KR101771111B1 - 남풍찰수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

남풍찰수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 남풍찰수수(Nampungchal Sorghum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 남풍찰수수 추출물은 Bcl-2 유전자의 발현을 감소시키고, Bax 유전자의 발현을 증가시키며, 활성 Caspase-3(cleaved Caspase-3)의 발현을 증가시킴으로써, 세포자멸사를 유도하여, 이를 암 예방 또는 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

남풍찰수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing and treating cancer comprising Nampungchal Sorghum}
본 발명은 남풍찰수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서, 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고 비조절적인 방식으로 증식하고 불사화되어 발생하는 질병이다. 암 발생의 원인으로는 화학물질, 바이러스,세균, 전리방사선 등의 환경적 또는 외적 요인과 선천성 유전자 변이 등의 내적 요인을 들 수 있다. 초기에 발견된 암일 경우 수술, 방사선 치료, 화학적 요법 등의 치료법이 있으나 그 부작용이 큰 문제로 대두되고 있으며, 말기 암이나 전이된 암의 경우 특별한 치료법 없이 시한부 인생으로 삶을 마감하는 상황이다.
최근, 암과 관련된 다양한 생화학적 기전이 규명되고 그에 따른 치료제가 개발되어 오고는 있지만, 아직까지 암에 대한 근본적인 치료방법은 제시되지 않고 있다. 이에 따라, 암과 관련된 다양한 생체 내 분자를 동정하고 이를 표적으로 하는 약물을 개발하려는 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 이러한 약물 중 일부를 조합하여 암 치료 효과를 증진시키고자 하는 노력 역시 시도되고 있다.
한편, 현재 우리나라에서 주요사망원인 1위는 암이다. 이 중 전립샘암은 남성암으로 전체 남성 암환자 중 발생률 5위, 사망률 6위를 나타내고 있으며, 미국과 영국에서는 발생률 1위를 나타내고 있다. 더욱이 전립샘암의 경우 발생률이 해마다 꾸준히 증가하는 경향을 보이고 있어 위험성이 점점 커져간다고 볼 수 있다.
전립샘암의 치료에는 외과적 수술, 방사선치료, 호르몬치료, 항암화학요법 등이 사용되고 있으며, 종양의 분화도, 환자의 연령과 건강상태 및 환자의 삶의 질에 미치는 영향 등을 고려하여 적용하는 방법을 신중하게 선택하고 있다. 여러 치료방법 중 전립샘 치료의 항암화학요법에서는 택솔(taxol)계 약물이 주로 사용되고 있다. 대부분의 항암제가 암세포뿐만 아니라 정상세포에서도 독성을 나타냄으로써 많은 부작용을 유발하는 문제점이 있는데, 택솔계 약물도 탈모, 심장장애, 말초신경염 등의 부작용이 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서 독성 및 부작용이 비교적 적은 식품소재의 치료제 또는 건강기능성 식품의 개발은 암발생 초기에 항암제를 대체하여 적용하거나 항암제와 병용으로 투여함으로써 항암제의 투여용량을 줄일 수 있는 이점이 있을 것이다.
한편, 수수(Sorghum, Sorghum bicolor L.)는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀로 쌀, 보리, 밀, 옥수수에 이어 세계 5대 식량자원에 속하며, 아시아, 아프리카, 중남미 지역에서 재배되고 있다. 수수에는 식이섬유 및 페놀화합물(phenolic compounds) 등의 생리활성성분이 다량 함유되어 있으며, 수수의 페놀화합물은 축합형 탄닌(condensed tannin), 플라보노이드(flavonoid), 페놀산(phenolic acid) 등으로 구성되어 있다. 남풍찰수수는 국립종자원에 등록되어 있는 수수 품종의 하나로 기존의 수수보다 안토시아닌(anthocyanin) 등의 생리활성물질의 함량이 높은 개량종이다.
남풍찰수수는 다른 곡류에 비하여 생리활성물질의 함량이 비교적 높은 작물이며, 실제 약리학적 소재로 널리 이용되고 있지 않은 것이 실정이다. 이에, 본 발명의 발명자들은 남풍찰수수 추출물이 전립샘암세포의 Bcl-2 유전자의 발현을 감소시키고, Bax 유전자의 발현을 증가시키며, 활성 Caspase-3의 발현을 증가시킴으로써, 세포자멸사를 유도한다는 점을 확인하여, 상기 추출물이 암 예방 및 치료의 가능성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 특허등록번호 제1014980750000호 대한민국 특허등록번호 제1014673950000호
1.de MoraisCardoso L, Pinheiro SS, et al. Sorghum (sorghum bicolor l.): Nutrients, Bioactive Compounds, and Potential Impact on Human Health. Crit Rev Food Sci Nutr. 2015. 2.Awika JM, Rooney LW. Sorghum phytochemicals and their potential impact on human health. Phytochemistry 2004, 65(9): 1199-1221. 3.ark JH, Darvin P, et al. Hwanggeumchal sorghum induces cell cycle arrest, and suppresses tumor growth and metastasis through Jak2/STAT pathways in breast cancer xenografts. PLoS One. 2012, 7(7): e40531.
따라서 본 발명의 목적은 생체에 부작용이 없으면서 다양한 약리 효과를 갖는 남풍찰수수(Nampungchal Sorghum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 남풍찰수수(Nampungchal Sorghum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 및 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 남풍찰수수(Nampungchal Sorghum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 유전상수(dielectric constant)가 18 ~ 80인 극성용매 추출물, 유전상수가 1.88~4.81인 비극성용매 추출물, 수증기 증류 추출물 또는 초임계 유체법 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 극성용매는 C1 내지 C4의 저급알코올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비극성용매는 클로로포름, 석유에테르, 에테르, 부탄올, 헥산 및 톨루엔일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립샘암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종 중 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일시예에 있어서, 상기 추출물은 Bcl-2 유전자의 발현을 감소시키고, Bax 유전자의 발현을 증가시키고, 활성 Caspase-3(cleaved Caspase-3)의 발현을 증가시킴으로써, 세포자멸사를 유도하여 암세포를 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예 있어서, 남풍찰수수(Nampungchal Sorghum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 식품 조성물일 수 있다.
본 발명은 남풍찰수수(Nampungchal Sorghum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 남풍찰수수 추출물은 Bcl-2 유전자의 발현을 감소시키고, Bax 유전자의 발현을 증가시키며, 활성 Caspase-3(cleaved Caspase-3)의 발현을 증가시킴으로써, 세포자멸사를 유도하여, 이를 암 예방 또는 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 남풍찰수수 추출물을 제조하는 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 인체 전립샘암세포인 PC3 세포에 대한 남풍찰수수 에탄올 추출물의 각 농도별 생존율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 인체 전립샘암세포인 PC3 세포에 대한 남풍찰수수 에탄올 추출물의 각 농도별 세포핵의 형태변화를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 인체 전립샘암세포인 PC3 세포에 대한 남풍찰수수 에탄올 추출물의 각 농도별 세포의 분포를 유세포분석기를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 인체 전립샘암세포인 PC3 세포에 대한 남풍찰수수 에탄올 추출물의 각 농도별 세포 내 단백질 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
남풍찰수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 남풍찰수수 추출물은 Bcl-2의 발현을 감소시키고, Bax 유전자의 발현을 증가시키며, 활성 Caspase-3(cleaved Caspase-3)의 발현을 증가시킴으로써, 세포자멸사를 유도하여, 이를 암 예방 또는 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 남풍찰수수 추출물의 농도에 따른 전립샘암세포의 생존률(도 2 참조), 세포핵의 형태변화(도 3 참조), 세포의 분포의 분석(도 4 참조), 세포 내 단백질 발현(도 5 참조)를 확인하였다.
본 발명에서 "수수"는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀로 쌀, 보리, 밀, 옥수수에 이어 세계 5대 식량자원에 속하며, 아시아, 아프리카, 중남미 지역에서 재배되고 있다. 수수에는 식이섬유 및 페놀화합물(phenolic compounds) 등의 생리활성성분이 다량 함유되어 있으며, 수수의 페놀화합물은 축합형 탄닌(condensed tannin), 플라보노이드(flavonoid), 페놀산(phenolic acid) 등으로 구성되어 있다.
특히, 본 발명의 "남풍찰수수"는 국립종자원에 등록되어 있는 수수 품종의 하나로 기존의 수수보다 안토시아닌(anthocyanin) 등의 생리활성물질의 함량이 높은 개량종이다.
본 발명의 용어 "apoptotic body"는 세포자멸사가 유도된 세포는 세포의 핵이 점차 응축되고, 핵 내 염색체가 분절되는 현상이 발생하게 되는데, 이렇게 응축되고 분절된 핵을 의미한다.
본 발명의 "암"은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종 등을 포함하며, 바람직하게는 전립샘암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 남풍찰수수 추출물은 당업계의 통상적인 추출방법으로 제조될 수 있으나, 극성용매 또는 비극성용매를 사용한 추출방법, 수증기 증류추출방법 또는 초임계 유체 추출방법으로 제조하는 것이 바람직하다. 이때 극성용매로는 유전상수(dielectric constant)가 18 ~ 80인 극성용매를 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따르면 보다 효과적으로 치매에 유용한 성분을 추출할 수 있다. 더욱 바람직하게는 C1 ~ C4의 저급알코올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 좋으며, 상기 저급알코올 및 물을 대신하여 주정을 사용할 수도 있다. 본 발명에 따르면 극성용매로 에탄올용액을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 이때 에탄올 50 내지 90%의 비율로 하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 에탄올 60 내지 80%일 수 있다. 이에 따르면 치매에 유용한 성분을 가장 효과적으로 추출할 수 있을 것이라 판단된다.
비극성용매로는 유전상수가 1.88 ~ 4.81인 비극성용매를 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따르면 보다 효과적으로 치매에 유용한 성분을 추출할 수 있다. 더욱 바람직하게는 클로로포름, 석유에테르, 에테르, 부탄올, 헥산 및 톨루엔으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 좋다. 본 발명에 따르면 비극성용매로 석유에테르를 사용하는 것이 가장 바람직할 수 있다.
극성용매 또는 비극성용매를 사용한 추출방법으로 남풍찰수수를 분쇄한 후,분말의 형태로, 용매를 첨가한 상태로 추출하는 방법을 사용할 수 있다. 이때 용매의 첨가량은 남풍찰수수의 건조물 중량을 기준으로 5 내지 20배로 하는 것이 바람직하다. 용매를 너무 많이 첨가하면 용매를 낭비하는 것이 되며, 너무 적게 첨가하면 유용한 추출물이 충분이 추출되지 않을 수 있다. 추출시간은 30분 내지 7시간으로 하는 것이 바람직하고, 추출온도는 20 내지 90℃일 수 있고, 초음파 추출기를 이용할 수 있다. 추출시간이 너무 길면 유용하지 못한 부가적 성분까지 추출될 수 있으며, 너무 짧으면 유용한 성분이 충분히 추출되지 않을 수 있고, 추출온도가 너무 높으면 유용성분이 변질되거나 파괴될 수 있으며, 너무 낮으면 유용성분과 용매의 활성도가 낮아져 추출효율이 낮아질 수 있다. 또한 진탕추출하여 추출효율을 높이는 것이 바람직하다. 추출 이후에는 추출물에 포함된 추출용매의 제거과정을 거쳐 유용성분을 농축하는 것이 바람직하며, 적은 양의 물 등에 녹이고 동결건조함으로써 약제, 식품, 식품첨가제의 제조 및 보관을 용이하게 하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 수증기 증류추출방법으로도 암 예방 및 치료 효과가 우수한 남풍찰수수 추출물을 제조할 수 있다. 이때 추출시간은 20분 내지 10시간으로 하는 것이 바람직하다. 추출시간이 너무 길면 열에 오랫동안 노출되기 때문에 유용성분이 변질 또는 파괴될 수 있으며, 너무 짧으면 유용성분이 충분히 추출되지 않을 수 있다.
본 발명에 따르면, 초임계 유체 추출방법으로도 남풍찰수수 추출물을 제조할 수 있다. 이때 유체로 이산화탄소를 사용하는 것이 바람직하며, 유량 1 내지 5㎖/min, 압력 200 내지 400bar, 온도 35 내지 75℃의 조건으로 30분 내지 2시간 추출하는 것이 바람직하다. 상기 조건에 따라 추출하면 보다 효과적으로 치매에 유용한 성분을 추출할 수 있다.
본 발명의 남풍찰수수 추출물 제조에는 남풍찰수수의 잎과 줄기, 뿌리, 껍질, 과실등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 잎, 줄기 또는 열매가 사용될 수 있다. 상기 남풍찰수수는 채취한 것, 재배한 것 또는 시판되는 것에 제한없이 사용될 수 있으며, 채취한 후 물로 세척하여 이물질 등을 제거한 후 건조하여 사용하는 것이 바람직하다. 건조는 그늘에서 바람이 잘 통하는 곳에서 이루어지는 것이 바람직하다. 직사광선 하에서 건조하는 경우 유용한 성분이 빛에 의해 물리화학적으로 변하거나 휘발될 수 있기 때문이다. 다만, 수증기 증류 또는 초임계추출을 위해서는 건조하지 않고 신선한 재료를 세척 후에 바로 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 추출물 자체일 수 있으며, 주성분인 상기 추출물의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약학적으로 허용가능한 통상적인 담체 및 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 약제학적 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여형태는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있고, 또는 단독으로 또는 타 약제학적 활성 화합물과의 결합뿐만 아니라 적당한 결합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에는 상기 주요성분 즉 남풍찰수수 추출물 이외에도 보조성분으로서 비타민 B, C, E나 베타카로틴, Ca, Mg, Zn 등의 미네랄 함유 화합물이나 레시틴 등의 인지질 또는 말톨, 아미노산 등의 화합물을 사용할 수 있으며, 이중에서도 비타민 C, E나 베타카로틴, 말톨 등 중에서 2 ~ 3 성분을 혼합하여 사용하면 생체 활성효과를 상승 또는 보강할 수 있기 때문에 더욱 바람직하다.
또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여 매실, 레몬향, 파인애플향 또는 허브향과 같은 천연향료나 천연과즙, 클로로필린(Chlorophyllin), 플라보노이드(Flvonoid) 등의 천연색소 및 감미성분인 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕 등과 구연산, 구연산나트륨 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물이 적용될 수 있는 개체는 척추동물이고, 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 생쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 경구투여용으로 사용한다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 조절될 수 있어 그 범위가 다양하며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 일일 투여량은 남풍찰수수 추출물의 양을 기준으로 0.1 ~ 10㎎/㎏이고, 바람직하게는 3 ~ 9㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 5 ~ 6mg/kg이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있으며, 바람직하게는 치매 예방, 치료효과를 나타내는 것으로 알려진 울금, 생강, 구기자, 오메가 3 지방산을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다. 본 발명의 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 상기 남풍찰수수 추출물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01 내지 0.04중량부, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03중량부의 범위에서 선택하는 것이 바람직하다. 상기 이 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 첨가될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 남풍찰수수 추출물의 제조
1, 남풍찰수수 에탄올 추출물 제조
남풍찰수수 에탄올 추출물을 제조하기 위하여, 하기의 방법을 수행하였다.
먼저, 냉장보관중인 남풍찰수수를 껍질을 포함하여 80 mesh로 분쇄하였다. 남풍찰수수 분말 100g에 70% 에탄올 또는 발효주정 1L를 가하여, 초음파 추출기를 이용하여 40℃ 이하에서 1시간씩 2회 반복 추출하였다. 이 후, 여과지(Whatman, No.2)를 사용하여 여과하고, 여액을 취하여 회전식 감압농축기를 사용하여 40℃ 이하에서 농축하여 에탄올을 제거하였다. 에탄올을 제거한 농축액은 동결건조기를 사용하여 건조하여 분말 형태의 최종 추출물(이하, 에탄올 추출물을 NEE라고 함)을 제조하였다. 상기 제조과정을 도 1에 나타내었다.
2. 남풍찰수수 메탄올 추출물의 제조
70% 에탄올 대신에 70% 메탄올을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하여 남풍찰수수 추출물을 얻었다.
3. 남풍찰수수 물 추출물의 제조
70% 에탄올 대신에 물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하여 남풍찰수수 추출물을 얻었다.
4. 남풍찰수수 석유에테르 추출물의 제조
70% 에탄올 대신에 석유에테르을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하여 남풍찰수수 추출물을 얻었다.
5. 남풍찰수수 수증기 증류 추출물의 제조
남풍찰수수의 건조분말 100g을 수증기 증류장치에 넣고 5시간 추출하여 남풍찰수수 추출물을 얻었다.
6. 남풍찰수수 초임계 유체 추출물의 제조
남풍찰수수의 건조분말 10g을 이산화탄소를 유체로 하는 초임계 추출 장치에 넣고 유량 2ml/min, 압력은 300 bar, 온도는 35℃~75℃에서 1시간 추출하여 남풍찰수수 추출물을 얻었다.
< 실시예 2> 남풍찰수수 추출물의 전립샘암에 대한 예방 및 치료 효과 확인
1.세포배양
인체 유래의 전립샘암세포(prostate adenocarcinoma cell)인 PC3세포를 한국세포주은행으로부터 제공받아 사용하였다. 5% CO2, 37°C 배양기에서 10% FBS(fetal bovine serum; Biowest, France), 1% anti-anti(Gibco, USA)를 혼합한 DMEM(Hyclone, USA)을 배지에서 세포를 배양하였다.
2. Cell counting kit -8을 이용한 세포생존율 측정
실시예 2.1의 배양중인 PC3 세포를 1.0 × 105 cells/mL이 되도록 준비한 후에 이를 96 well plate의 각 well에 100μL씩 분주하여 5% CO2, 37°C에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 배지에 NEE(실시예 1에서 제조한 남풍찰수수 추출물)를 농도가 0(대조군), 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 및 128μg/mL이 되도록 배지에 혼합하여 제조하였고, 배양중인 세포의 배지를 제거한 후에 각 농도별로 NEE가 혼합된 배지를 100μL씩을 첨가하여 배양하였다. 24시간 후, 세포가 있는 배지에 CCK-8(cell counting kit-8; Dojindo, USA)을 10μL를 첨가하고, 2시간 동안 배양기 안에서 반응하게 하였다. CCK-8 반응 후, microplate reader(Bio-TekTM, USA)를 사용하여 450nm 파장에서 96 well plate 각 well의 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 CCK-8이 세포에 의해서 환원된 양을 나타내는 것으로 각 well에 존재하는 세포의 수에 비례하게 된다. 측정된 흡광도는 NEE를 처치하지 않은 대조군(0μg/mL)을 100%로 하여 각각의 농도에 대한 흡광도를 상대적 수치로 환산하여 표시하였다. 상기 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 대조군(0μg/mL)의 세포생존율을 100%로 하였을 때, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 및 128μg/mL NEE 농도에 대해 각각 99.0%, 98.9%, 97.8%, 97.8%, 97.5%, 80.0%, 33.2%, 12.9% 및 11.8%의 생존율을 나타내었고, 특히, 16 내지 128μg/mL 농도에서는 통계학적으로 유의하게 세포생존율이 낮아진 것을 확인하였다(*: p<0.01).
3. DAPI 염색을 이용한 apoptotic body 관찰
상기 실시예 2.1에서 배양중인 PC3 세포를 2.0 × 105 cells/mL이 되도록 준비한 후, 이를 8 well slide glass의 각 well에 200μL씩 분주하여 5% CO2, 37°C에서 배양하였다. 24시간 후, 배지에 NEE를 농도가 0(대조군), 4, 8 및 16μg/mL이 되도록 배지에 혼합하여 제조하였고, 배양중인 세포의 배지를 제거한 후, 각 농도별로 NEE가 혼합된 배지를 200μL씩 첨가하여 배양하였다. 24시간 후, 각 well의 배지를 제거한 후에 95% 에탄올로 세포를 고정하고, 1μg/mL 농도의 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 용액으로 세포의 핵을 염색하였다. 이 후, 수용성봉입제를 사용하여 봉입하고, 형광현미경(Zeiss, German)을 사용하여 세포핵의 형태를 관찰하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 대조군(0μg/mL)에서 균일한 형태의 세포핵이 관찰되고 있으며, 대조군과 비교하여 NEE 4μg/mL 농도에서도 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, NEE 8μg/mL 및 16μg/mL 농도에서 크기가 작고 염색질의 응축으로 인하여 상대적으로 밝은 형광을 나타내는 apoptotic body(화살표)의 형성이 점차 증가된 것을 확인하였다. 따라서, 세포자멸사의 유도가 NEE의 농도에 의존적으로 증가하는 경향을 보임을 확인하였다.
4. 유세포분석기를 이용한 세포분포 측정
실시예 2.1에서 배양중인 PC3 세포를 2.0 × 105 cells/mL이 되도록 준비한 후, 이를 100mm 접시에 10mL씩 분주하여 5% CO2, 37°C에서 배양하였다. 24시간 후에 배지에 NEE를 농도가 0(대조군), 4, 8 및 16μg/mL이 되도록 배지에 혼합하여 제조하였고, 배양중인 세포의 배지를 제거한 후에 각 농도별로 NEE가 혼합된 배지를 10mL 첨가하여 배양하였다. 24시간 후에 각 접시의 배지는 제거하고 PBS(phosphate buffered saline; Hyclone, USA)로 세척하고, 각각 2.0 × 106 cells/mL이 되도록 동일하게 준비하였다. 이 중 0.1mL을 취하여 튜브로 옮기고, FITC annexin V apoptosis detection kit(BD Bioscience, USA)에 있는 annexin V-FITC와 PI(propidium iodide) 용액을 각 튜브에 첨가하여 세포를 염색하였다. 염색한 각각의 세포는 유세포분석기(BD FACSCaliburTM, BD Bioscience, USA)를 사용하여 정상세포, 죽은 세포, 세포자멸사 초기 및 세포자멸사 후기인 세포의 분포를 분석하였다. 이의 결과를 도 4 및 표 1에 나타내었다.
도 4 및 표 1에 나타난 바와 같이, NEE를 처치하지 않은 대조군(0μg/mL)에서 정상세포, 죽은 세포, 세포자멸사 초기 및 세포자멸사 후기인 세포의 분포가 73.40%, 1.20%, 9.86% 및 15.54%(총 세포자멸사: 25.40%)로 확인되었으며, NEE 4μg/mL 농도에서 68.15%, 1.31%, 10.79% 및 19.75%(총 세포자멸사: 30.54%)로, NEE 8μg/mL 농도에서 59.21%, 2.28%, 14.77% 및 23.74%(총 세포자멸사: 38.51%)로, NEE 8μg/mL 농도에서 49.03%, 3.87%, 17.02% 및 30.08%(총 세포자멸사: 47.10%)로 각각 나타남을 확인하여, NEE의 농도에 따라 세포자멸사가 증가되는 경향이 나타남을 확인하였다.
Quard cell population(%)
NEE concentration (?g/mL)
0 4 8 16
상단 왼쪽 (Dead) 1.20 1.31 2.28 3.87
하단 왼쪽 (Normal) 73.40 68.15 59.21 49.03
하단 오른쪽(Early apoptosis) 9.86 10.79 14.77 17.02
상단 오른쪽 (Late apoptosis) 15.54 19.75 23.74 30.08
총 세포자멸사 25.40 30.54 38.51 47.10
5. 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용한 세포내 단백질 발현 분석
실시예 2.1에 배양중인 PC3 세포를 2.0 × 105 cells/mL이 되도록 준비한 후, 이를 100mm 접시에 10mL씩 분주하여 5% CO2, 37°C에서 배양하였다. 24시간 후, 배지에 NEE를 농도가 0(대조군), 4, 8 및 16μg/mL이 되도록 배지에 혼합하여 제조하였고, 배양중인 세포의 배지를 제거한 후, 각 농도별로 NEE가 혼합된 배지를 10 mL 첨가하여 배양하였다. 24시간 후에 각 접시의 배지는 제거하고 PBS로 세척하고, 세포를 전부 모은 후에 RIPA 완충액(Thermo Scientific, USA)을 사용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 Detergent compatible Bradford assay reagent(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 단백질의 농도를 측정하고, 이를 바탕으로 동일한 양의 단백질을 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)에 전기영동하여 크기별로 분리하였으며, 이를 PVDF 막에 옮겼다. 이 후, PVDF 막은 5% 스킴 밀크(skim milk) 용액으로 blocking 하였다. 그 후 1차 항체로 Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3, GAPDH(cellsignaling technology, USA)를 4°C에서 약 16시간 이상 반응시켰고, 2차 항체로 anti-rabbit IgG(cellsignaling technology, USA)를 1시간 반응시켰다. 2차 항체 반응이 완료되면, Luminata crescendo western HRP substrate를 첨가하고, Sensi-Q2000 Chemidoc(Lugen sci., Korea)을 사용하여 막으로부터 해당 단백질과 1차 및 2차 항체에 의해 나타나는 밴드를 촬영하였다. 이의 결과를 도 5에서 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, NEE를 처치하지 않은 대조군(0μg/mL)과 비교하여 각 농도별로 NEE를 처치한 세포에서 Bcl-2 단백질의 발현이 점차 감소하였고, Bax 단백질은 증가하였으며, 활성 형태인 cleaved caspase-3의 발현이 증가함을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 남풍찰수수(Nampungchal Sorghum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 유전상수(dielectric constant)가 18 ~ 80인 극성용매 추출물, 유전상수가 1.88~4.81인 비극성용매 추출물, 수증기 증류 추출물 또는 초임계 유체법 추출물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제2항에서 있어서,
    상기 극성용매는 C1 내지 C4의 저급알코올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이며, 상기 비극성용매는 클로로포름, 석유에테르, 에테르, 부탄올, 헥산 및 톨루엔으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 Bcl-2 유전자의 발현을 감소시키고, Bax 유전자의 발현을 증가시키고, 활성 Caspase-3(cleaved Caspase-3)의 발현을 증가시킴으로써, 세포자멸사를 유도하여 암세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 남풍찰수수(Nampungchal Sorghum) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 전립선암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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우관식 et al, ‘찰수수 및 메수수 첨가 밥의 취반특성과 항산화활성’, 한작지(Korean J. Crop Sci.), 58(4): 399~407(2013)*

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