KR100898758B1

KR100898758B1 - 항당뇨 활성을 나타내는 패과식물의 추출물

Info

Publication number: KR100898758B1
Application number: KR1020070057318A
Authority: KR
Inventors: 김기옥; 이주엽; 한종헌; 김미량; 오유성; 강민철; 고광효; 진호경; 김행범; 김봉석; 엄병헌
Original assignee: 재단법인 제주하이테크산업진흥원
Priority date: 2007-06-12
Filing date: 2007-06-12
Publication date: 2009-05-25
Also published as: KR20080109243A

Abstract

본 발명은 항당뇨 활성을 나타내는 패과식물의 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 패과식물 추출물은 패, 넓패 중 선택된 1종을 준비하여 세척한 후, 70 % 에탄올에 침적시키고 2 ~ 3 일동안 실온에서 교반하여 침출한 다음, 여과기로 여과하여 조추출물을 제조하고, 이 조추출물을 극성이 다른 용매인 n- 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용해 순차적으로 분획하여 분획물을 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해 패과식물 추출물이 유효성분으로 포함된 항당뇨용 조성물 및 항산화용 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명에 의해 패과식물 추출물로부터 분리한 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol)이 유효성분으로 포함된 항당뇨용 조성물 및 항산화용 조성물이 제공된다.

패, 넓패, 항당뇨, 항산화, 추출

Description

항당뇨 활성을 나타내는 패과식물의 추출물{ISHIGEACEAE EXTRACTS HAVING ANTI-DIABETES ACTIVITY}

도 1은 본 발명의 패과식물 추출물 및 그로부터 분리된 단일물질의 제조공정도

도 2는 패추출물의 에틸아세테이트층에 대한 Prep-HPLC 분석 크로마토그램

도 3은 패의 조추출물에 대한 HPLC 크로마토그램

도 4는 패추출물의 에틸아세테이트층에 대한 HPLC 크로마토그램

도 5는 패추출물로부터 분리한 Peak 1의 HPLC 크로마토그램

도 6은 패추출물로부터 분리한 Peak 2의 HPLC 크로마토그램

도 7은 패추출물로부터 분리한 Peak 1의 LC-MS-MS 스펙트럼

도 8은 패추출물로부터 분리한 Peak 1의 ¹H-NMR 스펙트럼

도 9는 패과식물 추출물로부터 분리한 Peak 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼

도 10은 패추출물로부터 분리한 Peak 1의 분자구조

도 11은 패과식물 추출물에 대한 알파-글루코시다제 억제효과 결과를 나타내는 그래프

A : 넓패추출물, B : 패추출물

도 12는 패추출물과 이로부터 분리한 Peak 1, Peak 2에 대한 알파-글루코시다제 억제효과 결과를 나타내는 그래프

도 13은 패과식물 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거활성 결과를 나타내는 그래프

A : 넓패추출물의 분획물, B : 패추출물의 분획물

도 14는 패추출물과 이로부터 분리한 Peak 1, Peak 2에 대한 DPPH 라디칼 소거활성 결과를 나타내는 그래프

도 15는 패과식물 추출물에 대한 NO 생성 저해활성 결과를 나타내는 그래프

A : 넓패추출물의 분획물, B : 패추출물의 분획물

도 16은 패추출물과 이로부터 분리한 Peak 1, Peak 2에 대한 NO 생성 저해활성 결과를 나타내는 그래프

도 17은 패과식물 추출물에 대한 잔틴산화효소 억제활성 결과를 나타내는 그래프

A : 넓패추출물의 분획물, B : 패추출물의 분획물

도 18은 패추출물과 이로부터 분리한 Peak 1, Peak 2에 대한 잔틴산화효소 억제활성 결과를 나타내는 그래프

도 19는은 패과식물 추출물에 대한 과산화물 소거활성 결과를 나타내는 그래프

A : 넓패추출물의 분획물, B : 패추출물의 분획물

도 20은 패추출물과 이로부터 분리한 Peak 1, Peak 2에 대한 과산화물 소거 활성 결과를 나타내는 그래프

패과(Ishigeaceae)식물은 갈조식물문(phacophyta), 민가지말목 (Chordariales)에 속하는 갈조식물로서, 대표적인 종으로는 패(Ishige okamurae Yendo)와 넓패(Ishige sinicola(Setchell et Gardner) Chihara)가 있다.

패(Ishige okamurae Yendo)는 남부 해안 각지, 제주도(각 지역 연안), 일본에까지 분포하며, 형태학적 특징으로는 딱딱한 나뭇가지처럼 보이고, 색은 암갈색이며 건조하면 흑색으로 되고, 몸의 구조는 내층은 배게 엉켜진 사상세포로 되어있고, 외층은 몸의 표면에 직각하고 열을 지은 소세포로 되어있다.

넓패(Ishige sinicola(Setchell et Gardner) Chihara)는 남부 해안 각지, 제주도(각 지역), 일본, 중국에 분포하며, 형태학적 특징으로는 엽상이고, 흑갈색이며, 기포처럼 팽배한 부분은 황갈색이고 건조하면 흑색으로 되고, 파도가 조용한 곳의 조간대 중부 바위 위에 군락을 이루면서 서식하며, 식용으로 이용되고 있다.

한국공개특허공보 특2003-0015536(넓패 추출물을 함유하는 미백 화장료)에는, 건조 및 분쇄된 넓패에 추출용매를 첨가하고, 침적하여 추출물을 얻고, 감압증류를 통해 농축하여 얻어진 넓패 추출물을 함유하는 미백 화장료에 관한 것으로, 티로시나아제 활성의 저해효과를 나타내어 미백에 효과적인 추출물에 관한 것이 공 개되어 있다.

또한, 한국등록특허공보 10-0386417(해조류의 추출물을 이용한 환경 친화적인 방오제)에는, 넓패의 추출물을 이용하여 가시파래와 홍합 등의 해양 부착 생물에 대하여 강한 방오활성을 나타내어 생태계 파괴 등의 문제를 갖고 있는 트리부틸틴을 대체할 수 있는 넓패 추출물에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 패과식물에 대해서는 상기 종래기술의 신경독성 억제, 방오 활성, 미백효과에 관한 연구 정도 외에는 더 다양한 생리활성에 대한 연구가 이뤄지고 있지 않다.

한편, 당뇨병(diabetes mellitus)은 고혈당(hyperglycemia)을 특징으로 하는 일련의 대사질환군으로 췌장에서 분비되는 호르몬인 인슐린이 부족하거나, 인슐린의 작용이 저하되어(insulin resistance) 생기는 만성퇴행성 질환이다.

인슐린은 혈당이 증가되면 췌장의 β-세포에서 분비되는 호르몬으로 혈액 내 포도당을 인체의 세포 속으로 유인시켜주며, 세포가 포도당을 이용하여 필요한 에너지를 생산하거나 포도당을 다른 물질(글리코겐)로 전환하여 저장하는 반응을 촉진하여, 혈당치를 정상으로 유지시켜준다.

만약, 인슐린 작용에 이상이 생기면 세포는 필요한 에너지를 만들어 내는 기능을 발휘할 수 없으며, 혈당치는 올라가게 된다.

현재 당뇨병의 치료제들 중 경구혈당 강하제는 오래 복용하면 부작용이 나타나므로 최근 당뇨병 치료에 대한 연구들은 천연물을 이용한 혈당 강하 물질을 이용 하려고 노력하고 있다.

전통의학이나 천연식물, 또는 식용으로 사용해 온 소재들로부터 새로운 활성 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며, 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 개발된 약물들에 의한 독성 염려가 적은 장점이 있다.

이러한 천연식물들은 특별히 뚜렷한 유효성분이 밝혀진 것은 아니지만, 여러 가지 성분들이 복합적으로 작용하여 인체의 생존을 위한 면역기능이나 치료기능들을 강하게 증강시키는 작용을 함으로써 질병의 치료나 예방을 가능하게 해주는 작용을 하기 때문에 예로부터 한약재로 복용하였으며, 기능성 식품이나 식품첨가제 등 다양하게 이용하기 위한 연구들도 활발히 진행되고 있다.

해조류에는 특유의 다양한 구조를 지닌 탄수화물류의 고분자 당류, 저분자 당류, 색소, 그리고 다양한 생리활성 물질이 함유되어 있어 많은 연구가 이뤄지고 있다.

해조류 추출물은 결정생성 방지, 에멀전 안정화 기술 등이 개발되어 활용되고 있으며, 젤리를 단단하게 하거나 식품건조방지, 어묵 등의 조직개량제로도 활용되고 있다.

또한, 최근에는 제주해양 연안에 분포하는 톳, 미역, 모자반, 감태, 우뭇가사리 등을 이용하여 상업화하려는 시도가 매우 활발히 진행되고 있다.

특히, 미역이나 다시마 같은 갈조류에서 분리된 푸코이단(fucoidan)은 당과 Uronic acid와 H₂SO₂이 결합된 황산화 다당체로서, 항암작용과 혈중 콜레스테롤 저 하, 면역력 증강 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있어, 기능성 음료와 건강식품, 의약품 등 매우 활용가치가 높은 물질로 각광받고 있다.

최근에는 이와 같이 갈조류에 대한 관심이 증가하고 있어 갈조류에 대한 연구 및 개발이 활발히 진행되고 있다.

한편, 한국등록특허공보 10-0527094(베타-아밀로이드에 의한 신경독성 경감용 조성물)에는, 감태, 넓패, 톳 및 모자반으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 해조 추출물을 유효성분으로 함유하는 베타-아밀로이드에 의한 신경독성 억제용 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 패과식물의 생리활성에 대한 연구가 부족한 실정이므로 보다 활발한 연구가 필요하다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 항당뇨 효과가 우수한 패과식물 추출물 및 이로부터 분리한 물질을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 패과식물 추출물을 활성성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물을 제공하고, 항산화용 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

또한, 본 발명의 항당뇨 및 항산화 활성이 우수한 패과식물 추출물이 첨가된 음료조성물, 식품첨가제를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 패과식물의 추출물은 패와 넓패 중 선택된 1종을 준비하여, 세척한 후 70 % 에탄올에 침적시키고 2 ~ 3 일동안 실온에서 교반하여 침출한 다음, 여과기로 여과하여 조추출물을 제조하고, 이 조추출물을 극성이 다른 용매인 n- 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용해 순차적으로 분획하여 분획물을 제조하는 것으로 구성된다.

또한, 본 발명은 상기의 패과식물 추출물이 유효성분으로 포함된 항당뇨용 조성물 및 항산화용 조성물을 제조하는 것으로 구성된다.

또한, 본 발명은 패과식물의 추출물로부터 분리한 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol)이 유효성분으로 포함된 항당뇨용 조성물 및 항산화용 조성물을 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명의 발명자들은 항당뇨 효과가 뛰어난 해조류에 대한 연구를 하던 중 갈조류에 속하는 패, 넓패 등의 패속 갈조류에서 항당뇨 활성이 우수하다는 사실을 알게되어 본 발명을 완성하게 되었다.

알파-글루코시다제(α-glucosidase)는 이당류를 단당류로 분해하는 효소로서, 소장점막에서 식후 혈당을 상승하는 작용을 하는 것으로 보고되어 있다.

따라서, 알파-글루코시다제 억제효과 실험을 통해 본 발명의 패과식물 추출물에 대하여 항당뇨 실험을 하였다.

그 결과, 본 발명의 실시예 1의 넓패추출물에 대한 α-glucosiase 억제효과 는 조추출물(IC₅₀; 0.1103 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 0.0815 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 0.0836 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC₅₀; 0.5182 ㎍/㎖)을 보여 매우 높은 억제효과를 보이고 있으며, 물분획물(IC₅₀; 3.7915 ㎍/㎖)을 보였다(표 5, 도 11A).

또한, 본 발명의 실시예 2의 패추출물에 대한 α-glucosiase 억제효과는 조추출물(IC₅₀; 0.8117 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 0.0480 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 0.0683 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC₅₀; 0.2921 ㎍/㎖)을 보여 매우 높은 억제효과를 보이고 있으며, 물분획물(IC₅₀; 8.5007 ㎍/㎖)을 보였다(표 5, 도 11B).

한편, 이미 상용화된 아카보스의 억제효과는 IC₅₀값이 242.08 ㎍/㎖으로써 본 발명의 패과식물 추출물이 아카보스의 α-glucosiase 억제효과에 비해 매우 탁월한 효과를 보이는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 패과식물 추출물이 항당뇨 효과가 월등히 뛰어나다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 패추출물과 이로부터 분리한 단일물질 Peak 1의 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol)와 Peak 2에 대한 α-글루코시다제 억제효과 실험 결과, P1은 IC₅₀; 0.63 ㎍/㎖, P2는 IC₅₀; 0.093 ㎍/㎖, 패조추출물은 IC₅₀; 0.812 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 분획물은 IC₅₀; 0.048 ㎍/㎖이며, 대조군 인 아카보스는 IC₅₀; 242.08 ㎍/㎖으로 나타났다(도 12).

따라서, 본 발명의 패과식물 추출물로부터 분리한 단일물질 또한 항당뇨 효과가 월등히 뛰어나다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 패과식물 추출물에 대하여 항산화 효과를 실험하였다.

먼저, DPPH 라디칼 소거활성 실험을 한 결과, 상용화된 아스코르빈산(IC₅₀; 8.23 ㎍)은 높은 활성라디칼 억제효과를 보였다.

본 발명의 넓패의 조추출물, 물분획, 헥산분획은 낮은 효과를 보였으나(IC₅₀; >400 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 111.09 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 178.17 ㎍/㎖)층은 조추출물보다 2 배 이상 활성산소억제 효과를 보였다(도 13A).

또한, 본 발명의 패의 조추출물은 활성산소 억제효과는 낮았으나, 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 40.44 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 74.21 ㎍/㎖)은 조추출물((IC₅₀; >400 ㎍/㎖)보다 높은 활성산소억제 효과를 보였다(도 13B).

또한, 단일물질인 Peak 1, Peak 2 분획물의 활성산소 억제효과는 Peak 1(IC₅₀; 100 ㎍/㎖), Peak 2(IC₅₀; 200 ㎍/㎖)로서, Peak 1이 다소 높게 나타났다(도 14).

또한, 본 발명의 패과식물 추출물에 대하여 NO 생성 저해활성 실험을 한 결 과, 표 5에서 보는 바와 같이 넓패의 조추출물과 물분획물(IC₅₀; 591.14)은 저해율이 매우 낮았으나, 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 82.59 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 147.08 ㎍/㎖)에서는 높은 억제효과를 보였다(도 15A).

또한, 본 발명의 패추출물은 도 15B에서 보는 바와 같이 헥산분획물(IC₅₀; >192.58 ㎍/㎖)을 제외한 모든 시료에서 낮은 저해효과를 보였다(IC₅₀; >300 ㎍/㎖).

또한, 단일물질인 Peak 1, Peak 2 분획물의 NO 소거활성 효과는 Peak 1, Peak 2 모두 IC₅₀; > 400 ㎍/㎖)로서, NO 소거력은 다소 낮게 나타났다(도 16).

또한, 본 발명의 패과식물 추출물에 대하여 잔틴산화효소 억제활성 실험을 한 결과, 본 발명의 넓패추출물에 대한 잔틴 산화효소 억제활성은 조추출물(IC₅₀; 20.63 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; <10.42 ㎍/㎖), 부탄올분획물(IC₅₀; 7.21 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC₅₀; 58.77 ㎍/㎖), 물분획물(IC₅₀: >314.97 ㎍/㎖)으로서, 에틸아세테이트층과 부탄올층에서 높은 활성을 보였다(도 17A).

본 발명의 패추출물에 대한 잔틴 산화효소 억제활성은 조추출물(IC₅₀; 187.47 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 0.71 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀;22.2 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC₅₀; 26.56 ㎍/㎖), 물분획물(IC₅₀: >400 ㎍/㎖)으로서 잔틴 산화효소 억제활성은 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물에서 높은 활성을 보였 다(도 17B).

또한, 본 발명의 패추출물로부터 분리한 단일물질인 P1. P2의 잔틴산화효소 억제활성효과는 P1(IC₅₀; 10 ㎍/㎖), P2(IC₅₀; 30 ㎍/㎖)로서 P1이 다소 높게 나타났다(도 18).

또한, 본 발명의 넓패추출물에 대한 과산화물 소거활성은 조추출물(IC₅₀ 37.7 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 19.95 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 37.91 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC50; 78.07 ㎍/㎖), 물분획물(IC50; 210.82 ㎍/㎖)으로서 에틸아세테이트 분획물에서 높은 효과를 보였다(도 19A).

본 발명의 패추출물에 대한 과산화물 소거활성은 조추출물(IC₅₀; 81.5 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 11.24 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 17.65 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC50; 70.80 ㎍/㎖), 물분획구(IC50; 114.95 ㎍/㎖)으로서 에틸아세테이트 분획물에서 높은 효과를 보였다(도 19B).

또한, 본 발명의 패추출물로부터 분리한 단일물질인 P1. P2 의 과산화물 소거활성효과는 P1( IC₅₀; 8 ㎍/㎖), P2 (IC₅₀; 35 ㎍/㎖)로서 P1이 다소 높게 나타났다(도 20).

따라서, 본 발명의 패과식물 추출물은 항산화 활성이 뛰어나다는 사실을 알 수 있었다.

한편, 본 발명의 패과식물 추출물에서 분리된 Peak 1을 LC-MS-MS를 이용하여 질량측정을 하고, 분석한 결과, 분자량이 512 임을 확인하였다(도 7).

또한, 핵자기공명(NMR)분석을 통해 ¹H-NMR, ¹³C-NMR 분석을 한 결과, 본 발명의 패과식물의 추출물 유래 단일물질 중 Peak 1에 대해 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다.

분자명은 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol)이며, 분자량이 512.383 이고, 분자식이 C₂₄H₁₆O₁₃이며, 조성비는 C 56.26 %; H 3.15 %; O 40.59 % 인 물질임을 확인하였다.

디플로르에토하이드록시카르마롤은 HIV-1 역전사효소 억제활성을 갖는 물질로 알려져 있다.

한편, 본 발명의 패과식물 추출물 및 이로부터 분리된 물질들은 식품첨가제, 음료조성물 등으로 다양하게 활용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 생리활성을 나타내는 패과식물 추출물 및 이로부터 분리된 물질들을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물 및 항산화용 조성물을 제조할 수 있다.

이때, 본 발명의 조성물은 환, 캡슐, 과립, 현탁액 등 다양한 형태로 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 패과식물 추출물 및 이로부터 분리된 단일물질이 유효성분 으로 포함된 조성물 제조시, 그 첨가량은 조성물의 용도 및 형태에 따라 다양하게 조절할 수 있다.

이하, 본 발명의 항당뇨 효과를 나타내는 패과식물 추출물에 대해 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 넓패추출물의 제조

제주도 동부연안 조간대에서 넓패를 채집한 후 자연건조하여 준비하였다.

준비한 패 500 g에 70 % 에탄올 5 ℓ를 넣고 실온에서 2 ~ 3 일간 침출하였다.

상기의 침출된 용액을 여과 후 감압 농축하였다.

상기의 농축액을 DEEP FREEZER에서 동결 후 동결건조기를 이용하여 잔여 용매를 제거하여 조추출물을 얻었다.

그 다음, 상기의 조추출물 50g을 증류수로 현탁하고, 분별 깔대기에서 비극성 용매부터 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하였다.

상기의 분획물을 여과, 감압 농축한 다음, 동결 건조하여 물분획물 29.7 g, 부탄올분획물 7.1 g, 에틸아세테이트 분획물 9.7g, 헥산분획물 3.5 g을 얻었다.

<실시예 2> 패추출물의 제조

본 발명의 실시예 1과 같은 방법으로 추출물을 제조하되, 패를 이용하여 패 추출물을 제조하였다.

상기의 조추출물 50 g을 증류수로 현탁하고, 분별 깔대기에서 비극성 용매부터 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하였다.

상기의 분획물을 여과, 감압 농축한 다음, 동결 건조하여 물분획물 14.5 g, 부탄올분획물 15.5 g, 에틸아세테이트 분획물 14 g, 헥산분획물 7.5 g을 얻었다.

<실시예 3> 패추출물 유래 단일물질의 분리

본 발명의 실시예 2에서 제조된 패의 에틸아세테이트 분획물을 준비하였다.

준비한 분획물을 HPLC용 메탄올에 용해한 후 0.45 μm 시료용 필터에 통과시킨 것을 안정화된 HPLC를 이용하여 분리하고자 하였다.

컬럼은 Nova-Pak silica 8 μm(7.8×300 mm)을 장착한 워터스사(Waters Co.) 모델 2695 얼라이언스(allience)를 사용하였고, 클로로포름과 메탄올을 95:5의 비율로 혼합, 탈기한 이동상 용매 2 ㎖/min의 유속으로 흐르게 하여 분석하였다.

워터스 2996 UV 검출기(UV Detecter)로 물질의 자외선 흡광패턴을 봤고 파장은 254 nm에서 측정하였다.

HPLC 기기조건을 표 1에 나타내었고, 이동상의 기울기 용리조건을 표 2에 나타내었다.

그 결과, Peak 1은 23.962 분대에서, Peak 2는 38.579 분대에서 나타났음을 확인하여(도 2), 이 물질들을 분리하였다.

<실험예 1> 패과식물 추출물로부터 분리한 단일물질에 대한 분석실험

1) HPLC 분석실험

실시예 2에서 제조된 조추출물과 각각의 분획물을 준비하였다.

또한, 실시예 3에서 분리된 단일물질 Peak 1과 Peak 2를 준비하였다.

준비한 시료를 Water사의 HPLC(Alliance2695)를 이용하였고, 용리액은 물(5 % 아세트산)과 아세토니트릴(5 % 아세트산)를 사용하여 기울기 용리법으로 분석하여 순도를 확인하였다.

이때, HPLC 기기조건을 표 3에 나타내었고, 이동상의 기울기 용리조건을 표 4에 나타내었다.

<표 3> 패과식물의 추출물 분석시 HPLC 장치 조건

HPLC	Waters Alliance 2695 system
컬럼(Column)	Sunfire^TM C18 5μm (4.6×250mm)
검출기(Detecter)	광다이오드 어레이(Photodiode Array) 검출기
유량(Flow rate)	1.0 ㎖/min
주입량(Injection Volume)	10 ㎕
컬럼온도(Column Temperature)	25 ℃
샘플온도(Sample Temperature)	10 ℃

<표 4> HPLC 기울기용리를 위한 이동상 조건

Program order	Time	Flow	H2O	Acetonitrile	Curve
1	0.00	1.00	95.0	5.0
2	5.00	1.00	95.0	5.0	6
3	10.00	1.00	90.0	10.0	6
4	30.00	1.00	80.0	20.0	6
5	40.00	1.00	80.0	20.0	6
6	50.00	1.00	70.0	30.0	6
7	60.00	1.00	70.0	30.0	6
8	70.00	1.00	50.0	50.0	6
9	80.00	1.00	50.0	50.0	6
10	81.00	1.00	0.0	100.0	6
11	90.00	1.00	0.0	100.0	6
12	91.00	1.00	95.0	5.0	6
13	100.00	1.00	95.0	5.0	6

2) 단일물질에 대한 구조분석 실험

분자량 확인을 위하여 순수 분리된 Peak 1을 HPLC용 메탄올에 용해하였다.

메탄올에 용해한 Peak 1을 0.2μm 시료용 필터에 통과시킨 후, 1 ㎎/㎖의 농도로 안정화 된 LC-MS-MS를 이용하여 질량측정을 하였다.

네가티브(Nagative)로 분석한 결과 512 분자량을 얻을 수 있었고, 그 결과를 도 7에 타나내었다(ESI-MS, m/z 511[M-H]).

또한, 핵자기공명(NMR)분석은 순수 정제 화합물 6 mg을 완전 건조하여 NMR용 DMSO(0.6mL)에 용해한 후 5mm NMR 튜브에 주입하고 지올 모델 기종(JMX-700)으로 FT-NMR을 이용하여 ¹H-NMR, ¹³C-NMR 분석을 실시하여 각각 도 8 및 도 9에 나타내었다.

상기의 결과로부터 얻은 본 발명의 패과식물 추출물 유래 단일물질 중 Peak 1은 다음과 같다.

분자명 : 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol)

분자식 : 7-(3,5-Dihydroxyphenoxy)-3-(2,4,6-trihydroxyphenoxy)dibenzo [b,e][1,4] dioxin-1,2,6,8-tetrol

9CI Chapman & Hall Number: CJY33-G

고유번호(CAS Registry Number) : 138529-04-1

Type of Compound Code(s): VG1000

분자식 : C₂₄H₁₆O₁₃

분자량 : 512.383

가속질량(Accurate Mass) : 512.059095

조성비 : C 56.26 %; H 3.15 %; O 40.59 %

또한, 본 발명의 패과식물 추출물로부터 분리한 단일물질인 Peak 1의 분자구조는 도 10과 같다.

<실시예 4> 넓패추출물을 이용한 환 제조

본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 넓패추출물을 동결건조한 후 분말로 준비하였다.

준비한 분말 1 ㎏에 물 200 g, 꿀 100 g을 넣고 반죽하여 환 제조장치에 넣어 환 모양으로 만든 후, 건조기에 넣고 30 ℃ 에서 12 시간 동안 건조하여 환을 제조하였다.

<실시예 4> 패추출물 유래의 물질을 이용한 캡슐 제조

본 발명의 실시예 3의 방법에 의해 패추출물로부터 분리된 Peak 1(디플로르에토하이드록시카르마롤)을 준비하였다.

준비한 물질을 이용해 통상적인 방법으로 캡슐로 제조하였다.

<실시예 5> 패추출물이 함유된 음료조성물의 제조

본 발명의 실시예 2의 방법에 의해 제조된 패추출물을 준비하였다.

정제수 1 ℓ 당 준비한 추출물 20 g, 비타민 B2 4 g, 비타민 B6 6 g, 니코틴산아미드 10 g, 구연산 30 g, 액상과당 2 ㎏, 허브향 70 ㎖ 를 첨가하여 본 발명의 패과식물의 추출물이 함유된 음료조성물을 제조하였다.

<실시예 6> 넓패추출물 유래의 물질이 함유된 음료조성물의 제조

본 발명의 실시예 1의 넓패추출물을 이용하여 실시예 3의 방법으로 분리된 Peak 1(디플로르에토하이드록시카르마롤)을 준비하였다.

정제수 1 ℓ 당 준비한 물질 10 g, 비타민 B2 4 g, 비타민 B6 6 g, 니코틴산아미드 10 g, 구연산 30 g, 액상과당 2 ㎏, 허브향 70 ㎖ 를 첨가하여 본 발명의 넓패추출물 유래의 물질이 함유된 음료조성물을 제조하였다.

<실시예 7> 넓패추출물이 함유된 식품첨가제의 제조

본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 넓패추출물을 동결건조 후 분말로 제조하였다.

통상적인 식품 제조시 상기의 분말을 2 중량% 첨가하여 사용하였다.

<실시예 8> 패추출물 유래의 물질이 함유된 식품첨가제의 제조

본 발명의 실시예 3의 방법에 의해 패추출물로부터 분리된 Peak 1(디플로르에토하이드록시카르마롤)를 준비하였다.

통상적인 식품 제조시 상기의 물질을 2 중량% 첨가하여 사용하였다.

<실험예 2> 본 발명의 패과식물의 추출물에 대한 항당뇨 효과 실험

억제효과는 0.1 M 인산버퍼(pH7.0)에 5 mM PNP(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)용액에 α-glucosidase(0.7U/ml)와 시료를 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨후 stop용액(1M glycine-NaOH, pH9.0)을 사용하여 중지시킨다.

흡광도는 405 nm에서 측정한 후 흡광도가 50 %이상 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

그 결과, 본 발명의 실시예 1의 넓패추출물에 대한 α-glucosiase 억제효과는 조추출물(IC₅₀; 0.1103 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 0.0815 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 0.0836 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC₅₀; 0.5182 ㎍/㎖)을 보여 매우 높은 억제효과를 보이고 있으며, 물분획물(IC₅₀; 3.7915 ㎍/㎖)을 보였다(표 5, 도 11A).

또한, 본 발명의 실시예 2의 패추출물에 대한 α-glucosiase 억제효과는 조추출물(IC₅₀; 0.8117 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 0.0480 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 0.0683 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC₅₀; 0.2921 ㎍/㎖)을 보여 매우 높은 억 제효과를 보이고 있으며, 물분획물(IC₅₀; 8.5007 ㎍/㎖)을 보였다(표 5, 도 11B).

<표 5> 패과식물 추출물에 대한 항당뇨 실험결과

구 분		α-glucosidase 억제효과(IC₅₀)
패추출물	조추출물	0.8117
	헥산분획물	0.2921
	에틸아세테이트 분획물	0.0480
	부탄올 분획물	0.0683
	물분획물	8.5007
넓패추출물	조추출물	0.1103
	헥산분획물	0.5182
	에틸아세테이트 분획물	0.0815
	부탄올 분획물	0.0836
	물분획물	3.7915
대조구(아카보스)		242.08

<실험예 3> 패추출물로부터 분리한 물질에 대한 항당뇨 효과 실험

본 발명의 실시예 2에서 제조된 패의 에틸아세테이트 분획물에서 분리한 물질인 Peak 1(디플로르에토하이드록시카르마롤)과 Peak 2를 준비하였다.

대조군으로 이미 상용화 되고 있는 아카보스(Acabose)를 준비하였다.

준비한 시료에 대하여 항당뇨 실험을 하여 아래 표 6에 나타내었다.

<표 6> 패추출물 및 이로부터 분리한 단일물질에 대한 항당뇨 활성 실험결과

구 분	IC₅₀(㎍/㎖)
패조추출물	0.812
에틸아세테이트 분획물	0.048
Peak 1	0.063
Peak 2	0.934
아카보스	242.08

상기의 표 6에서 보는 바와 같이 Peak 1은 IC₅₀; 0.63 ㎍/㎖, Peak 2는 IC₅₀; 0.093 ㎍/㎖, 패조추출물은 IC₅₀; 0.812 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 분획물은 IC₅₀; 0.048 ㎍/㎖, 대조군의 아카보스는 IC₅₀; 242.08 ㎍/㎖으로 나타났다(도 12).

따라서, 본 발명의 패과식물 추출물로부터 분리한 단일물질 또한 항당뇨 활성이 월등히 뛰어나다는 사실을 알 수 있었다.

<실험예 4> 본 발명의 패과식물 추출물에 대한 항산화 실험

1. DPPH 라디칼 소거활성 실험

본 발명의 실시예 1 및 2의 방법으로 제조한 패과식물 추출물의 조추출물 및 분획물을 준비하였다.

또한, 실시예 2에서 제조된 패의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 단일물질 Peak 1 과 Peak 2을 준비하였다.

전자공여능(electron donating ability)측정은 Blosis방법에 의한 DPPH 자유라디칼 소거법에 따라 측정하였다.

먼저 메탄올에 녹인 다양한 농도의 시료를 각각 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고 0.4 mM DPPH용액을 동량으로 첨가하여 실온에서 10 분동안 반응시킨 후 517 ㎚에서 측정하였다.

이때, 대조군으로는 아스코르빈산, 트롤록스를 사용하였다.

DPPH 라디칼 소거활성은 아래의 식으로부터 산출하였으며, DPPH의 흡광도가 50 % 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

DPPH radical 소거활성(%)= (A _control-A_sample)/A_control ×100

A_sample = 시료를 첨가한 반응액의 흡광도

A_control = 시료대신 메탄올을 첨가한 반응액 흡광도

그 결과, 상용화된 아스코르빈산(IC₅₀; 8.23 ㎍)은 높은 활성라디칼 억제효과를 보였다.

본 발명의 넓패의 조추출물, 물분획, 핵산분획은 낮은 효과를 보였으나(IC₅₀; >400 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 111.09 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 178.17 ㎍/㎖)층은 조추출물보다 2 배 이상 활성산소억제 효과를 보였다(도 13A).

2. 질소화합물 소거활성 측정실험

자연적으로 질소화합물(nitric oxide)를 생성하는 물질인 sodium nitroprusside(SNP)를 사용하여 시료의 질소화합물(NO)소거 활성을 분석하였다.

10 mM SNP용액에 200 ㎕에 시료를 농도별로 첨가하고 25 ℃에서 3 시간 동안 반응시킨후 동량의 Griess reagent(2.5% phophoric acid, 1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylendiamine)를 첨가하여 실온에서 10 분간 반응하여 540 nm의 흡광도를 측정하였다.

NO 소거활성은 흡광도가 50 %감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC₅₀)로 표시하였다.

그 결과, 표 7에서 보는 바와 같이 넓패의 조추출물과 물분획물(IC₅₀; 591.14)은 저해율이 매우 낮았으나, 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 82.59 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 147.08 ㎍/㎖)에서는 높은 억제효과를 보였다(도 15A).

(3) 잔틴 산화효소 억제 및 과산화물 소거활성 측정실험

xantihine/xanthine oxidase에 의한 요산 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였다.

superoxide의 양은 니트로블루 테트라졸리움(NBT) 환원방법에 의해 측정하였다.

반응액(0.5 mM 잔틴, 200 mM 인산버퍼(pH7.5) 1 mM EDTA)에 50 mU/ml 잔틴산화효소(xanthine oxidase)를 첨가하여 요산생성을 유도하였다.

과산화물(superoxide) 소거활성은 위 반응액에 0.5 mM NBT를 첨가하여 반응하였다.

잔틴 산화효소 억제 및 과산화물 소거활성은 각각 생성된 요산과 과산화물의 흡광도가 50 %이상 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

그 결과, 본 발명의 넓패추출물에 대한 잔틴 산화효소 억제활성은 조추출물(IC₅₀; 20.63 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; <10.42 ㎍/㎖), 부탄올분획물(IC₅₀; 7.21 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC₅₀; 58.77 ㎍/㎖), 물분획물(IC₅₀: >314.97 ㎍/㎖)으로서, 에틸아세테이트층과 부탄올층에서 높은 활성을 보였다(도 17A).

본 발명의 패추출물에 대한 잔틴 산화효소 억제활성은 조추출물(IC₅₀; 187.47 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 0.71 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀;22.2 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC₅₀; 26.56 ㎍/㎖), 물분획물(IC₅₀: >400 ㎍/㎖)으로서 잔틴 산화효소 억제활성은 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물에서 높은 활성을 보였다(도 17B).

또한, 본 발명의 패추출물로부터 분리한 단일물질인 P1. P2의 잔틴산화효소 억제활성효과는 P1( IC₅₀; 10 ㎍/㎖), P2 (IC₅₀; 30 ㎍/㎖)로서 P1이 다소 높게 나타났다(도 18).

또한, 본 발명의 넓패추출물에 대한 과산화물 소거활성은 조추출물(IC₅₀ 37.7 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 19.95 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 37.91 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC50; 78.07 ㎍/㎖), 물분획물(IC50; 210.82 ㎍/㎖)으로서 에틸아세테이트층에서 높은 효과를 보였다(도 19A).

본 발명의 패추출물에 대한 과산화물 소거활성은 조추출물(IC₅₀; 81.5 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC₅₀; 11.24 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC₅₀; 17.65 ㎍/㎖), 헥산분획물(IC50; 70.80 ㎍/㎖), 물분획구(IC50; 114.95 ㎍/㎖)으로서 에틸아세테이트층에서 높은 효과를 보였다(도 19B).

또한, 본 발명의 패추출물로부터 분리한 단일물질인 P1. P2 의 과산화물 소 거활성효과는 P1( IC₅₀; 8 ㎍/㎖), P2 (IC₅₀; 35 ㎍/㎖)로서 P1이 다소 높게 나타났다(도 20).

<표 7> 패과식물 추출물에 대한 항산화 실험 결과

구 분		DPPH (IC₅₀)	NO (IC₅₀)	잔틴산화효소 (IC₅₀)	과산화물 (IC₅₀)
패추출물	조추출물	-	924.58	187.47	81.5
	헥산분획물	217.74	192.58	26.56	70.8
	에틸아세테이트 분획물	40.44	343.03	0.71	11.24
	부탄올 분획물	74.21	-	22.2	17.65
	물분획물	-	-	531.45	114.95
넓패추출물	조추출물	-	591.14	20.63	37.7
	헥산분획물	-	240.09	58.77	78.07
	에틸아세테이트 분획물	111.09	82.59	10.42	19.95
	부탄올 분획물	178.17	147.08	7.21	37.91
	물분획물	-	-	314.97	210.82
대조구		Asco 8.23	Qucertin 380.56	Allo 0.24	Allo 0.028

본 발명에 의해 항당뇨 활성이 우수한 패과식물 추출물 및 이로부터 분리한 물질이 제공된다.

또한, 본 발명의 패과식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 및 항산화용 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 항당뇨 및 항산화 활성이 우수한 패과식물 추출물이 첨가된 음료조성물, 식품첨가제가 제공된다.

Claims

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패과식물 추출물로부터 분리되며, 알파-글루코시다제(α-glucosidase) 억제활성을 나타내는 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlor-ethohydroxycarmalol)을 유효성분으로 함유하는 항당뇨용 조성물.
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