KR20190090716A - 와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 뇌 신경세포 보호 및 신경질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 뇌 신경세포 보호 및 신경질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 와송으로부터 분획한 분획물은 높은 총 페놀화합물 함량을 나타냈으며, 특히, ABTS, DPPF 라디칼 소거 활성과 FRAP 및 지방질과산화물 생성 억제 활성, 과산화수소로 인한 신경세포 사멸에 대한 세포 생존율을 향상시키며 신경세포의 세포막 손상 보호 활성 효과를 가지고 있어 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
인체에서 산소를 소비하는 과정으로 인해 불가피하게 발생하는 부산물인 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 초과산화음이온(superoxide anion, O2-), 하이드록실라디칼(hydroxyl radical, OH.) 등과 같은 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)은 생체 내에서의 높은 반응성으로 인하여 독성을 유발한다. 적정량의 활성 산소종은 생체 내에서 세포내 신호전달 물질로 작용함으로써, 미토콘드리아 내의 전자전달계 및 백혈구 세포의 활성화 등 세포기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다. 반면, 과잉 생성된 활성 산소종은 생체 내의 산화방지 균형을 무너뜨림으로써 산화적 스트레스를 야기한다. 활성산소의 독성이 세포 구성성분들인 지방질, 단백질, 당 및 DNA 등을 비선택적, 비가역적으로 손상시켜 암을 비롯하여 뇌졸중, 알츠하이머병 등과 같은 뇌질환과 심장질환, 동맥경화, 염증 및 자가면역질환 등의 각종 질병 및 조화를 일으킬 수 있다.
생체 내에서 카탈레이스(catalase, CAT), 글루타싸이온과산화효소(glutathione peroxidase, GSH-Px), 초과산화물제거효소(superoxidedismutase, SOD)와 같은 내인성 산화방지효소들은 활성산소와의 균형을 유지함으로써 DNA 손상, 단백질 변형 및 지방질 과산화를 예방한다. 인간의 신체 부위 중 뇌는 상대적으로 활성산소를 제거하는 내인성 산화방지효소가 적으며, 전체 산소 소비량의 20%를 차지하기 때문에 체내에서 가장 많은 활성산소가 발생하는 부위이다. 또한 뇌는 신경전달 기능으로 인하여 활성 산소종에 의해서 쉽게 산화되는 불포화지방 함량이 높아 다른 장기들에 비해 산화적 스트레스에 매우 취약하므로 과량의 활성 산소종은 신경세포의 사멸을 통한 뇌손상을 일으키게 된다. 이에 따라 산화방지 활성을 통해 활성 산소로 유발된 산화스트레스로부터 신경세포를 보호할 수 있으며, 신경퇴행성질환 예방에 기여환다고 보고되고 있는 페놀성 화합물이 풍부한 천연소재에 대한 관심이 높아지고 있다.
대한민국 공개특허공보 제2009-0055957호는 와송 추출물을 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것으로, 와송 추출물이 피부 각질 형성 세포 분화 촉진 및 피부 장벽 기능 회복에 효과가 있고, 각질형성세포의 분화를 촉진하고 피부 장벽 기능을 회복시키는 피부 보흡용 화장료로 개시되고 있으며, 대한민국 공개특허공보 제2015-01000078호는 와송추출물을 이용한 항암 기능성 된장 및 간장에 관한 것으로, 와송 열수추출물로 콩을 삶아 발효시켜 만든 와송 메주와, 이로부터 제조되는 된장, 간장에 대하여 개시되며, 와송 된장 및 간장의 항암활성과 관능성에 대하여 개시되어 있다.
그러나 아직까지 와송 추출물을 통한 신경질환 예방 및 치료에 관한 것은 상대적으로 미비한 실정이다. 따라서, 천연물질인 와송으로부터 산화방지 활성 및 신경세포의 보호 및 치료효과를 가지는 치료용 조성물로서의 연구가 필요하다.
따라서, 상기와 같은 종래의 문제점들을 개선하기 위해 안출된 본 발명의 목적은, 와송 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 와송 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공하는 것이다.
전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 와송(Orostachys japonicus A. Berger)의 산화방지 효과와 산화스트레스로부터의 신경세포 손상에 대한 보호효과 및 주요 생리활성물질을 분석하였다. 와송(Orostachys japonicus A. Berger, 瓦松)은 둥근바위솔이라하며 일명 암송 및 옥송 등으로 불리는 돌나물과의 다년생 초본식물로 산 위의 바위에서 자라며 민간에서는 와송의 뿌리를 제거한 전초를 건조하여 약용으로 사용해 왔다. 본 발명에서는 와송으로부터 노말헥세인, 클로로폼, 아세트산에틸 및 증류수 분획물을 각각 제조하였으며, 총 페놀화합물 함량을 확인하였다. 와송 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Orostachys japonicus A. Berger extract:EFOJ)은 다른 분획물보다 높은 총 페놀화합물 함량을 나타냈으며, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)로 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성과 FRAP 검정 및 지방질과산화물 억제력 분석을 실시한 결과, 우수한 라디칼 소거 활성, 총산화방지력과 과산화 지방질 생성물의 억제력을 확인하였다. 또한 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)은 과산화수소로 인한 신경세포 사멸에 대한 세포 생존율을 향상시켰으며, 신경 세포막 손상을 보호하는 능력이 우수한 것을 확인하였다. 이러한 생리 활성을 가진 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 주요물질을 분석하기 위하여 LC-MSe를 실시하였으며, 주요 생리활성 물질은 퀘세틴 배당체와 캠페롤 배당체로 추정되었다.
또한, 신경세포 손상에 관련 신경질환의 치료 및 개선 효과를 증진시키기 위해 와송 추출물과 와송 분획물을 혼합하여, 혼합물을 제조하였으며, 제조된 혼합물의 적정 혼합비를 통해 신경세포 손상에 대한 세포 생존율 및 산화적 손상을 방지하는 효과를 확인하였다.
본 연구 결과들을 바탕으로, 와송 추출물은 우수한 산화방지력을 가지고 있을 뿐만 아니라 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호효과를 통해 퇴행성 신경질환과 같은 질병을 예방할 수 있는 건강기능식품의 천연산화방지제 소재로서의 유용성을 확인하였다.
전술한 바와 같은 본 발명의 와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 따르면, 와송 추출물과 이의 분획물은 높은 총 페놀화합물 함량을 나타냈으며, 특히, ABTS, DPPF 라디칼 소거 활성과 FRAP 및 지방질과산화물 생성 억제 활성, 과산화수소로 인한 신경세포 사멸에 대한 세포 생존율을 향상시키며 신경세포의 세포막 손상 보호 활성 효과를 가지고 있어 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품으로 이용이 가능하다.
이상에서의 본 발명에 따른 효과는 상기에 한정되는 것은 아니며, 기타 본 발명의 효과들은 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 와송으로부터 추출물과 분획물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 와송 분획물인 노말헥세인 분획물, 클로로폼 분획물, 아세트산에틸 분획물 및 증류수 분획물 각각의 총 페놀화합물 함량을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 와송 분획물의 ABTS 라디칼 소거 활성 및 DPPH 라디칼 소거 활성도 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 와송 분획물의 총산화방지력 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 와송 분획물의 malondialehyde(MDA)의 생성 억제 측정결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 와송 분획물의 과산화수소로 유도된 활성 산소종 생성 억제 측정 결과는 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 와송 분획물의 신경세포 생존력, 세포막 손상에 대한 LDH 방출 억제 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 와송 분획물의 총이온 크로마토그래피 및 이온스팩트럼에서 검출된 화합물을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 와송 혼합물의 과산화수소에 대한 신경세포 생존율 및 세포 손상 억제 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 와송 혼합물의 알코올에 대한 신경세포 생존율 및 세포 손상 억제 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 와송 분획물인 노말헥세인 분획물, 클로로폼 분획물, 아세트산에틸 분획물 및 증류수 분획물 각각의 총 페놀화합물 함량을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 와송 분획물의 ABTS 라디칼 소거 활성 및 DPPH 라디칼 소거 활성도 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 와송 분획물의 총산화방지력 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 와송 분획물의 malondialehyde(MDA)의 생성 억제 측정결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 와송 분획물의 과산화수소로 유도된 활성 산소종 생성 억제 측정 결과는 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 와송 분획물의 신경세포 생존력, 세포막 손상에 대한 LDH 방출 억제 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 와송 분획물의 총이온 크로마토그래피 및 이온스팩트럼에서 검출된 화합물을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 와송 혼합물의 과산화수소에 대한 신경세포 생존율 및 세포 손상 억제 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 와송 혼합물의 알코올에 대한 신경세포 생존율 및 세포 손상 억제 실험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명은 와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일실시예에 따르면 와송 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서 이용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 상기 분획물은 노말헥세인, 클로로폼, 아세트산에틸 또는 증류수 중에 선택된 하나로 추출한 것일 수 있다. 여기서, 와송 분획물은 냉동 건조시킨 와송을 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 통하여 추출된 추출물로부터 분획될 수 있다. 구체적으로, 와송분획물은 냉동 건조시킨 와송을 80% 에탄올에 40℃에서 2시간동안 환류 냉각하여 와송추출물을 추출한 후, 와송추출물을 증류수에 녹여 노말헥세인 및 클로로폼으로 순차적으로 분획하고 남은 와송추출물에서 아세트산에틸로 분획하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 따른 와송 추출물 또는 이의 분획물은 산화 방지 활성 및 과산화 수소로 유도된 산화 스트레스로부터 신경세포의 보호 활성을 가진다. 본 발명에 따르면 와송 추출물의 고부가 자연 산화방지제 및 신경질환 치료용 약학 조성물로서 이용될 수 있다.
본 발명에서 와송 추출물 또는 분획물을 포함하는 조성물의 신경질환 치료 및 개선 효과를 증진하기 위하여 와송 추출물과 분획물을 혼합한 혼합물로서 제공될 수 있다. 예를 들어 와송 추출물은 물, 30 내지 100% 에탄올 또는 메탄올로 추출하여 제조한 것을 이용할 수 있다. 또한, 상기에서 제조된 와송 분획물을 이용하여 와송 추출물과 분획물의 혼합물을 이용할 수 있다. 이에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 와송 추출물 : 와송 분획물은 1:2 내지 2:1 의 혼합비로 혼합한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 와송분획물은 과산화 수소 유발 산화 스트레인 인 활성 산소종의 감소, 또는 신경 세포의 산화 스트레스로 인한 세포막 손상 감소 활성이 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면 와송 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 신경질환 치료 및 예방용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명에서 신경질환은 신경세포 손상에 의해 발병되는 질병으로 뇌졸증, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨 질환, 허팅턴병, 피크병, 크로이펠츠-야콥병, 전두측두치매, 루이치매, 근육위축가쪽경화증, 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계자가면역질환, 다발성경화증, 염증성 및 신경병증성 통증 또는 뇌혈관질환 중에 하나 일 수 있으며, 바람직하게는 뇌손상, 뇌질환, 척추손상 말초신경손상, 말초신경질환 또는 근위축성 측색 경화증 중에 어느 하나 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 치매(dementia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's, disease), 뇌전증(epilepsy), 뇌졸증(stroke), 중풍, 허혈설 뇌질환 또는 퇴행성 뇌질환 중 어느 하나 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 추출 용매로 추출하거나 추출 용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에서는 추출 용매에는 제한되지 않으나, 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디크로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 또한, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 용매로서 80% 에탄올을 이용하여 추출하였으며, 이후 추출물을 증류수에 녹인 뒤 노말헥세인, 클로로폼, 아세트산에틸로 순차적으로 분획하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 "추출물(extract)"은 와송을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 와송 추출물은 통상의 기술분야에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경질환의 발생 및 이로인한 합병증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 신경질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 신경질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸의 경구형 제형, 액상, 크림상, 로션상, 페이스트상 또는 고체상의 경피 국소 도포형 제형, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되고 있다.
본 발명에서 약학조성물은 와송 추출물 또는 이의 분획물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 추가하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 와송 추출물 또는 와송 분획물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 경피, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
본 발명의 조성물은 식품으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 다른 신경질환 치료제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강기능식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 와송 추출물 또는 와송 분획물을 활성성분 또는 유효성분으로 포함하여 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다.
첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 와송 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이하에서 설명되는 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 예시로서 이에 의해 본 발명이 한정되는 것을 아닐 것이다.
<실시예 1> 와송 추출물의 산화방지 활성 및 산화 스트레스에 대한 신경세포 보호 활성
1-1 재료 준비
본 발명에서 사용된 시약으로 폴린-시오칼토 페놀시약(Folin-Ciocalteus phenol reagent), 갈산(gallic acid), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazdine- 6sulfonic-acid)(ABTS), 트리클로로아세트(trichloroacetic acid), 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ), 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA), 과산화수소(H2O2), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 분석키트(assay kit), 락트산수소떼기효소(lactate dehydrogenase) release 분석키트는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. HEPES, 탄산수소나트륨, 소태아혈청, RPMI 1640 medium은 Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin) 및 나머지 시약은 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하여 사용하였다.
1-2 와송 추출물의 제조
본 발명에서 사용된 와송(Orostachys japonicus A. Berger)은 경상북도 문경시 산북면 대상리에 위치한 '게르마늄 햇살와송'으로부터 2015년 8월에 구입하여 사용하였다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 와송으로부터 추출물과 분획물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다. 본 발명에서 사용된 와송 추출물은 냉동건조 시킨 와송을 80% 에탄올에 40℃에서 2시간 동안 환류 냉각 조건에서 50배 추출하였으며, 이 와송추출물은 No.2 거름종이(Whatman Inc, Kent, UK)로 여과하여 농축하였다. 그 후 3차 증류수에 녹인 후, 동일한 비율의 노말헥세인(n-hexane)을 이용하여 극성차이로 분획하였고, 남은 3차 증류수 층은 클로로폼(chloroform) 및 아세트산에틸(ethylacetate: EtOAC) 용매를 사용하여 순차적으로 각각 분획하였다.
각 분획물은 농축하여 냉동건조 시킨 후, -20℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.
<실시예 2> 와송 추출물의 페놀화합물 함량 확인
2-1 와송 추출물의 총 페놀화합물 함량 확인
상기 실시예에서 제조한 와송분획물 1 mL에 3차 증류수 9 mL을 혼합하고, 폴린-시오칼토 페놀시약을 1 mL 혼합한 후, 상온에서 5분 방치하였다. 혼합용액에 7% 탄산소듐(Na2CO3)용액 10 mL을 넣어 혼합한후, 3차 증류수로 25 mL 정량하였다. 상온에서 2시간 방치 후, 분광광도계(UV-spectrophotometer, Libra S32PC, Biochrom Ltd.,Cambridge, UK)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도는 갈산(gallic acid) 보정곡선을 이용하여 총 페놀화합물 함량을 환산하였다.
플라보노이드류, 페놀산류 및 식물성 에스트로겐류를 포함하는 총 페놀화합물은 식물의 2차 대사산물로, 페놀릭 하이드록실기를 2개 이상 가지고 있다. 이를 통한 수소공여로 라디칼과 반응하여 공명구조를 통해 안정화됨으로써 산화를 방지하는 활성 및 항노화 등과 같은 생리효과를 가지게 된다. 이에 와송의 산화방지효과를 알아보기 위하여 상기 실시예에서 제조된 와송의 분획물들인 노말헥세인 분획물, 클로로폼 분획물, 아세트산에틸 분획물 및 증류수 분획물 각각의 총 페놀화합물 함량을 측정하였으며, 결과는 도 2에 표시하였다. 각각의 분획물의 총 페놀화합물 함량은 99.00, 129.83, 222.92 및 81.58 mg GAE/gof dried Orostachys japonicus A. Berger으로, 아세트산에틸 분획물(EFOJ)에서 가장 우수한 함량을 나타냈다. 이는 분획을 통해 와송에 함유되어 있는 페놀성 성분들이 극성도에 따라 용매별로 분획된 것으로 판단된다. 총 페놀화합물은 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성, 환원력 및 과산화 지방질 억제와 같은 산화방지 활성에 중요한 인자로 작용한다. 이에 따라 가장 높은 총 페놀화합물 함량을 나타낸 아세트산에틸 분획물(EFOJ)을 이용하여 이후 실험을 진행하였다.
<실시예 3> 와송 분획물의 산화 방지 효과
3-1 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성
상기 실시예에서 제조된 와송 분획물의 ABTS 라디칼 소거 활성 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. ABTS 용액은 734 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02이 나오도록 완충용액으로 희석시켜 사용하였다. 시료용액 20 μL에 흡광도 값을 맞춘 ABTS 용액 980 μL를 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH 라디칼 소거 활성 측정은 80% 메탄올로 용해시킨 0.1mM DPPH 용액을 517 nm에서 흡광도 값이 1.00±0.02이 나오도록 80% 메탄올로 희석시켜 사용하였다. 추출물 0.1 mL에 흡광도를 맞춘 DPPH 용액 2.9 mL을 균일하게 혼합한 후, 암흑에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성과 DPPH 라디칼 소거 활성은 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.
ABTS 라디칼 소거 활성은 과황산칼륨과의 반응을 통해 인위적으로 만들어진 청록색을 띄는 과산화라디칼(peroxide radical) 성격의 ABTS 라디칼이 샘플에 있는 다양한 산화방지물질들에 의해 제거되어 청록색이 탈색되어 나타나는 색 변화를 이용하여 측정하였다. ABTS 라디칼은 물과 유기용매에 용해될 수 있기 때문에 친수성 및 친유성 화합물의 산화방지력을 측정하는데 효과적인 산화방지력 측정 방법이다. 상기 실시예에서 제조된 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 ABTS 라디칼 소거 활성은 도 3의 (A)에 나타냈다. 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 200 μg/mL 농도에서 ABTS 라디칼 소거 활성은 69.04%로 측정되었으며, 그 이상의 농도에서는 라디칼의 완전한 소거 활성을 나타냄으로써 매우 뛰어난 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타냈다.
DPPH 라디칼 소거 활성은 수소 공여 산화방지제를 측정하는 것으로, 산화방지제에 의해 수소나 전자를 받아 환원되면서 보라색이 탈색되어 나타나는 색 변화를 이용한 측정법으로 비교적 실험법이 간단하고 짧은 시간 내에 산화방지력을 측정할 수 있어 널리 이용되고 있다. 이를 이용하여 와송 아세트산 에틸 분획물(EFOJ)의 산화방지력을 측정하였다. 측정된 산화방지력은 도 3의 (B)에 나타냈다. 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 DPPH 라디칼 소거 활성은 농도 의존적으로 증가함을 확인하였으며, 1000 μg/mL 농도에서 DPPH 라디칼 소거 활성은 91.79%로 측정되었다. 또한 양성대조구인 비타민C의 농도 500 μg/mL (96.91%)와 비교하였을 때, 유사한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다. 다양한 연구를 통해 총 페놀화합물은 반응성이 높은 라디칼 소거 활성을 지니는 것으로 알려져 있으며, 이를 고려할 때, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)에 존재하는 높은 함량의 총 페놀화합물이 ABTS 라디칼 소거 활성과 DPPH 라디칼 소거 활성에 영향을 미쳤을 것이라 판단된다.
3-2 Ferric reducing/antioxidant power(FRAP)를 이용한 총산화 방지 효과 확인
본 발명의 실시예에서 제조된 와송 분획물을 이용하여 FRAP으로부터 총산화방지 효과를 측정하였다. 미리 제조된 아세트산나트륨 완충용액, TPTZ 용액 및 염화제2철(FeCl3) 용액을 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 37℃에서 10분간 방치시켜 FRAP 시약을 준비하였다. FRAP 시약 1.5 mL를 와송분획물 50 μL에 혼합한 뒤 실온에서 30분간 방치한 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다.
FRAP 방법은 ABTS 라디칼과 DPPH 라디칼 소거 활성과는 메커니즘이 다른 산화방지력 측정법이다. ABTS와 DPPH 방법의 경우 시료 속의 산화방지 물질이 라디칼을 직접적으로 소거하는 것을 이용하여 착안된 방법인 반면, FRAP 방법은 시료의 전자공여능을 측정하지 않고 산화 및 환원 반응을 측정함으로써 산화방지제인 총 페놀화합물이 Fe3+을 Fe2+으로 환원시키는 원리를 이용하여 측정하였다. 측정된 결과는 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타낸 것과 같이, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 1,000 μg/mL 농도에서 총산화방지력은 1.77로, 양성대조구인 비타민C의 농도 500 μg/mL(2.74)와 비교하였을 때, 유의적으로 낮은 총산화방지력을 나타냈고, 농도가 증가함에 따라 총산화방지력이 증가하는 농도 의존적 경향도 확인되었다. 이 결과를 통해, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)은 라디칼 소거 활성뿐만 아니라 잠재적인 산화방지 활성의 척도인 환원력이 있음을 확인하였다.
3-3 지방질과산화물(MDA) 생성 억제 효과 확인
본 발명의 실시예에서 제조된 와송 분획물을 이용하여 뇌 조직에서 지방질 과산화 생성물인 MDA 생성 억제 활성을 측정하였다. ICR(Institute of Cancer Research) 쥐(8주령, 숫컷)는 실험동물 공급업체(Santako, Osan, Korea)로부터 구입하여 7일간의 환경적응기간을 유지했다. 뇌 부위 조직을 10배의 차가운 트리스-염산 완충용액(20 mM, pH 7.4)에 균질화 시킨 후 4℃에서 15분간 12,000×g으로 원심분리하였다. 상층액 0.1 mL에 10 μM 황산철(II) 0.1mL, 0.1 mM 아스코르브산 0.1 mL 및 시료 0.2 mL를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 이 반응액에 30% 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid) 0.1 mL을 첨가하여 반응을 종결시키고, 1% 싸이오바비트루산(thiobarbituric acid) 0.3 mL을 첨가하여 80℃에서 20분간 가열한 후, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 후 상층액을 취하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 동물 실험은 경상대학교 동물윤리심의위원회 승인을 거쳐 진행하였다(경상대학교 동물실험인가번호 GNU-120831-M0067).
자유라디칼과 같은 활성 산소종에 의해 손상된 조직에서 생성되는 지방질과산화물의 중간생성물인 MDA는 산화 스트레스를 측정하기 위한 지표로 제시된다. 뇌 조직은 뇌신경세포의 신호전달 기능으로 인해 높은 함량의 불포화 지방산을 함유한 조직일 뿐만 아니라 낮은 함량의 체내 산화방지 효소를 가지고 있어 활성 산소종의 존재에 매우 취약한 부위이다. 본 발명을 통해서 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)이 산화적 스트레스에 대한 지방질과산화물 생성 억제효과를 측정하기 위하여 ICR 쥐에서 적출한 뇌 조직을 사용하여 실험을 진행하였으며, 그 결과를 도 5에 나타냈다. 도 5에서와 같이, 상기 실시예에서 제조된 와송 아세트 산에틸 분획물(EFOJ)의 1,000 μg/mL 농도에서 70.26%의 MDA 생성 억제 효과를 보였으며 양성대조군인 카테킨(100 μg/mL) 농도에서의 72.28%와 유사한 MDA 생성 억제 효과를 보였다. 페놀성 화합물을 많이 함유하고 있는 추출물은 지방질과산화물의 생성을 억제하는 효과가 높다는 것으로 보고되고 있으며, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)은 총 페놀화합물의 함량이 높다는 것을 본 발명에서 확인하였다. 이에 와송에 존재하는 페놀성 화합물들이 산화방지력에 유효한효과를 내재함으로써 지방질과산화물인 MDA의 생성을 억제한 것으로 판단된다. 퇴행성(알츠하이머성) 치매 환자들의 뇌에는 아크로레인(acrolein)과 같은 지방질과산화물의 생성이 증가되는 점에서 본 발명의 와송의 아세트산에틸 분획물(EFOJ)이 뇌 조직에 생성되는 지방질과산화물 생성 억제효과를 기반으로 신경퇴행성질환의 예방이 가능하다.
<실시예 4> 신경세포 손상에 대한 보호 효과
4-1 신경세포 배양 및 세포내 산화스트레스 측정
상기 실시예에서 제조된 와송 분획물의 신경 세포의 산화 스트레스를 측정하였다. 본 실험에서 사용한 PC12 신경세포(KCLB 21721, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 신경세포의 특성을 나타내는 세포로 쥐의 갈색 세포 종으로부터 유래한 것이다. PC12 신경세포를 25mM HEPES, 25 mM 탄산수소소듐, 10% 소태아혈청, 50 units/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
과산화수소로 유도된 PC12 신경세포 내 산화 스트레스 생성량은 dihydrochlorofluoresein-diacetate(DCF-DA)를 이용한 측정방법으로 수행하였다. PC12 신경세포를 1.0×104 cells/well로 분주하였고, 샘플 및 양성대조구인 비타민C (200 μM)를 PC12 신경세포에 처리하였다. 24시간 방치 후, 200 μM 과산화수소를 3시간 동안 반응시켰으며 대조구(control)에는 동일양의 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS, pH 7.4)을 처리하였다. 이후, 50 μM DCF-DA를 넣어 50분간 배양하여 형광 마이크로플레이트 분석기(fluorescence microplate reader, Infinite 200, Tecan Co. SanJose, CA, USA)를 사용하여 485 nm (excitation wave)과 535 nm (emission wave)에서 형광강도를 측정하였다.
과산화수소(H2O2)는 활성 산소종의 하나로 생체막을 투과할 수 있어 세포에 산화적 스트레스를 유발하며, 세포 내의 과도한 양의 과산화수소는 금속 양이온인 Fe2+ 와의 반응을 통해 하이드록실라디칼 단계를 거쳐 세포 내 거대분자를 비가역적으로 손상시키며, 신호전달경로에 관여하여 세포사멸을 유도한다.
따라서, 본 실험예에서는 PC12 신경세포에 산화적 스트레스를 가하기 위하여 과산화수소(H2O2)를 사용하였다. 비형광 화합물인 DCF-DA가 탈 에스터화 과정을 거쳐 세포 내로 들어가게 되면, 세포 내 존재하는 활성 산소종에 의해 형광 물질인 DCF로 산화되는 원리를 이용하여 PC12 신경세포에 있어 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 과산화수소로 유도된 활성 산소종 생성 억제 효과를 측정하기 위한 DCF-DA 실험을 진행하였으며, 실시한 결과는 도 6에 나타냈다. 과산화수소만 처리한 그룹에서는 대조구와 대비하여 170.90%의 활성산소 생성량이 나타났고, 과산화수소와 비타민C (200 μM)를 함께 처리한 그룹에서는 47.79%의 활성산소 생성량이 나타났다. 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)을 처리한 그룹에서는 100 μg/mL 농도에서 46.07%의 활성산소생성량을 나타내었으며, 높은 수준으로 활성산소 생성량을 억제하였음을 확인할 수 있었다. 세포 내 초과산화음이온(O2-)은 NADPH 산화효소에 의한 산화나 미토콘드리아에서의 호기성 호흡에 의한 전자 누출에 의해 불가피하게 발생되며, 초과산화음이온은 세포내 존재하는 초과산화물제거효소(SOD)에 의하여 빠르게 과산화수소(H2O2)로 전환되며, 이는 카탈레이스(CAT), 글루타싸이온과산화효소(GSH-Px)과 같은 세포내 산화방지 효소에 의하여 H2O로 전환된다. 그러나 H2O2 수준이 산화방지 효소가 제어할 수 없을 정도로 증가하게 되면, 하이드록실라디칼(OH.)은 금속 양이온과의 반응을 통해 형성되고 이는 세포 거대 분자를 비가역적으로 손상시켜 결국 세포사멸로 이끌게 된다. 신경세포 내 활성 산소종의 증가는 세포내 산화방지 효소인 글루타싸이온(GSH)를 고갈시키고, 칼슘이온을 유입시켜 신경세포의 사멸및 손상을 유도한다고 알려져 있으며, 식물성 화학물질인 폴리페놀 및 플라보노이드는 이러한 활성 산소종에 의한 손상이나 사멸을 막을 수 있다고 보고되고 있다. 이에 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ) 내의 폴리페놀성 생리활성물질이 세포내 과산화수소로 유도된 과도한 양의 활성 산소종을 감소시켜줌으로써 세포내 산화방지 효과를 가질 수 있다.
4-2 신경세포 생존율 및 세포막 손상 보호 효과
상기 실시예에서 제조된 와송 분획물의 과산화수소에 의해 유도된 PC12 신경세포 사멸에 대한 보호 효과를 MTT 검정법으로 측정하였다. 와송 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Orostachys japonicus A. Berger extract:EFOJ)을 PC12 신경세포에 24시간동안 전 배양한 후, 200 μM 과산화수소를 3시간동안 처리하였으며 대조구에는 동일양의 인산 완충식염수를 처리하였다. 이 상태의 PC12 신경세포에 MTT stock 용액(5 mg/mL)을 처리하여 37℃에서 3시간 배양 시킨 후, 배지를 거른 well에 DMSO 100 μL를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 마지막으로, 흡광도는 microplate reader (680, bio-rad, Tokyo, Japan)에서 570 nm (determination wave)와 690 nm (reference wave)에서 측정하였다. 양성대조구는 비타민C (200 μM)를 사용하였고, 세포 생존율은 대조구에 대한 % 농도로 나타내었다. PC12 신경세포에 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)을 48시간 동안 전 배양한 후, 200 μM 과산화수소를 처리하고 대조구에는 동일양의 인산완충식염수를 처리하였다. 그 후 3시간 배양하고, 5분간 원심분리(250×g)하여 100 μL 상층액을 새로운 well로 옮긴 후 LDH 분석키트(Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 세포막 손상효과를 측정하였다.
살아있는 세포는 미토콘드리아의 전자전달계를 통하여 생존에 필요한 에너지를 생산하는데, 세포 내의 환원 효소에 의해 쉽게 환원되는 MTT의 색 변화를 통하여 미토콘드리아의 전자전달능력 및 세포의 활성 정도를 측정하여 세포 생존률을 확인할 수 있는 MTT assay를 진행하였으며, 과산화수소로 유도된 산화적 스트레스 상태에서 PC12 신경세포의 생존율에 대한 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 효과를 MTT assay로 측정한 결과는 도 7의 (A)에 나타냈다. 과산화수소를 처리한 그룹에서는 대조구와 대비하여 86.44%의 세포 생존율을 나타냈고, 과산화수소와 비타민C (200μM)를 함께 처리한 그룹에서는 105.13%의 세포 생존율을 나타냈다. 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)을 처리한 그룹에서는 40 μg/mL 농도에서 112.18%의 세포 생존율을 나타냈다. 다음으로, 세포막 손상에 대한 와송 아세트산에틸 분획물의 보호효과에 대한 효과를 알아보기 위하여 락트산수소떼기효소 실험을 수행하였으며, 그 결과는 도 7의 (B)에 나타냈다. 락트산수소떼기효소는 세포막에 존재하는 지방질 성분이 산화적 스트레스로 인해 세포막 보전이나 유동성에 변화가 일어남으로써 세포막 파괴를 통해 배지로 방출되는 물질로, 세포막의 파괴를 알 수 있는 척도로서 신경퇴행성 질환의 지표로 제시된다. 과산화수소로 유도된 세포막 손상에 대한 와송 아세트산에틸 분획물의 보호효과에 대한 실험 결과는 다음과 같다. 과산화수소만 처리한 그룹(103.28%)에서는 대조구(86.69%)와 대비하여 약 17% 정도 락트산수소떼기효소 방출량이 증가하였으며, 비타민C(200 μM) 처리 그룹(79.88%)은 락트산수소떼기효소 방출량이 과산화수소 그룹보다 약 23% 감소하였다. 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)을 처리한 그룹은 모든 농도에서 유의적으로 과산화수소 처리군보다 락트산수소떼기효소 방출량이 낮으며 농도 의존적인 경향을 보였다. 100 μg/mL 농도에서 락트산수소떼기효소 방출량이 80.08%로 비타민C 그룹과 유사한 신경세포막 보호효과를 나타냈다. MTT assay 결과에서, 과산화수소(H2O2)를 처리한 음성대조구과 대조구를 비교하였을 때, 대조구에서 세포 생존율이 더 높음을 확인하였으며, 이는 처리한 과산화수소(H2O2)가 생체막을 투과하여 세포 내 거대분자를 손상시키고 신호전달경로에 관여하여 세포사멸을 유도한 것이라 판단된다. 이에 본 발명의 실시예에서 제조된 와송 추출물을 처리한 그룹에서 세포생존율이 샘플 처리 농도에 의해 유의적으로 높아짐을 확인함에 따라 와송 추출물의 산화방지력이 신경세포 내의 산화적 스트레스를 감소시켜줌으로써 미토콘드리아 전자전달계에 관여되는 단백질 손상과 세포사멸로 유도되는 신호전달경로의 감소에 기여한 것이라 판단되며, 신경세포 내 산화적 스트레스로 인한 세포막 손상을 감소시켜 줌으로써 신경세포를 보호하였다고 판단된다. 결국 위 결과들을 고려할 때, 상기 실시예에서 제조된 와송 추출물의 산화방지 효과에 기인한 뇌신경세포 보호 효과는 나아가 퇴행성 신경질환을 예방에 기여할 수 있다.
<실시예 5> 와송 아세트산에틸 분획물의 생리활성 물질 분석
5-1 주요 생리활성물질 분석
상기 실시예에서 제조된 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)의 주요 생리활성물질은 초 고성능 액체 크로마토그래피 사중극 비행시간 질량 분광법(ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time of flight tandem mass spectrometry, UPLC-QTOF/MS)을 사용하여 분석하였다. 크로마토그래피실험은 Waters ACQUITYTM UPLCTM system(Waters Corp., Miford, MA, USA)로 수행되었다. 시료는 메탄올에 용해시킨 후 0.2 μm 필터로 여과하여 사용하였으며, ACQUITY UPLC BEH C18 column (2.1×100 mm, 1.7 μm particle size; Waters Corp.)으로 유속 0.4 mL/min 조건으로 생리활성 물질의 UPLC 분석하였다. 이동상 용매는 A (0.1 % 폼산) 및 용매 B (메탄올)로 구성되었고, 기울기 용리 조건: 0-0.5 min, 0% B; 0.5-8 min, 0-100% B; 8-8.5 min 100% B; 8.5-10 min 100-0% B; 10-11 min 0% B으로 설정하였다. 이온화는 전기 분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 음이온모드에서 수행되었다; ramp collision energy, 20-40 V; oven temperature, 40℃; capillary voltage, 3 kV; desolvation temperature, 350℃; pressure of nebulizer, 40 psi; fragmentor, 175 V; cone voltage, 40 V; 질량 범위, 50-1200 m/z.
뛰어난 산화방지 활성에 기인한 신경세포 보호효과를 가진 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)에 존재하는 주요 생리활성 물질을 확인하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피 사중극 비행시간 질량 분광법(UPLC-QTOF/MS)을 실시하였으며, 와송 아세트산에틸 분획물(EFOJ)에서 얻어진 총 이온 크로마토그램(total ion chromatogram)의 peak들에 대해 상대적 함량의 50% 이상의 화합물을 주요물질로 판단하여 해당 물질 peak에 대한 질량 스펙트럼 분석을 통해 순차적으로 MSe 분석을 진행하였으며, 그 결과는 도 8에 나타냈다. 음이온모드 [M-H]-: 화합물 A, 463 m/z (머무름시간(retention time, RT): 5.64 min, 조각화 이온(fragment ions): 463, 300, 301 m/z) (도 8의 (B)); 화합물 B, 593 m/z (머무름시간: 5.85 min, 조각화 이온: 593, 285 m/z) (도 8의 (C)); 화합물 C, 447m/z (머무름시간: 6.04 min, 조각화 이온: 447, 284, 285 m/z) (도 8의 (D)); 화합물 D, 431 m/z (머무름시간: 6.44 min, 조각화 이온: 431, 285, 284 m/z) (도 8의 (E))이며, 크로마토그램에서의 peak 면적을 활용한 상대적 함량: 화합물 A (8,815), 화합물 B (3,153), 화합물 C (6,290), 화합물 D (3,360)을 확인하였다. 다른 주요한 단편들과의 비교에서 이러한 peak들의 질량 스펙트럼 경향은 각각 쿼세틴-3-O-글루코사이드(화합물 A), 캠페롤-3-O-루티노사이드(화합물 B), 캠페롤-3-O-글루코사이드(화합물 C) 및 캠페롤-3-O-람노사이드(화합물 D)로 추정하였다. 와송 추출물로부터 동정된 다양한 플라보노이드 물질과 알칼로이드계 물질은 우수한 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성과 산화질소라디칼(NO.) 소거 활성을 가졌으며, 특히 쿼세틴과 캠페롤 배당체로부터의 산화방지능이 우수함을 가진다. 이에 와송에 존재하는 주요 생리활성 물질이 in vitro 산화방지 효과와 과산화수소로 유도된 산화스트레스에 대한 신경세포 보호효과를 나타낸 것으로 판단된다.
<실시예 6> 와송 추출물의 혼합물 제조 및 신경세포 보호효과
6-1 와송 추출물의 혼합물 제조
상기 실시예에서 확인한 와송 아세트산에틸 분획물의 신경세포 보호 효과를 증진하기 위하여 와송의 60% 에탄올 추출물(EtOH)과 와송 아세트산에틸 분획물을 혼합하여 혼합물을 제조하였다.
본 실시예에서 와송의 60% 에탄올 추출물(EtOH): 와송 아세트산에틸 분획물(EtOAc)을 1:2, 1:1, 2:1의 혼합비로 혼합하여 제조하였으며, 제조된 혼합물을 이용하여 신경세포 생존율 및 보호효과에 대하여 실험하였다.
6-2 신경세포 보호 효과 확인
상기 실시예 6-1에서 제조된 혼합물을 이용하여 최적의 신경세포 보호 효과를 갖는 혼합비를 확인하기 위해 신경세포의 산화적 스트레스에 대한 세포 생존율을 확인하였다.
PC12 신경세포에 대해 와송 60% 에탄올 추출물(EtOH)과 아세트산에틸 분획물(EtOAc)의 혼합비(EtOH:EtOAc)가 1:1, 2:1, 1:2 인 혼합물을 과산화수소로 유도된 활성산소종 생성에서 신경세포 생존율과, DCF-DA 실험을 진행하였다. 실험 결과에서 EtOH:EtOAc가 1:1과, EtOH:EtOAc 2:1 인 혼합물 보다 EtOH:EtOAc 1:2인 혼합물에서 높은 신경세포 생존율과 산화적 스트레스 소거 활성이 나타났다(도 9).
PC12 신경세포에 대해 와송 60% 에탄올 추출물(EtOH)과 아세트산에틸 분획물(EtOAc)의 혼합비(EtOH:EtOAc)가 1:1, 2:1, 1:2 인 혼합물을 에탄올로 유도된 활성산소종 생성 억제효과를 측정하기 위한 신경세포 생존율과 DCF-DA 실험을 진행하였다. 실험 결과, 도 9와 유사한 결과를 보였으며, EtOH:EtOAc 가 1:2인 혼합물이 다른 비율의 혼합물과 비교하였을 때 높은 신경세포 생존율과 산화적 스트레스 소거 활성이 나타났다(도 10).
상술한 바와 같은 본 발명은 와송 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 산화방지 효과와 산화스트레스로부터 신경세포 손상에 대한 보호효과 및 주요 생리활성 물질을 분석하였다. 특히, 와송 아세트산에틸 분획물 (ethylacetate fraction from Orostachys japonicus A. Berger extract:EFOJ)은 다른 분획물에 비하여 높은 총 페놀화합물 함량을 나타냈으며, 와송 아세트산에틸 분획물로 ABTS, DPPF 라디칼 소거 활성과 FRAP 및 지방질과산화물 생성 억제 활성이 있다. 또한, 와송 아세트산에틸 분획물은 과산화수소로 인한 신경세포 사멸에 대한 세포 생존율을 향상시키며 신경세포의 세포막 손상 보호 활성이 있는 것으로 확인된다. 또한, 와송 추출물과 분획물이 혼합된 혼합물을 통하여 신경세포 사멸에 대한 세포 생존율을 향상시켜 신경세포 보호 활성을 증진할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 와송 아세트산에틸 분획물은 또는 와송 추출물은 우수한 산화방지력을 가지고 있을 뿐만 아니라 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호효과를 통해 퇴행성 신경질환과 같은 질병을 예방할 수 있는 건강기능식품의 천연산화방지제 소재로서 유용하다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 조성물은 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (8)
- 와송 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는, 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 와송 추출물은 증류수, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 분획물은 노말헥세인, 클로로폼, 아세트산에틸, 증류수 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것 인, 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 와송 추출물: 와송 분획물이 1:2 내지 2:1 로 혼합되는 것을 특징으로 하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 신경세포의 산화적 스트레스로 인한 손상을 감소시키는 것을 특징으로 하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 신경질환은 뇌졸증, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨 질환, 허팅턴병, 피크병, 크로이펠츠-야콥병, 전두측두치매, 루이치매, 근육위축가쪽경화증, 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계자가면역질환, 다발성경화증, 염증성 및 신경병증성 통증 또는 뇌혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 약학적 조성물. - 와송 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 와송 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 신경질환 예방 또는 개선용 식품.
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| KR1020190009329A KR20190090716A (ko) | 2018-01-25 | 2019-01-24 | 와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 뇌 신경세포 보호 및 신경질환 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR1020210023587A KR102369217B1 (ko) | 2018-01-25 | 2021-02-22 | 와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 뇌 신경세포 보호 및 신경질환 예방 또는 치료용 조성물 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210023587A KR102369217B1 (ko) | 2018-01-25 | 2021-02-22 | 와송 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 뇌 신경세포 보호 및 신경질환 예방 또는 치료용 조성물 |
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102138348B1 (ko) * | 2020-04-24 | 2020-07-28 | 권혁분 | 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230016995A (ko) | 2021-07-27 | 2023-02-03 | 숙명여자대학교산학협력단 | 와송 젤리 및 그 제조방법 |
Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20140072464A (ko) * | 2012-12-05 | 2014-06-13 | 인제대학교 산학협력단 | 와송 유래 핵산 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR20170003854A (ko) * | 2015-06-30 | 2017-01-10 | 목포대학교산학협력단 | 와송 추출물을 유효성분으로 포함하는 환형 식품 조성물 및 이의 제조방법 |
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2019
- 2019-01-24 KR KR1020190009329A patent/KR20190090716A/ko active Application Filing
-
2021
- 2021-02-22 KR KR1020210023587A patent/KR102369217B1/ko active IP Right Grant
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102138348B1 (ko) * | 2020-04-24 | 2020-07-28 | 권혁분 | 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법 |
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| Publication number | Publication date |
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