할 수 있다. 쿠마린 환의 모든 수소가 이웃 수소를 갖고 있지 않은 것으로 보아 옥시메틸기는 쿠마린의 4번 탄소에 결합되어 있음이 틀림없다.

2.15 ppm과 1.89 ppm은 sp2-탄소상에 결합된 메틸기임을 짐작할 수 있다. 위의 분자식 중 산소가 6개 중 2개는 메톡시기이고 남은 4개는 두개의 에스테르기에 기인함을 짐작할 수 있다.

이 분획을 메탄올/수산화칼륨에서 가수 분해한 후 산 부분을 분리하여 구조를 확인한 바 2,2-디메틸아크릴산(3-메틸-2-부텐산)임을 확인하였다.

결론적으로 이 물질의 구조는 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸) 쿠마린임을 확정하였다. 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린의 구조는 도 1의 HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation) 및 HMQC (Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence) 상관관계에 의해서도 확인되었다.

(2) 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본의 구조 결정

얻어진 또다른 분획으로부터 정제된 물질을 FeCl₃ 와 페놀반응을 시킨다. 이 물질에 대해 ¹³C-NMR 및 ¹H-NMR을 측정한 결과 표 2와 같았다.

표 2: 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본의 ¹³C-NMR(600 MHz) 및 ¹H-NMR(150 MHz) 데이타

표 2에서 보는 바와 같이 이 물질은 4 개의 메톡시 탄소를 빼면 15개의 방향족 탄소로 구성된 물질이다. 즉 하나의 플라보노이드임을 알 수 있다. 피크 7.66 ppm (J=2.1 Hz), 6.96 ppm (J=8.43 Hz), 7.61 ppm (J=8.43 Hz, 2.1 Hz)는 3,4-치환된 페닐기임을 쉽게 알 수 있다. 일반적인 플라보노이드의 구조로 보아 B-링이 3,4-디옥시페닐임을 알 수 있다. 6.87 ppm의 singlet는 플라본의 3번 수소에 해당한다. 그렇다면 A-링은 모든 탄소가 치환되어 있음을 알 수 있다. 12.36 ppm에는 수소교 결합을 한 페놀성 수소이며 수소교 결합은 4 번의 카보닐기와의 사이에 있음을 쉽게 알 수 있다. 나머지 메톡시 또는 히드록시기의 위치는 도 2의 HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation) 및 HMQC (Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence) 상관관계로 분석할 수 있다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 8.71 ppm의 페놀성 수소는 5번 및 6번 탄소와 HMBC가 성립됨으로써 HO-7의 수소임을 알 수 있다. 또한 B-링의 7.66 ppm의 수소가 C-3 (147.48 ppm)과 HMBC 관계가 성립되고 이는 다시 9.90 ppm의 HO-3수소와 상관 관계가 있음으로써 HO-3의 수소가 확정되었다. 즉 이 물질은 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본임이 밝혀졌다. 이 물질은 천연으로부터 처음으로 분리되었다.

본 발명의 두 번째 양상에서 본 발명은 아래 일반식(III)의 화합물을 제공한다:

(III)

[식 중, R은 C_1-3 알킬임.

본발명자는 crinum latifolium으로부터 혈관 신생 억제 작용을 갖는 유효 성분이 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본임을 확인하고, 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린을 실험실적으로 합성하고 이 합성법에 준하여 물질군 2 및 물질군 3(실시예 3 참조)의 여러 유도체를 제조하여 항암 효과를 실험해 본 결과, 여러 유도체 중 6,7-디메톡시-4-(p-알콕시신나모일옥시메틸) 쿠마린이 우수한 항암 효과를 가짐을 발견하였다.

본 발명의 세번째 양상에서, 본발명은

(i) 3,4-디톡시페놀과 에틸 4-클로로아세테이트를 Pechman 법에 의하여 황산 중에서 축합하여 4-클로로메틸-6,7-디메톡시쿠마린을 합성하는 단계, 및

(ii) 4-클로로메틸-6,7-디메톡시쿠마린을 트리에틸아민 존재 하에서 상응하는 유기산과 반응시켜 일반식(III)의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 일반식(III)의 화합물의 제조 방법을 제공한다.

본발명의 네번째 양상에서 본발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 구조식(I)의 화합물, 구조식(II)의 화합물 및/또는 일반식(III)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물을 제공한다.

본발명에 따른 항암제 조성물은 더욱 바람직하게는 crinum latifolium의 잎으로부터 추출한 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및/또는 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본을 포함한다.

본 발명에 따르는 구조식(I)의 화합물, 구조식(II)의 화합물 및/또는 일반식(III)의 화합물은 다양한 양에서 강력한 항암효과를 가지고 있어서 임상적으로 유용한 항암제로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 구조식(I)의 화합물, 구조식(II)의 화합물 및/또는 일반식(III)의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물은 임상적으로 이용 시에 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 함께 배합하여, 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면, 정제, 캅셉제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사 시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조 분말 등의 형태인 주사용 제제, 연고제, 크림제, 액제 등의 국소적용형 제제 등의 다양한 제제로 제형화할 수 있다.

본 발명의 조성물 내에서 사용될 수 있는 담체는 약제학적 분야에서 통상적인 것으로, 예를 들면 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 있다. 이렇게 제조된 약제학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로, 예를 들면, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있다. 또한 경구투여시에 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나 정제 등의 경구투여용 고형 제제를 장용피로 피복된 제제로 제형화하여 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 구조식(I)의 화합물, 구조식(II)의 화합물 및/또는 일반식(III)의 화합물의 인체에 대한 투여량은 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 증등도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 10mg내지 50mg으로, 바람직하게는 25mg의 양으로 투여될 수 있다. 이렇게 제형화된 단위투여형은 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관할하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정 시간 간격으로 수회, 바람직하게는 1회 내지 6회 투여할 수 있다.

실시예

본발명은 하기의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 본발명의 이해를 돕기 위해 예시한 것으로 본발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: Crinum latifolium잎의 분획 및 유효 성분의 분리

음건한 Crinum latifolium 잎 2 kg을 잘게 분쇄한 다음 메탄올 3 리터가 들어 있는 추출기에 넣고 3시간 끓인다. 추출물은 여과하여 저장하고 남아 있는 식물체는 다시 동량의 메탄올로 추출한 다음 여과하고 남은 식물체는 다시 한번 추출한다. 추출액(약 10리터)은 감압 농축하여 농축물 96 g을 얻었다. 이를 모두 물 500 ml에 현탁시키고 0.5 N-HCl로 pH 3-4가 되게 한다. 이 산성용액을 메칠렌 클로라이드(MC) 300 ml 씩으로 3회 추출하여 MC 추출물을 모은다. 모은 MC 추출물은 물로써 산성 반응을 보이지 않을 때까지 세척한 후 무수 망초를 가하여 탈수한다. 탈수된 MC층은 감압 하에서 농축한다. 농축물의 양은 23 g이었다(MC분획). 분획의 HUVEC 관형성 억제효과를 측정한 결과 MC분획만이 작용을 보이고 물층은 효과가 없었다.

MC 분획 22 g을 실리카겔 칼럼에서 초산에칠/헥산 혼액 중 초산에칠을 10%에서 50%로 상향 조정하면서 크로마토그라피를 행하여 추출되는 물질군의 색깔에 따라 MC1에서 MC-7까지 7개 분획을 얻었다. HUVEC 저해 효과를 측정한 결과 MC-3, MC-6 및 MC-7이 활성을 보였다.

MC-3(4.0 g)는 다시 같은 칼럼에서 크로마토그라피하여 다시 MC1-1, MC1-2 및 MC1-3의 3 분획을 얻었으며, 이중 MC1-2가 활성을 보였다. 이를(0.8 g) 다시 반복 크로마토그라피하여 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린(구조식 I, 7 mg)을 단리 할 수 있었다. 이는 MC분획 기준으로 할 때 대략 0.03% 수율이다.

분획 MC6 과 MC7(합해서 9.0g)은 박막 상에서 중첩되는 부분이 많아서 혼합하여 실리카겔 칼럼에서 메탄올/MC 혼액으로 메탄올 부분을 2.5에서 7.5%로 올리면서 크로마토그라피하여 MC6-1, MC6-2, MC6-3, MC6-4 및 MC6-5 등 5개의 분획을 얻었다. 억제 작용을 보이는 분획 MC6-4 는 분취용 실리카겔 박막에 적용하고 MC/MeOH/H₂O (7:1:1) 혼액의 하층을 분리하여 전개시켰다. UV하에서 청갈색을 내는 부분을 긁어내어 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본(구조식 II, 28 mg)을 얻었다. 이는 MC분획으로부터 계산하면 0.13% 수율이다.

6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린

흰색 침상 결정; IR (KBr, nmax cm^-1) 1720, 1640, 1610, 1565; FAB-MS m/z (M+) 318.1107; ¹H-NMR (CDCl₃) δ Table 38; ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ ; 표 1 참조.

5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본

노란색 삼각 기둥상 결정; m.p. ℃; IR (KBr, nmax cm^-1) 3500, 3360, 1680, 1600, 1575; EI-MS (70 eV) m/z 360 (M+); ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ Table 38; ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ; 표 2 참조.

실시예 2: 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린의 혼합 제제의 제조

위에서 얻은 MC 분획 중, MC-3, MC-6 및 MC-7을 혼합하여 얻은 혼합 분획으로부터 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린과 5,6,3'

-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본의 혼합 제제(각각 7mg, 28mg임)를 제조하였다.

실시예 3: 6,7-디메톡시-4-(p-메톡시신나모일옥시메틸) 쿠마린을 포함하는 여러가지 유도체의 제조

(1) 물질군 2의 제조

아래와 같은 구조식의 물질군 2를 다음과 같이 제조하였다.

물질군 2

① 6-클로로-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸) 쿠마린(2a)의 제조

4-클로로 페놀(10 mmol)과 에틸 4-클로로아세테이트(15 mmol)를 0 ℃로 냉각한 한 다음 여기에 농 황산 (5 mL)을 가하고 교반하면서 천천히 실온으로 반응온도를 상승시키고 12-16시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 반응물은 얼음물(200ml)에 교반하면서 가한다. 12시간 방치 후 생성된 침전물은 여과한다. 고형물은 물로서 산성반응을 하지 않을 때까지 세척하여 6-클로로-4-클로로메틸 쿠마린을 얻었다.

6-클로로-4-클로로메틸쿠마린(1mmol)과 3-메틸-2-프로펜산(1.5 mmol)을 아세토니트릴(5 mL)에 용해시키고 여기에 트리에틸아민(1.5 mmol)을 가한다. 이 혼액을 실온에서 30분간 교반한다. 이 반응물을 물 (10ml)에 가하고 교반한 다음 메틸렌 클라라이드 15 ml 씩으로 2회 추출한다. 추출액은 0.1N HCl로 흔들어 트리에틸 아민을 제거한다. 추출액은 산성이 나타나지 않을 때까지 물로 세척한 다음 건조 망초로 탈수한다. 탈수된 메틸렌 클로라이드 용액은 증발 건조한다. 건조물을 헥산/에틸 아세테이트 혼합용매로 실리카겔 칼럼 상에서 정제하여 6-클로로-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸) 쿠마린(2a)을 얻었다(수율 65%).

IR(KBr, nmax cm^-1) 1720, 1640; ¹H-NMR(90 MHz, CDCl₃)δ; 7.05 - 6.9(3H, m), 6.32 (1H, s), 5.75 (1H, s), 5.27 (2H, s), 1.93 (3H, s), 2.18 (3H, s).

② 기타 유도체의 제조

상응하는 치환기로 치환된 페놀 유도체로부터 출발하여 상기 실시예 3(1)①에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 아래의 유도체들을 제조하였다.

7-메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸) 쿠마린 (2b)

수율 61%. IR (KBr, max cm^-1) 1730, 1680; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) 6.89-6.73 (3H, m), 6.30 (1H, s), 5.72 (1H, s), 5.25 (2H, s), 3.81 (3H, s), 1.87 (3H, s), 2.09 (3H, s).

6-메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸) 쿠마린(2c)

수율 38%. IR (KBr, max cm^-1) 1720, 1680; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) 6.85-6.74 (3H, m), 6.33 (1H, s), 5.77 (1H, s), 5.21 (2H, s), 3.85 (3H, s), 1.88 (3H, s), 2.12 (3H, s).

6,7-메틸렌디옥시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸) 쿠마린(2d)

수율 72%. IR (KBr, max cm^-1) 1720, 1680; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) 6.88 (1H, s), 6.75 (1H, s), 6.32 (1H, s), 5.95 (2H, s), 5.72 (1H, s), 5.22 (2H, s), 1.88 (3H, s), 2.11 (3H, s).

6,7-벤조-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린(2e)

수율 67%. IR (KBr, max cm^-1) 1730, 1690; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) δ 7.38-6.91 (4H, m), 6.89 (1H, s), 6.77 (1H, s), 6.30 (1H, s), 5.74 (1H, s), 5.23 (2H, s), 1.99 (3H, s), 2.13 (3H, s).

6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린(구조식(I)의 화합물)

수율 34%: 표 1의 데이타 참조

물질군 2의 제법 및 화합물 2a 내지 2e의 구조식을 도식화하면 아래 반응식 1과 같다.

반응식1

(2) 물질군 3의 제조

아래 구조식의 물질군 3을 다음과 같이 제조하였다.

물질군 3

① 4-(2-부테노일옥시메틸)-6,7-디메톡시쿠마린(3a)의 제조

3,4-디메톡시 페놀(10 mmol)과 에틸 4-클로로아세테이트(15 mmol)를 0 ℃로 냉각한 한 다음 여기에 농 황산 (5 mL)을 가하고 교반하면서 천천히 실온으로 반응온도를 상승시키고 12-16시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 반응물은 얼음물(200ml)에 교반하면서 가한다. 12시간 방치 후 생성된 침전물은 여과한다. 고형물은 물로서 산성반응을 하지 않을 때까지 세척하여 6,7-디메톡시-4-클로로메틸 쿠마린을 얻었다.

6,7-디메톡시-4-클로로메틸쿠마린(1mmol)과 2-부텐산(1.5 mmol)을 아세토니트릴(5 mL)에 용해시키고 여기에 트리에틸아민(1.5 mmol)을 가한다. 이 혼액을 실온에서 30분간 교반한다. 이 반응물을 물 (10ml)에 가하고 교반한 다음 메틸렌 클라라이드 15 ml 씩으로 2회 추출한다. 추출액은 0.1N HCl로 흔들어 트리에틸 아민을 제거한다. 추출액은 산성이 나타나지 않을 때까지 물로 세척한 다음 건조 망초로 탈수한다. 탈수된 메틸렌 클로라이드 용액은 증발 건조한다. 건조물을 헥산/에틸 아세테이트 혼합용매로 실리카겔 칼럼 상에서 정제하여 6,7-디메톡시-4-(2-부테노일옥시메틸)쿠마린(3a)을 얻었다.

수율 88%. IR (KBr, max cm^-1) 1725, 1640; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) δ 6.86 (1H, s), 6.80 (1H, s), 6.78 (1H, m), 6.37 (1H, s), 5.77 (1H, d, J = 14.39 Hz), 5.22 (2H, s), 3.88 (3H, s), 3.78 (3H, s), 1.87 (3H, d, J = 7.12 Hz).

② 기타 유도체의 제조

상기 ①에서 합성한 6,7-디메톡시-4-클로로메틸 쿠마린에서 출발하여 상기 실시예 3(2)①에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상응하는 유기산과 반응시켜 아래의 유도체들을 제조하였다.

4-신나모일옥시메틸-6,7-디메톡시쿠마린(3b)

수율 82%. IR (KBr, max cm^-1) 1715, 1640; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) 7.63 (1H, d, J = 15.59 Hz), 7.38-7.05 (5H, m), 6.81 (1H, s), 6.77 (1H, s), 6.47 (1H, d, J = 15.59 Hz), 6.33 (1H, s), 5.22 (2H, s), 3.84 (3H, s), 3.81 (3H, s).

6,7-디메톡시-4-(p-메톡시신나모일옥시메틸) 쿠마린(3c)

수율 75%. IR (KBr, max cm^-1) 1720, 1640; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) 7.71 (1H, d, J = 15.43 Hz), 7.42-7.25 (2H, m), 7.16-6.95 (2H, m), 6.80 (1H, s), 6.78 (1H, s), 6.39 (1H, d, J = 15.43 Hz), 6.31 (1H, s), 5.24 (2H, s), 3.81 (3H, s), 3.78

6,7-디메톡시-4-(3,4,5-트리메톡시신나모일옥시메틸) 쿠마린(3d)

수율 90%. IR (KBr, max cm^-1) 1720, 1640; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) 7.69 (1H, d, J = 14.49 Hz), 6.82 (1H, s), 6.80 (1H, s), 6.52 (2H, s), 6.40 (1H, d, J = 15.59 Hz), 6.30 (1H, s), 5.27 (2H, s), 3.85 (3H, s), 3.84 (3H, s).

6,7-디메톡시-4-(p-클로로신나모일옥시메틸) 쿠마린(3e)

수율 90%. IR (KBr, nmax cm^-1) 1730, 1640; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) δ 7.95 (1H, d, J = 15.39 Hz), 7.67 (2H, d, J = 8.84 Hz), 7.46 (1H, s), 7.34 (1H, s), 7.03 (2H, d, J = 8.84 Hz), 6.69 (1H, d, J = 15.39 Hz), 6.33 (1H, s), 5.53 (2H, s), 3.91 (3H, s), 3.85 (3H, s).

4-(p-히드록시신나모일옥시메틸)-6,7-디메톡시쿠마린 (3f)

수율 51%. IR (KBr, nmax cm^-1) 3430, 1715, 1630; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃)δ 9.78 (1H, s), 7.71 (1H, d, J = 16.02 Hz), 7.50-7.4 (2H, m), 7.03-6.80 (4H, m), 6.48-6.33 (2H, m), 5.45 (2H, s), 3.94 (6H, overlap).

4-[(3-히드록시-4-메톡시)신나모일옥시메틸]-6,7-디메톡시쿠마린(3g)

수율 45%. IR (KBr, max cm^-1) 3400, 1720, 1640; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) 7.77 (1H, d, J = 15.48 Hz), 7.49-7.28 (3H, m), 6.87 (1H, s), 6.79 (1H, s), 6.67 (1H, d, J = 15.48 Hz), 6.33 (1H, s), 5.45 (2H, s), 3.91 (3H, s), 3.88 (3H, s).

4-(p-아미노신나모일옥시메틸)-6,7-디메톡시쿠마린(3h)

수율 44%. IR (KBr, nmax cm^-1) 3360, 1730, 1640; ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃)δ 7.83-7.41 (3H, m), 7.21-7.00 (2H, m), 6.81-6.29 (4H, m), 5.51 (2H, s), 3.86 (3H, s), 3.84 (3H, s)3.49 (2H, br).

물질군 3의 제법 및 화합물 3a 내지 3h의 구조식을 도식화하면 아래 반응식 2과 같다.

반응식2

실시예 3: Crinum latifolium잎으로부터 추출된 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본에 대한 세포독성 및 혈관신생 억제 효과 실험

1. 암세포 B16, HCT116 및 HUVEC에 대한 세포독성 실험

(1) 세포와 배양액 준비

배양액은 멸균 주사용 증류수 1 L에 RPMI 1640 배지 1 포장단위, 중탄산나트륨 2 g, 페니실린 10만 단위, 스트렙토마이신 100 mg을 넣어 용해시킨 후, 0.1 N HCl로 pH를 조절 (pH 7.2 ~ 7.3)한 후 세균여과하여 제조하였으며, 사용 전에 56℃ 수조에서 30 분 동안 가열하여 불활성화시킨 태아 소 혈청(FBS) 100 mL를 넣어 4℃에서 보관하면서 사용하였다. 세포는 3 일에 한번씩 계대 (propagation)하여 유지하였으며, 세포를 부착면으로부터 분리하기 위하여 포스페이트 버퍼된 식염수 용액에 0.5% 트립신과 2% EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)를 녹인 용액을 사용하였다.

(2) 세포 독성 실험

암세포에 대한 독성실험은 1989년에 미국국립암연구소에서 약물의 in vitro 항암활성을 측정하기 위하여 개발된 sulforrhodamine-B (SRB)법을 사용하였다. 실험에 사용할 세포들을 0.5% 트립신-EDTA 용액으로 부착면으로부터 분리시키고 3∼4×10⁴ cells/mL의 세포현탁액을 만든 다음 96 웰 평판의 각 웰에 180㎕ 씩 가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 시료는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 실험에 필요한 농도까지 실험용 배지 또는 3차 증류수로 희석하여 최종 DMSO의 농도가 0.2% 이하가 되도록 단계별로 희석하였다. 96 웰 평판의 각 웰에 단계별 농도로 희석한 시료를 각각 20㎕씩 넣어준 다음 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 시료를 가한 시점에서 시간 제로(Tz) 평판을 수집하였다. Tz 평판 및 배양이 끝난 후 각 평판의 배지를 제거하고 10% 트리클로로아세트산 (TCA)를 각 웰당 50 ㎕씩 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치하여 세포들을 평판의 바닥면에 고정시킨다. 세포의 고정이 끝난 후 평판을 물로 5∼6회 세척하여 남아있는 TCA용액을 완전히 제거하고 실온에서 남은 물기가 없도록 건조시켰다. 완전히 건조된 평판은 웰 당 50㎕ 의 1% 초산용액에 0.4% SRB를 녹인 염색용액을 가하여 30분간 세포를 염색하고 다시 1% 초산 용액으로 수회 세척하여 세포에 결합하지 않은 SRB를 모두 제거하였다. 이렇게 염색한 후 평판을 다시 실온에서 건조시켰다. 여기에 10mM Tris용액 100㎕를 가해 염료를 녹여 마이크로평판 판독기로 520nM에서 광학 밀도(O.D.)값을 측정하였다. 암세포에 대한 ED₅₀ (50% 유효 용량)값은 다음과 같이 계산하였다. 시료를 가하여 배양을 시작하는 시간에 수집하여 SRB단백질 양을 측정하여 그 값을 Tz으로 하였다. 즉 초기의 살아있는 세포수를 초기값 (Tz)으로 정했다. 시료를 처리하지 않고 배양한 웰의 O.D. 값을 대조군 (C)으로 하고 시료를 처리하고 배양한 웰의 O.D. 값을 약물 처리된 실험값 (T)으로 하였다. Tz, C 및 T로부터 다음의 수식에 의해 물질들의 세포독성 정도를 측정하였다. 즉 Tz = T인 경우에는 {(T - Tz) / (C - Tz)}×100의 수식으로 계산하고 Tz < T 인 경우에는 {(T - Tz) / Tz}×100의 수식으로 계산한다. 이렇게 계산된 값들로부터 Lotus 프로그램의 데이타 회귀 기능을 이용하여 약물의 암세포 성장을 50% 억제하는 농도인 50% 유효 용량(ED₅₀)값을 계산하여 각 물질들의 세포독성 정도를 비교하였다.

2. 혈관신생 억제 실험

혈관신생 억제 실험은 HUVE세포에 대한 튜브모양형성억제 실험에 의해 수행되었다.

(1) HUVE세포와 배양액

배양액은 멸균 주사용 증류수에 L-glutamine이 포함된 M199 medium 한 봉지, 50℃ 수조에서 30분간 가열하여 불활성화 시킨 fetal bovine serum (FBS) 200mL, NaHCO₃ 2g, penicillin 10만 단위, streptomycin 100mg을 넣어 용해시킨 후 0.1N 염산으로 pH를 조절하여 전체를 1L가 되게 한 후 세균여과 하여 제조하였으며, 4℃에서 보관하면서 사용하였다. 세포의 일주일에 한번씩 계대하여 유지하였으며, 세포를 부착면으로부터 분리하기 위하여 phosphate buffered saline용액에 0.5% trypsin과 2% EDTA를 녹인 용액을 사용하였다

(2) 튜브모양형성 억제실험

① Matrigel

-20℃가 일정하게 유지되는 냉동고에서 보관되어진 Matrigel을 4℃에서 하룻밤 방치하여 천천히 녹인 후 냉동튜브에 1mL씩 분주한 후 4℃에서 보관하였다.

② HUVE세포배양을 위한 M199배지의 조제

i) M199 배지 : M199 배지 한 봉지와 중탄산나트륨 2.2g을 증류수 1L에 녹인 다음 pH 7.2로 조절하였다.

ii) bFGF 10㎍을 멸균한 증류수 100㎕에 녹였다.

iii) Heparin 100,000 단위(175 units/mg) 571mg을 멸균한 M199 배지 5.7mL에 녹였다.

iv) i) 240mL, FBS 60mL, ii) bFGF 9㎕, iii) 헤파린 300㎕를 넣어 하루동안 오염여부를 확인한 후 PS 3mL을 첨가하여 사용하였다.

③ 젤라틴 코팅

판매되고 있는 시약은 2% 젤라틴이므로 3차 증류수로 0.3%로 희석하여 멸균하여 사용하였다. 이것을 T75 배양 플라스크에 1.5mL로 바닥을 코팅하여 클린 벤치 안의 평평한 곳에 2시간 동안 방치한 후 냉장보관 하였다.

④ 시료처리

위에서 제조한 Matrigel을 96 웰 평판에 1 웰 당 70㎕씩 거품이 생기지 않게 평판 바닥에 균일하게 도포한 후 평판을 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 96 웰 평판의 1 웰 당 2×10⁴ 세포/200㎕의 HUVE세포를 넣은 후 곧 바로 시료를 DMSO에 녹인 용액을 가하였다. 이때 최종 농도는 3, 1, 0.3, 0.1 ㎍/mL 이 되도록 조정하였으며 양성대조군으로는 수라민(100uM)을 사용하였다.

⑤ 튜브모양형성 억제도 평가

각 웰을 100배로 확대한 후 5개의 영역을 무작위로 선정, 사진 촬영하여 인화한 후 각 인화지에 나타난 혈관의 전체길이를 아도브 포토샵™ 소프트웨어로 측정하여 평균값을 계산한 후 음성대조군과 시료처리군과의 전체길이의 백분율로서 활성도를 나타내었다.

3. 실험 결과

Crinum latifolium잎으로부터 추출된 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본에 대한 상기 세포독성 및 혈관신생 억제 효과 실험의 결과는 표 3과 같았다.

표 3: Crinum latifolium잎으로부터 추출된 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본에 대한 세포독성 및 혈관신생 억제 효과 실험 결과

(주: ¹암세포주:B16, 쥐 폐암; HCT116, 인간 직장암. ²세포의 성장을 50% 저해하는 시료의 농도. ³N세포독성 농도 이하의 농도. ⁴관형성 억제효과 판정;++++;≥75%, ++;≥25%, <50%, +;<25%. ⁵이미 개발된 혈관신생 억제제. ⁶ 평가되지 않음.)

표 3에서 알 수 있는 바와 같이, crinum latifolium의 잎으로부터 분리한 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린((구조식(I)의 화합물) 및 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본(구조식(II)의 화합물)은 B16, HCT116 및 HUVEC에 대하여 세포독성을 보이지 않으나 HUVEC의 관형성만을 저해하고 있다. 특히, 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린은 9.4 uM(3 ug/ml)에서도 관형성을 100% 저해하였으며 심지어 3.13 uM (1 ug/ml)에서도 상당한 저해 효과를 보인다. 이 물질이 31.3 uM (10 ug/ml) 이상에서도 암세포 독성을 보이지 않음으로 혈관형성 억제제로서 항암 목적에 사용할 수 있다. 또한 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본도 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린과 비슷한 강도의 관형성 억제 작용을 보인다. 즉 27.5 uM (10 ug/ml) 농도에선 관형성을 100%, 8.27 u (3 ug/ml)에서도 상당히 좋은 저해 작용을 보임으로써 이 물질 또한 혈관 형성 억제제로서 항암 목적으로 사용할 수 있다. 본발명에 따른 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본은 공지된 혈관 신생 억제제인 수라민(100 uM)보다 훨씬 낮은 농도에서 보다 강한 관형성 억제 작용을 보인다.

실시예 5: 물질군 2 및 물질군 3에 대한 세포독성 및 혈관신생 억제 효과 실험

실시예 4에서 기술된 것과 동일한 방법에 의해 B16 및 HCT116에 대한 세포독성 실험을 수행하고 또한 혈관신생 억제 실험(HUVE세포에 대한 튜브모양형성 억제실험)을 수행하였다. 그 결과는 표 4 및 표 5와 같았다.

표 4: 물질군 2에 대한 세포독성 및 혈관신생 억제 효과 실험 결과

표 5: 물질군 3에 대한 세포독성 및 혈관신생 억제 효과 실험 결과

표 4 및 5에서 알 수 있는 바와 같이, 물질군 2는 모두 세포독성을 보이지 않았고 물질군 3 중에서는 물질 3c, 즉 4-(4-메톡시쿠마로일옥시메틸)-6,7-디메톡시쿠마린만이 HCT116과 B16 세포주에 대하여 각각 IC₅₀=0.96 및 1.02를 나타내어 유의한 세포독성을 나타내었다.

또한, 관형성 억제 효과에 대해서는, 물질군 2 중에서는 물질 2d와 2e가 각각 9.87 uM와 9.68 uM의 농도에서 중 정도의 관형성 저해작용을 보일 뿐이었다. 합성한 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린의 경우 천연물에서와 같이 강한 관형성 저해효과를 보였다. 물질군 3중에서는, 화합물 3c인 (4-메톡시쿠마로일옥심틸)-6,7-디메톡시쿠마린이 7.52 uM에서 강한 억제효과를, 2.50 uM에서도 중 정도의 억제효과를 보였다. 이 강도는 비교 물질인 수라민의 그것보다 더 강한 억제효과를 보였다. 이 물질은 관형성 억제효과와 더불어 세포독성도 보임으로써 항암제로서 더욱 유효하다고 판단된다. 실제로 혈관 신생 억제만으로는 암조직의 괴사를 유발할 수는 있으나 암세포 모두를 사멸시키지는 못한다. 그러므로 세포독성 항암제와 병용을 요한다. 그러므로 물질 3c와 같은 경우에는 이 두 요구 조건이 하나의 구조 중에 내재되어 있음으로 실로 항암제로서는 이상적이다. 이외에도 물질 3g, 즉 4-(3-히드록시-4-메톡시쿠마로일옥시메틸)-6,7-디메톡시-쿠마린이 7.23 uM에서 좋은 관형성 억제 효과를 보였다.

실시예 6: LL/2 세포를 이용한 동물실험

실시예 1에서 얻은 MC 건조 분획 40mg을 MC 분획 샘플로 하고, MC-3의 건조 분획 40mg 및 MC-6 및 MC-7의 혼합한 건조 분획 95mg을 합하여 만든 것을 MC367 분획 샘플로 하였다. 이 MC367 샘플 중에는 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린이 0.12mg, 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본이 11.4mg 함유되어 있다.

(1) LL/2세포와 배양액 제조

배양액은 멸균 주사용 증류수에 L-글루타민이 포함된 RPMI 1640 배지 1 포장단위, 56℃ 수조에서 30분간 가열하여 불활성화시킨 태아 소 혈청(FBS) 100 mL, 중탄산나트륨 2 g, 페니실린 10만 단위, 스트렙토마이신 100 mg을 넣어 용해시킨 후 0.1N HCl으로 pH를 조절하여 전체를 1 L가 되게 한 후 세균 여과하여 제조하였으며, 4℃에서 보관하면서 사용하였다. 세포를 3일에 한 번씩 계대하여 유지하였으며, 세포를 부착면으로부터 분리하기 위하여 포스페이트 버퍼된 식염수 용액에 0.5% 트립신과 2% EDTA를 녹인 용액을 사용하였다.

(2)LL/2세포를 이용한 동물실험

LL/2세포를 이용한 동물실험은 Teruhiro, U., Jiro, S., Yoshikazu, S., Kumio, A. and Yuji, Y. ; Antitumor activity of a novel podophyllotoxin derivative (TOP53) against lung cancer and lung matastatic cancer, Cancer Res., 56, 2809 14 (1996)에 따라서 다음과 같이 수행하였다.

시험관내에서 배양한 LL/2세포를 멸균된 냉 생리식염수를 사용하여 충분히 세척한 후 세포를 혈구계 (haemacytometer)로 세어 5 × 10⁶ 세포/mL의 농도로 세포 부유액을 만들고 이 부유액을 0.2 mL 씩 BDF1 마우스의 겨드랑이에 피하로 이식하였다. 이식 24 시간 후에 각군을 5 마리로 분류하였다. 시료는 주사하기 바로 직전에 5%의 디메틸설폭사이드, 20%의 크레모포어(cremophore)를 함유한 생리식염수에 용해시켜 MC분획은 10 mg/ml이 되게, MC367도 10mg/ml가 되게 시료용액을 제조하여, 실험동물의 복강 내에 0.2 mL씩 주사하였다. 음성대조군에는 5%의 디메틸설폭사이드, 20%의 크레모포어를 함유한 생리식염수만을 시료 투여량과 같은 용량으로 투여하였으며 양성 대조군으로는 에토포사이드 (36 mg/kg/일)를 암세포 이식 후 1, 5, 9 일째에 주사하였으며 주사일정은 시료에 따라 다르나 여기에서는 시료 50mg/kg/day의 투여량으로 암세포 이식 후 24 시간이 지난 후에 시작하여 3, 5, 7, 9, 11 일에 투여하다가 16, 17, 18 일 투여하여 전체 9 회 투여하였다.

마우스에 대한 각각의 시료의 독성을 측정하기 위해 2 일에 1 회 몸무게를 측정하였으며, 항암 효과는 약물투여 11 일 ∼ 19 일에 대조군과 약물처리군의 암괴의 부피를 측정 후 다음 식에 따라 계산하였다.

암의 부피 (mm³) = 길이 (mm) × 폭² (mm²) / 2

암성장억제율 (%) = (C - T) × 100 / C

상기 식에서, C : 대조군의 평균 암부피 (mm³), T : 시료투약군의 평균 암부피 (mm³)를 나타낸다.

(3) 동물실험 결과의 평가

상기 실험의 결과는 아래 표 6과 같다.

표 6: LL/2 세포를 이용한 동물실험 결과

분획	암성장억제율(%)
대조군	0
MC	38
MC367	79
에토포사이드	69

상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 정제된 분획인 MC367은 비교물질인 에토포사이드보다 강한 항암성을 보였다. 따라서 분획 MC367에 포함된 구조식 I의 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 구조식 II의 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본은 관형성 억제효

과도 우수할 뿐만 아니라 매우 높은 항암성을 보임을 알 수 있다.

따라서, 본발명에 따른 구조식(I) 및 (II)의 화합물들 및 일반식(III)의 화합물은 항암 활성이 우수하다.

도 1은 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 HMBC(Het

eronuclear Multiple Bond Correlation) 및 HMQC (Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence) 상관관계를 나타내는 그림이다.

도 2는 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본의 HMBC(Hetero

nuclear Multiple Bond Correlation) 및 HMQC (Heteronuclear Multiple-Qua

ntum Coherence) 상관관계를 나타내는 그림이다.

Claims

구조식(I)의 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린:

(I)
구조식(II)의 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본:

(II)
일반식(III)의 화합물:

(III)

[식 중, R은 C_1-3 알킬임.
제 3항에 있어서, R은 메틸인 화합물.
(i) 3,4-디톡시페놀과 에틸 4-클로로아세테이트를 Pechman 법에 의하여 황산 중에서 축합하여 4-클로로메틸-6,7-디메톡시쿠마린을 합성하는 단계, 및

(ii) 4-클로로메틸-6,7-디메톡시쿠마린을 트리에틸아민 존재 하에서 상응하는 유기산과 반응시켜 제3항에 따른 일반식(III)의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 제3항에 따른 일반식(III)의 화합물을 제조하는 방법.
Crinum latifolium의 잎으로부터 추출한 제1항에 따른 구조식(I)의 6,7-디메톡시-4-(3-메틸-2-부테노일옥시메틸)쿠마린 및 제2항에 따른 구조식(II)의 5,6,3'-트리히드록시-7,8,4'-트리메톡시플라본을 유효성분으로서 함유하는 항암제.
약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제3항에 따른 일반식(III)의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물.