KR101685829B1 - 항산화 활성이 증진된 겨우살이 추출 발효물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 겨우살이 추출물을 발효시키는 단계를 포함하는, 항산화 활성이 증진된 겨우살이 추출 발효물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 발효물의 우수한 항산화 효과와 카페인산(caffeic acid), 헤스페레틴 (hesperetin), 시린지알데하이드(syringaldehyde) 및 리오니레시놀(lyoniresinol) 함량의 급격한 증가를 확인하였는바, 항산화 활성과 밀접한 관계가 있는 퇴행성 질환, 각종 염증 등의 질병의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 효과적으로 접근하여 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

항산화 활성이 증진된 겨우살이 추출 발효물의 제조방법 {Method for prepareing fermented extract of mistletoe having enhanced antioxidative effect}

본 발명은 겨우살이 추출 발효물의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 겨우살이 추출물을 발효시키는 단계를 포함하는, 항산화 활성이 증진된 겨우살이 추출 발효물의 제조방법에 관한 것이다.

겨우살이과(Loranthaceae)에 속하는 겨우살이(mistletoe)는, 동백나무겨우살이(Korthalsella japonica), 꼬리겨우살이(Hyphear tanakae) 등이 있으며, 일반적으로 겨우살이라 함은 참나무, 팽나무, 오리나무 등에 기생하는 다년생 식물로 Viscum속에 속하는 식물을 일컫는다.

오늘날, 생리 활성 물질 중 하나로서 겨우살이에 대한 관심이 증대되고 있다. 실제로, 유럽 각지에서 민간요법을 통해 고혈압, 동맥경화, 악성종양 등에 대한 치료제로서 사용되고 있으며, 동물과 인간을 대상으로 한 임상실험에서, 암 환자의 생존율을 증가시키는 것으로 보고되어 이미 유럽과 국내의 일부 병원에서 암 치료의 목적으로 유럽산 겨우살이의 추출물을 임상에 사용하고 있다. 겨우살이 추출물 내에서 이러한 세포독성 및 면역증강효과를 나타내는데 역할을 하는 활성물질들로 렉틴(lectin), 폴리펩티드인 비스코톡신(viscotoxin), 당류인 폴리사카라이드(polysaccharide), 올리고사카라이드(oligosaccharide) 및 알칼로이드(alkaloid) 등이 알려져 있으며, 그 중에서도 렉틴이 항암 및 면역증진 활성의 주된 성분으로 인정되어 가장 집중적인 연구가 수행되어 왔다. 한국산 겨우살이에 대한 연구도 최근에 활발히 진행되어 한국산 겨우살이의 렉틴성분이 가지는 항종양, 면역증강 활성이 보고되었고, 그 주요 활성물질로서 특이성을 가지는 lectin 성분(KML-C)을 분리하기도 하였다. 또한, 이외에도 혈당 강하 효과, 및 인슐린 분비 증진 효과 등을 확인한 바가 있으며, 이와 같이 겨우살이 추출물을 이용한 생리 활성 조절에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(한국 특허공개번호 10-2015-0010414).

한편, 발효는 넓은 의미에서 미생물이 자신의 효소로 유기물을 분해 또는 변화시켜 각기 특유의 최종산물을 만들어내는 현상으로, 좁은 의미로는 탄수화물이 무산소적으로 분해되는 복잡한 반응계열로 이루어지는 과정을 말한다. 또는 미생물이 각종 효소를 분비하여 유기화합물을 산화, 환원 또는 분해, 합성시키는 반응이라고 말할 수도 있다.

발효식품의 종류는 누룩곰팡이에 의해서 만들어 지는 막걸리, 증류해서 만든 증류주(브랜디, 럼주, 위스키, 보드카, 진 소주), 초산균으로 만드는 식초, 효모로 만드는 포도주와 맥주, 빵 효모로 만드는 빵, 곰팡이에 의해서 만들어지는 된장 또는 간장, 유산균 등으로 만드는 김치, 그리고 서양의 치즈, 버터, 요구르트 등이 있다. 특히, 식품 추출물의 경우, 발효하게 되면 발효생성물이 생성되어 원래의 식품보다 특이한 영양 성분이 더 많이 존재하게 되는 경우가 있다. 예를 들면, 각종 대두 가공 식품의 추출물을 이용한 항돌연변이 실험에서 발효 식품의 추출물이 비발효 식품보다 항돌연변이원성이 훨씬 높게 나타났으며, 식품에 함유된 이소플라본의 aglycone 함량에 비례하여 항돌연변이 정도가 증가함을 확인하였다. 또한, 재래식 메주 및 된장 중의 항산화 활성 역시 발효기간에 비례하여 증가한다는 결과가 보고된 바 있다.

종래의 겨우살이 추출물의 생리 활성에 대한 연구는 겨우살이 추출물 내 물질인 렉틴의 항암성 및 기능성에 큰 비중을 두고 연구 개발되거나 제품화되어 왔다. 다만, 렉틴 성분에 초점을 맞춘 겨우살이 추출물 제조방법은 때때로 알레르기와 과민반응을 일으킬 우려가 있으며, 복잡한 정제 공정에 따른 과도한 비용이 발생할 수 있다는 문제점이 존재하였다. 이에, 본 발명자들은 겨우살이 추출물에 발효 기술을 접목시켜, 우수한 항산화 활성을 나타내는 겨우살이 추출물의 제조방법을 개발하고자 하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 겨우살이 추출 발효물의 항산화 활성 증진 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 겨우살이와 용매를 혼합한 후, 가열하여 겨우살이 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 겨우살이 추출물에 미생물 또는 미생물 유래 효소액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 항산화 활성이 증진된 겨우살이(mistletoe) 추출 발효물의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 미생물 또는 미생물 유래 효소액을 이용한 발효를 통해 겨우살이 추출물의 항산화 활성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 방법에 의해 제조된 겨우살이 추출 발효물을 유효성분으로 포함하는, 항산화제를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 겨우살이와 용매를 혼합한 후, 가열하여 겨우살이 추출물을 제조하는 단계; 및 b) 상기 겨우살이 추출물에 미생물 또는 미생물 유래 효소액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 항산화 활성이 증진된 겨우살이(mistletoe) 추출 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 a) 단계는, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매로 추출할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 b) 단계에서는, 겨우살이 추출물에 메주균 (Aspergillus kawachii) 유래의 효소액을 처리할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 b) 단계에서는, 겨우살이 추출물을 3일이상 발효시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 카페인산(Caffeic acid), 헤스페레틴(Hesperetin), 실린지알데하이드(Syringaldehyde), 및 리오니레시놀(Lyoniresinol)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물의 함량을 증가시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 미생물 또는 미생물 유래 효소액을 이용한 발효를 통해 겨우살이 추출물의 항산화 활성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 방법에서는, 겨우살이 추출물에 메주균 (Aspergillus kawachii) 유래의 효소액을 처리하여 3일 이상 발효시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 겨우살이 추출 발효물을 유효성분으로 포함하는, 항산화제를 제공한다.

본 발명은 상기방법에 의해 제조된 겨우살이 추출 발효물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 항산화 및 이와 관련된 퇴행성 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 추출 발효물을 포함하는 조성물의 항산화 및 이와 관련된 퇴행성 질환의 치료용도를 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법은 겨우살이 추출물을 발효시키는 단계를 포함하며, 상기 방법에 의해 제조된 추출 발효물의 우수한 항산화 효과와 카페인산(caffeic acid), 헤스페레틴(hesperetin), 시린지알데하이드(syringaldehyde) 및 리오니레시놀(lyoniresinol) 함량의 급격한 증가를 확인하였는바, 항산화 활성이 증진된 겨우살이 추출 발효물을 제조할 수 있음을 구체적으로 확인하였다. 따라서, 본 발명은 항산화 활성과 밀접한 관계가 있는 퇴행성 질환, 각종 염증 등의 질병에 대한 보다 효과적인 예방, 치료 및 개선에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 겨우살이 추출물의 발효에 의해 증가한 항산화 효과를 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능력 측정을 통하여 확인한 결과이다.
도 2는 겨우살이 추출물의 발효에 의해 증가한 항산화 효과를 ABTS 라디컬 양이온의 탈색화 측정을 통하여 확인한 결과이다.
도 3은 겨우살이 추출물에 대한 발효 전후 화합물의 함량 변화를 HPLC에 의해 분석한 결과이다.
도 4는 발효 후 함량이 증가된 화합물의 구조를 나타낸 도이다.
도 5는 겨우살이 추출물의 발효에 의해 증가한 화합물들에 대한 항산화 효과를 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능력 측정을 통하여 확인한 결과이다.
도 6은 겨우살이 추출물의 발효에 의해 증가한 화합물들에 대한 항산화 효과를 ABTS 라디컬 양이온의 탈색화 측정을 통하여 확인한 결과이다.
도 7은 겨우살이 추출물의 발효에 의해 증가한 화합물 (카페인산 또는 리오니레시놀)의 HT-22 세포 내에서의 활성산소종 제거 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 겨우살이 추출물을 메주균유래 효소액으로 발효시킨 경우, 시간의 경과 (1일~4일)에 따른 화합물의 함량 변화를 확인한 결과이다.

본 발명자들은, 겨우살이 추출물에 메주균 (Aspergillus kawachii) 유래의 효소액을 처리하여 발효시킴으로서, 항산화 활성을 증진시킬 수 있음을 확인하였으며, 구체적으로, 항산화 활성 화합물인 카페인산(caffeic acid), 헤스페레틴 (hesperetin), 시린지알데하이드(syringaldehyde) 및 리오니레시놀(lyoniresinol) 함량의 급격한 증가를 확인하였다. 또한, 항산화 활성을 극대화하기 위한 최적의 발효 시간을 조사한 결과, 겨우살이 추출물을 약 3일 이상 발효시킨 경우, 항산화 관련 화합물의 함량이 최대가 된다는 점을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 a) 겨우살이와 용매를 혼합한 후, 가열하여 겨우살이 추출물을 제조하는 단계; 및 b) 상기 겨우살이 추출물에 미생물 또는 효소액을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 항산화 활성이 증진된 겨우살이 추출 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "겨우살이(mistletoe)"는 겨우살이과(Loranthaceae)에 속하며, 참나무, 팽나무, 오리나무 등에 기생하는 다년생 식물로 Viscum속에 속하는 식물이다.

본 발명에서, 겨우살이 추출물은 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서 겨우살이 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 또한, 겨우살이로부터 추출물을 추출하는 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 통하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸 에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수도 있다. 상기 분획 시 온도는 4℃ 내지 120℃일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "발효"는 미생물이 자신의 효소로 유기물을 분해 또는 변화시켜 각기 특유의 최종산물을 만들어내는 현상을 일컫는다. 본 발명에서는 겨우살이 추출물을 발효시킴으로써, 항산화 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하며, 항산화 화합물인 카페인산(Caffeic acid), 헤스페레틴(Hesperetin), 실린지알데하이드(Syringaldehyde), 및 리오니레시놀(Lyoniresinol)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물의 함량을 증진시킬 수 있다.

또한, 본 발명에서, 겨우살이 추출물의 발효는, 우선, 물 1ml당 겨우살이 추출물이 1~1,000mg, 바람직하게는 50mg 함유하도록 현탁시킬 수 있으며, 상기 현탁액과 효소액을 1:0.1~1:100mg/ml, 바람직하게는 1:1이 되도록 처리할 수 있다. 이 후, 10~50℃, 바람직하게는 30℃에서 발효시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 발효 단계에서는 추출물의 발효를 위하여, 미생물 또는 미생물의 효소액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메주균(Aspergillus kawachii) 유래의 효소액을 사용할 수 있으나, 이와 유사한 활성을 나타내는 미생물 또는 미생물의 효소액이라면 제한없이 이용될 수 있다.

또한, 상기 발효 단계는 1시간~7일간, 바람직하게는 3일 이상 반응시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게는 72시간 내지 76시간 발효시킬 수 있으며, 경우에 따라 물 대신 바람직한 완충액, 예를 들어 시트루산완충액(pH 4.6) 등을 사용할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 겨우살이 추출물 및 겨우살이 추출 발효물을 제조하여, 발효 후 겨우살이 추출물의 DPPH 라디컬 소거활성이 증가를 포함한 항산화 활성 증진 효과를 확인하였다(실시예 1 내지 2 참조). 또한, 발효 후 겨우살이 추출물에서, 카페인산, 헤스페레틴, 시린지알데하이드, 및 리오니레시놀 함량의 급격한 증가와 이들의 농도 증가에 따른 항산화 활성 증진 효과를 확인하였으며, 발효 시간에 따른 항산화 활성 화합물의 함량 변화를 측정함으로써, 최적의 발효 시간 (3시간 이상)을 확인하였는바, 항산화제 및 항산화 활성과 밀접한 관계가 있는 퇴행성 질환, 각종 염증 등의 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 3 내지 5 참조).

이에, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 겨우살이 추출 발효물을 유효성분으로 포함하는, 항산화제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 항산화 활성이 증가된 겨우살이 추출 발효물을 이와 관련이 깊은 퇴행성 질환의 예방 또는 치료제로서, 약제학적 제제의 형태로 제조하는 경우, 유효성분을 약제학적으로 허용되는 통상적인 담체와 함께 배합하여 투여 목적에 따라, 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제나 현탁제와 같은 경구 투여용 제제 또는 주사가능한 액제나 현탁제, 비강세척제 등과 같은 비경구 투여용 제제의 형태로 제형화할 수 있다.

경구 투여의 목적으로 본 발명의 유효성분을 정제, 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제, 현탁제 등의 제제로 제형화하는 경우에는, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산이칼슘 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산마그네슘과 같은 활택제, 슈크로스 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있다. 단위 투여형이 캅셀제인 경우에는 상기 성분 외에도 폴리에틸렌글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포함될 수도 있다.

비경구 투여를 위한 용액 또는 현탁액 형태의 주사제는 비경구적으로, 예를 들면 피하, 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내로 투여될 수 있다. 일반적으로, 주사가능한 용액 또는 현탁액은 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 설탕 용액제, 비휘발성 오일, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜과 같은 글리콜류 등의 약제학적으로 허용되는 액상 담체 중에 유효량의 유효성분을 균질하게 혼합시켜 제조할 수 있다. 이외에도 필요에 따라 가용화제, 항세균제, 킬레이트제, 완충제, 보존제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체로는 약제학적으로 순수하고, 실질적으로 무독성이며, 유효성분의 작용을 저해하지 않는 임의의 모든 보조제를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 발효 겨우살이 추출물은 천연추출물로서, 본 발명의 예방 또는 치료제는 상기한 약학적 제제 외에도, 기존의 청량 음료, 미네랄 워터, 알콜 음료 등의 음료 제품 또는 츄잉껌이나 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등에 적당량 배합하거나, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강 보조 식품, 또는 식품 첨가제 등에 포함시켜 식품 또는 식품 보조제의 형태로 제조할 수도 있다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료제의 1일 투여용량은 투여하고자 하는 대상의 질환의 중증도, 합병증, 체중, 연령, 성 등의 다양한 요인에 따라 변화될 수 있으나, 일반적으로는 추출물 1 내지 1,000㎎/㎏, 바람직하게는 10 내지 500㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 100㎎/㎏을 1일 1 내지 3회 경구투여할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 항산화 활성과 관련된 퇴행성 질환, 각종 염증 등의 질병에 대한 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명에 의한 항산화 활성이 증가된 겨우살이 추출 발효물을 화장료 제제의 형태로 제조하는 경우, 상기 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비 함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 겨우살이 추출물의 제조 및 발효

겨우살이는 시중에서 구입하여 사용하였다. 겨우살이 5kg을 95% 에탄올 8 L에 넣고 5시간 동안 2회 수욕에서 가열추출한 후, 여과하고 여액을 회전감압농축기로 건조하여 건고물 433g을 수득하였다. 이를 800㎖의 시트루산 완충액(pH 4.6)에 분산시킨 후 800mL의 메주균(Aspergillus kawachii) 유래의 효소액을 처리한 다음, 30℃에서 5일간 발효시켰다.

실시예 2. 발효 전후 추출물의 항산화 활성 확인

2-1. DPPH assay

발효에 의한 항산화 효과의 증진을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 발효 전후 겨우살이 추출물에 의한 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능력을 측정하였다. 본 실시예에서는, 기존의 문헌 [Study on the inhibitory effect of tannins and flavonoids against the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Biochemical pharmacology. 1998;56(2):213-22]의 방법에 준하여 시행하였다. 구체적으로, DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹인 추출물 시료(10μl)와 Ethanol와 희석시킨 DPPH 용액(190μl)을 96-well plate에서 30분간 암소에서 반응시켰다. 이 후, 517 nm에서 흡광도(OD)를 측정하여 하기 수학식 1에 의해 DPPH 라디컬 소거활성을 측정하였으며, quercetin(Sigma, USA)을 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 발효 전 겨우살이 추출물의 DPPH 라디컬 소거활성(Before)은 대조군과 비교하여 20% 이하로 관찰된 반면, 발효 후 DPPH 라디컬 소거활성(after)은 급격하게 증가하였으며, 500ppm에서는 약 60%의 소거 활성을 나타냈다. 또한, 발효 후 겨우살이 추출물에서 농도 의존적으로 DPPH 라디컬 소거활성이 증가함을 확인하였다.

2-2. ABTS radical cation decolorization assay

발효에 의한 항산화 효과의 증진을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 발효 전후 겨우살이 추출물에 의한 ABTS 라디컬 양이온의 탈색화를 측정하였다. 본 실시예에서의 항산화 활성 측정 방법인 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity)는 기존의 문헌 [Antioxidant activity and total phenolic content of selected Jordanian plant species. Food Chem. 2007;104(4):1372-8]의 방법에 준하여 시행하였다. 구체적으로, 7mM ABTS와 4.9mM potassium persulfate를 혼합하여 4℃, 암소에서 12시간 동안 방치하여, ABTS＋˙을 형성시켰으며, 734nm에서 흡광도 값이 0.700(±0.025)이 되도록 80% EtOH로 ABTS 용액을 희석하였다. 희석된 ABTS 용액(190μL)에 다른 농도의 Trolox (10μL)를 가하고, 30분 동안 방치한 후 734nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 발효 전 겨우살이 추출물의 항산화 활성(Before)은 대조군과 비교하여 20% 이하로 관찰된 반면, 발효 후 항산화 활성(after)은 급격하게 증가하였으며, 특히 100ppm, 250ppm, 500ppm에서 유의적으로 크게 증가하였다. 또한, 발효 후 겨우살이 추출물에서는 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가함을 확인하였다.

실시예 3. 발효 전후 추출물의 화합물 함량 변화 확인

겨우살이 추출물에 효소액을 처리하여 발효시킨 경우 화합물의 함량 변화를 조사하기 위하여 HPLC 분석을 실시하였다. 분석은 XTerra RP18(4.6ⅹ250mm, 5μm; Waters, USA )의 역상 컬럼을 통해 이루어졌으며, 실온에서 유속은 1mL/min, 10㎕를 injection volume으로 설정하였다. 이동상으로는 1% acetic acid(HOAc)를 각각 포함하는 물(H₂O; solventA)과 acetonitrile(MeCN; solvent B)을 사용하여 농도 구배를 주어 사용하였다. Photodiode array detector를 이용하여 전체의 파장을 분석한 후, 적정파장을 280nm로 설정하였다. HPLC system 및 분석조건은 표 1에 나타내었다.

또한, 발효 전과 후의 겨우살이 추출물을 증발 건고한 다음, 메탄올을 가하고 원심분리하였다. 메탄올 가용성 부분인 상층액만 취하여 다시 증발 건고하고, 상기 건고물에 100,000ppm이 되도록 메탄올을 가한 다음, 0.45㎛ 크기의 막을 통과시켜 이 중 10㎕를 HPLC 분석용 시료로 사용하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, HPLC 분석 결과 발효 전(위)과 비교하여 발효 후(아래)에는 적색 화살표로 표시한 바와 같이, 4개의 peak의 크기가 증가함을 확인하였다(1 내지 4). 또한, 발효 후 증가한 화합물은 도 4에 나타낸 바와 같이, (a) 카페인산(Caffeic acid)(도3의 1), (b) 헤스페레틴(Hesperetin)(도3의 2), (c) 실린지알데하이드(Syringaldehyde)(도3의 3), (d) 리오니레시놀(Lyoniresinol)(도3의 4)임을 확인하였다.

실시예 4. 발효 후 증가한 화합물에 대한 항산화 활성 확인

상기 실시예 3에서 확인한 발효 후 증가한 화합물들을 대상으로 다양한 농도(1, 10, 25, 50, 100μM)에서의 DPPH 라디컬 소거능, ABTS 라디컬 양이온의 탈색화를 측정하였으며, 상기 화합물 중 카페인산 또는 리오니레시놀 처리에 따른 세포 내 활성산소종(ROS) 소거 효과를 비교하였다.

DPPH 라디컬 소거능 및 ABTS 라디컬 양이온의 탈색화는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행되었으며, 세포 내 활성산소종(ROS) 소거 효과는 HT22 세포에 Glutamate로 산화적 스트레스를 유발시킨 후, 활성 산소종 발생 억제효과를 flow cytometry 분석을 통해 확인하였다. 본 실시예에서는, CM-H2DCFDA[5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluoro-resceindiacetate,acetylester, Invitrogen, USA]를 사용하였으며, HT22 세포는 culture dish (falcon, USA)에 1.2ⅹ10⁶ cell/ml의 밀도로 계대한 후, 24시간 동안 배양하였다. 준비한 시료를 농도별로 12시간 동안 처리하고 10mM의 glutamate를 4시간 처리하여 세포 내 활성산소종의 발생의 유도하였다. 이 후, 0.25% trypsin-EDTA 1ml 처리하여 trypsinization 시켰으며, 원심 분리하여 cell pellet을 얻었다. 세포는 phenol-red DMEM을 이용하여 1회 washing한 후, 5μM CM-H2DCFDA를 처리하여 37℃에서 15분간 배양하였다. 이 후, 원심 분리하여 다시 cell pellet을 얻은 다음, 다시 한 번 washing하였다. Washing한 cell은 분석을 위하여 다시 phenol red-free DMEM에 재현탁시켰다. FACS(fluorescence-activated cell sorting) system을 통해 10,000개의 세포를 분석하여 형광 광도를 측정하였으며, quercetin(Sigma, USA)을 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 발효 후 증가한 화합물 (카페인산, 헤스페레틴, 실린지알데하이드, 및 리오니레시놀)의 함량이 증가할수록, DPPH 라디컬 소거활성 및 ABTS 라디컬 양이온의 탈색화가 증진됨을 확인하였다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 글루카메이트를 단독으로 처리한 경우와 비교하여 카페인산 또는 리오니레시놀을 처리한 경우 세포 내 활성산소종이 약 25% 감소하는 효과를 나타내었다.

상기의 실험 결과는 발효 후 증가한 화합물들은 항산화 활성과 밀접한 관련이 있으며, 이를 통하여 발효 후 겨우살이 추출물의 증진된 항산화 활성을 확인하였다.

실시예 5. 최적 발효 시간의 측정

발효 시간에 따른 겨우살이 추출물의 항산화 활성 증진 효과를 평가하기 위하여, 발효 후 증가된 화합물(카페인산, 헤스페레틴, 실린지알데하이드, 및 리오니레시놀)의 함량 변화를 관찰하였다. 본 실시예에서는, 화합물의 함량 변화를 HPLC로 분석하였다. 1g의 겨우살이 에탄올 추출물을 10ml의 증류수에 분산시킨 후 메주균유래 효소액(5mL)을 포함한 10ml의 시트루산 완충액(pH 4.6)에 2ml씩 분주하여 30℃에서 시간별로 배양하였다. 1일, 2일, 3일, 4일로 각각 반응시킨 후, 2ml의 메탄올을 가하여 시트루산을 침전시킨 다음 메탄올 가용성 분획에 대하여 HPLC 분석을 실시하였다. 이 때 zero time 설정은 Auto clave하여 비활성화 시킨 효소액을 처리한 겨우살이 추출물에 대한 분석치를 사용하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 3일 이상 발효시킨 경우, 증가된 화합물의 함량이 가장 높았으며, 이를 통하여 겨우살이 추출물을 3일 이상 발효시킨 경우, 최적의 항산화 효능을 가짐을 확인하였다.

제조예 1. 경질 캅셀제의 제조

실시예 1의 혼합추출물의 10배 농축물 10 ㎎

D-소르비톨 10 ㎎

락토스 5 ㎎

콜로이달실리콘디옥사이드 5 ㎎

스테아르산마그네슘 3 ㎎

총량 33 ㎎

통상적인 캅셀제의 제조방법에 따라 상기 성분들을 지정된 양으로 배합한 후, 1 캅셀 당 33㎎의 배합물이 되도록 적절한 크기의 경질 젤라틴 캅셀에 충진하여 목적하는 캅셀제를 제조하였다.

제조예 2. 정제의 제조

실시예 1의 혼합추출물의 10배 농축물 10 ㎎

D-소르비톨 10 ㎎

락토스 5 ㎎

콜로이달실리콘디옥사이드 5 ㎎

스테아르산마그네슘 3 ㎎

총량 33 ㎎

상기 성분들을 지정된 양으로 혼합한 후, 통상적인 정제의 제조방법에 따라 정제를 제조하였다.

제조예 3. 연질 캅셀제의 제조

실시예 1의 혼합추출물의 10배 농축물 10 ㎎

콩기름 100 ㎎

팜유 76 ㎎

총량 186 ㎎

상기 성분들을 지정된 양으로 배합한 후, 통상의 연질 캅셀제 제조방법에 따라 연질 캅셀제를 제조하였다.

제조예 4. 주사제의 제조

실시예 1의 혼합추출물의 10배 농축물 10 ㎎

토코페롤 172 ㎎

셀레늄 30 ㎎

주사용 증류수 적량

PH 조정제 적량

1 바이알 (10㏄)의 주사에 상기 성분들을 통상적인 주사제 제조방법에 따라 제조하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

1. 하기의 단계를 포함하는, 항산화 활성이 증진된 겨우살이(mistletoe) 추출 발효물의 제조방법:
   a) 겨우살이와 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매를 혼합한 후, 가열하여 겨우살이 추출물을 제조하는 단계; 및
   b) 상기 겨우살이 추출물에 메주균 (Aspergillus kawachii) 유래의 효소액을 처리하여 3일 이상 발효시키는 단계.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 방법은, 카페인산(Caffeic acid), 헤스페레틴(Hesperetin), 실린지알데하이드(Syringaldehyde), 및 리오니레시놀(Lyoniresinol)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
5. 메주균 (Aspergillus kawachii) 유래의 효소액을 이용한 3일 이상 발효를 통해 겨우살이 추출물의 항산화 활성을 증진시키는 방법.
   
6. 삭제
7. 삭제

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