KR101122297B1 - 비짜루국화 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 세포 산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비짜루국화 (Aster Subulatus Michx.) 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 세포 산화에 의해 야기되는 질환을 예방 및 치료하는 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 비짜루국화 추출물, 분획물 또는 화합물은 지질의 산화, 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 방지함으로써 노화, 암, 심장질환, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 산화에 의하여 야기되는 질환의 예방 및 치료용 조성물, 상기 질환들의 예방 및 개선용 건강식품, 또는 피부노화방지용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

비짜루국화, 추출물, 산화, 당뇨

Description

비짜루국화 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 세포 산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING DISEASES INDUCED BY CELLULAR OXIDATION COMPRISING EXTRACT, FRACTION OR COMPOUND FROM ASTER SUBULATUS MICHX.}

본 발명은 비짜루국화 (Aster Subulatus Michx.) 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 세포 산화에 의해 야기되는 질환을 예방 및 치료하는 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비짜루국화를 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 얻은 비짜루국화 추출물, 이로부터 얻은 용매 분획물 또는 이로부터 분리 정제한 화합물을 유효성분으로 포함함으로써 노화, 암, 심장질환, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 산화에 의하여 야기되는 질환의 예방 및 치료용 조성물, 상기 질환들의 예방 및 개선용 건강식품, 또는 피부노화방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

생체 내에서 안정한 상태로 존재하던 산소가 화학약품, 공해물질, 광화학 반 응과 같은 환경적 및 생화학적 요인 등에 의해 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 (superoxide anion radical, O_{2 ‘} ^-), 히드록실 라디칼 (hydroxyl radical, OH' ), 과산화수소 (hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중항산소 (singlet oxygen, ¹O₂ ) 등과 같이 반응성이 큰 활성산소 (reactive oxygen species: ROS)로 전환되면 인체의 세포구성 성분인 단백질, 지질 및 DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴를 유도하여 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파키슨 병과 같은 뇌질환, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병을 일으킨다고 알려져 있다 (Cross 등, Ann. Intern. Med ., 1987, 107, 526; Alderson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 2706). 이와 같이, 산화적 스트레스가 노화를 비롯하여 각종 질환을 일으키는 중요한 원인임이 밝혀지면서 생체 내 활성산소를 효과적으로 제거하는 활성산소 소거제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 활성산소 소거활성이 탁월하면서 보다 안전한 새로운 천연활성산소 소거제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 비짜루국화(Aster Subulatus Michx.)는 국화과에 속하는 식물로써 한해살이풀 이다. 북아메리카 원산으로, 우리나라에는 1971년 처음 발견되었고 지금은 전국적으로 퍼져 있으나, 이 식물의 성분은 현재까지 문헌상에 보고 된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 현재 성분과 효능에 대한 것은 현재 문헌상에 보고 된바 가 없는 제주도의 비짜루국화를 이용하여 에탄올 추출물, 순차적 용매분획물 또는 화합물을 얻어 항산화 활성과 α-글루코시다제 억제활성의 측정결과 세포산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및 치료에 관련하여 산업적 활용 가능성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 비짜루국화로부터 추출하여 분리, 정제한 신규한 화합물과 그 제조방법, 및 상기 화합물의 세포 산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및 치료용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 비짜루국화 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리, 정제한 화합물을 유효성분으로 포함함으로써 세포 산화에 의하여 야기되는 질환의 예방 및 치료용 조성물, 또는 상기 질환들의 예방 및 개선용 건강식품, 또는 피부노화방지용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

이때, 상기 화합물은 1-[(부타노일)플로로글루시닐]-베타-디-클루코피라노시드(1-[(butanoyl)phloroglucinyl]-β-D-glucopyranoside)로서, 비짜루국화로부터 추출, 분리 및 정제하여 얻을 수 있는데, 구체적으로 그 제조방법을 살펴보면, (a) 비짜루국화를 물, C₁~C₃의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 비짜루국화 추출물을 얻는 단계;

(b) 상기 단계 a에서 얻은 비짜루국화 추출물을 물, n-헥산(n-hexane), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 또는 n-부탄올(n-butanol)로 분획하여 비짜루국화 분획물을 얻는 단계; 및

(c) 상기 단계 b에서 얻은 비짜루국화 분획물을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화합물을 얻는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 세포의 산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

이때, 상기 세포의 산화에 의해 야기되는 질환은 활성 산소에 의해 세포의 구성성분의 산화에 의해 유발되는 질환을 의미하며, 구체적으로 노화, 암, 심장질환, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 세포의 산화에 의해 야기되는 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 세포의 산화에 의해 야기되는 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 비짜루국화 추출물 또는 상기 비짜루국화 추출물로부터 분획하여 얻은 비짜루국화 분획물을 유효성분으로 포함하는 세포의 산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 비짜루국화 추출물은 물, C₁~C₃의 알코올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 에탄올로 추출한 것을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비짜루국화 추출물은 비짜루국화를 열풍건조하고 분쇄하여 얻은 분쇄물을 70 % 에탄올에 침적시키고 3일 동안 실온에서 교반하여 침출하고 여과한 다음 감압, 농축함으로써 수득할 수 있다.

본 발명에서, 비짜루국화 추출물의 용매분획은 비짜루국화 추출물을 증류수로 현탁한 후 비극성 용매부터 n-헥산(n-hexane), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 및 n-부탄올(n-butanol)을 사용하여 분획함으로써 수득할 수 있다.

본 발명에서, 비짜루국화로부터 분리정제한 화합물로는 상술한 본 발명에서 발견한 신규한 화합물인 상기 화학식 1로 표시되는 1-[(부타노일)플로로글루시닐]-베타-디-글루코피라노시드(1-[(butanoyl)phloroglucinyl]-β-D-glucopyranoside), 하기 화학식 2로 표시되는 3,5-디카페오일 퀴닉산(3.5-dicaffeoyl quinic acid) 및 하기 화학식 3으로 표시되는 3,5-디카페오일 에피-퀴닉산(3.5-dicaffeoyl epi-quinic acid)이 포함된다.

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명의 예방 및 치료용 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 비짜루국화 추출물 또는 이의 분획물 이외에 예방 및 치료용 조성물에 통상적으로 이 용되는 성분들을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 비짜루국화 추출물 또는 상기 비짜루국화 추출물로부터 분획하여 얻은 비짜루국화 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.

이때, 상기 비짜루국화로부터 분리정제한 화합물로서 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부노화방지용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 비짜루국화 추출물 또는 이의 용매분획물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸 글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 비짜루국화 추출물 또는 상기 비짜루국화 추출물로부터 분획하여 얻은 비짜루국화 분획물을 유효성분으로 포함하는 산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

이때, 상기 비짜루국화로부터 분리정제한 화합물로서 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.

즉, 본 발명의 조성물은 산화에 의해 야기되는 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 비짜루국화 추출물, 분획물 또는 그로부터 분리된 화합물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물 또는 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1중량부의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 비짜루국화 추출물, 분획물 또는 화합물은 지질의 산화, 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 방지함으로써 노화, 암, 심장질환, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 산화에 의하여 야기되는 질환의 예방 및 치료용 조성물, 또는 상기 질환들의 예방 및 개선용 건강식품, 또는 피부노화방지용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 비짜루국화 추출물 제조

먼저, 비짜루국화(Aster Subulatus Michx.)전초 364.7 g를 흐르는 물에 세척 후 3일 동안 40℃ 열풍건조 하여 분쇄기로 분쇄하였다. 건조된 시료를 70 % 에탄올에 침적시켜 2~3 일 동안 실온에서 교반하여 침출하였고, 이 침출물을 여과기로 여과하고, 침출 및 여과과정을 2~3 회 더 반복한 후, 이 여과액을 감압, 농축하고, 동결, 건조하여 분말형태의 에탄올 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 비짜루국화 추출물 유래 용매분획물 분리

비짜루국화의 에탄올 추출물에 대한 용매분획은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 1에서 제조한 비짜루국화 에탄올 추출물(70% ethanol extract) 중 30.2 g을 가지고, 증류수 1L에 현탁시킨 후, n-헥산(1 L)을 첨가하여 n-헥산층과 수층으로 분획한 후 이를 2회 반복하여 n-헥산층을 얻었다. 그 후 수층에 메틸렌 클로라이드(1 L)를 첨가하여 메틸렌 클로라이드층과 수층으로 분획한 후 이를 3회 반복하여 메틸렌 클로라이드 층을 얻었다. 에틸 아세테이트(1 L)를 첨가하여 에틸 아세테이트층과 수층으로 분획한 후 이를 3회 반복하여 에틸 아세테이트층을 얻었고 수층에 n-부탄올(1 L)을 첨가하여 n-부탄올층과 수층을 분획한 후 이를 3회 실시하여 n-부탄올층을 얻었다. 각각을 감압, 농축시켜 5개의 분획층을 수득하였다 (표 1 및 도 1 참조).

[표 1]

본 실험에서 시료의 추출에 사용된 용매들은 Merk Co., Junsei Co., Hyman Co.사의 제품을 사용하였다. 분리과정에서 사용된 충진제로 역상 실리카겔 컬럼크로마토그래피(reverse-phase silica gel column chromatogrphy)에서는 실리카겔 100(RP-18, 230-400 mesh, Merck Co.)를 사용하였고, 정상 실리카겔 컬럼크로마토그래피(normal-phase silica gel column chromatography)에서는 실리카겔 60(0.040-0.063 mm, Merck Co.)을 사용하였다.

실시예 3: 비짜루국화 에탄올 추출물의 용매분획물로부터 화합물의 분리 및 구조 동정

에틸아세테이트 분획층(1.9 g)을 가지고 역상 실리카겔과 물과 메탄올을 전개용매(reverse-phase SiO_{2 ,} (H₂O/MeOH)(v/v))로 사용해 10개의 분획으로 나누었다. 그 중 분획-5 (274.1mg)을 가지고, 정상 실리카겔과 클로로포름과 메탄올을 전개용매(normal-phase SiO₂(CHCl₃/MeOH)=(3/1))로 사용해 이용해 3개의 분획을 얻었다. 이 때 클로로포름과 메탄올의 비율이 3:1이 되게 하였다. 그리고 분획-5에서 얻은 3개의 분획 중에 분획-1에서 화합물 1(9.9 mg), 분획-5에서 얻은 3개의 분획 중에 분획-3에서 화합물 2(131.1 mg)을 얻었으며, 분획-6에서 화합물 3(68.6 mg)을 얻었다. 얻어진 3개의 화합물은 HPLC 분석 및 NMR을 이용해 확인한 결과 순수하게 분리되었음을 확인하였다.

핵자기공명기(Nuclear Magnetic Resonance)를 이용하여 스펙트럼을 얻었으며, 이들 스펙트럼을 종합적으로 분석하여 구조를 결정하였으며, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용해 정량분석을 하였다.

분석과정에서는 Waters사의 HPLC(Alliance2695)를 이용하였고, XTerra^TM C18 3.5μm 4.6×100mm를 장착하여 사용하였다. 구조분석에 이용된 핵자기공명기는 NMR(Bruker Co., 500MHz)를 사용하였고, NMR 측정시 용매로는 NMR전용 Merck Co.에 DMSO-d _{6 ,} CDCl_{3 ,} CD₃OD, Acetone-d ₆ , D₂O가 사용되었다. 분리된 화합물의 질량분석을 위해서는 한국 기초과학지원연구소(서울센터)의 HR FAB-MS를 사용하였고, 사용된 매트릭스(Matrix)로는 NBA(4-nitro benzyl alcohol)를 사용하였다. 분리 물질의 광학회절을 확인하기 위해 편광계(polarimeter)는 Jasco P-1030을 사용하였고, 메탄올을 용매로 하여 측정하였다.

그 결과, 화합물 1은 신규한 화합물로 1-[(부타노일)플로로글로시닐]-베타- 디-글루코피라노시드(1-[(butanoyl)phloroglucinyl]-β-D-glucopyranoside)으로 명명하였으며, 하기 화학식 1로 표시하였다. 화합물 2는 3,5-디카페오일 퀴닉산(3.5-dicaffeoyl quinic acid)으로 판명되었으며, 하기 화학식 2로 표시하였다. 또한, 화합물 3은 3,5-디카페오일 에피-퀴닉산(3.5-dicaffeoyl epi-quinic acid)로 판명되었으며, 하기 화학식 3으로 표시하였다.

화합물 1

[화학식 1]

1) 성상 : 비결정질 가루

2) 분자식 : C₁₆H₂₂O₉

3) UV(CH₃OH) : 286.2, 228.2 nm

4) [α]²⁰ _D : ?46.2(c 0.011, MeOH)

5) 전자충격 질량분석(HR-FAB-MS) : m/z =381.1160 [M+Na]⁺

6) ¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) : δ5.94 (1H, d, 2.0, H-4), 6.17 (1H, d, 2.0, H- 6), 3.16 (1H, ddd, 16.5, 7.5, 6.5, H-2'), 3.09 (1H, ddd, 16.5, 9.0, 7.0, H-2'), 1.69 (2H, m, H-3'), 0.97 (3H, t, 7.5, H-4'), 5.03 (1H, d, 7.5, H-1"), 3.53 (1H, dd, 9.0, 7.5, H-2"), 3.46 (1H, m, H-3"), 3.41 (1H, dd, 9.0, 9.0, H-4"), 3.46 (1H, m, H-5"), 3.91 (1H, dd, 12.5, 2.5, H-6"), 3.72 (1H, dd, 12.5, 5.0, H-6")

7) ¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) : δ162.4(C-1), 106.9(C-2), 167.8(C-3), 98.4(C-4), 165.9(C-5), 95.5(C-6), 207.6(C-1'), 47.3(C-2'), 19.3(C-3'), 14.4(C-4'), 101.9(C-1"), 74.9(C-2"), 78.7(C-3"), 71.3(C-4"), 78.5(C-5"), 62.6(C-6").

화합물 2

[화학식 2]

1) 성상 : 회색(황색)이 도는 흰색의 가루

2) 분자식 : C₂₅H₂₃O₁₂

3) UV(CH₃OH) : 329, 243.5 nm

4) [α]²³ _D : ?207(c 0.2, MeOH)

5) 전자충격 질량분석(ESI-HR MS) : m/z = 515.1198 [M-H]^-

6) ¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) : δ 7.61(1H, d, J=16.0Hz, H-7'), 7.58(1H, d, J=16.0Hz, H-7"), 7.06(1H, dd, J=8.0, 1.5Hz, H-6'), 6.96(1H, dd, J=8.0, 1.5Hz, H-6"), 6.78(2H, d, J=8.0Hz, H-5', 5"), 6.37(1H, d, J=16.0Hz, H-8'), 6.27(1H, d, J=16.0Hz, H-8"), 5.42(2H, (1H, m, H-3, 5), 3.95(1H, dd, J=8.0, 3.0Hz, H-4), 2.32-2.15(4H, m, H-4, 6)

7) ¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) : δ181.1(C-7), 169.4(C-9'), 169.1(C-9"), 149.4(C-4'), 149.3(C-4"), 147.1(C-7'), 147.0(C-7"), 146.6(C-3', 3"), 128.1(C-1'), 127.9(C-1"), 123.1(C-6', 6"), 116.6(C-5', 5"), 115.9(C-2'), 115.5(C-2"), 115.4(C-8', 8"), 74.2(C-1), 72.9(C-5), 72.3(C-4), 50.0(C-3), 40.3(C-2), 37.4(C-6)

화합물 3

[화학식 3]

1) 성상 : 회색(황색)이 도는 흰색의 가루

2) 분자식 : C₂₅H₂₃O₁₂

3) UV(CH₃OH) : 327.8, 243.5 nm

4) ¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) : δ7.61(1H, d, J=14.0Hz, H-7'), 7.58(1H, d, 14.0, H-7“), 7.06(2H, dd, 2.0,10.0, H-6',6"), 6.97(1H, dd, 1.5, 5.5, H-2'), 6.95(1H, dd, 1.5, 5.5, H-2"), 6.77(2H, d, 8.5, H-5',5"), 6.39(1H, d, 16., H-8'), 6.29(1H, d, 16.0, H-8"), 5.51(1H, m, H-3), 5.39(1H, q, 3.5, H-5), 3.91(1H, dd, 3.0, 9.0, H-4), 2.28(1H, dd, 3.5,15.5, H-6eq), 2.17-2.05(2H, m, H-2eq), 2.17-2.05(1H, m, H-6ax)

5) ¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) : δ169.4(C-9'), 169.0(C-9"), 149.6(C-4'), 149.5(C-4"), 147.0(C-3'), 146.9(C-3"), 146.9(C-7'), 146.9(C-7"), 128.2(C-1'), 128.0(C-1"), 123.1(C-6'), 123.0(C-6"), 116.6(C-5'), 116.6(C-5"), 116.1(C-8'), 115.7(C-8"), 115.3(C-2',2"), 76.2(C-1), 74.2(C-5), 72.9(C-4), 72.5(C-3), 40.5(C-2), 37.5(C-6).

실험예 1: 비짜루국화 추출물, 분획물 및 화합물의 1,1- 디페닐 -2- 피크릴히드라질 (1,1- Diphenyl -2- picrylhydrazyl , DPPH ) 라디칼 소거 활성 측정

전자공여능(electron donating ability) 측정은 Blosis 방법에 의한 DPPH 라디칼 소거법에 따라 측정하였다. 즉, 에탄올에 녹인 여러 농도의 시료를 96개의 웰 플레이트(well plate)에 100 ㎕씩 분주하고 0.4 mM DPPH 용액을 동량 첨가하여 실온에서 10분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 양성 대조군으로는 BHA(butylated hydroxy anisole)를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 아래의 수학식 1로부터 산출하였고, DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

DPPH 라디칼 소거활성(%) = (A_control - A_sample)/A_control × 100

상기 식에서, A_sample는 시료를 첨가한 반응액의 흡광도이고, A_control는 시료 대신 에탄올을 첨가한 반응액의 흡광도이다.

비짜루국화의 에탄올 추출물과 순차적 분획물의 항산화 활성에 대한 결과를 하기 표 2에 나타내었다. DPPH의 라디칼 소거 활성은 에탄올 추출물과 순차적 분 획물 모두에서 처리농도에 따라 농도 의존적으로 증가하였다. 순차적 분획물 중 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서 DPPH의 라디칼 소거 활성의 대조군인 BHA 보다 약간 떨어지는 활성을 보였으나 다른 분획물보다는 현저히 좋은 활성을 갖고 있으며, 이때의 IC₅₀ 값은 각각 17.66, 61.03 ㎍/㎖로 나타났다 (하기 표 2 참조).

또한 비짜루국화 에탄올 추출물에서 분리된 화합물에 대한 항산화 활성에 대한 결과 또한 하기 표 2에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거활성 실험에서는 화합물 2 및 화합물 3의 IC₅₀ 값이 각각 9.0 ㎍/㎖과 8.5 ㎍/㎖,로 나타나 대조군 BHA (IC₅₀=5.95 ㎍/㎖) 에 비교하여 높은 억제활성을 보였다.

[표 2]

실험예 2: 비짜루국화 추출물, 분획물 및 화합물의 크산틴 옥시다제( Xanthine oxidase ) 억제 및 수퍼옥사이드 ( superoxide ) 라디칼 소거 활성 측정

크산틴 옥시다제에 의한 요산(uric acid) 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, 대조군으로 알로퓨리놀(allopurinol, Sigma)을 사용하였다. 수퍼옥사이드의 양은 NBT(nitroblue tetrazolium) 환원방법으로 560 nm에서 측정하였다. 반응액은 각 시료의 여러 농도와 0.5 mM 크산틴과 1 mM EDTA를 200 mM 포스페이트 버퍼 (pH 7.5) 100 μl에서 준비하였고, 50 mU/ml 크산틴 옥시다제를 첨가 하여 요산의 생성을 유도하였다. 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성은 위 반응액에 0.5 mM NBT를 첨가하여 반응시켰다. 크산틴 옥시다제 억제 및 수퍼옥사이드 소거 활성은 각각 생성된 요산과 수퍼옥사이드의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC₅₀)로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복 실험 후 평균값을 구하였다.

비짜루국화 에탄올 추출물 및 순차적 분획물의 크산틴 옥시다제 억제활성 및 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성에 대한 결과 또한 상기 표 2에 나타내었다. 비짜루국화 에탄올 추출물 및 순차적 분획물 모두 농도 의존적으로 크산틴 옥시다제 억제활성을 보였으며, 에틸아세테이트 분획물이 분획물중 IC₅₀ 값이 84.63 ㎍/㎖으로 높은 억제활성을 보였다 (상기 표 2 참조). 특히 비짜루국화 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트와 부탄올 분획물의 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성 IC₅₀ 값이 각각 14.20 ㎍/㎖과 2.54 ㎍/㎖, 29.98 ㎍/㎖로 나타나 대조군 알로퓨리놀(allopurinol) (IC₅₀=6.80 ㎍/㎖) 에 비교하여 전혀 뒤떨어지지 않는 높은 억제활성을 보였다 (상기 표 2 참조).

또한 비짜루국화 에탄올 추출물에서 분리된 화합물에 대한 크산틴 옥시다제 억제활성 및 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성 측정에 대한 결과 또한 상기 표 2에 나타내었다. 크산틴 옥시다제 억제활성에서는 화합물 1의 IC₅₀ 값이 55.3 ㎍/㎖에서 나타났으며 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성은 화합물1(IC₅₀=18.69 ㎍/㎖), 화합물 2(IC₅₀=3.29 ㎍/㎖), 화합물 3(IC₅₀=3.04 ㎍/㎖)으로 대조군 알로퓨리놀 (IC₅₀=2.11 ㎍/㎖) 에 비교하여 높은 억제활성을 보였다 (상기 표 2 참조).

실험예 3: 비짜루국화로부터 분리정제된 화합물의 α - 글루코시다제 억제활성 측정

α-글루코시다제 억제 활성 실험은 Kim JS, Kwon CS, Son KH. Inhibition of alpha-glucosidase and amylase by luteolin, a flavonoid. Biosci . Biotechnol . Biochem. 2000. 64(11). 2458~2461, Li Y, Peng G, Li Qian, Wen S, Huang TH, Roufogalis BD, Yamahara J. Salacia oblonga improves cardiac fibrosis and inhibits postprandial hyperglycemia in obese Zucker rats. Life sci. 2004. 75(14). 1735~1746, 및 Lee DS, Lee SH. Genistein, a soy isoflavone, is a potent alpha-glucosidase inhibitor. FEBS Lett . 2001. 501(1). 84~86에 기재된 실험법에 의해 실험하였다.

먼저, 각 시료를 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹였으며 yest α-글루코시다제 (0.2 U/mL, Sigma)는 50mM 소듐포스페이트 버퍼(pH 6.8)에 준비하였다. 기질인 p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드(PNPG, Sigma)는 효소를 녹인 같은 버퍼에 10 mM 농도로 희석하였다. 10uL의 시료와 α-글루코시다제 (0.2 U/mL) 95 uL를 섞어 37℃에서 반응시켰다. 5분 반응 후 405 nm 흡광도에서 측정하였고, PNPG는 1 mM의 농도로 희석하고 95uL를 첨가하여 시간에 따른 증가량을 측정하였다. 기질을 넣기 전 측정한 값과 넣은 후 증가하는 값을 측정하여 그 차이를 계산하였다. 대조군은 Acarbose(100 mg/mL, Glucobay)를 사용하였으며 모든 실험은 3회 반복을 수행하였다.

비짜루국화 에탄올 추출물에서 분리된 화합물에 대한 α-글루코시다제 억제활성의 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다. 전반적으로 정제된 화합물은 농도 의존적으로 효소 활성을 억제하는 경향을 나타내었다. 화합물 2 및 화합물 3은 각각 IC₅₀ 값이 309.4 , 416.5 의 농도로 α-글루코시다제를 억제함을 확인할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 비짜루국화로부터 에탄올 추출물 및 이의 용매 분획물을 얻는 과정을 나타낸 흐름도이다.

도 2a 및 도2b는 본 발명의 일구현예에 따른 비짜루국화 에탄올 추출물에서 분리된 화합물 1 내지 3에 대한 α-글루코시다제 억제활성의 결과를 나타내는 그래프이다.

Claims (17)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물.

   [화학식 1]

   
2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 비짜루국화(Aster Subulatus Michx.)로부터 추출, 분리 및 정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 화합물.
3. (a) 비짜루국화를 물, C₁~C₃의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 비짜루국화 추출물을 얻는 단계;

   (b) 상기 단계 a에서 얻은 비짜루국화 추출물을 물, n-헥산(n-hexane), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 또는 n-부탄올(n-butanol)로 분획하여 비짜루국화 분획물을 얻는 단계; 및

   (c) 상기 단계 b에서 얻은 비짜루국화 분획물을 컬럼 크로마토그래피를 수행 하여 화합물을 얻는 단계를 포함하는 제1항의 화합물의 제조방법.
4. 제1항의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암, 심장질환, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 및 치료용 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 하기 화학식 2 내지 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암, 심장질환, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 및 치료용 조성물.

    [화학식 2]

    

    [화학식 3]

    
11. 제10항에 있어서, 상기 화학식 2 내지 3으로 표시되는 화합물은 비짜루국화로부터 추출, 분리 및 정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 암, 심장질환, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 및 치료용 조성물.
12. 제4항 및 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암, 심장질환, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 및 치료용 조성물.
13. 삭제
14. 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부노화방지용 화장료 조성물.

    [화학식 1]

    

    [화학식 2]

    

    [화학식 3]

    
15. 삭제
16. 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암, 심장질환, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 및 개선용 건강식품.

    [화학식 1]

    

    [화학식 2]

    

    [화학식 3]

    
17. 삭제

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