KR20100086680A

KR20100086680A - 능실로부터 분리된 신규 화합물 및 이를 함유하는 항산화 조성물

Info

Publication number: KR20100086680A
Application number: KR1020090006025A
Authority: KR
Inventors: 김형자; 진창배; 이용섭
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2009-01-23
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2010-08-02
Also published as: KR101116757B1

Abstract

본 발명은 능실로부터 분리된 신규 화합물 및 이를 함유하는 항산화 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 능실로부터 신규 화합물 1,6-디-O-갈로일-2-O-카페오일-β-D-글루코피라노오즈(1,6-di-O-galloyl-2-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose)(화합물 1)와 트라파린(traparin)(화합물 2)을 분리하고, 상기 분리된 신규 화합물을 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 신규 화합물 및 이를 함유하는 항산화 조성물은 우수한 항산화 활성뿐만 아니라 칼페인 저해효과 및 티로시나제 저해효과를 나타내므로 활성산소 및 이들 효소의 과도한 활성에 의해 유발되는 질병의 치료, 예방 또는 증상의 완화에 유용하게 사용될 수 있다.

능실, 항산화 조성물, 1,6-디-O-갈로일-2-O-카페오일-β-D-글루코피라노오즈, 트라파린

Description

능실로부터 분리된 신규 화합물 및 이를 함유하는 항산화 조성물{Novel componds isolated Trapa species and antioxidant activity composition}

인체 내에는 안정한 상태의 산소가 효소계, 환원 대사, 화학약품, 공해물질, 광화학 반응과 같은 환경적 및 생화학적 요인 등에 의해 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide radical, O_2˙ ^-), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, OH^-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중항산소(singlet oxygen, ¹O₂)와 같은 반응성이 큰 활성산소(reactive oxygen species: ROS)로 전환되어 세포구성 성분을 비가역적 으로 파괴한다. 이들 활성산소의 작용은 체내 방어기구인 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 글루타치온(glutathione) 등의 항산화성 효소 및 비티민 C(vitamin C, ascorbic acid), 비타민 E(tocopherol) 등의 항산화 물질의 작용에 의하여 최소화 될 수 있다. 그러나, 이러한 생체 방어력에 이상이 생기거나 과도한 활성산소에 노출될 경우, 균형이 깨어져서 활성산소가 생체에 치명적인 산소독성을 일으키며 세포구성성분인 지질, 단백질, 당 DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴를 유도함으로써 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파키슨병과 같은 뇌질환, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자기면혁질환 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다[Cross 등, Ann. Intern. Med., 1987, 107, 526; Alderson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 2706].

이와 같은 산화적 스트레스가 노화를 비롯하여 각종 질환을 일으키는 중요한 원인임이 밝혀지면서 생체 내 활성산소를 제거하는 항산화제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 활성 산소종을 조절할 수 있는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 글루타치온(glutathione) 등의 항산화성 효소 및 비티민 C(ascorbic acid), 비타민 E(tocopherol) 등의 천연물 유래의 저분자 항산화 물질에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다. 합성 항산화제로는 BHA(butylated hydroxy anosole), BHT(butylated hydroxy toluene) 및 NDGA(nordihydroguaiaretic acid) 등도 많이 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다.

그러나, 합성 항산화제는 생체 내에서 독성을 나타내어 알러지와 종양을 발생시킬 수 있는 단점이 있어서 천연 항산화제의 개발이 활발히 진행되어 여러 가지 물질들이 보고되고 있으나, 현재까지 알려진 천연 항산화제는 합성 항산화제에 비하여 안전하지만 그 효력이나 생산 비용 면에서 합성 항산화제를 능가하지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 항산화 활성이 탁월하면서 보다 안전하고 효능이 탁월한 새로운 천연 항산화제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 다양한 식물에 함유된 성분 중에서 항산화 활성을 나타내는 물질을 연구하던 중, 능실로부터 새로운 항산화 화합물을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 능실로부터 다음 화학식 1로 표시되는 1,6-디-O-갈로일-2-O-카페오일-β-D-글루코피라노오즈(1,6-di-O-galloyl-2-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose)(화합물 1)와 다음 화학식 2로 표시되는 트라파린(traparin)(화합물 2); 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 능실로부터 다음 화학식 1로 표시되는 1,6-디-O-갈로일-2-O-카페오일-β-D-글루코피라노오즈(1,6-di-O-galloyl-2-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose)(화합물 1)와 다음 화학식 2로 표시되는 트라파린(traparin)(화합물 2); 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 그 특징으로 한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명에 따른 능실로부터 분리한 신규 화합물 1,6-디-O-갈로일-2-O-카페오일-β-D-글루코피라노오즈(1,6-di-O-galloyl-2-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose)(화합물 1)와 트라파린(traparin)(화합물 2)은 DPPH 라디칼 소거능과 잔틴/잔틴 옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼의 소거능이 우수하며, 지질과산화물 생성 억제 효과가 매우 우수하므로 이를 이용하면 피부의 노화 억제 및 피부 미백 기능 에 효과적이다. 또한, 생약으로서 비교적 안전한 것이므로 식품이나 화장료 등에 배합하면 노화(aging), 암(cancer), 복합성 동맥경화(multiple atherosclerosis), 관절염, 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 혈관장애, 고지혈증, 심근경색 또는 뇌경색 등의 질병을 예방 및 치료하는 효과를 제공하여 제품의 부가가치를 크게 높일 수 있게 된다.

이하, 본 발명을 구체적으로 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 능실로부터 신규 화합물 1,6-디-O-갈로일-2-O-카페오일-β-D-글루코피라노오즈(1,6-di-O-galloyl-2-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose)(화합물 1)와 트라파린(traparin)(화합물 2)을 분리하고, 상기 분리된 신규 화합물을 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

능실은 마름과(Hydrocaryaceae)에 속하는 마름의 생약명으로 Trapa 속 식물의 열매로 수면에 떠서 자라는 1년초이며 잎은 삼각형을 띤 마름모꼴이고 가장자리에 톱니가 많고 잎 끝이 뾰족하다. 능실은 초가을에 까맣게 익는데 양쪽 끝이 뾰족해져서 날카로운 가시가 된다. 마름의 주성분은 단백질과 탄수화물로 이루어진 하얀 과육으로 가득 차 생으로 먹을 수 있기 때문에 물에서 따는 밤 같다고 하여 물밤 또는 말밤, 말뱅이라고 부른다. 열매를 잘 말린 것을 능실(菱實), 열매껍질을 능각(菱角)이라고 한다.

<약용식물사전>에 마름 열매를 달여 먹으면 두창을 낫게 하고 술독을 풀며 눈을 밝게 할 뿐만 아니라 위암, 자궁암을 낫게 한다고 적혀 있으며, 또 <약이 되는 식물>에 마름 열매 15~20개를 물로 달여서 하루 3번 나누어 마시면 갖가지 암에 효과가 있고 술독과 태독을 없애며 소화를 잘 되게 한다고 적혀 있다.

마름 열매인 능실은 약 15%가 전분으로 구성되어 있으며 이외에도 포도당, 단백질, 비타민 C, 비타민 B등의 성분을 함유하고 기운은 평(平)하고 약간 단 맛을 가지고 있다. 한방에서 마름은 주로 건위(健胃), 건비(健脾)작용을 가지고 있어서 허약체질, 위장기능이 약하여 영양불량이 있거나 노약자의 영양식으로 권장되고 있다.

능실은 죽으로 먹기도 하고 그냥 끓여서 먹기도 하는데 이시진의 본초강목에서는 마름죽이 위장을 좋게 하고, 속에 있는 열을 없애고, 성인이나 노인이 마름죽을 상식하면 위장과 비장을 건강하게 하여 다리와 허리를 강하게 하고, 기운이 생긴다고 언급하고 있다.

본 발명자들은 능실로부터 갈로탄닌 유도체인 1,6-디-O-갈로일-2-O-카페오일-β-D-글루코피라노오즈(1,6-di-O-galloyl-2-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose)(화합물 1)와 트라파린(traparin)(화합물 2)을 분리하였다.

또한, 본 발명에 따른 화합물은 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염에는 알칼리금속 수산화물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨), 알칼리금속 중탄산염(예: 중탄산나트륨, 중탄산칼륨), 알칼리금속 탄산염(예: 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘)등과 같은 무기염기와 1차, 2차 3차 아민 아미노산과 같은 유기염기가 포함된다.

또한, 본 발명의 화합물들은 용매화물, 특히 수화물의 형태일 수 있다. 수화는 상기 화합물을 분리하는 동안 일어날 수 있거나, 또는 화합물의 흡습성으로 인해 시간이 경과함에 따라 일어날 수 있다.

항산화 활성을 갖는 본 발명의 화합물은 능실을 알코올, 함수 알코올 또는 아세트산에틸로 추출하여 얻을 수 있으며, 예를 들어 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 즉, 능실을 잘게 절단하거나 분말화하여 그대로 사용하거나 냉동건조시킨 후, 여기에 1 ㎏ 당 메탄올(MeOH), 에탄올과 같은 저급알코올, 60 내지 100% 알코올 수용액, 또는 아세톤을 0.1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 0.5 내지 1.0 ℓ의 양으로 가하고 상온에서 4 내지 5 일 동안 방치한다. 이 과정은 필요에 따라 3회 이상 반복할 수 있다. 얻어진 추출물을 여과 및 감압 증발시켜 알코올 추출물을 얻는다. 알코올 추출물 1 ㎏ 당 1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 1.5 내지 2.0 ℓ의 물을 가한 후, 아세트산에틸(EtOAc) 0.1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 1.0 내지 1.5 ℓ로 충분히 추출하여 아세트산에틸 추출물을 얻을 수 있다. 아세트산에틸 추출물은 알코올 추출과정을 생략하고 직접 능실을 아세트산에틸로 추출하여 제조할 수도 있다.

이렇게 얻은 추출물들의 항산화 활성을 확인한 결과, 능실의 메탄올 추출물이 항산화 활성을 나타내었다. 또한, 능실의 메탄올 추출물을 디클로로메탄, 아세트산에틸, 부탄올, 물 등으로 분획한 추출물들의 항산화 활성을 조사한 결과, 아세트산에틸 추출물과 부탄올 추출물의 항산화 활성이 가장 강력하였다.

본 발명의 결과에 따라, 능실 추출물을 항산화제로 사용하기 위해서는 메탄 올, 에탄올, 함수 에탄올과 같은 알코올 추출물을 사용할 수 있으며, 아세트산에틸 분획과 부탄올 분획을 사용하면 매우 효과적인 약리 작용을 기대할 수 있을 것으로 보인다.

상기에서 얻은 능실의 아세트산에틸 추출물에 대하여 실리카겔, 세파덱스(Sephadex LH-20), 역상 실리카겔(RP-18), 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로써 항산화 효과를 갖는 성분들을 분리 및 정제할 수 있다. 칼럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있는데, 특히, 세파덱스, RP-18 및 실리카겔을 충진제로 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 적절히 조합하여 수행하는 것이 가장 바람직하다.

상기 칼럼크로마토그래피 과정을 통해 능실의 아세트산에틸 추출물로부터 신규 화합물 1,6-디-O-갈로일-2-O-카페오일-β-D-글루코피라노오즈(1,6-di-O-galloyl-2-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose)(화합물 1)와 트라파린 (traparin)(화합물 2)을 분리할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 항산화 작용을 하는 유효 활성성분들이 갈로탄닌 유도체들임이 확인되었으며, 이 화합물들이 항산화제에 효과적이라는 본 발명의 결과를 입증하는 것이다.

상기한 바와 같이 본 발명에 따른 능실의 추출물 및 이로부터 분리된 화합물 1과 2가 항산화 활성을 나타내므로, 이들을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 활성산소에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 예방, 식품의 유지 및 피부의 산화에 의한 손상을 방지하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.

이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 활성산소에 의한 세포구성성분의 산화에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 질병으로는 예를 들면, 노화(aging), 암(cancer), 복합성 동맥경화 (multiple atherosclerosis), 관절염, 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 혈관장애, 고지혈증, 심근경색 또는 뇌경색 등이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체와 함께 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캅셀, 새세이 또는 기타 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭씨르, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 주사용 용액 또는 현탁액, 연고제, 크림제, 겔제 또는 로숀제 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 능실로부터 분리된 유효성분(화합물 1 및 화합물 2)의 유효량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏이다. 바람직하게는 500 내지 5,000 ㎎의 범위가 통상적이며, 일부 질환에 따라 더 높은 일일 투여량이 요구될 수 있다. 또한, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 연령, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

상기 유효성분으로 포함하는 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 일반적인 의약품, 의약외품 및 기능성 식품 등의 형태로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 능실로부터 분리된 유효성분을 각종 식품의 건조중량에 대하여 0.05 ~ 90 중량%의 함량으로 배합하여 활성산소 유발 억제용 건강식품을 제조할 수도 있다.

본 발명에 따른 능실로부터 분리된 유효성분(화합물 1과 2)은 활성이 우수하여 산화에 의해서 일어나는 식품의 냄새나 풍미의 변화, 유지의 산패, 그리고 식품의 변색을 효과적으로 방지할 수 있다. 따라서, 상기 능실로부터 분리된 유효성분을 종래의 각종 식품류에 배합함으로써 이들 식품류를 보존하거나 식품의 신선도 및 품질을 장기간에 걸쳐 유지하기 위해 사용할 수 있다.

또한, 여기에서, 기능성 식품으로서는 과자, 가공식품, 조합 유지, 유제품, 음료 등의 각종 식품을 들 수 있고, 형상ㅇ성상도 특별히 제한되지 않아 고체 형상, 반고체 형상, 겔 형상, 액체 형상, 분말 형상 등 어느 것이라도 된다.

한편, 본 발명은 능실로부터 분리된 유효성분을 포함하고 항산화 활성을 가지는 화장료를 포함한다. 본 발명의 화장품 조성물은 능실로부터 분리된 유효성분을 그대로 사용하거나 또는 필요에 따라 희석하여 사용할 수 있다. 상기 능실로부터 분리된 유효성분은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로숀제 및 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있다. 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알코올, 프로 필렌글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸알코올 및 유동 파라핀 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장품 조성물은 피부의 산화에 의한 손상, 예를 들면, 반점(갈색반), 주근깨, 피부균열, 자외선 손상(햇볕에 탐)등을 예방하는데 매우 유용하며, 화장품 자체의 산화를 방지함으로써 화장품의 품질을 유지하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하에서 본 발명을 실험예 및 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 기술적 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 능실 추출물의 제조

능실은 2006년 3월에 구입하여 실험에 이용하였다. 잘 건조된 능실의 껍질 1.7 kg을 18.4 ℓ의 메탄올에 담그어 실온에서 4-5일 동안 냉침하여 여과하였고, 용매는 40 ℃ 이하에서 감압 건조하여 메탄올 추출물을 만들었다. 이를 3번 반복 실험한 결과 총 메탄올 추출물 98.5 g를 수득하였다. 메탄올 추출물을 900 ㎖의 물에 현탁시키고, 900 ㎖의 디클로로메탄(CH₂Cl₂, 900 ㎖ x 3), 아세트산에틸(EtOAc, 900 ㎖ x 3) 그리고 부탄올(BuOH, 900 ㎖ x 3)로 용매 극성에 따라 순 차적으로 각각 3회씩 반복 추출하여 분획을 나누었다.

실시예 2: 능실의 아세트산에틸 분획으로부터 항산화 활성 물질의 분리

능실의 아세트산에틸 분획의 활성이 가장 강하게 나타났으며, 아세트산에틸 분획 21.3 g을 메탄올을 전개용매로 사용하여 세파덱스를 이용한 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 얻어진 분획들은 역상 실리카겔 TLC(전개용매: 40% 메탄올)로 관찰한 후, 유사한 극성을 갖는 화합물끼리 모아 9개의 소분획(833E1-833E9)으로 나누었다. 소분획 833E6(8.4 g)은 역상 실리카겔을 이용하여 25~100% 메탄올을 전개용매로 이용한 칼럼크로마토그래피를 실시하여 19개의 소분획(833E6A~833E6S)으로 나누었다. 소분획 833E6K(816.6 ㎎)를 역상 실리카젤(LiChroprep RP-18)을 이용하여 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 사용한 용매는 25% 메탄올로부터 메탄올양을 점차 증가시켜 40% 메탄올을 사용하여 6개의 소분획(833E6K1~833E6K6)으로 나누었다. 소분획 833E6K5(470 ㎎)는 도요펄(Toyopearl HW-40)를 이용하여 메탄올을 전개용매로 이용한 칼럼크로마토그래피를 실시하여 화합물 1(47.1 ㎎)과 화합물 2(22.8 ㎎)를 순수하게 얻었다.

실시예 3: 신규 화합물 1의 구조 결정

메탄올 용액에서 선광도[α]^D를 측정하였고, 400 MHz(¹H)와 100 MHz(¹³C)의 NMR 스펙트럼을 측정하였으며, 각 피크의 화학 시프트(chemical shift)는 내부 표 준물질인 트리메틸실란에 대한 상대값으로 나타내었다.

본 발명의 화합물 1의 화학적 특성은 다음과 같다.

Yellow amorphous powder;

[α]²¹ _D -121.8° (c 1.81, MeOH);

HRFABMS (negative-ion mode) m/z 645.1108 [M-1]^- (calcd. for C₂₉H₂₅O₁₇: 645.1092)

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 3.64 (1H, t, J=9.4 Hz, H-4), 3.78 (1H, t, J=9.4 Hz, H-3), 3.81 (1H, m, H-5), 4.44 (1H, dd, J=4.6, 12.0 Hz, H-6_a), 4.54 (1H, d, J=11.4 Hz, H-6_b), 5.12 (1H, dd, J=8.9, 9.1 Hz, H-2), 5.84 (1H, d, J=8.4 Hz, H-1), 6.23 (1H, d, J=15.8 Hz, caff-8), 6.71 (1H, d, J=8.2 Hz, caff-5), 6.88 (1H, br d, J=9.2 Hz, caff-6), 6.97 (1H, br s, caff-2), 7.01 (2H, s, 1-gal-2,6), 7.08 (2H, s, 6-gal-2,6), 7.54 (1H, d, J=15.8 Hz, caff-7).

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD)δ: 64.2 (C-6), 71.2 (C-4), 74.0 (C-2), 75.8 (C-3), 76.5 (C-5), 94.1 (C-1), 110.2 (C-gal-2,6), 110.5 (C-gal-2,6), 114.5 (C-caff-8), 115.2 (C-caff-2), 116.4 (C-caff-5), 112.0 (C-gal-1), 121.2 (C-gal-1), 123.1 (C-caff-6), 127.6 (C-caff-1), 139.9 (C-gal-4), 140.6 (C-gal-4), 146.5 (C-gal-3,5), 146.7 (C-caff-3), 147.8 (C-caff-7), 149.6 (C-caff-4), 166.5 (C-gal-7), 168.2 (C-gal-7), 168.3 (C-caff-9).

이 화합물은 노란색의 무정형 분말로, 메탄올 용액에서 측정한 선광도 [α]²¹ _D는 -121.8°로 나타나고 있다. 분자량은 네가티브 이온 모드(negative ion mode)에서 HRFABMS로 측정하였을 때 C₂₉H₂₅O₁₇에서 645로 나타나 분자량은 646임을 알았다. ¹H-NMR에서 이중결합에서 기인하는 피크가 δ 6.23(d, J=15.8 Hz)과 7.54(d, J=15.8 Hz)에서 피크는 커플링 상수로부터 트랜스(trans)형태의 이중결합임을 알 수 있었다. 벤젠고리에서 기인한 피크가 δ 6.71(1H, d, J=8.2 Hz, caff-5), 6.88(1H, br d, J=9.2 Hz, caff-6)에서 각각 나타나고 있는데, 이들의 피크패턴으로부터 벤젠 고리가 ABX 체계로 치환하고 있는 카페오일기가 있음을 알 수 있었다.

또한, δ 7.01(2H, s)와 7.08(2H, s)에서의 단일 피크는 이 화합물에 치환된 두 개의 갈로일기에서 기인한 피크임을 예상할 수 있었다. 한편, δ 5.84(1H, d, J=8.4 Hz, H-1)에서의 피크는 당의 anomeric 수소에서 기인한 것이고 그 커플링 상수로 미루어 β 형태로 치환하고 있음을 알 수 있었다. ¹H-¹H COSY 스펙트럼으로부터 당의 다른 피크들의 위치를 파악할 수 있었다. 즉, δ 5.84에서의 anomeric 수소는 δ 5.12(1H, dd, J=8.9, 9.1 Hz, H-2)에서의 피크와 상관관계가 나타나고 있으며, 이 피크는 3.78(1H, t, J=9.4 Hz)에서의 H-3과 상관관계를 보이고, δ 3.81(1H, m)에서의 5번 수소는 δ 3.64(1H, t, J=9.4 Hz)에서의 H-4와 4.44(1H, dd, J=4.6, 12.0 Hz, H-6_a), 4.54(1H, d, J=11.4 Hz, H-6_b)에서의 피크와 각각 상관관계가 나타나 당에서 기인한 수소들의 위치를 파악할 수 있었다.

¹³C-NMR에서 당에 의한 피크가 δ 64.2(C-6), 71.2(C-4), 74.0(C-2), 75.8(C-3), 76.5(C-5), 94.1(C-1)에서 나타나고 있어 이 화합물에 있는 당은 글루코즈임을 확인할 수 있었다. HMQC에서 카페오일기와 갈로일기의 탄소와 수소의 상관관계로부터 정확한 위치를 알 수 있었으며, HMBC로부터는 이들이 글루코즈에 치환된 위치를 파악할 수 있었다. 즉, δ 5.84에서의 anomeric 수소는 갈로일기에서 기인한 δ 166.5에서의 카르보닐기와 상관관계가 나타나며, δ 4.44에서의 6번 수소는 δ 168.2에서의 갈로일기의 카르보닐기와 상관관계가 나타나 두 개의 갈로일기는 글루코즈의 1번과 6번에 치환하고 있음을 알 수 있었다. 또한, δ 5.12에서의 2번 수소는 δ 168.3에서의 피그와 상관관계가 나타나고 있는데 이 피크는 카페오일의 카보닐기에서 기인한 것으로 카페오일기의 δ 6.23(d, J=15.8 Hz, caff-8)과 7.54(d, J=15.8 Hz, caff-7)의 이중결합에서 기인한 피크와도 상관관계를 보여주고 있어 카페오일기는 글루코즈의 2번에 치환하고 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 이 화합물은 1,6-디-O-갈로일-2-O-카페오일-β-D-글루코피라노오즈(1,6-di-O-galloyl-2-O-caffeoyl-β-D-glucopyranoside)로 규명하였으며, 자연계에서 처음으로 분리된 화합물임을 알았다.

[화학식 1]

실시예 4: 신규 화합물 2의 구조 결정

본 발명의 화합물 2의 화학적 특성은 다음과 같다.

Yellowish amorphous powder;

[α]²³ _D -84.4° (c 0.995, MeOH);

IR(KBr):ν 3430,1812,1730,1719,1612,1541,1450,1320,1196,1091,1072,1027 cm^-1;

ESIMS (negative-ion mode) m/z 925 [M-1]^-;

HRESIMS (negative-ion mode) m/z obsd. 925.0946 (calcd. for C₄₀H₂₉O₂₆: 925.0952);

¹H-NMR (400MHz, CD₃OD): δ 1.81 (1H, dd, J=2.0, 16.7 Hz, H-4'), 2.05 (1H, dd, J=12.0, 16.6 Hz, H-4'), 3.51 (1H, br d, J=11.9 Hz, H-3'), 4.06 (1H, dd, J=2.2, 11.1 Hz, glc-6_a), 4.41 (1H, td, J=2.0, 9.7 Hz, glc-5), 4.63 (1H, d, J=3.4 Hz, H-2'), 5.25 (1H, dd, J=10.32, 10.6 Hz, glc-6_b), 5.42 (1H, t, J=9.4 Hz, glc-4), 5.57 (1H, dd, J=8.0, 9.7 Hz, glc-2), 5.64 (1H, t, J=9.6 Hz, glc-3), 6.18 (1H, d, J=7.9 Hz, glc-1), 6.74 (1H, s, H-3), 6.90 (2H, s, gal-2,6), 6.92 (2H, s, gal-2,6), 7.04 (2H, s, gal-2,6).

¹³C-NMR (75 MHz, CD₃OD): δ 33.0 (C-4'), 44.8 (C-3'), 47.6 (C-2'), 64.0 (C-glc-6), 71.6 (C-glc-5), 72.0 (C-glc-2), 74.5 (C-glc-3), 74.8 (C-glc-4), 93.9 (C-glc-1), 110.4 (C-gal-2,6), 110.6 (C-gal-2,6), 114.3 (C-3), 116.6 (C-1), 119.2 (C-2), 119.7, 120.2, 120.3 (C-gal-1), 136.0 (C-5), 140.3, 140.8 (C-gal-4), 143.2 (C-6), 146.2, 146.3, 146.6 (C-gal-3,5), 148.0 (C-4), 166.1 (C-gal-7), 166.5 (C-7), 166.8, 167.2 (C-gal-7), 173.6 (C-6'), 176.6 (C-1',5').

이 화합물은 미황색의 무정형의 분말로, TLC 판에서 황산 발색시 검은색을 띠게 되어 탄닌 유도체임을 알 수 있었다. 메탄올 용액에서 측정한 선광도 [α]²¹ _D는 -84.4°로 나타나고 있으며, 분자량은 HRESMS에서 925.0946(calcd. for C₄₀H₂₉O₂₆: 925.0952)임을 알았다. 이 화합물은 ¹H-NMR에서 세 개의 갈로일기에서 기인하는 피크가 각각 δ 6.85, 6.87, 7.00에서 나타나고 있어 이 화합물에서 갈로일기가 3개 치환하고 있음을 예상할 수 있었다. δ 6.69에서 하나의 수소에 해당하는 단일피크는 모두 치환되고 하나의 수소만이 있는 다른 벤젠고리가 있음을 알 수 있었다. 또한, 당의 anomeric 수소에서 기인하는 피크가 δ 6.13에서 doublet으로 나타나며, 그 커플링 상수가 7.9 Hz로 나타나 β 형태로 결합하고 있음을 알 수 있었다. 당에서 기인한 피크가 δ 4.0~5.7에서 나타나고 있으며, 이 보다 고자장에서 나타나는 다른 알킬기에서 유래한 피크임을 예상할 수 있었다. 이들의 상관관계는 ¹H-¹H COSY에서도 확인할 수 있는데, δ 3.51(1H, br d, J=11.9 Hz, H-3')에서의 피크는 메틸렌기에서 기인한 δ 1.81(1H, dd, J=2.0, 16.7 Hz, H-4'), 2.05(1H, dd, J=12.0, 16.6 Hz, H-4')에서의 피크와 4.63 (1H, d, J=3.4 Hz, H-2')에서의 피크와 각각 상관관계를 보여주고 있어 이들 수소들이 서로 연결되어 있음을 알 수 있었다. 또한, δ 6.13에서의 anomeric 수소와 상관관계를 나타내고 있는 δ 5.57의 당의 2번 수소를 비롯하여 당의 나머지 수소들의 정확한 위치도 파악할 수 있었다.

¹³C-NMR에서는 δ 33.0(C-4'), 44.8(C-3'), 47.6(C-2')에서의 알킬기에서 기인하는 피크를 확인할 수 있었으며, δ 64.0(C-glc-6), 71.6(C-glc-5), 72.0(C-glc-2), 74.5(C-glc-3), 74.8(C-glc-4), 93.9(C-glc-1)에서의 피크들로부터 이 화합물에 포함된 당이 글루코즈임을 알 수 있었다. 한편, δ 166.1, 166.8, 167.2에서의 3개의 피크는 갈로일기에서 기인한 카르보닐기 피크임을 알 수 있었으며, 이 피크 이외에 δ 166.5(C-7)의 피크는 갈로일과 유사한 카르보닐기가 있음을 알 수 있었고, δ 173.6(C-6')와 176.6(C-1',5')의 피크는 알킬기와 결합하고 있는 카복실산과 에스테르에서 기인한 카르보닐기가 있음을 예상할 수 있었다.

HMQC로부터 글루코즈와 3개의 갈로일기의 탄소-수소의 상관관계로부터 정확 한 위치를 알 수 있었으며, HMBC로부터는 3개의 갈로일기가 치환된 글루코즈의 위치를 파악할 수 있었다. δ 6.13에서의 anomeric 수소는 갈로일기에서 기인한 δ 166.1에서의 카르보닐기와 상관관계가 나타나며, δ 5.57(glc-2)과 5.63(glc-3)의 수소는 각각 δ 166.8, 167.2에서의 갈로일기의 카르보닐기와 상관관계가 나타나 세 개의 갈로일기는 글루코즈의 1번과 2번, 3번에 각각 치환하고 있음을 알 수 있었다. δ 5.42에서의 4번 수소는 δ 166.5에서의 피크와 상관관계가 나타나고 있는데, 이 피크는 나머지 갈로일기의 카보닐기에서 기인한 것이며, δ 4.06(glc-6_a)과 5.25(glc-6_b)의 피크는 알킬기와 결합하고 있는 카복실기인 δ 173.6(C-6')에서의 피크와 상관관계가 나타나고 있다. 또한, 이 카르복실 피크는 δ 1.81(H-4'), 2.05(H-4'), 3.51(H-3'), 4.63(H-2')의 피크들과도 상관관계를 보여주고 있어 이들이 같은 쪽에 결합하고 있음을 알 수 있었다. 게다가 이들 알킬기에서 기인한 피크들은 δ 176.6(C-1',5')의 카르복실산의 카르보닐기와도 상관관계를 보여주고 있어 두 개의 카르보닐기가 알킬기의 양쪽에 결합하고 있는 형태임을 알 수 있었다. 또한, δ 4.63(H-2')의 피크는 δ 116.6(C-1)과 119.2(C-2)에서의 피크와 각각 상관관계를 보여주고 있으며, 적외선 분광기(IR) 스펙트럼에서 1813 ㎝^-1의 흡수피크로부터 글루코즈의 4번에 치환된 갈로일기가 락톤 고리를 포함하고 있음을 알 수 있었다. 이상의 결과를 종합하여, 이 화합물은 화학식 2에 나타낸 구조로 자연계에서 처음으로 분리된 화합물로 동정하였으며 화합물의 이름을 트라파린(traparin)이라 명명하였다.

[화학식 2]

실시예 5: 분리된 화합물들의 자유라디칼 소거 효과

1) 실험 방법

자유라디칼 소거(free radical scavenging) 작용(Blois 등, Nature, 1958, 181, 1199)은 100 μM 1,1-디페닐-2-피크릴 히드라질(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl; DPPH) 에탄올 용액 190 ㎕에 상기 실시예 2에서 분리한 각 화합물들의 에탄올 용액 10 ㎕를 가해 30분 동안 37 ℃에서 반응시킨 후, 515 ㎚에서 흡광도를 측정하여 자유라디칼 소거 효과를 IC₅₀ 값으로 구하였다. IC₅₀은 자유라디칼 소거 효과를 계산하여 50% 억제 효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)를 의미한다.

실시예 2에서 분리한 각 화합물들과 기존 소거제[아스코르빈산(비타민 C), 콰르세틴(quercetin), 루테올린(luteolin)과의 자유라디칼 소거 효과를 비교하여 결과를 다음 표 1에 제시하였다.

제시되는 데이터는 3회 실시 평균값이다. 다음 표 1에서 알 수 있는 바 와 같이, 신규 화합물이 높은 활성을 나타내고 있다.

시험물질	자유라디칼 소거 효과 (IC₅₀,M)
화합물 1	4.61 ± 0.05
화합물 2	3.20 ± 0.15
아스코르빈산 (비타민 C)	38.04 ± 1.11
콰르세틴 (quercetin)	23.99 ± 2.60
루테올린 (luteolin)	19.96 ± 0.80

실시예 2에서 분리한 신규 화합물들의 자유라디칼 소거 효과를 기존의 소거제들과 비교한 결과, 신규 화합물 1과 2는 항산제로 알려진 아스코르빈산(비타민 C)보다 월등히 우수한 효능을 보이고 있었으며, 콰르세틴(quercetin)이나 루테올린(luteolin)의 효능보다도 다소 우수한 효과를 보이고 있어 이들 화합물들이 항산화활성을 갖는 화합물임을 알 수 있었다.

실시예 6: 분리된 화합물들의 잔틴/잔틴 옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O _2˙ ^- )의 소거 효과

1) 실험 방법

잔틴(Xanthine)과 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase, XOD)의 반응으로 생성되는 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 생성을 억제시키는 효능을 평가하기 위하여 토다 등[Toda 등, Planta, Med. 1991, 57, 8]의 방법을 하기와 같이 수행하였다.

구체적으로, 0.1 mM 잔틴, 0.1 mM EDTA, 50 ㎍/㎖ 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA), 25 mM 니트로블루 테트라졸린(Nitroblue tetrazolium, NBT)과 40 mM Na₂CO₃ 용액, 각 농도별로 희석한 시험 화합물 용액, 그리고 1.4×10^-3 단위 XOD를 포함하는 최종 부피가 200 ㎕인 용액을 혼합하여 25 ℃에서 20분간 반응시켰다. 상기 반응용액에 6 mM CuCl₂ 6.6 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 생성된 포마잔(formazan)을 560 ㎚에서 흡광도를 측정하여 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 소거 효과를 비교한 결과를 IC₅₀ 값으로 구하였다. IC₅₀은 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide radical, O_2˙ ^-) 소거 효과를 계산하여 50% 억제 효과를 나타내는 농도(IC₅₀)를 의미한다.

상기 실시예 2에서 분리한 각 화합물의 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide radical, O₂ _˙ ^-) 소거효과를 기존 소거제[아스코르빈산(비타민 C), 콰르세틴(quercetin), 루테올린(luteolin)]들과 비교한 결과를 다음 표 2에 나타내었다. 제시되는 데이터는 3회 실시 평균값이다.

시험물질	잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 (superoxide adical, O₂ _˙ ^-) 소거 효과(IC₅₀,μM)
화합물 1	33.18 ± 2.43
화합물 2	4.62 ± 0.03
아스코르빈산 (비타민 C)	>50
콰르세틴 (quercetin)	>50
루테올린 (luteolin)	7.59 ± 0.17

신규 화합물에 대한 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide radical, O₂ _˙ ^-) 소거 효과를 기존의 소거제들과 비교한 결과, 항산화제로 잘 알려진 아스코르빈산(비타민 C)이나 콰르세틴(quercetin)보다도 우수한 효능을 보이고 있었다. 신규 화합물 1의 경우에는 루테올린(luteolin)보다는 다소 약한 항산화 활성을 나타내고 있지만, 화합물 2의 경우에는 루테올린 보다도 우수한 효능을 보이고 있었다(표 2). 그러므로 이 신규 화합물들이 항산화 효과의 주성분임을 입증할 수 있었다.

실시예 7: 분리된 화합물들의 지질과산화물 생성 억제 효과

1) 실험 방법

상기 실시예 2에서 분리한 각 화합물들의 지질과산화물 생성 억제 효과를 실험하였다. 지질과산화물은 여러 산화반응에 의해 지질이 과산화되어 생성되는 물질로, 각종 반응성이 큰 활성산소와 자유 라디칼(free radical) 등이 불포화 지방산이 다량 함유된 세포막의 인지질을 산화시켜 세포막에 지질과산화물이 생성된다. 세포막에 지질과산화물이 축적되면 세포막의 유동성과 기능성이 저하되어 세포기능이 저해되고 세포구조가 변화되는 등 조직상에 국소적인 장애가 생긴다.

따라서, 능실로부터 분리된 화합물들의 지질과산화물 생성 억제 효과를 쥐의 간 균질액을 이용하여 샌즈 등[Sanz, 등 Xenobiotica, 1994, 24, 689-699]의 방법을 수정하여 실시하였다.

구체적으로 간 균질액(100 ㎕, 16 ㎎ protein/㎖), 10 μM FeSO₄, 10 ㎕ 시료와 0.4 mM의 아스코르빈산(ascorbic acid), 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)를 가하여 총 부피가 1 ㎖가 되도록 하여 37 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 지질과산화 저해능력은 Buege와 Aust의 방법[Bueg, 등 Methods in Enzymology, 1978, 52, 302-310]에 의한 티오바비츄릭산[thiobarbituric acid-reactive substance (TBARS)]을 이용하여 측정하였다. 즉, 상기 반응용액에 티오바비츄릭산 용액을 가하여 95 ℃에서 30분 동안 반응시킨 후 냉침하여 원심분리한 상등액을 취하여 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 535 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 능실로부터 분리된 화합물들의 지질과산화물 생성 억제율(A, %)을 다음과 같은 수학식 1로 구하고 그 결과는 다음 표 3에 나타내었으며, 제시되는 값은 3회 평균값이다.

[수학식 1]

A (%) = 시험물질 시료의 반응흡광도/대조군의 반응흡광도 × 100

시험물질	지질과산화물 생성 억제 효과(IC ₅₀ , μM)
화합물 1	6.46 ± 0.94
화합물 2	4.37 ± 0.39
트롤록스 (trolox)	73.47 ± 15.11
콰르세틴 (quercetin)	8.93 ± 0.62
루테올린 (luteolin)	15.09 ± 1.58

실시예 2에서 분리한 신규 화합물들의 지질과산화물 생성 억제율을 기존의 소거제[트롤록스(trolox), 콰르세틴(quercetin), 루테올린(luteolin)]들과 비교하였다. 상기 표 3에서 제시하는 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 신규 화합물에서 높은 활성을 보여주고 있는데 이는 지질과산화 저해제로 알려진 트롤록스에 비하여 11~ 17 배 정도 우수한 저해효능을 보이고 있었으며, 특히 화합물 2의 경우에는 항산제로 잘 알려진 콰르세틴의 효능보다 2배 정도 우수하게 나타났으며 루테올린 보다는 3배 정도 우수한 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다. 따라서, 능실에서 분리한 신규 화합물들은 우수한 지질과산화 저해활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다.

시험예 2: 플루오로제닉 칼페인(Fluorogenic calpain) 저해 효능

칼페인 저해 효능은 루비스키 등[W. Lubisch et . al ., J. Med . Chem . 2003, 46, 2404)의 방법을 수정하여 실시하였다. 구체적으로, 효소는 μ-칼페인[μ-Calpain Human Erythrocytes(Calbiochem)]과 칼페인 기질 II[Calpain substrate II(Calbiochem)]을 사용하였다. 시약들은 50 mM Tris HCl buffer(pH 7.5)에 용해한 1 mM DTT(dithiothreithol) 용액에 용해하여 사용하였다. 시료 용액은 DMSO에 용해하여 사용하였고, NaCl은 물에 용해하여 반응에 이용하였다. 시료 1 ㎕와 1 mM 칼페인 기질 25 ㎕, 1 M NaCl 10 ㎕, 1 mM CaCl₂ 11 ㎕를 fluorescence 측정용 96웰 플레이트에 가하고 1 mM 디티티(DDT)를 가하였다. 여기에 34 nM 칼페인 53 ㎕를 가하여 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 반응 산물인 형광물질을 형광광도계(spectrofluorimeter)를 이용하여 λ_ex=355 nm, λ_em=460 nm에서 fluorescence를 측정하였고, 대조군에 대한 형광도의 감소 비율로서 μ-칼페인의 억제 효과를 계산하여 50% 억제 효과를 나타내는 농도(IC₅₀)로 나타냈으며, 그 결과는 다음 표 4에 나타내었다.

시험물질	μ-칼페인의 억제 효과(IC_50,μM)
화합물 1	>50
화합물 2	19.51 ± 3.41

칼페인은 모든 포유동물에 존재하는 효소로 칼슘 농도에 의존적인 단백질 분해효소인데 칼페인이 활성화되는데 필요한 칼슘의 농도가 마이크로몰(μ)이 필요한 μ-칼페인과 밀리몰이 필요한 m-칼페인으로 나누어진다. μ-칼페인이 과도하게 활성화(over-activation)되면 백내장과 당뇨병, 뇌허혈과 심허혈, 류마티스 관절염, 알츠하이머를 비롯하여 심근경색과 뇌졸중, 뇌손상과 척수손상을 포함한 급성발작에 의한 이차 질환을 야기한다고 알려져 있다[Markgraf, C. G., et. al., Stroke 1998, 29, 152; Boland, B., et. al., Neurobiol. Aging 2003, 24, 179; Huang Y., et. al., Trends Mol Med 2001, 7, 355; Branca D. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 322, 1098; Yadavalli R., et. al., J. Biol. Chem. 2004, 279, 21948]. 그러므로 μ-칼페인을 저해하는 화합물들은 뇌졸중이나 알쯔하이머병과 같은 질환을 효과적으로 치료하고 예방할 수 있을 것으로 기대되어 많은 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 화합물 2는 뇌졸중 및 알쯔하이머병에서 문제가 되고 있는 활성산소를 소거하는 효과가 매우 우수할 뿐만 아니라 이들 질병을 악화시키는 μ-칼페인 또한 저해하는 효능 역시 나타내고 있다. 따라서, 화합물 2는 천연물에서 추출한 안전한 화합물로 활성산소나 μ-칼페인이 과도하게 활성화되어 야기되는 질병인 뇌졸중 또는 알쯔하이머병의 예방, 증상의 완화 및 치료에 도움이 될 것으로 기대한다.

시험예 3: 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성 시험

능실로부터 분리한 화합물 1과 화합물 2의 급성 독성을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 화합물 1과 화합물 2 각각을 10 ml의 생리식염수에 현탁하여 1 g/kg의 용량으로 상기 랫트 2 마리의 전경골근(anterior tibialis)에 근육 내 주사 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 화합물 1과 화합물 2는 랫트에서 1 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 1 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

시험예 4: 티로시나제(Tyrosinase)의 저해 효능

피부 미백에 관여하는 티로시나제(tyrosinase)의 저해효능은 티로신(tyrosin)을 기질로 하여 mushroom tyrosinase(Sigma)의 효소작용으로 생성되는 반응생성물인 도파크롬(dopachrome)을 측정하였다. 구체적으로 96웰 플레이트에 시료 1 ㎕, 증류수에 용해한 0.03% 티로신 50 ㎕, 0.1 M 포타슘 포스페이트 버퍼(potassium phosphate buffer, pH 6.8)에 용해한 티로시나제 5 ㎕를 가하고 버퍼와 증류수를 가하여 총 부피가 150 ㎕가 되도록 하였다. 이 용액을 37 ℃에서 10분 동안 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 능실로부터 분리된 화합물들의 티로시나제 억제 효능(A, %)을 다음 수학식 2로 구하고 그 결과는 다음 표 5에 나타내었으며, 제시되는 값은 3회 평균값이다.

[수학식 2]

시험물질	티로시나제 억제 효과(IC₅₀ _,μM)
화합물 1	>100
화합물 2	49.32 ± 0.39
코직산(kojic acid)	53.55 ± 1.38

최근의 피부 화장료의 개발은 단일 작용기전을 통하여 효능을 나타내는 물질보다는 다양한 작용기전을 가지는 동시에 가지는 물질들의 개발에 많은 관심을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 화합물의 우수성을 더욱 입증하기 위하여 티로시나제의 저해 효과를 측정하였다. 티로시나제는 멜라닌 생성에 관련된 효소로 과도하게 활성화가 되면 피부에 검은색을 나타나게 할 수 있으므로 코지산과 같은 티로시나제의 저해제가 피부 미백용 화장료로 많이 사용되어 왔다. 항산화 효능이 우수한 것으로 나타난 능실로부터 분리된 신규 화합물들의 티로시나제 억제효능은 상기 표 4에 나타낸 바와 같이 피부 미백제 알려진 코직산을 대조약물로 사용하여 검색하였다. 그 결과, 화합물 2에서의 효능은 대조약물로 사용한 코직산과 유사한 효능을 나타내어 피부 미백 화장료의 가능을 보여주었다. 또한, 최근에는 코직산의 부작용으로 인하여 사용에 어려움이 있어 그의 대체 약물 개발이 시급한 때에 항산화 작용이 우수할 뿐만 아니라 인체에 안전한 천연 약물인 능실을 소재로 화장료를 개발한다면 그 가능성은 높다고 사료된다.

제제예 1: 시럽제의 제조

화합물 1, 화합물 2 또는 이의 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 2%(중량/부피) 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화합물 1, 화합물 2 또는 이의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

유효성분 ················· 2 g

사카린 ················ 0.8 g

당 ·········· ····· 25.4 g

글리세린 ················ 8.0 g

향미료 ········ ······· 0.04 g

에탄올 ················ 4.0 g

소르브산 ················ 0.4 g

증류수 ················ 정량

제제예 2: 정제의 제조

화합물 1, 화합물 2 또는 이의 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

유효성분 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제조예 3: 화장료의 제조

화합물 1, 화합물 2 또는 이의 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 이용하여 다음과 같은 조성으로 에센스를 제조하였다.

[조성]

유효성분 10.0 mg, 글리세린 3.0 mg, EDTA 0.05 mg, 벤조페논-9 0.04 mg, 카르복시비닐 폴리머 0.2 mg, 트리에탄올아민 0.18 mg, 옥시도테세스-25 0.6 mg, 글리세릴모노스테아레이트 1.0 mg, 방부제 0.01 mg, 향료 0.01 mg, 정제수 잔량

제조예 4: 음료의 제조

화합물 1, 화합물 2 또는 이의 약학적으로 허용되는 그의 염 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때, 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 화합물:

[화학식 1]
다음 화학식 2로 표시되는 화합물:

[화학식 2]
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 능실(Trapa sp.)로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 화합물.
청구항 1 또는 2의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 노화(aging), 암(cancer), 복합성 동맥경화(multiple atherosclerosis), 관절염, 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 혈관장애, 고지혈증, 심근경색 또는 뇌경색 예방 및 치료 효과를 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1 또는 2의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료.
청구항 1 또는 2의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 활 성산소 유발 억제용 건강식품.