KR101824970B1 - 생약 추출물을 포함하는 혈전 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

생약 추출물을 포함하는 혈전 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당귀 및 치자를 포함하는 복합 생약 추출물 또는 당귀, 단삼 및 치자를 포함하는 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 건강기능식품의 유효성분인 복합 생약 추출물들은 항산화 효과, 혈전 용해 효과, 세포접착단백질의 발현 억제, 혈관 염증 유발 효소의 발현을 저해하고 혈액응고 관련인자의 생성을 저해하여, 심근경색, 뇌출혈, 뇌졸증 및 뇌경색 등의 혈전 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.

Description

생약 추출물을 포함하는 혈전 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising plant extracts for prevention or treatment of thrombosis diseases}
본 발명은 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
최근 선진국뿐 아니라 우리나라에서도 뇌출혈, 심장병, 뇌졸중, 뇌경색 등의 순환기 질환이 사망원인 1, 2위를 차지하고 있다. 다양한 원인에 의해 혈관이 막혀 상기 질병들이 발생할 수 있는데, 심장 혈관이 막힐 경우 심근 경색증이 일어날 수 있고, 뇌의 혈관이 막혔을 경우 뇌경색이 발병될 수 있다. 뇌경색의 경우 질병이 계속 진행되어 뇌졸중 증세가 나타나 목숨을 잃게 될 수 있다. 미국의 경우 뇌졸중이 성인의 사망 원인 중 3번째로 높은 순위를 차지하고 있으며 운동성이 무력하게 되는 가장 큰 요인으로 알려져 있다. 이들 질환의 주요 발병원인으로는 혈전(thrombus)으로 알려져 있는데, 혈전이란 과잉된 혈소판 응집에 의해 매개되는 병리현상으로 인식되고 있다. 또한, 이로 인해 혈액순환의 장애도 발생하게 된다.
인간은 상처부위의 치료와 혈액의 손실을 막기 위한 생체 시스템을 가지고 있으며, 이것은 혈소판과 혈장의 응고, 섬유소 분해, 그리고 응고억제라고 하는 복잡한 과정의 조절과 균형으로 이루어진다. 그러나, 여러 가지 요인으로 이러한 평형상태가 깨지면 혈액의 흐름이 방해를 받아 혈전이 생성되고, 조직의 기능에 장애가 생기게 된다.
혈전증 (thrombosis)은 혈관 안쪽에 덩어리가 생기거나 혈전이 생겨서 혈액의 흐름이 막힌 것을 말한다. 혈관에 상처가 생기면 혈관은 수축하게 되며, 상처부로 드러나게 된 콜라겐 섬유에 혈소판이 달라붙어 혈관 수축 물질인 세로토닌(serotonin)과 아데노신 디포스페이트 (adenosine diphosphate. ADP) 그리고 트롬복산 A2(thromboxane A2)를 방출한다. ADP는 더 많은 혈소판들이 달라붙게 하며, 트롬복산 A2는 혈소판들이 응집되도록 작용하여 혈관은 수축하게 된다. 이와 같이 일차적으로 지혈된 후에는 혈액 응고(blood coagulation)가 이루어진다. 지혈 후 생성된 피브린(fibrin)은 섬유소 용해작용(fibrinolysis)에 의해 용해되는데 tissue-type plasminogen activator(t-PA)와 우로키나아제(urokinase, UK)는 플라스미노겐(plasminogen)을 플라스민(plasmin)으로 전환시켜 피브린을 분해시키는 역할을 한다. 이러한 혈액 응고(blood coagulation)와 섬유소 분해(fibrinolysis)는 정상의 경우 균형을 이루고 있으나, 이 균형이 깨질 경우 혈관 내에 섬유소 덩어리가 침착되고 혈액 순환장애가 발생하는 혈전증이 일어나게 된다( Nesheim M., Chest., 2003 Sep ;124:33S-9S).
현재 혈전 질환의 예방과 치료에는 항혈소판제, 항응고제, 형성된 혈전을 치료하기 위한 혈전용해제 등이 사용되고 있으나. 대표적인 항혈소판제제인 아스피린은 효과는 뛰어나지만 위장관 출혈과 소화성 궤양 등의 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한, 그 외의 항응고제로 쓰이는 약물들은 대부분 경구투여가 불가능하며, 혈전에 대한 선택성이 적어 장기간 복용시 용혈현상, 면역반응, 발열, 알러지 등의 다양한 부작용을 나타내고 있다.
따라서, 혈소판의 활성화 및 응고의 억제, 혈전의 용해 활성 등의 혈전생성 저해에 대한 높은 선택성을 가지며 부작용을 최소화시키는 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 당귀((Angelica gigas Nakai , 連翹)는 미나리과에 속하는 다년생 초본으로 한의학에서는 승검초의 뿌리를 가리키는 말이다. 당귀의 용도를 보면 자궁기능 조절작용, 진정작용, 진통작용, 항균작용, 설사작용 및 비타민E 결핍치료작용을 가지므로 빈혈증, 진통, 강장, 통경 및 부인병약으로 쓰인다.
단삼은 다년생초본으로 식물 전체에 복모가 있으며, 뿌리에 페난트라키논계 색소인 탄쉬논 화합물이 있어 붉은 밤색을 띤다. 단삼에 대하여 지금까지 밝혀진 약리작용으로는 항암효과, 항산화 효과, 항염증 효과 등이 알려져 있다.
치자(Gardeniae Fructus)는 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하는 치자나무 (Gardenia jasmoides Ellis) 또는 그 밖의 동속식물의 열매로 예로부터 식품의 착색제로 사용되어왔다. 한방에서는 소염, 이뇨, 해열, 진정, 항균, 담즙분비, 간장염치료약으로 이용하고 있다.
한국공개특허공보 제2004-0105183호
복합 생약 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 당귀 및 치자 또는 당귀, 단삼 및 치자를 포함하는 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 당귀 및 치자 또는 당귀, 단삼 및 치자를 포함하는 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 생약 추출물은 당귀 45~75 중량% 및 치자 25~55 중량%를 포함하거나 또는 당귀 35~65 중량%, 단삼 15~45 중량% 및 치자 5~35 중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 혈전 질환은 심근경색, 뇌출혈, 뇌졸증 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 생약 추출물은 혈전 용해 활성을 가지며, 세포접착단백질의 발현을 억제하며, 혈관염증유발 효소의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 생약 추출물은 항산화 효과, 혈전 용해 효과를 가지며, 세포접착단백질의 발현 억제, 혈관 염증 유발 효소의 발현을 저해하고 혈액응고 관련인자의 생성 억제한다. 따라서, 심근경색, 뇌출혈, 뇌졸증 및 뇌경색 등 혈전 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1 내지 3에서 제조된 추출물들의 항산화 효과를 나타낸다.
도 2는 실시예 1 내지 3에서 제조된 추출물들의 폴리페놀 함량을 분석한 것이다.
도 3은 실시예 1 내지 3에서 제조된 추출물들의 세포독성을 측정한 것이다.
도 4는 실시예 2, 3에서 제조된 추출물들의 혈전 용해 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 2, 3에서 제조된 추출물들의 세포접착단백질(ICAM-1)의 발현 억제 여부를 면역세포화학염색으로 확인한 것이다.
도 6은 실시예 2, 3에서 제조된 추출물들의 세포접착단백질(VCAM-1)의 발현 억제 여부를 면역세포화학염색으로 확인한 것이다.
도 7은 실시예 2, 3에서 제조된 추출물들의 혈관염증유발 효소 (COX-2)의 발현 억제 여부를 면역세포화학염색으로 확인한 것이다.
도 8은 실시예 2, 3에서 제조된 추출물들의 혈관염증유발 효소 (5-LO)의 발현 억제 여부를 면역세포화학염색으로 확인한 것이다.
도 9는 실시예 2, 3에서 제조된 추출물들의 혈관염증유발 효소(COX-2, 5-LO)의 발현 억제여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 10은 실시예 2, 3에서 제조된 추출물들의 혈관염증유발 효소(COX-2)의 활성 저해여부를 ELISA로 확인한 것이다.
도 11은 실시예 2, 3에서 제조된 추출물들의 ACE 효소 억제 여부를 확인한 것이다.
도 12는 실시예 2, 3에서 제조된 추출물들에 대한 혈액응고 관련인자 (Thromboxane B2) 생성 억제 정도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 당귀 및 치자 또는 당귀, 단삼 및 치자를 포함하는 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 혈액순환장애 및 혈행 개선에 의한 혈전 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품의 유효성분인 복합 생약 추출물은 다음과 같은 2단계를 통해서 수득될 수 있다.
본 발명은 당귀, 단삼, 치자를 자연건조, 급속냉동 후 동결건조, 열풍건조 또는 저온건조에 의해 건조한 후, 바람직하게는 20℃ 내지 100℃에서 10 시간 내지 80 시간 동안, 더욱 바람직하게는 40℃ 내지 80℃에서 20 시간 내지 60시간 동안 열풍건조한 후, 당귀, 단삼, 치자 시료 중량의 1 내지 40배, 바람직하게는 2 내지 20 배의 정제수를 포함한 물, 알코올, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 가하여 20℃ 내지 100℃에서 1 시간 내지 10 시간 동안, 바람직하게는 40℃ 내지 80℃에서 2 시간 내지 6 시간 동안 열수 추출, 환류 순환 추출, 가압 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 수득한 추출액을 여과하는 단계; 및 상기 여과된 추출액을 감압 농축 또는 동결 건조, 분무 건조하여 당귀, 단삼, 치자 추출물을 수득할 수 있다.
상기 당귀, 단삼, 치자 추출물을 추출하기 위한 용매로 C1 내지 C4의 저급 알코올을 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 에탄올, 메탄올 또는 부탄올을 사용하는 것이며, 더욱 바람직하게는 10% 내지 50%의 에탄올(주정, 에틸알코올)을 사용하는 것이다.
또한, 상기 추출물들은 혼합하여 복합 생약 추출물을 제조할 수 있으며, 당귀 45~75 중량% 및 치자 25~55 중량%를 포함하는 복합 생약 추출물 또는 당귀 35~65 중량%, 단삼 15~45 중량% 및 치자 5~35 중량%를 혼합하여 복합 생약 추출물을 제조할 수 있다.
상기와 같은 방법으로 수득한 복합 생약 추출물들은 항산화 효과, 혈전 용해 효과를 가지며, 세포접착단백질의 발현을 억제하며, 혈관염증유발 효소의 발현을 저해하며 혈액응고 관련인자의 생성을 억제한다. 따라서, 상기 생약 추출물은 심근경색, 뇌출혈, 뇌졸증 및 뇌경색 등 혈전 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.
상기 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 붕해제로는 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 크로스카멜로스나트륨, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 키토산, 구아검, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴라크릴린 칼륨 등이 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 약학적 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.
경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명의 당귀 및 치자를 포함하는 복합 생약 추출물 또는 당귀, 단삼 및 치자의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 형태 및 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등일 수 있고, 건강기능식품의 종류는 버터, 요구르트, 치즈를 포함한 유제품, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 유산균 제제, 발효유, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 건강기능식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 당귀, 단삼 , 치자 에탄올 추출물 제조
당귀, 단삼, 치자를 60 ℃에서 48시간 건조한 후, 당귀, 단삼, 치자 시료 중량의 12배의 에탄올(주정, 에틸알코올)을 가하고, 60 ℃에서 4시간 동안 진탕시킨 다음 여과한 후, 당귀, 단삼, 치자의 30% 에탄올 추출물을 제조하였다. 상기 추출물을 여과한 후, 그 여액을 55 ℃에서 3시간 동안 감압농축 및 동결건조하여 분석용 시료로 사용하였다.
< 실시예 2> 당귀, 치자의 복합 생약 추출물 제조
실시예 1에서 얻어진 당귀 추출물 60 중량%, 치자 추출물 40 중량%를 혼합하여 복합 생약 추출물(당6치4)을 제조하여 분석용 시료로 사용하였다.
< 실시예 3> 당귀, 단삼 , 치자의 복합 생약 추출물 제조
실시예 1에서 얻어진 당귀 추출물 50 중량%, 단삼 추출물 30 중량%, 치자 추출물 20 중량%를 혼합하여 복합 생약 추출물(당5단3치2)을 제조하여 분석용 시료로 사용하였다.
< 실험예 1> DPPH 프리 라디칼 소거활성(항산화 효과 실험)
실시예 1 내지 실시예 3에서 얻어진 추출물에 DPPH (0.2 mM in ethanol) 750 ㎕, 3차 정제수 675 ㎕를 혼합한 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 96 well plate에 반응액 200 ㎕를 옮긴 후 ELISA reader로 520 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성(%)은 (1-시료 첨가구의 흡광도/시료 무 첨가군의 흡광도)×100의 계산식을 사용하였으며, 발생한 라디칼 50%를 소거하는데 필요한 시료의 농도(SC50)는 ppm 단위로 표시하였다. 실험결과는 3회 반복하여 평균±표준오차(mean±SEM)로 나타냈으며, Student’s t-test로 통계처리하여 비교하였다. 통계처리에서 p값이 0.05 미만일 경우(p<0.05) 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
본 실험 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 얻어진 상기 복합 생약 추출물(당6치4)은 DPPH 시약을 이용한 라디칼 소거능 실험에서 높은 소거활성을 나타내었다.
< 실험예 2> 폴리페놀 함량 분석(항산화, 콜레스테롤 저하, 항암 효과 실험)
실시예 1 내지 3에서 얻어진 추출물들이 항돌연변이, 콜레스테롤 저하작용, 항암 및 항산화작용 등의 다양한 생리활성 기능이 있는지 확인하기 위하여 폴리페놀 함량을 측정하였으며, 총 페놀성 화합물의 함량은 Gutfinger(Gutfinger, 1981)의 방법을 변형하여 측정하였다.
즉, 시료 1 ml에 2% (w/v) Na2CO3 용액 1 ml를 가하여 3분간 상온에서 반응시킨 후, 50% Folin-Ciocalteu 시약 0.2 ml를 첨가하여 30분간 상온에서 반응시켰다. 이 반응물 1 ml를 취하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준농도 곡선은 EGCG(epigallocatechin gallate)를 이용하여 작성하였다. 실험결과는 3회 반복하여 평균±표준오차(mean±SEM)로 나타냈으며, Student’s t-test로 통계처리하여 비교하였다. 통계처리에서 p값이 0.05 미만일 경우(p<0.05) 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
본 실험 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 얻어진 복합 생약 추출물(당5단3치2)은 폴리페놀함량이 높았다.
< 실험예 3> MTT 어세이 (세포독성 실험)
마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well이 되도록 분주하고 CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 24시간 뒤 배양배지를 제거하고 새로운 배양배지와 함께 DMSO(최종농도 1%)를 이용하여 용해한 시료를 농도별로 세포에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양시킨 96 well plate에 PBS에 용해한 MTT 용액(5 μg/mL)을 가하고, CO2 incubator에서 3시간 방치하였다. 3시간 동안 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)에 의해 MTT가 블루 포르마잔(blue formazan)을 형성하면 상등액을 제거하고 DMSO를 well당 200 μL씩 넣어 20분간 쉐이킹(shaking)한 다음 ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%)은 다음과 같은 식을 사용하여 나타내었다. 세포 생존율(%)=(샘플처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100
본 실험 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 치자(500ppm, 1000pp)를 제외한 다른 추출물들은 세포독성을 나타내지 않았다.
< 실험예 4> 피브린 용해 활성(혈전 용해 활성 실험)
50mM sodium phosphate buffer (pH7.4)에 0.5% 농도로 녹인 피브리노겐(fibrinogen) 5mL에 동일 완충용액에 용해한 트롬빈(thrombin, 100 NIH unit/mL) 0.1mL을 가하고 여기에 1% 농도로 용해한 아가로스(agarose) 용액 5mL를 첨가하여 혼합한 후 직경 9cm의 페트리 디쉬(petri dish에) 붓고 상온에서 1시간 응고하였다. 응고된 피브린 아가로스 젤(fibrin-agarose gell)에 직경이 3mm의 구멍을 뚫고 여기에 실시예 2, 3에서 얻어진 추출물들을 각 농도별로 처리하였다. 양성대조군으로는 단백질 가수분해 효소인 플라스민(plasmin)을 사용하였으며, 음성대조군으로는 심적환을 사용하였다.
본 실험 결과, 도 4, 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 2, 실시예 3에서 얻어진 당6치4, 당5단3치2의 복합 생약 추출물은 농도 의존적으로 피브린을 용해하여 혈전 용해 활성이 높은 것으로 확인되었다.
Sample 처리농도 용해면적
Plasmin 1U/mL, 10μL 13.85cm2
당6치4 100ppm, 10μL 2.01cm2
당6치4 400ppm, 10μL 6.15cm2
당5단3치2 100ppm, 10μL 2.27cm2
당5단3치2 400ppm, 10μL 8.04cm2
심적환 100ppm, 10μL 1.54cm2
심적환 400ppm, 10μL 2.54cm2
< 실험예 5> 세포접착단백질의 발현억제 실험
실험예 5-1. 세포접착단백질(ICAM-1)의 발현억제 실험
세포접착단백질(ICAM-1, Intercellular Adhesion Molecule-1)은 혈관협착, 혈전 형성, 혈액순환 장애에 관여하는 것으로 알려져 있다. TNF-α에 의해 활성화된 인간 제대정맥혈관내피세포주인 HUVEC (Human umbilical vein endothelial cell) 세포에서 세포접착단백질인 ICAM-1의 발현을 억제하는 효능을 측정하기 위해 면역세포화학염색(immunocytochemistry)을 실시하였다.
24 well plate에 12 mm 커버글라스를 넣고 HUVEC 세포를 1×10 cells/ml의 농도로 1 ml/well seeding 후 배양 (at 37℃, for 24 hours)하여 샘플(실시예 2, 3에서 얻어진 추출물)을 처리하고 1시간 후 TNF-α를 1 μg/ml 처리하고 다시 배양 (at 37℃, for 24 hours)한 후 배지를 PBS로 씻어낸 후 4% formalin으로 고정하고 일차항체인 ICAM-1 (Cell Signaling Technology, MA, USA)과 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 이용하여 항원을 표지하고 DAB로 발색하였다. Mayer’s hematoxylin으로 배경 염색하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 정상적인 인간 제대정맥혈관내피세포군(PBS 처리군)은 ICAM-1의 발현이 낮았지만, TNF-α에 의해 활성화한 세포군(TNF-α 처리군)은 약 70% 이상의 세포가 발현(적갈색으로 표지된 세포)되었고, 실시예 2, 실시예 3에서 얻어진 당6치4, 당5단3치2를 처리한 경우, 처리한 농도에 의존적으로 ICAM-1의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 대조군으로 사용한 심적환을 처리한 경우 ICAM-1의 발현에 영향을 주지 않았다.
실험예 5-2. 혈관세포접착단백질(VCAM-1)의 발현억제 실험
혈관세포접착단백질(VCAM-1, Vascullarr Adhesion Molecule-1)은 혈관협착, 혈전 형성, 혈액순환 장애에 관여하는 것으로 알려져 있다. TNF-α에 의해 활성화된 인간 제대정맥혈관내피세포주인 HUVEC (Human umbilical vein endothelial cell)세포에서 혈관세포접착단백질인 VCAM-1의 발현을 억제하는 효능을 측정하기 위해 실험예 5-1과 동일한 방법으로 면역세포화학염색(immunocytochemistry)을 실시하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 정상적인 인간 제대정맥혈관내피세포군(PBS 처리군)은 VCAM-1의 발현이 낮았지만, TNF-α에 의해 활성화한 세포군(TNF-α 처리군)은 약 70% 이상의 세포가 발현(적갈색으로 표지된 세포)되었고 실시예 2, 실시예 3에서 얻어진 당6치4 또는 당5단3치2를 처리한 경우 처리한 농도에 의존적으로 VCAM-1의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 대조군으로 사용한 심적환을 처리한 경우 VCAM-1의 발현에 영향을 주지 않았다.
< 실험예 6> 혈관염증유발 효소의 발현억제 실험
실험예 6-1. 혈관염증유발 효소( COX -2)의 발현억제 실험
LPS를 이용한 염증 세포(Raw264.7 cell)모델에서 혈관 염증유발 효소인 COX-2(Cyclooxygenase-2)의 생체내 발현을 억제하는 효능을 측정하기 위해 면역세포화학염색(immunocytochemistry)을 실시하였다.
24 well plate에 12 mm 커버글라스를 넣고 RAW 264.7 세포를 1×10 cells/ml의 농도로 1 ml/well seeding 후 배양 (at 37℃, for 24 hours)하여 샘플을 처리하고 1시간 후 LPS (1 μg/ml) 처리하고 다시 배양 (at 37℃, for 24 hours)한 후 배지를 PBS로 씻어낸 후 4% formalin으로 고정하고 일차항체인 COX-2 (Cell signaling Technology, MA, USA) 와 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 이용하여 항원을 표지하고 DAB로 발색하였다. Mayer’s hematoxylin으로 배경 염색하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 정상세포군(PBS 처리)은 COX-2의 발현이 낮았지만, 염증을 유발한 세포군(LPS 처리)은 약 50% 이상의 세포가 발현(적갈색으로 표지된 세포)되었고 실시예 2, 실시예 3에서 제조된 당6치4 또는 당5단3치2를 처리한 세포군은 200ppm의 농도에서는 COX-2의 발현이 억제되지 않았지만 1000ppm의 농도에서는 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 대조군으로 사용한 심적환을 처리한 경우 COX-2의 발현에 영향을 주지 않았다.
실험예 6-2. 혈관염증유발 효소(5- LO )의 발현억제 실험
LPS를 이용한 염증 세포(Raw264.7 cell)모델에서 혈관염증유발효소인 5-LO(5-Lipoxygenase)의 생체내 발현을 억제하는 효능을 측정하기 위해 실험예 6-1과 동일한 방법으로 면역세포화학염색(immunocytochemistry)을 실시하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 정상세포군(PBS 처리)은 5-LO의 발현이 낮았지만, 염증을 유발한 세포군(LPS 처리)은 약 50% 이상의 세포가 발현(아래의 그림에서 적갈색으로 표지된 세포)되었고 실시예 2, 실시예 3에서 제조된 당6치4 또는 당5단3치2를 처리한 세포군은 5-LO의 발현이 200ppm의 농도에서는 억제되지 않았지만, 1000ppm의 농도에서는 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 대조군으로 사용한 심적환을 처리한 경우 5-LO의 발현에 영향을 주지 않았다.
< 실험예 7> 혈관염증유발 효소( COX -2 및 5- LO )의 발현억제 실험( Western blotting)
LPS를 이용한 염증 세포(Raw264.7 cell)모델에서 염증유발효소인 COX-2 및 5-LO의 생체내 발현을 억제하는 효능을 측정하기 위해 웨스턴 블랏(Western blotting)을 실시하였다.
염증반응에 의한 단백질 발현량의 변화는 LPS에 의한 염증 세포모델을 제작하였고 각 실험군별로 세포를 용해(Lysis)시켜 모은 총 단백질을 정량하고 각 웰(well)당 20 mg의 총 단백질을 전기영동(SDS-PAGE)한 후 nitrocellulose 막에 전환(Transfer)한 다음, COX-2 (Cell Signaling Technology, MA, USA) 또는 5-LO (Cell Signaling Technology, MA, USA)의 1차 항체와 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 및 enhanced chemiluminescence (ECL, Pierce, IL, USA)를 이용하여 X-ray필름에 표현하였고 총 단백질량의 동일성은 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)의 양으로 검증하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 웨스턴 블랏의 실험에서는 당5단3치2, 당6치4 및 심적환 모두 농도와 상관없이 COX-2, 5-LO의 단백질의 발현 자체에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
< 실험예 8> 혈관염증유발 효소( COX -2)의 활성저해 실험
혈관염증유발 효소인 COX-2 (cyclooxygenase-2)의 활성을 저해하는 효능을 알아보기 위해서 이러한 효소의 기질인 아라키돈산(arachidonic acid)을 사용하여 프로스타글란딘(prostaglandin)의 전구물질인 PGF2를 생산하고 이를 ELISA 기법을 이용하여 측정하였다.
1.5 ml 튜브에 COX-2 효소 10 μl, heme 10 μl, 반응 완충액 950 μl을 넣고 여기에 샘플 20 μl 첨가한 후 5분간 37℃에서 안정화시켰다. 여기에 아라키돈산 10 μl을 넣고 2분간 37℃에서 반응시킨 후 1 M HCl 50 μl를 넣고 반응을 정지하였다. SnCl2 100 μl를 넣고 잘 섞어준 후 상온에서 5분간 방치. 반응액을 EIA 완충액으로 2000배, 4000배 희석하고 이를 프로스타그란딘 항체가 코팅된 96well plate에 50μl 분주 후 PGs screening AChE tracer를 50 μl와 Antiserum을 50 μl 첨가한 후 18시간 동안 상온에서 반응시켰다. 96well을 완충액으로 5회 세척한 후 Ellman's reagent를 200 μl 넣고 60분간 발색한 후 410nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. COX-2 활성억제 정도는 제조사의 방법을 준용하여 50% 억제하는 농도인 IC50 (ppm)값으로 나타내었다. 실험결과는 3회 반복하여 평균±표준오차(mean±SEM)로 나타냈으며, Student’s t-test로 통계처리하여 비교하였다. 통계처리에서 p값이 0.05 미만일 경우(p<0.05) 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
혈관염증유발효소인 COX-2를 50% 저해하는 농도인 IC50값을 도 10에 나타내었다. 당6치4 및 당5단3치2는 대표적인 COX-2 저해제로 사용되는 합성의약품인 이부프로펜(Ibuprofen)보다는 효과가 좋지 않았지만 심적환과 비교하여 상당히 우수한 COX-2 활성 저해능을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 9> ACE 효소 억제
실시예 2, 3에서 얻어진 추출물이 혈관수축작용을 담당하는 ACE(angiotensin-converting enzyme) 효소를 저해시켜 혈관의 이완을 통해 혈압의 감소와 원활한 혈액순환을 유도하는지 알아보기 위해 ACE 효소 억제율을 실험해보았다. 실험에 사용한 ACE의 기질인 안지오텐신(angiotensin I)을 대신하여 N-Hippuryl-His-Leu을 사용하였고 ACE는 토끼의 폐 조직 파우더(powder)로부터 추출하여 효소액으로 사용했다. 효소반응을 통해 생성된 hippuric acid를 228 nm에서 측정하여 저해율을 확인했다.
시료들을 3000 ppm이 되게 증류수에 녹여 사용 전까지 4℃에 보관했다. 본 실험은 Cho 등의 방법을 수정하여 수행하였다(E. K. Cho, S. K. Yoo and Y. J. Choi, Inhibitory Effects of Maesaengi (Capsosiphon fulvescens) extracts on angiotensin converting enzyme and α-glucosidase. J. Life Sci. 21(6) 811-818, 2011). 토끼의 폐 조직 파우더 (Sigma, USA)을 0.3 M NaCl 이 함유된 0.1 M Sodium borate buffer(pH 8.3) 0.1 g/㎖(w/v)의 농도로 한 후, 4℃ 2 시간 추출하였다. 이후 4℃, 4000 rpm에서 40 min동안 원심분리 하였으며, 상등액을 ACE 조효소액으로 사용하였다. 기질은 0.3 M NaCl이 함유된 0.1 M Sodium borate buffer(pH 8.3)에 HHL(hippuryl-histidyl-leucine)을 5 ㎎/㎖(w/v)의 농도로 녹인 후 사용하였다. ACE 저해활성은 시료 50 ㎕에 ACE 조효소액 50 ㎕을 가한 다음 37℃에서 5 분간 예비반응을 시킨 뒤 기질 용액 50㎕을 가한 후 다시 37℃에서 2시간 반응시켰다. 0.1 M HCl 150 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고 750 ㎕의 ethyl acetate를 가한 후 15초간 교반하고 4℃, 3000 rpm에서 5 분간 원심분리시켰다. 상등액을 완전히 건조시키고 증류수 1 ㎖에 녹여 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 조효소액 대신 증류수를 사용하였으며 양성 대조군은 에날라프릴 말레에이트 염(Enalapril maleate salt)을 사용하였다. 모든 대조군 및 실험군은 2반복하여 ACE 저해율을 다음 계산식을 이용하여 계산하였다. ACE 저해율 (%) =[1 - (O.D. of ACE test / O.D. of ACE control)] × 100
그 결과, 표 2 및 도 11에 나타난 바와 같이, 당6치4, 당5단3치2의 최종 농도가 증가할수록 ACE 효소의 저해율도 증가한 것을 알 수 있었다.
제조농도 (ppm) 최종농도 (ppm) 저해율 IC50
당5단3치2 3000 1000 86.7 ± 0.52 235.0 ppm
1500 500 66.2 ± 1.05
750 250 57.4 ± 2.79
375 125 37.2 ± 1.39
당6치4 3000 1000 51.3 ± 2.61 896.3 ppm
1500 500 43.4 ± 2.09
750 250 34.1 ± 2.35
375 125 30.9 ± 2.09
심적환 3000 1000 81.6 ± 0.26 395.0 ppm
1500 500 61.2 ± 0.35
750 250 48.3 ± 1.66
375 125 25.8 ± 0.17
Enalapril maleate salt
(양성 대조군)
75 25 91.9 ± 0.78
< 실험예 10> 혈액응고 관련인자 ( Thromboxane B2) 생성억제
실험예 10-1. 실험동물의 제조 및 혈장 준비
*260∼300g의 7주령 수컷 Sprague Dawley계 흰쥐(셈타코, Korea)를 구입한 후 1주 동안 새로운 사육 환경에 적응시키고, 실험 전 기간 동안 실험동물들은 고형사료(셈타코, Korea) 및 물을 자유롭게 섭취시켰다. 사육실 온도는 20±2℃, 상대습도는 65±5%를 유지하고, 광주기와 암주기를 12시간이 되도록 빛을 조절하였다. 먼저 표 3과 같이 일반식이(normal diet)를, 표 4와 같이 고콜레스테롤 식이(high-cholesterol diet)를 제조하였다.
Ingredient %(w/w)
Casein(from milk) 20
Corn Starch 15
Sucrose 49
Cellulose 6
Corn Oil 5
Mineral Mixture 3.5
Vitamin Mixture 1
Choline Bitartrate 0.2
DL-Methionine 0.3
Cholesterol 0
Cholic acid 0
Total 100
Ingredient %(w/w)
Casein(from milk) 20
Corn Starch 15
Sucrose 49
Cellulose 4.5
Corn Oil 5
Mineral Mixture 3.5
Vitamin Mixture 1
Choline Bitartrate 0.2
DL-Methionine 0.3
Cholesterol 1
Cholic acid 0.5
Total 100
먼저 동물 그룹을 두 개의 그룹으로 분류하고, 표 3, 표 4에서 제조된 일반식이와 고콜레스테롤 식이를 이들 두 그룹의 동물들에게 2주간 공급하였다. 이후, 실시예 2, 3에서 제조된 복합 추출물들을 표 5와 같이 각 시료를 농도별로 고콜레스테롤 식이와 함께 공급하였다.
시료 종류 Oral dose / day(28 days )
일반식이
( Normal diet )
sham DW
고콜레스테롤식이
( High - cholesterol diet )
-( 음성대조군 ) DW
당6치4 -100 당6치4 100 mg/kg body weight
당6치4 -400 당6치4 400 mg/kg body weight
당5단3치2 -100 당5단3치2 100 mg/kg body weight
당5단3치2 -400 당5단3치2 400 mg/kg body weight
심적환 -400(양성대조군) 심적환 400 mg/kg body weight
마지막 사료의 공급 24시간 후 에테르로 마취하고 하대정맥에서 채혈하였고 20분간 상온에서 방치한 후 고속원심분리기(Centricon T-42K, Italy)를 이용하여 3,000 rpm으로 15분간 원심분리를 시행하여 혈장을 얻었다.
실험예 10-2. 혈액응고 관련 인자 생성 억제 실험
트롬복산 A2(Thromboxane A2, TXA2)는 혈소판의 응집, 혈관 수축, 기관지 수축 등의 작용으로 뇌졸중, 혈전증, 혈액순환장애, 협심증, 기관지천식에 관여하는 것으로 알려져 있다. 프로스타그란딘(PGG2 or PGH2)이 변환된 TXA2는 반감기가 30초 정도로 화학적으로 매우 불안정하여 생성직후 체내에서 최종대사 산물인 Thromboxane B2(TXB2)로 변환되는데, Thromboxane B2는 혈관을 수축시키고 혈소판을 모아서 혈액 응고를 촉진하는 것으로 알려져 있다.
실시예 4에서 채취한 혈장을 이용하여 실시예 2, 3에서 얻어진 추출물들이 혈액응고 관련인자(Thromboxane B2)의 생성을 억제하는지 확인하기 위해 TXB2 EIA kit(Enzo, USA)를 이용하여 트롬복산 B2(thromboxane B2, TXB2) 농도를 측정하였다.
시험관에 혈장 또는 kit에 포함된 표준 TXB2를 농도별로 희석한 후 100㎕를 96 웰 프레이트(well plate)에 넣어서 well에 코팅되어 있는 일차항체(Goat anti-rabbit IgG antibody)에 혈장 중의 항원 또는 표준 TXB2를 결합시키고 여기에 conjugate(alkaline phosphatase conjugated TXB2)를 첨가하였다. 여기에 2차항체(rabbit polyclonal antibody to TXB2)를 첨가하고 상온에서 2시간 반응시켰다. 각 well을 TBST로 3회 세척하고 기질인 p-nitrophenyl phosphate용액을 200㎕씩 넣고 상온에서 45분간 반응시켰다. 반응을 정지시킨 후 ELISA reader(Molecular Devices, USA)기기를 이용해서 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과는 2회 반복하여 평균±표준오차(mean±SEM)로 나타내며, Student’s t-test로 통계처리하여 비교하였다. 통계처리에서 p값이 0.05 미만일 경우(p<0.05) 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
그 결과, 표 6 및 도 12에 나타난 바와 같이, 실시예 2, 실시예 3에서 얻어진 복합 생약 추출물(당6치4당, 5단3치2)의 농도가 증가할수록 혈중 혈액응고 관련인자(Thromboxane B2)의 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
Thromboxane B2 in plasma (pg/ml)
Normal diet sham 451.6  ± 53.3
High-cholesterol diet (-)control 1033.4 ± 211.7
당6치4-100 949.4 ± 160.1
당6치4-400 881.4 ± 231.1
당5단3치2-100 794.2 ± 198.3
당5단3치2-400 681.0 ± 85.0
심적환-400 824.1 ± 261.9

Claims (5)

  1. 당귀 에탄올 추출물 45~75 중량% 및 치자 에탄올 추출물 25~55 중량%를 유효성분으로 하는 혈전 용해제 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 세포접착단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 혈전 용해제 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 혈관염증유발 효소의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 혈전 용해제 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
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