KR101440684B1 - 클로렐라 유래 항산화 활성을 갖는 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항산화 활성을 갖는 펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)에서 유래된 Leu-Asn-Gly-Asp-Val-Trp으로 구성된 기능성 펩티드에 관한 것이다. 본 발명인 항산화 활성을 갖는 펩티드는 세포 내 활성 산소종을 소거할 수 있는 항산화 효과를 나태낼 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 산화적 스트레스 관련 질환에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

클로렐라 유래 항산화 활성을 갖는 펩티드{Novel antioxidative peptide purified from a marine Chlorella ellipsoidea.}
본 발명은 항산화 활성을 갖는 클로렐라 유래 기능성 펩티드에 관한 것이다.
우리 몸은 음식물을 섭취하고 이를 분해하여 에너지를 발생시킨다. 그러나 이러한 신진대사 과정에서 활성산소가 발생하고 이러한 활성산소는 세포를 공격하여 세포에 손상을 준다. 활성산소에 의한 세포손상은 암, 자가면역 질환, 간질환, 신경퇴행성 질환, 관상동맥 질환(coronary artery disease, CAD) 또는 심혈관 질환, 노화 등과 매우 밀접한 관련이 있다고 보고되고 있고, 따라서 항산화 기능을 갖는 다양한 물질에 대한 연구가 활발한 실정이다.
항산화(antioxidation)란 체내에서 일어나는 여러 산화작용을 방지하는 것을 말하며, 생체막이나 지단백질로서 존재하는 지질은 체내에서 발생하는 자유 라디칼(free radical)의 공격을 받아 여러 종류의 과산화물을 형성하는데, 과산화물들과 분해산물 등은 반응성이 높아 주변의 생체분자들의 구조와 기능을 변화시켜 이를 적절히 제거하지 않으며 노화 현상 및 여러 가지 만성질환을 초래한다. 생체 내에는 이러한 자유 라디칼(free radical)을 중화시키고 몸을 보호할 수 있는 여러 가지 항산화 방어기구가 있다.
인간의 질병 및 노화는 체내 대사과정 중 발생하는 O2 -(superoxide), NO(nitric oxide), NO2(nitrogen dioxide), OH(hydroxyl), ROO(proxyl), RO(alkoxyl), HO2(hydroperoxyl) 라디칼(radical) 등의 산화반응에 기인하다. 따라서, 생체 내에서는 이런 유해한 라디칼인 유리기로부터 생체를 방어하기 위한 수단을 보유하고 있다. 대표적으로, 간과 적혈구에 존재하는 항산화 효소인 슈퍼옥시드 디스무타제(SOD, superoxide dismutase)는 슈퍼옥시드 라디칼(superoxide radical)을 환원시켜 H2O2로 전환시키고, 이때 생성된 H2O2는 카탈라제(CAT; catalase), 글루타치온 퍼옥시다제(GSH-px; glutathione-peroxidase) 등의 항산화 효소나 비타민 E, 글루타치온 등의 항산화 물질이 유리기를 제거함으로써 생체를 산화적 손상으로부터 보호한다. 그러나 이러한 항산화 방어 체계가 유리기 생성을 조절할 수 없을 정도로 저하된 경우, 산화적 스트레스로 인한 조직의 손상이 촉진되며 체내에서 생성된 과잉의 유리기와 지질 과산화물은 단백질의 산화, DNA 손상을 야기시켜 다양한 질병과 노화의 원인이 된다.
이러한 산화적 스트레스의 감소를 위해 많은 합성 또는 천연 항산화 물질이 개발되어 왔다. 합성 항산화제로는 BHA(butylated hydroxyanisol), BHT(butylated hydroxyltoluene), TBHQ(tert-butylhydroquinone)가 인체에서 항산화제로 효과가 있다고 보고되었으나, 이러한 합성 항산화제는 암을 유발하거나 간을 손상시키는 등 다양한 부작용을 야기시키는 문제점이 있었다.
최근에는 각종 생약과 식용식물 추출물 등에 존재하는 항산화제 물질인 카로티노이드류, 플라보노이드류, 폴리페놀 물질들을 이용하여 보다 안전하며 항산화 효과가 뛰어난 천연 항산화제를 개발하기 위하여 노력 중이다.
이러한 움직임은 다양한 해양 자원으로부터 안전성 높은 천연 항산화제를 발굴하기 위한 방향으로의 진전도 있었는데, 최근 보고에서는 해양 천연자원 단백질로, 해양 담륜충, 참치 등뼈, 가라지, 오징어 근육, 초어 등으로부터 정제된 단백질의 가수분해 산물이 항산화 효과에 효과적이라는 보고도 있었다.
또한, 해양 생물로부터 유래된 생리활성 펩티드를 동정하는 연구도 진행중인데, 생리활성 펩티드들은 해양 천연자원을 효소 가수분해하여 손쉽게 얻을 수 있고, 영양소로 섭취하였을 때 체내에서 소화과정을 통하여 생리활성을 조절하는 물질로 작용할 수 있다는 장점이 있다. 생리활성 펩티드들은 2~20개의 아미노산으로 구성되어 있고, 이들의 구조적 특징에 기인하여 항고혈압, 항산화, 면역반응 조절 등에 기여한다고 알려져 있다.
클로렐라는 전 세계적으로 인기 있는 식품류로, 다량의 단백질, 미네랄, 비타민, 클로로필 및 생리활성 물질을 함유하고 있다. 최근 연구는 이들 구성성분이 항산화, 항당뇨, 항고콜레스테롤, 항염, 면역 졸절 등의 생리학적 기능을 발휘하고, 이와 같은 생리학적 기능은 클로렐라에 함유된 식이섬유, 미네랄, 클로로필 등에 의해 발휘된다고 보고하고 있다.
한편, 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)는 해수식물플랑크톤 녹조류로, 타원형 단세포이며, 현재 담륜충이나 새우의 먹이로만 활용되고 있을 뿐, 별다른 활용예가 없다. 하지만, 클로렐라 엘립소이데아에 함유된 단백질을 정제하여 적절히 활용한다면 인체에 이로운 기능성 물질로 이용될 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명자들은 해양 클로렐라 엘립소이데아로부터 펩티드를 분리 정제하여, 상기 분리 정제된 펩티드가 강력한 항산화 활성을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
1. LEE, S.H., Chang, D.W., Lee, B.J., Jeon, Y.J., 2009. Antioxidant activity of solubilized Tetraselmis suecica and Chlorella ellipsoidea by enzymatic digests. J. Food Sci. Nutr. 14, 21-28. 2. Nanjo, F., Goto, K., Seto, R., Suzuki, M., Sakai M., Hara, Y., 1996. Scavenging effects of tea catechins and their derivatives on 1,1,-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Free Radic. Bio. Med. 21, 895-902.
따라서 본 발명의 목적은 항산화 활성이 우수한 기능성 펩티드를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 생체에 부작용이 없으면서 항산화 활성이 우수하여 산화적 스트레스 관련 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 생체에 부작용이 없으면서 항산화 활성이 우수하여 산화적 스트레스 관련 질환을 효과적으로 개선할 수 있는 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항산화 활성을 갖는 펩티드를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsodiea)에서 유래되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩티드일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)를 가수분해한 분해물로부터 분리 및 정제한 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩티드일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가수 분해물은 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)를 트립신(trypsin), 알파-키모트립신(a-chymotrypsin), 펩신(pepsin) 및 파파인(papain)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 효소를 사용하여 효소 대 기질인 클로렐라 엘립소이데아를 1:100(w:w)의 양으로 반응시켜 수득한 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩티드일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 자유 라티칼에 의해 유도되는 세포 손상을 억제함으로써 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 10 내지 200uM의 농도로 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 산화적 스트레스 관련 질환은 암, 자가면역 질환, 간질환, 신경퇴행성 질환, 관상동맥 질환(coronary artery disease, CAD) 또는 심혈관 질환(cardiovascular disease, CVD)일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 클로렐라 엘립소이데아로부터 정제된 펩티드는 세포 내 활성산소종(ROS)을 소거할 수 있는 항산화 효과를 나타낼 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 산화적 스트레스 관련 질환에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1A는 펩신으로 클로렐라 엘립소이데아를 가수분해한 후 Sephadex G-25 컬럼으로 분리한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 1B는 상기 컬럼으로 분리한 결과 각 분획이 보이는 항산화 활성을 나타내는 표이다.
도 2A는 Sephadex G-25 컬럼으로 분리한 F4 분획을 YMC-Pack ODS-A 컬럼으로 다시 분리한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 2B는 상기 컬럼으로 분리한 결과 각 분획이 보이는 항산화 활성을 나타내는 표이다.
도 3은 정제된 항산화 펩티드의 RP-HPLC 분석 결과이다.
도 4는 Q-TOF 질량 분석기를 이용하여 정제된 펩티드의 분자량과 아미노산 서열을 분석한 실험 결과이다.
도 5는 정제된 펩티드가 정상 세포에 세포 독성을 나타내는지 확인하기 위한 MTT assay 결과이다.
도 6은 AAPH에 의해 유도된 세포 내 라디칼이 정제된 펩티드를 함께 처리한 경우 농도 의존적으로 감소함을 보여주는 DCFH-DA assay 결과이다.
도 7은 AAPH 처리한 세포의 생존율과 정제된 펩티드를 함께 처리한 경우 세포 생존율을 비교한 MTT assay 결과이다.
도 8은 AAPH에 의해 유도되는 세포사멸과 정제된 펩티드를 함께 처리한 경우 세포사멸을 비교한 형광현미경 사진이다.
도 9는 AAPH 처리한 세포의 세포자살 정도와 정제된 펩티드를 함께 처리한 경우 세포자살 정도를 비교한 FACS 데이타이다.
본 발명은 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella epplipsoidea)에서 정제된 펩티드의 항산화 용도에 관한 것으로, 상기 정제된 펩티드를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스관련 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명의 해양 클로렐라 엘립소이데아는 담수식물플랑크톤 녹조류로, 직경 4~10um, 길이 5~14um의 타원형 단세포이다. 엽록체는 얇은 판상이고 1개의 피레노이드를 가지고 있으며 세계 각지의 호수나 늪, 웅덩이 등에서 손쉽게 구할 수 있다.
클로렐라는 비타민, 미네랄, 아미노산을 풍부하게 함유하고 있어 이미 항산화제로 널리 이용되고 있으나, 클로렐라 중 특히 어떤 성분이 항산화제로서 뛰어난 효과를 발휘하는지에 대한 연구는 꾸준히 지속되고 있다.
클로렐라 유래의 신규한 천연성분을 발굴한다면, 이들 천연성분을 농축시킨 치료제 또는 치료보조제의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 이에 본 발명자들은 클로렐라 엘립소이데아로부터 상기와 같은 항산화 효과를 갖는 기능성 펩티드을 정제하고 이들 서열을 분석하여 항산화 관련 질병을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.
Figure 112012081746609-pat00001
상기 표 1은 클로렐라 엘립소이데아에서 항산화 효과를 갖는 기능성 펩티드를 정제하기 위하여, 다양한 가수분해 효소를 이용하여 클로렐라 엘립소이데아를 가수분해한 경우, 각각의 수율, 가수분해도, 항산화 활성을 보여주는 표이다.
표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 펩신, 트립신, α-키모트립신, 파파인 처리시 수율(건조 무게)은 각각 34.1%, 30.8%, 32.4%, 31.7%로 나타났고, 가수분해도(DH)는 각각 72.3%, 60.1%, 70.1%, 40.3%로 나타났다. 한편, 각각의 효소가 처리된 가수분해물 중 가장 뛰어난 효과를 가지는 펩티드를 동정해내기 위하여 DPPH, 히드록실(Hydroxyl), 퍼옥실(Peroxyl) 라디칼의 자유 라디칼 소거 활성을 측정하였는데, 그 결과 펩신에 의한 가수분해물이 가장 높은 히드록실, 퍼옥실 라디칼의 자유 라디칼 소거 활성을 나타낸바, 본 발명자들은 항산화 활성을 갖는 기능성 펩티드 정제를 위하여 펩신 가수분해 산물을 이용하여 다음과 같이 추가 정제 실험을 진행하였다.
항산화 활성을 갖는 기능성 펩티드를 정제하기 위하여 펩신 가수분해물을 Sephadex G-25 Column 크로마토그래피로 분리하였다. 그 결과 4개의 분획을 얻을 수 있었는데(F1~F4), 그 중 F4 분획이 가장 강력한 히드록실, 퍼옥실 라디칼 소거 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 1A, 1B). 본 발명자들은 F4 분획을 YMC-Pack ODS-A 컬럼을 이용한 RP-HPLC로 추가 분리 정제하였고, 그 중 A 분획이 더 좋은 히드록실, 퍼옥실 라디칼 소거 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 2A, 2B).
이후, 본 발명자들은 상기 정제된 펩티드의 분자량과 아미노산 서열을 파악하고자 Q-TOF ESI mass spectroscopy를 이용하여 실험하였는데(도 4), 그 결과 상기 정제된 펩티드는 분자량 702.2 Da의 헥사펩티드로 밝혀졌고, 그 아미노산 서열은 Leu-Asn-Gly-Asp-Val-Trp임을 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 상기 정제된 아미노산이 항산화 활성을 갖는지 다시 한 번 확인해 보고자, 동일 서열의 펩티드를 합성하여 항산화 활성을 다시 시험해 보았다. 하기 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 합성된 동일 서열의 펩티드는 정제된 펩티드와 동일한 정도의 항산화 활성을 나타냈다. 따라서, 본 발명자들은 상기 6개의 아미노산으로 구성된 펩티드는 항산화 활성에 매우 효과적인 펩티드임을 규명하였다.
Figure 112012081746609-pat00002
본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 정제된 펩티드가 세포 내에서도 항산화 기능을 발휘하는지 여부를 확인해 보기로 하였다. 이를 위해서는 우선 정제된 펩티드 자체의 세포 독성을 확인하여야 하는바, 본 발명자들은 상기 정제된 펩티드의 농도를 달리하여 원숭이 신장 세포주인 Vero 세포에 처리해 보았다. 그 결과, 정제된 펩티드의 농도를 달리하여도 아무것도 처리하지 않은 세포(Control)와 비교하여 세포 생존율에 영향이 없음을 확인할 수 있었고, 정제된 펩티드는 세포 독성을 유발하지 않음을 확인할 수 있었다(도 5).
따라서 본 발명자들은 정제 펩티드가 AAPH에 의해 유도된 세포 내 라디칼 억제에 미치는 영향 및 세포 독성에 미치는 영향을 본격적으로 실험해 보았다. 그 결과, 정제 펩티드는 농도 의존적으로 AAPH에 의해 유도된 세포 내 라디칼을 억제하는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었고(도 6), 또한 농도 의존적으로 AAPH에 의해 유도된 세포 독성을 완화시켜 세포 생존율을 증가시키는 효과도 확인할 수 있었다(도 7).
본 발명자들은 추가적으로 AAPH 처리된 세포의 세포사멸을 억제하는 정제 펩티드의 기능을 확인하기 위하여, 형광현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다. 그 결과, AAPH 처리된 세포에서는 세포자살(Apoptosis)과 괴사(Necrosis) 현상이 관찰되었으나, 정제된 펩티드를 전 처리한 경우 AAPH를 처리하더라도, 정제된 펩티드 농도 의존적으로 세포자살 및 괴사 현상이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다(도 8). 또한, 유세포 분석기를 통하여 sub-G1 DNA를 가지는 세포 비율을 측정한 결과, AAPH 처리한 세포에서는 그 비율이 32.95%에 달하여 AAPH가 세포자살을 유도함을 확인할 수 있었으나, 정제 펩티드를 전 처리한 경우 sub-G1 DNA를 가지는 세포 비율이 농도 의존적으로 감소한 것으로 보아, 정제 펩티드가 AAPH에 의해 유도되는 세포자살을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다(도 9).
이와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 클로렐라 엘립소이데아에서 유래된 정제 펩티드가 항산화 활성을 가지는 것을 실험적으로 입증하였다.
그러므로 상기 정제 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 산화적 스트레스와 관련된 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있을 것이다. 이러한 산화적 스트레스 관련 질환의 종류로는 암, 자가면역 질환, 간질환, 신경퇴행성 질환, 관상동맥 질환(coronary artery disease, CAD) 또는 심혈관 질환(cardiovascular disease, CVD)가 있을 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료되는 상기 관상동맥질환은 심근경색, 협심증, 다른 만성 관상동맥질환, 아테롬성동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군(예컨대, 불안정협심증, NSTEMI(non-ST-elevation myocardial infarction) 또는 STEMI(ST-elevation myocardial infarction), PAOD(peripheral arterial occlusive disease) 또는 뇌혈관 발작이 있을 수 있다.
본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 "치료하는"이란 용어는 "치료"가 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
따라서 포유동물에 있어서 산화적 스트레스 관련 질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 산화적 스트레스 관련 질환의 발달을 저지시킴,
(2) 산화적 스트레스 관련 질환의 확산을 예방함,
(3) 산화적 스트레스 관련 질환을 경감시킴,
(4) 산화적 스트레스 관련 질환의 재발을 예방함 및
(5) 산화적 스트레스 관련 질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에 따른 클로렐라 엘립소이데아에서 정제된 펩티드는 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 추출이란 적절한 용매를 이용하여 클로렐라 엘립소이데아에서 추출한 것이며, 예를 들어, 클로렐라 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 그러나, 클로렐라 엘립소이데아에서 추출하지 않은 합성된 펩티드도 항산화 효과를 가지는 기능성 물질로 활용할 수 있고 별도의 용매를 사용하지 않고 분리 정제한 펩티드도 본 발명의 기능성 물질로 활용할 수 있을 것이다.
상기 클로렐라 엘립소이데아에서 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 클로렐라 엘립소이데아 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서 클로렐라 엘립소이데아 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
상기 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 서열번호 1로 이루어진 기능성 펩티드는 조성물에 10 내지 200μM 농도로 포함될 수 있으며, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 클로렐라 엘립소이데아로부터 정제된 펩티드는 천연물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 및 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 백운풀 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
또한, 본 발명은 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 클로렐라 엘립소이데아로부터 정제된 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 클로렐라 엘립소이데아로부터 정제된 펩티드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 클로렐라 엘립소이데아로부터 정제된 펩티드를 투여하는 것을 포함하는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 기능성 펩티드를 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 클로렐라 엘립소이데아에서 정제된 기능성 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
재료 준비
해양 클로렐라 엘립소이데아는 Marine Bio Process Co., Korea로부터 입수하여, 동결건조기를 이용하여 -70℃에서 동결건조하였다. 동결건조된 클로렐라 엘립소이데아 분말은 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), α-키모트립신(α-chymotrypsin), 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1,1,-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH), 5,5-디메틸-1-피롤린 N-옥사이드( 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide, DMPO), 2,2-아조비스(2-아미디노프로판) 히드로클로라이드(2,2-azobis(2-amidinopropane) hydrochloride, AAPH)는 Sigma Chemical Co.(St.Louis, USA)에서 구입하였다. DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), FBS(fetal bovine serum), 스트렙토마이신-페니실린(streptomycin-penicillin)은 Gibco(Gaithersburg, MD)에서 구입하였다. 다른 화학물질과 시약들은 분석용 등급을 사용하였다.
통계처리
실험결과는 3번의 반복 실험 결과를 평균±표준편차로 표기하였고, 평균값의 통계 비교는 분산분석(ANOVA)과 SPSS 소프트웨어를 이용한 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 의하였다. 통계의 유의성은 p<0.05에서만 고려되었다.
<실시예 2>
클로렐라 일립소이데아 가수분해물 제조
본 발명자들은 클로렐라 일립소이데아로부터 생리활성 펩티드를 얻기 위하여 선행문헌 1에 개시된 방법에 따라 다양한 프로테아제(papain, trypsin, α-chymotrypsin 등)인 펩신, 트립신, α-키모트립신, 파파인을 이용하여 구입처에서 제시한 방법에 따라 효소 가수분해를 실시하였다. 효소와 기질은 1:100(w/w) 비율로 혼합하였고, 상기 적정 온도하에서 12시간 동안 반응시켰다. 그 후 효소를 불활성화시키기 위하여 100℃에서 10분간 가열하였다.
그 결과, 상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 펩신, 트립신, α-키모트립신, 파파인 처리시 수율(건조 무게)은 각각 34.1%, 30.8%, 32.4%, 31.7%로 나타났고, 가수분해도(DH)는 각각 72.3%, 60.1%, 70.1%, 40.3%로 나타났다. 본 발명자들은 향후 실험을 위하여 상기 가수분해 결과물을 -20℃에서 보관하였다.
<실시예 3>
항산화 활성을 갖는 기능성 펩티드의 정제
본 발명자들은 강력한 라디칼 소거 활성이 있는 펩티드를 정제하기 위하여 해양 클로렐라 엘립소이데아 가수분해물을 사용하였다. 상기 표 1에 도시된 바와 같이 펩신, 트립신, α-키모트립신, 파파인에 의한 가수분해물의 라디칼 소거 활성을 비교해 본 결과, 펩신이 가장 강력한 히드록실, 퍼옥실 라디칼 소거 활성을 나타낸 바, 본 발명자들은 펩신 가수분해물을 이용하여 항산화 활성을 갖는 기능성 펩티드를 정제하기로 하였다.
본 발명자들은 강력한 라디칼 소거 활성이 있는 기능성 펩티드를 정제하기 위하여, 각 정제 단계별로 라디칼 소거 활성을 확인해 보기로 하였다. 우선, 가장 강력한 라디칼 소거 활성을 갖는 펩신에 의한 가수분해물을 증류수에 용해시키고, 증류수로 평형화된 세파덱스 G-25 컬럼(Sephadex G-25 gel filtration column)(2.5×75cm)에 로딩하였다. 컬럼은 2.0ml/min의 유동율로 증류수와 함께 용리하였고, 각 분획은 10ml 용량으로 분리하였다.
그 결과, 4개의 분획을 얻을 수 있었는데(F1~F4), 이 중 F4 분획이 가장 강한 히드록실 및 퍼옥실 라디칼 소거 활성을 나타낸 바(도 1A, 1B 참조), 본 발명자들은 F4 분획을 추가 분리 정제하기로 하였다.
즉, F4 분획은 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)를 포함하는 아세토니트릴(0-20% v/v, 30분)의 선형 구배로 YMC-Pack ODS-A 컬럼(5um, 4.6×250mm, YMC Co., Kyoto, Japan)을 이용한 RP-HPLC의 방법으로 유동율 1.0mL/min으로 분리하였다. 용리점은 280nm에서 감지하였다.
그 결과, 본 발명자들은 2개의 분획을 관찰할 수 있었고, 그 중 A 분획에서 더 높은 라디칼 소거 활성을 확인할 수 있었다(도 2A, 2B 참조). 한편, A 분획의 순도는 RP-HPLC로 확인할 수 있었다(도 3 참조).
<실시예 4>
정제된 항산화 펩티드의 분자량 및 아미노산 서열 결정
본 발명자들은 해양 클로렐라 엘립소이데아에서 정제된 펩티드의 분자량과 아미노산 서열을 확인하기 위하여 전자 분사 이온화 소스(ESI source)와 결합된 Q-TOF 질량분석계(Micromass, Altrincham, UK)를 사용하였다. 본 발명자들은 메탄올/물(1:1,v/v)에 용해된 정제 펩티드를 ESI 소스에 주입하여 질량분석기를 이용하여 2가 양이온 (M+2H)2+ 상태를 분석하여 분자량을 결정하였는데, 분자량은 약 702.2 Da으로 확인되었다. 분자량을 결정한 후, 펩티드는 탠덤 MS 분석(tandem MS analysis)하여 6개의 아미노산 서열을 분석하였는데 그 결과, Leu-Asn-Gly-Asp-Val-Trp으로 구성된 헥사펩티드 임을 확인할 수 있었으며(도 4 참조), 상기 아미노산의 서열을 서열번호 1로 표시하였다.
<실시예 5>
항산화 활성 측정을 위한 전자스핀공명(ESR) 분광 분석
한편, 본 발명자들은 클로렐라 엘립소이데아 가수분해물 중 항산화 활성을 갖는 펩티드를 분리해 내기 위하여, 분리의 각 단계별로 기질에 대한 항산화 활성을 측정해 보았다. 기질에 대한 항산화 활성은 산화과정에서 자유 라디칼의 소거 활성을 측정함으로써 확인할 수 있었다.
5-1. 클로렐라 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 분석은 항산화 물질의 전자공여능으로 인해 방향족 화합물 및 방향족 아민류에 의해 환원되어 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 항산화 능력을 측정하는 방법이다. 본 발명자들은 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(DPPH) 라디칼 소거 활성을 측정하기 위하여 선행문헌 2에 개시된 방법을 활용하였다. 즉, 샘플 용액(60ul)을 메탄올에 용해된 DPPH(60uM/L) 60uL와 격렬히 10초간 혼합한 후, 상기 용액을 100uL 테플론 모세관으로 이동시켜 ESR 스펙트로미터(JES-FA machine, JOEL, Tokyo, Japan)에 주입시키고, 2분 경과 후 중심장 3475G, 변조 주파수 100kHz, 진폭 변조 2G, 마이크로웨이브 파워 5mW, 게인(gain) 6.3×105의 조건 하에서 ESR 스펙트로미터상의 스핀 어덕트(spin adduct)를 측정하였다.
그 결과, 펩신, 트립신, α-키모트립신, 파파인으로 가수분해한 가수분해물 중 α-키모트립신, 펩신, 파파인, 트립신 가수분해물 순으로 DPPH 라디칼에 대한 소거 활성이 높게 나타났다(표 1 참조).
5-2. 클로렐라 가수분해물의 히드록실 라디칼 소거 활성
본 발명자들은 클로렐라 엘립소이데아 가수분해물의 히드록실 라디칼 소거 활성도 측정하였는데, 이를 위해 본 발명자들은 펜톤 반응(Fenton reaction)에 의해 발생된 히드록실 라디칼을 니트론 스핀 트랩(Nitorne spin trap) DMPO에 격렬히 반응시키고, 그 결과 얻어지는 DMPO-OH를 ESR 스펙트로미터을 이용하여 측정하였다. ESR 스펙트럼은 중심장 3475G, 변조 주파수 100kHz, 진폭 변조 2G, 마이크로웨이브 파워 1mW, 게인(gain) 6.3×105의 조건 하에서 측정되었는데, JES-FA ESR 스펙트로미터(JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하였으며, 0.3M DMPO 0.2mL, 10mM FeSO4 0.2mL, 10mM H2O2 0.2mL을 PBS(pH7.4)에 혼합한 후 2.5분 경과 후 측정하였다.
그 결과, 본 발명자들은 펩신을 처리한 가수분해물에서 가장 효과적인 히드록실 라디칼 소거 활성이 나타남을 확인할 수 있었다(표 1 참조).
5-3. 클로레랄 가수분해물의 퍼옥실 라디칼 소거 활성
또한, 본 발명자들은 클로렐라 엘립소이데아 가수분해물의 퍼옥실 라디칼에 대한 소거 활성도 관찰하였다. 퍼옥실 라디칼은 AAPH에 의해 발생하도록 하였다. 즉, 10mM AAPH, 10mM 4-POBN, 테스트용 샘플을 포함하는 PBS(pH 7.4) 반응 혼합물을 37℃ 항온 수조에서 30분간 반응시키고, 상기 반응액을 100uL 테플론 모세관으로 이동시켜 ESR 스펙트로미터(JES-FA machine, JOEL, Tokyo, Japan)에 주입시킨 후, 중심장 3475G, 변조 주파수 100kHz, 진폭 변조 2G, 마이크로웨이브 파워 10mW, 게인(gain) 6.3×105의 조건 하에서 ESR 스펙트로미터상의 스핀 어덕트(spin adduct)를 측정하였다.
그 결과, 펩신을 처리한 가수분해물에서 가장 높은 퍼옥실 라디칼 소거 성능을 관찰할 수 있었고(표 1 참조), 따라서 본 발명자들은 펩신 가수분해물을 이용하여 항산화 기능을 갖는 펩티드를 정제하기로 결정하였다.
< 실시예 6>
정제 펩티드의 세포 내 항산화 활성 측정
실험에 앞서 본 발명자들은 상기 정제된 펩티드가 정상 세포에서 그 자체로 세포 독성을 나타내는지 여부를 확인하였고, 세포 독성이 없다는 결과를 확인한 후, 항산화 효과에 대한 추가 실험을 진행하였다.
6-1. 세포 배양
본 발명자들은 Vero(원숭이 신장 세포주) 세포를 10% FBS, 스트렙토마이신(100mg/mL), 페니실린(100U/mL)을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였으며, 배양기의 온도는 37℃, CO2는 5%를 유지하도록 하여 이하 실험을 진행하였다.
6-2. MTT assay 를 이용한 정제 펩티드(서열번호 1)의 세포독성 평가
본 발명자들은 본 발명인 정제 펩티드 자체의 세포 독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 즉, 본 발명자들은 상기 Vero 세포를 96 웰 플레이트에 1×105 cells/ml로 분주하여 16시간 배양한 후, 본 발명인 정제 펩티드를 농도별(25, 50, 100uM)로 처리하였고, 그 후 37℃에서 24시간 추가 배양하였다. 세포 독성을 평가하기 위하여, MTT 저장액(50uL; 2mg/mL in PBS)을 총 부피가 250uL가 되도록 각 well에 첨가하여 4시간 추가 배양하고, 각 플레이트를 원심분리하여(800g, 5분) 상청액을 제거한 후, 포르마잔 결정(formazan crystals)을 150uL DMSO에 용해시켰다. 그 후, 540nm에서 ELISA plate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
본 발명자들은 정제된 펩티드를 25, 50, 100uM까지 처리하였으나, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 정제된 펩티드를 처리하지 않은 대조군(Control)에 비하여 정제된 펩티드 자체는 세포 생존력에 전혀 영향이 없는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명자들은 DPPH, 히드록실, 퍼옥실 라디칼의 자유 라디컬 소거 활성을 측정하는 추가 실험이 가능하다고 판단하고 추가 실험을 실시하였다.
6-3. 정제 펩티드의 AAPH 에 의해 유도된 세포내 라디칼 억제 효과
본 발명자들은 정제된 펩티드가 AAPH에 의해 유도되는 세포내 라디칼에 어떤 영향을 미치는지 확인해 보고자 하였다. 따라서, 본 발명자들은 Vero 세포를 96 웰 플레이트에 1×105 cells/ml로 분주하여 16시간 배양한 후, 정제 펩티드를 농도별(25, 50, 100uM)로 처리하여 37℃에서 24시간 추가 배양하고, 30분 경과 후 10mM 농도의 APPH를 첨가한 후 다시 37℃에서 30분간 추가 배양하였다. 마지막으로, 2'7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA; 5ug/mL)를 세포에 처리한 후 485nm에서 들뜸 파장(excitation wavelength)과 535nm에서 방출파장(emission wavelength)을 Perkin-Elmer LS-5B 스펙트로플루오로미터를 이용하여 측정하였다.
세포내 라디칼 소거 활성은 DCF의 양에 의해 측정될 수 있는데, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군 세포(Control)에서는 1274.9, AAPH-처리 세포는 7824.2의 강도로 측정되었다. 한편, 정제 펩티드를 전처리하고 AAPH를 처리한 세포에서는 농도 의존적으로 25, 50, 100uM에서 각각 6595.5, 3738.1, 2502.4의 강도를 나타냈는데(도 6 참조), 이 결과는 상기 정제된 펩티드가 실제로 라디칼 형성을 억제할 수 있는 천연 분자로 기능할 수 있음을 보여주는 긍정적인 결과라고 판단되었다.
6-4. 정제 펩티드가 AAPH 에 의해 유도된 세포독성에 미치는 영향
한편, 본 발명자들은 항산화 펩티드가 라디칼 소거 활성을 보여준다는 상기 결과에 근거하여, 정제 펩티드가 AAPH에 유도된 세포독성에 미치는 영향을 추가로 검토해 보고자 하였다. 따라서, 본 발명자들은 Vero 세포를 96 웰 플레이트에 1×105 cells/ml로 분주하여 16시간 배양한 후 본 발명인 정제 펩티드를 농도별(25, 50, 100uM)로 처리하고, 1시간 후 AAPH를 10mM 농도로 처리하여 37℃에서 24시간 동안 추가 배양하였다. 그 후 MTT 저장액(50uL; 2mg/mL in DPBS)를 각 웰에 처리하여 총 반응부피가 250uL가 되도록 하고 4시간 동안 다시 배양하였다. 배양된 각 플레이트를 원심분리(800g, 5분)하여 상청액을 제거한 후, 포르마잔 결정(formazan crystals)을 150uL DMSO에 용해시키고, 540nm에서 ELISA plate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
상대적인 세포의 생존력은 MTT가 불용성 포르마잔 염으로 전환된 양에 의해 평가될 수 있는데, 아무것도 처리하지 않은 대조군 세포(Control)에서 생성된 포르마잔의 밀도를 100% 생존력으로 두고, 상기 대조군에 대비하여 각 처리군에서 생존한 세포를 평균 백분율로 표시한 결과, AAPH만 처리한 세포의 생존율은 48.6%인 반면, 정제 펩티드를 전처리한 세포의 생존율은 정제 펩티드의 농도가 25, 50, 100uM일 때 각각 56.3, 72,3, 79.4%로 나타나, 정제 펩티드는 AAPH에 의해 유도되는 세포 독성을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도7 참조).
6-5. AAPH 에 의해 유도된 세포사멸 및 정제 펩티드의 항산화 효과의 현미경 분석
본 발명자들은 AAPH에 의해 유도된 세포사멸이 세포자살(apoptosis)인지 괴사(necrosis)인지 판단하기 위하여, Hoechst 33342(HO342) 또는 PI(propidium iodide)로 세포 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하기로 하였다.
우선, Vero 세포를 24 웰 플레이트에 1×105 cells/ml로 분주하여 16시간 배양한 후, 상기 정제 펩티드를 농도별(25, 50, 100uM)로 처리하고, 1시간 후 AAPH를 10mM 농도로 처리하여 37℃에서 24시간 동안 추가 배양하였다. 그 후, 1.5uL의 HO342(10mg/mL) 또는 PI를 각 웰에 처리하고 다시 37℃에서 10분간 배양하였다. 염색된 세포는 핵의 응결정도를 파악하기 위하여 Moticam-Pro 디지컬 카메라 칼라영상 분석을 이용하여 형광 현미경 관찰하였다.
그 결과 본 발명자들은 AAPH 처리된 세포에서는 세포자살(apoptosis)의 대표적 현상인 핵의 단편화(도 8B 좌측 패널, 파란색)와 괴사(necrosis)의 대표적 현상인 세포 파괴 현상(도 8B 우측 패널, 빨간색)을 관찰할 수 있다. 그러나, 정제된 펩티드를 전처리한 세포에서는 핵의 단편화 또는 세포의 파괴 현상이 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다(도 8C-F 참조).
6-6. 유세포 분석기를 이용한 정제된 펩티드가 AAPH 처리된 세포에 미치는 효과 분석
본 발명자들은 상기 정제된 펩티드가 세포사멸에 미치는 영향을 좀 더 명확히 파악하기 위하여 유세포 분석기를 이용하여 추가 실험하였다. 즉, 본 발명자들은 세포자살을 나타내는 sub-G1 세포의 비율을 측정하기 위하여, Vero 세포를 6 웰 플레이트에 1×105 cells/ml로 분주하여 16시간 배양한 후, 본 발명인 정제 펩티드를 농도별(25, 50, 100uM)로 처리하였다. 1시간 배양 후 AAPH(10mM)를 처리하고 24시간 추가 배양한 후, 세포를 수득하여 1mL의 4℃, 70% 에탄올에 30분간 고정시켰다. 상기 세포를 PBS로 2번 세척하고, 100ug PI, 100ug RNase A를 포함하는 1mL의 PBS을 처리하여 37℃ 암조건에서 30분간 반응시였다. 유세포 분석은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA, ISA)를 이용하여 이루어졌다. 세포 주기에 미치는 영향은 세포 주기의 각 단계에 분포하는 세포 비율로 평가하였고, Cell Quest and Mod-Fit 컴퓨터 프로그램에 의한 히스토그램으로 판단하였다.
그 결과, AAPH를 처리한 세포에서는 sub-G1 세포의 비율이 32.95%로 나타남을 확인할 수 있었고, 따라서 AAPH가 세포자살을 유도함을 확인할 수 있었다. 그러나, 정제된 펩티드를 전처리한 경우 농도 의존적으로 sub-G1 세포의 비율이 감소하는 것으로 나타나, 정제 펩티드가 AAPH에 의해 유도되는 Vero 세포의 세포자살을 억제하는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
* : p<0.05
** : P<0.01
<110> Cheju National University Industry-Academic Cooperation Foundation KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE <120> Novel antioxidative peptide purified from a marine Chlorella ellipsoidea <130> PN1207-409 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Amino acid sequence from Chlorella ellipsoidea <400> 1 Leu Asn Gly Asp Val Trp 1 5

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항산화 활성을 갖는 펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsodiea)에서 유래되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)를 가수분해한 분해물로부터 분리 및 정제한 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩티드.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 가수 분해물은 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)를 트립신(trypsin), 알파-키모트립신(a-chymotrypsin), 펩신(pepsin) 및 파파인(papain)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 효소를 사용하여 효소 대 기질인 클로렐라 엘립소이데아를 1:100(w:w)의 양으로 반응시켜 수득한 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩티드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는 자유 라티칼에 의해 유도되는 세포 손상을 억제함으로써 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 펩티드.
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