KR101715996B1 - 톳 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 활성 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 톳(Hizikia fusiformis) 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 또는 개선용 건강식품 조성물 및 약학조성물과 톳을 에탄올로 추출한 추출물을 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트로 분획하여 제조하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 활성이 증진된 톳 분획물의 제조방법에 관한 것이다.

Description

톳 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 활성 조성물{Composition for antidiabetic activity comprising dichloromethane or ethyl acetate fraction of Hizikia fusiformis extract as effective component}

본 발명은 톳(Hizikia fusiformis) 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 또는 개선용 건강식품 조성물 및 약학조성물과 톳을 에탄올로 추출한 추출물을 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트로 분획하여 제조하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 활성이 증진된 톳 분획물의 제조방법에 관한 것이다.

지난 30년간 급격한 경제발전을 이룩한 우리나라는 생활수준의 향상과 더불어 식습관 및 생활양식이 서구화되어 당뇨병, 고혈압, 비만, 고지혈증 등의 만성 질환의 발병률이 증가하였고, 이로 인해 만성 질환의 예방과 치료에 대한 국민들의 관심이 증가하고 있다. 이 중에서도 당뇨병은 2010년에 조사된 한국인의 사망 원인 중 5위로 밝혀졌고, 2012년 대한 당뇨병학회에서는 한국인 성인 10명 중 1명은 현재 당뇨병 상태이고, 10명 중 2명은 잠재적 당뇨병 단계로서, 합산하면 한국인 성인 10명 중 3명이 고혈당의 위협에 노출되어있다는 분석을 하였다. 또한 당뇨병의 발병이 지금과 같은 추세라면, 2050년의 예상 당뇨병 환자는 현재 대비 약 2배 수준인 591만 명으로 증가할 것이라고 밝혀, 당뇨병의 예방과 치료는 국민 보건상 큰 관심거리가 아닐 수 없다.

제2형 당뇨병 증상 중의 하나인 인슐린 저항성에 관련된 효소 중에는 PTP1B(protein tyrosine phosphatase 1B)가 있다. PTP1B는 단백질의 인산화된 티로신 잔기로부터 인산기를 제거하는 PTPs(protein tyrosine phosphatases)이다. PTP에는 PTP-α, LAR(leukocyte antigen-related tyrosine phosphatase), SHP2(SH2-domaincontaining phosphotyrosine phosphatase) 등이 있는데, 이것들은 세포 내 신호와 신진대사에 있어 중요한 역할을 하고, 또한 인슐린 신호전달 조절에 관련된다. 주요한 PTP인 PTP1B는, 간, 근육, 지방 세포 등과 같은 전형적으로 인슐린이 작용하는 조직 내의 소포체의 세포질의 표면에서, 인슐린의 세포 내 신호전달을 차단하여 인슐린 저항성을 유발한다. 세포막 내 인슐린 수용체(insulin receptor, IR)의 α-서브유닛에 인슐린이 결합하면 β-서브유닛의 세포 내 영역에 있는 티로신 포스파타아제(tyrosine phosphatase)가 활성화되고, IR에 있는 티로신 잔기의 인산화가 일어난다. 동시에 인슐린 수용체 물질(IR substrates, IRS)도 인산화 되어지면서 세포 내로 글루코스 수송과 글리코겐 합성 등을 야기하는 신호전달체계를 활성화시킨다. 다량의 PTP1B가 IR에 작용하게 되면, PTP1B는 IR와 IRS 단백질을 탈 인산화하여, IR의 신호전달을 저해하고, 결과적으로 인슐린 저항성을 높여 체내로 당이 흡수되지 못하고 혈중 당 함량이 증가하게 된다. 그러므로 PTP1B의 활성억제는 제 2 당뇨병의 치료를 위해 이용될 수 있다.

포유류의 α-글루코시다아제는 소장 점막 융모 내에 존재하는 소화효소로서, 체내에 들어온 올리고당류, 다당류 형태의 탄수화물의 단당류로의 가수분해를 촉진하여, 당이 체내로 흡수되도록 한다. α-글루코시다아제의 작용이 증가하여 분해된 포도당이 증가하게 되면, 혈당 수치가 높아져 고 혈당 상태가 야기된다. α-글루코시다아제 억제제는 소장 내에서 탄수화물의 소화를 지연시켜, 식후의 혈당 수치의 증가를 약화시키고, 고혈당으로 인한 인슐린 분비를 지연시키는데 효과적이다. 상업적으로 이용 가능한 α-글루코시다아제 억제제로는 아카보스(acarbose), 미글리톨(miglitol), 보글리보스(voglibose) 등이 있으며 이들은 제2형 당뇨병을 치료하는데 사용되고 있다.

모자반과에 속하는 해조류 톳(Hizikia fusiformis)은 한국, 일본, 중국 등의 북서 태평양 해변에 널리 분포하여 수세기 동안 건강식품으로서 사용되어 왔다. 특히 한국에서는 주로 서해안과 남해안 그리고 제주도에서 발견되며 특색 있는 향과 높은 함량의 칼슘, 비타민 A, 무기염, 요오드와 식이섬유질을 함유하고 있어 당뇨병, 고혈압, 결장암, 변비, 갑상선 암, 각기병, 죽상 동맥경화증과 폐경 후의 골다공증과 같은 여러 가지 질병에 효능을 나타낸다고 하며, 항산화, 항 미생물, 항암, 항돌연변이, 항응고와 지질대사 개선과 같은 다양한 생리활성을 나타낸다고 알려져 있다. 톳에서 분리한 라미나란(laminaran), 후코이단(fucoidan)과 푸코잔틴(fucoxanthin)은 면역기능 개선 작용, 항응고작용과 유리기 소거 작용 등이 알려져 있다.

한국등록특허 제1246689호에는 식물혼합추출물을 함유하는 항당뇨용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2005-0071459호에는 인삼잎 알코올 추출물을 함유하는 항당뇨 기능성 식품이 개시되어 있으나, 본 발명의 톳 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 활성 조성물과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 PTP1B(Protein tyrosine phosphatase 1B) 억제능 및 α-글루코시다아제 억제능이 우수하여 항당뇨 활성이 우수한 톳 추출물을 제조하기 위해, 톳 추출물의 제조조건 및 분획조건을 최적화하여, 항당뇨 활성이 증진된 톳 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 톳(Hizikia fusiformis) 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 톳(Hizikia fusiformis) 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 톳을 에탄올로 추출한 추출물을 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트로 분획하여 제조하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 활성이 증진된 톳 분획물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 항당뇨 활성이 증진된 톳 분획물을 제공한다.

본 발명의 톳 추출물의 디클로로메탄 분획물 또는 에틸 아세테이트 분획물은 항당뇨 활성이 우수하여, 상기 분획물을 이용하여 제조된 식품 및 약학 조성물은 혈당을 조절할 수 있는 우수한 보조제의 역할을 할 뿐만 아니라, 천연 물질로만 이루어져 부작용없이 상시 섭취할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 톳 추출물 및 이의 분획물의 농도별 ONOO^- 유도 티로신 니트로화(tyrosine nitration) 억제 활성을 비교한 것이다.
(a) 70% 에탄올 추출물, (b) 디클로로메탄 분획물, (c) 에틸 아세테이트 분획물, (d) n-부탄올 분획물, (e) 물 분획물

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톳(Hizikia fusiformis) 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 당뇨 예방 또는 개선용 건강식품 조성물에서, 상기 톳 추출물은 톳 에탄올 추출물일 수 있는데, 구체적으로는 톳에 65~75%(v/v) 에탄올을 첨가한 후 2~4시간씩 2~4회 추출한 후 35~45℃에서 진공 농축하여 제조된 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 첨가한 후 3시간 동안 3회 추출한 후 40℃에서 진공 농축하여 제조된 추출물일 수 있다.

상기 건강식품 조성물은 당뇨를 예방 및 개선시키기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 분획물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 분획물 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 분획물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 냉면육수, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 분획물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g이다.

상기 외에 본 발명의 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 분획물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 분획물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 또한, 톳(Hizikia fusiformis) 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 분획물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 분획물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 분획물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 분획물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 분획물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 분획물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 분획물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 또한, 톳을 에탄올로 추출한 추출물을 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트로 분획하여 제조하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 활성이 증진된 톳 분획물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 항당뇨 활성이 증진된 톳 분획물의 제조방법은 보다 구체적으로는, 톳에 65~75%(v/v) 에탄올을 첨가한 후 2~4시간씩 2~4회 추출한 후 35~45℃에서 진공 농축하여 제조된 추출물을 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트로 분획하여 제조할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 톳에 70%(v/v) 에탄올을 첨가한 후 3시간 동안 3회 추출한 후 40℃에서 진공 농축하여 제조된 추출물을 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트로 분획하여 제조할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 항당뇨 활성이 증진된 톳 분획물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험재료 및 방법

1. 재료

본 실험에서 사용한 톳(Hizikia fusiformis)은 전라남도 완도에서 수확한 것을 2012년 1월에 부산 원진상사로부터 구입하여 사용하였으며 그 표본은 부경대학교 식품영양학과에 보관하였다.

2. 톳의 추출과 분획

동결 건조한 톳 300 g을 70% 에탄올로 3시간씩 3회 환류냉각 장치를 사용하여 추출하고 40℃에서 진공 농축하여 추출물 50 g을 획득하였다. 이 추출물을 증류수에 현탁하여 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸 아세테이트(EtOAc), 그리고 n-부탄올(n-BuOH)의 순으로 순차적으로 분획하여 디클로로메탄(4.0 g), 에틸 아세테이트(0.4 g), n-부탄올(2.5 g) 분획물과 최종 남은 물 분획물(40.0 g)을 획득하였다.

3. 시약 및 기기

3-1. 시약

컬럼 포장재는 Kieselgel 60(Si gel, 70~230 mesh ASTM, Merck, Art. 7734), Sephadex LH-20(bead size 25~100 ㎛, Sigma, St. Louis, MO, USA), RP-18(LiChroprep RP-18, 40~63 ㎛, Merck, Germany), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography)는 Kieselgel 60 F₂₅₄ plates(20 ＞ 20 cm, 0.25 mm, precoated, Merck, Art. 5715)와 RP-18 F_254s plates(5 ＞ 10 cm, Merck, Art. 5685)를 사용하였다. 발색시약은 50% H₂SO₄을 사용하였으며 추출 및 컬럼 크로마토그래피에는 1급 시약을 사용하였다. NMR 측정에 사용된 용매는 dimethyl sulfoxide(DMSO)-d ₆ (Cambridge Isotope Laboratories, deuterium degree 99.9%)이다.

효모(yeast), α-글루코시다아제(α-glucosidase), 아카보스(acarbose), pNPP(p-nitrophenyl phosphate), pNPG(p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside), EDTA(ethylene diamine tetra acetic acid), BSA(bovine serum albumin), 아미노구아니딘(aminoguanidine), 프락토스(D-(-)-fructose), 글루코스(D-(+)-glucose), NADPH(β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 케르세틴(quercetin), DL-글리세르알데히드 이합체(DL-glyceraldehyde dimer), DMSO(dimethyl sulfoxide)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. PTP1B(Protein tyrosine phosphatase 1B, human recombinant)는 Biomol International LP(Plymouth Meeting, PA, USA)에서, DTT(dithiothreitol)는 Bio-Rad Laboratories(Hercules, CA, USA)에서 구입하였고, 아지드화 나트륨(sodium azide)은 Junsei Chemical Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하였다.

3-2. 기기

¹H-NMR과 ¹³C-NMR은 JEOL JNM-ECP 400 분광계(¹H-NMR 400 MHz and ¹³C-NMR 100 MHz, JEOL, Japan)로 측정하였으며, TLC상의 화합물 검색을 위해 장파장(365 nm)과 단파장(245 nm) 겸용 UV 램프(Model ENF-240C, Spectroline, USA)를 사용하였다. PTP1B(Protein tyrosine phosphatase 1B) 억제활성, α-글루코시다아제 억제활성 측정은 마이크로플레이트 리더 분광광도계(Molecular Devices, VERSA max, CA, USA)로 하였으며, AGE 형성 억제활성의 형광도 측정은 마이크로플레이트 형광발광 리더 FLx 800(Bio-Tek instruments, Inc., Winooski, USA)로 하였고, AR 억제활성에서의 흡광도는 UV/가시 분광광도계(Ultraspec 2100 pro, Amersham Biosciences, USA)로 측정하였다.

4. 실험방법

4-1. 항당뇨 실험

4-1-1. PTP1B ( Protein tyrosine phosphatase 1B) 억제활성 실험

PTP1B(Protein tyrosine phosphatase 1B)의 억제 활성을 평가하는 방법은 Na et al.의 방법을 변형하여 실험하였다. PTP1B(human, recombinant) 효소는 BIOMOL International LP로부터 구입하였다. 효소의 활성은 pNPP(p-nitrophenyl phosphate)를 기질로서 사용하여 측정하였다. 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 반응 혼합물의 총 부피를 100 ㎕로 하였다. 먼저 여러 농도의 샘플 10 ㎕와 효소 10 ㎕, 그리고 PTP1B 버퍼[50 mM citrate buffer (pH 6.0), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT] 30 ㎕를 넣어 35℃에서 5~10분간 전배양을 시켰다. 그리고 기질(pNPP) 50 ㎕를 첨가하여 35℃에서 20분간 배양시킨 후 10 M NaOH를 10 ㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. 이후 마이크로플레이트 리더 분광광도계(Molecular Devices, VERSA max, CA, USA)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며 양성 대조구로 우르솔릭산(ursolic acid)을 사용하였다. PTP1B 억제 활성은 아래의 식을 이용하여 구한 후, IC₅₀ 값으로 환산하였다.

PTP1B 억제활성(%) = {1-(A_Sam - A_{Sam -C}) / A_Cont} × 100

A_Sam: 측정시료를 넣었을 때의 흡광도

A_{Sam -C}: 측정시료를 넣고 pNPP를 넣지 않았을 때의 흡광도

A_Cont: 측정시료를 넣지 않았을 때의 흡광도

4-1-2. α- 글루코시다아제 (α- glucosidase ) 억제활성 실험

α-글루코시다아제 효소의 억제활성을 측정하기 위해서 Li et al의 방법을 수정하여 실시하였다. 각각의 웰에 100 mM 인산 버퍼(pH 6.8) 20 ㎕와 10% DMSO에 녹인 여러 농도의 샘플 20 ㎕를 넣었다. 그리고 기질로 사용된 100 mM 인산완충액(pH 6.8)에 녹인 2.5 mM pNPG 20 ㎕를 넣은 후, 효소인 0.2 unit/mL α-글루코시다아제를 10 mM 인산완충액(pH 6.8)에 녹여 20 ㎕를 넣었다. 37℃에서 15분 동안 배양시킨 후 반응을 종결시키기 위해 0.2 M 탄산나트륨 용액 80 ㎕를 넣었다. 이후 405 nm에서 마이크로플레이트 리더 분광광도계(Molecular Devices, VERSA max, CA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며 아카보스(acarbose)를 양성 대조구로 사용하였다. α-글루코시다아제 억제활성은 아래의 식을 이용하여 억제율을 구한 후, IC₅₀ 값으로 환산하였다.

α-글루코시다아제 억제활성(%) = {1-(A_Sam -A_{Sam -C}) / A_Cont} × 100

A_Sam: 측정시료를 넣었을 때의 흡광도

A_{Sam -C}: 측정시료를 넣고 pNPG를 넣지 않았을 때의 흡광도

A_Cont: 측정시료를 넣지 않았을 때의 흡광도

4-2. ONOO ^- 에 의한 티로신 니트로화 ( tyrosine nitration ) 억제 활성

3-니트로티로신의 형성을 억제하는 능력은 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 평가하였다. 10 % DMSO에 녹인 시료 2.5 ㎕를 BSA(0.5 mg of protein/ml) 95 ㎕와 상온에서 10분간 배양한 뒤, 2.5 ㎕의 ONOO^-(200 μM)를 첨가하여 상온에서 10분간 배양하였다. 준비된 시료 용액을 겔 버퍼(Bio-Rad)와 혼합하고 5분간 가열하여 단백질을 변성시킨 후 동량의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기 영동시켰다. 전기 영동이 끝나면 wet transfer system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 PVDF 멤브레인으로 옮기고, 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위해서 멤브레인을 블로킹 용액(blocking solution, TBST 버퍼에 5% 탈지분유 첨가)으로 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 그 후 멤브레인에 3-니트로티로신에 대한 항체(1:2500 in TBST buffer with 5 % 탈지 분유)를 4℃에서 밤새 반응시켰다. 3-니트로티로신의 발현 양은 HRP가 부착되어 있는 항-마우스 IgG(1:2000 in TBST buffer)로 실온에서 1시간 반응 후 Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 X-레이 필름(Kodak, Rochester, NY, USA)에 노출시켜 확인하였다. 분자량은 full-range rainbow molecular weight markers(Amersham)을 이용하여 확인하였다.

실시예 1: 톳 추출물 및 이의 분획물의 항당뇨 효과

톳 70% 에탄올 추출물의 PTP1B 억제활성은 32.07±0.96 ㎍/ml의 IC₅₀ 값을 나타내었고, 대조군인 우르솔릭산은 4.28±0.13 ㎍/ml의 IC₅₀ 값을 나타내었다. 톳 추출물로부터 용매 분획한 디클로로메탄과 에틸 아세테이트 분획물의 경우에서는 각각 1.69±0.05와 8.02±0.64 ㎍/ml의 IC₅₀ 값을 나타낸 반면, 부탄올과 물 분획물에서는 200 ㎍/ml 농도에서도 활성을 나타내지 않았다(표 1).

톳 추출물 및 이의 분획물의 PTP1B 억제활성

샘플	PTP1B 억제활성(IC50)
70% 에탄올 추출물	32.07±0.96
디클로로메탄 분획물	1.69±0.05
에틸 아세테이트 분획물	8.02±0.64
n-부탄올 분획물	> 200
물 분획물	> 200
우르솔릭산	4.28±0.13

톳 70% 에탄올 추출물의 α-글루코시다아제 억제활성은 420.8±12.8 ㎍/ml의 IC₅₀ 값을 나타내었고, 대조군인 아카보스(acarbose)는 236.9±7.1 ㎍/ml의 IC₅₀ 값을 나타내었다. 톳 추출물로부터 용매 분획한 디클로로메탄과 에틸 아세테이트 분획물의 경우에서는 각각 39.9±3.8 및 61.11±4.5 ㎍/ml의 IC₅₀ 값을 나타낸 반면, 부탄올과 물 분획물에서는 250 ㎍/ml 농도에도 활성을 나타내지 않았다(표 2).

톳 추출물 및 이의 분획물의 α-글루코시다아제 억제활성

샘플	α-글루코시다아제 억제활성(IC50)
70% 에탄올 추출물	420.8±12.8
디클로로메탄 분획물	39.9±3.8
에틸 아세테이트 분획물	61.11±4.5
n-부탄올 분획물	> 250
물 분획물	> 250
아카보스	236.9±7.1

이상과 같은 결과는 톳의 추출물과 그 분획물들의 인슐린 신호전달에서 부정적 조절의 억제를 통한 제 2 당뇨병의 치료는 α-글루코시다아제와 PTP1B 억제에 관련한 것임을 나타내었다.

PTP1B는 인슐린 감수성이 높은 간, 근육, 지방 세포 등과 같은 전형적으로 인슐린이 작용하는 조직 내의 소포체의 세포질의 표면에서, 인슐린의 세포 내 신호전달을 차단하여 인슐린 저항성을 유발한다. 이에 따라 PTP1B를 억제하는 것은 인슐린 저항성을 완화함으로써 제2형 당뇨병을 치료하는 약물로 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 식후 혈당조절에 관여하는 효소인 α-글루코시다아제는 올리고당류, 다당류 형태의 탄수화물을 단당류 형태로 가수분해하여, 당이 체내에 흡수되도록 한다. 이에 따라 α-글루코시다아제를 억제하는 것은 탄수화물의 소화를 지연시켜, 식후 혈당 수치를 감소시키고, 고혈당으로 인한 인슐린 분비를 지연시킬 수 있다.

즉, 톳은 PTP1B의 활성과 α-글루코시다아제를 억제함으로써, 이에 따라 인슐린이 작용하는 조직 내에서 인슐린의 세포 내 신호전달차단을 완화하고, 인슐린 저항성을 완화함에 따라 제2형 당뇨병을 예방하고 치료하는 것으로 생각된다.

실시예 2: 톳 추출물 및 이의 분획물의 ONOO ^- 유도 티로신 니트로화( tyrosine nitration ) 억제 활성

톳 추출물과 분획물들의 ONOO^- 티로신 니트로화에 대한 억제효과를 알아보기 위하여, 3-니트로티로신 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 하였다. 톳의 70% 에탄올 추출물과 용매 분획물들의 억제효과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 (a)에서 보는 바와 같이, 200에서 1600 ㎍/ml 농도로 70% 에탄올 추출물을 전처리하면 용량의존적으로 ONOO^- 유도 티로신 니트로화를 억제하였다. 추출물과 분획물들의 활성을 비교하기 위하여 50 ㎍/ml 농도에서 검토하였다. 50 ㎍/ml 농도에서 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 부탄올 분획물은 유의적으로 티로신의 니트로화를 억제하였으나 70% 에탄올 추출물과 물 분획물은 같은 농도에서 티로신의 니트로화를 억제하지 못하였다. 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 부탄올 분획물은 각각 12.5~100 ㎍/ml, 3.125~25 ㎍/ml와 6.25~50 ㎍/ml의 농도 범위에서 농도 의존적으로 티로신의 니트로화를 억제하였다. 이들 분획물 중에서 에틸 아세테이트 분획물이 아주 낮은 농도에서도 티로신의 니트로화를 유의적으로 억제하였으며 25 ㎍/ml 농도에서는 거의 검출할 수가 없었다. 반면에 물 분획물은 400 ㎍/ml 이상의 농도를 처리하여도 억제 효과가 없었다.

활성산소종(ROS)과 유리기들은 생체 조직 내에 들어있는 항산화성 물질들에 의하여 감소한다. 반응성이 큰 산화제인 과산화아질산염(ONOO^-)은 병적인 상태에서 초과산화물 음이온기(·O₂)와 일산화질소(NO)의 신속한 반응으로 만들어진다. ONOO^-는 지질막을 산화시키서 세포사를 가져오고 조직이 손상된다. 뿐만 아니라 고농도의 ONOO^-는 티로신 잔기를 니트로화시켜 단백질의 활성을 잃게 한다. 면역학적인 연구 결과에 의하면 단백질 티로신 니트로화는 세포신호 경로에 관한 여러 가지 기능에 관여하고 단백질 구조를 변경하기도 한다. 뿐만 아니라 당뇨병 쥐의 췌장 손상에 니트로티로신이 관여한다. 이러한 사실들은 산화적 스트레스가 당뇨병과 관련한 여러가지 질병들의 개시와 진행에 관여한다고 여겨진다.

Claims (7)

1. 톳에 65~75%(v/v) 에탄올을 첨가하여 2~4시간씩 2~4회 추출한 후, 35~45℃에서 진공 농축한 톳 추출물을 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트로 분획하여 제조된 톳(Hizikia fusiformis) 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
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