KR101559483B1

KR101559483B1 - 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경보호용 조성물

Info

Publication number: KR101559483B1
Application number: KR1020120126792A
Authority: KR
Inventors: 김종평; 함민수; 배미정
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2015-10-12
Also published as: KR20140060106A

Abstract

본 발명의 해조류 추출물 또는 이의 분획물은 신경세포에 대하여 세포 독성이 거의 없고, 글루타메이트 독성에 대한 산화적 스트레스를 억제할 수 있으므로, 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 뇌질환 치료용 약학적 조성물 또는 신경보호용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경보호용 조성물{Neuroprotective composition comprising extracts or fractions of seaweed as an active ingredient}

본 발명은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경보호용 조성물 또는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

글루타메이트(glutamate)는 중추신경계(CNS)에서 주된 흥분성 신경전달물질(excitatory neuro-transmitter)로 작용하며 대사성 수용기(metabotropic receptor)와 이온성 수용기(ionotropic receptor)들(NMDA-, quisqualate-, kainate-type)과 결합하여 여러 가지 신경 생리학적 효과를 나타낸다. 신경세포 외로 방출된 글루타메이트는 시냅스 전 말단(presynaptic terminal)으로 직접 재흡수되거나 Na⁺-dependent high affinity transporter에 의해 성상세포(astrocyte)(교질세포(glial cell))내로 흡수된 후, ATP를 요구하는 글루타민 합성효소(glutamine synthase)에 의해 글루타민(glutamine)으로 전환되어 시냅스 전 말단으로 이동하게 된다.

이러한 시냅스 전 말단과 성상세포의 작용으로 세포 외부의 글루타메이트 농도는 0.3 μM의 저농도로 유지되게 된다. 그러나, 뇌가 뇌허혈(ischemia), 저산소증(hypoxia), 발작(seizure), 저혈당증(hypoglycemia), 뇌외상(trauma) 등에 걸리면 글루타메이트 수송에 필요한 에너지 공급이 부족하게 되어, 세포 외 글루타메이트 농도는 정상상태의 10,000배인 3 mM 정도로 증가하며, 이로 인해 중추신경 세포가 죽게 된다. 이러한 글루타메이트에 의한 신경 세포사는 글루타메이트로 유도된(glutamate-induced) 신경독성(neurotoxicity)으로 불리고 있으며, 세포 내의 자유 라디칼(free radical)의 발생에 의한 산화 스트레스(oxidative stress)와 매우 밀접한 관계가 있다. 따라서, 글루타메이트 독성에 의한 신경세포의 사멸이 세포 내에 과량으로 발생한 자유 라디칼에 의한 지질, 당, 핵산, 단백질 등의 세포구성성분의 파괴에 의한 것임이 밝혀짐으로써 이를 억제할 수 있는 자유 라디칼 제거제(free radical scavenger)와 같은 지질과산화 저해물질은 뇌세포를 보호할 수 있는 새로운 치료소재로서 매우 중요한 의미가 있다.

글루타메이트의 세포 외 농도 증가는 뇌허혈, 뇌졸중, 뇌외상, 저산소증, 저혈당증, 발작 등의 급성질환뿐만 아니라, 헌팅턴 병(Huntington's disease, HD), 파킨슨 병(Parkinson's disease, PD), 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)과 같은 만성질환에도 관여하는 것으로 알려져있다. NIH의 조사 결과에 의하면 급성질환의 하나인 뇌졸중(stroke)은 미국인의 세 번째 사망원인이며, 성인불구의 가장 큰 원인이 되고 있다. 매년 50만 명의 환자가 발생하며, 이중 30%는 사망하고 20 ~ 30%는 영구 불구자가 되고 나머지는 신체 불구, 신체마비, 시력감퇴, 기억상실 등의 고통을 받고 있다. 또한, 우리나라에서도 암에 이어서 사망 원인 2위의 중요한 질병으로 대두하여, 이러한 질병에 대한 치료제가 강력히 요구되고 있다.

글루타메이트는 이온성 수용기(ionotropic receptor), 대사성 수용기(metabotropic receptor)의 두 가지 수용기(receptor)와 결합한다. 이온성 수용기는 이온 채널(ion channel)과 연관되어 있으며, 신경세포에 독립적으로 작용하여 흥분독성 손상(excitotoxic damage)을 주게 된다. 반면, 대사성 수용기의 경우는 이온성 수용기와는 달리 글루타메이트가 직접적인 신경 세포사를 야기하지는 않는다.

이온성 수용기에 글루타메이트가 결합하여 일으키는 신경 세포사는 Na⁺와 Cl^-의존성과 Ca² ⁺ 의존성의 두 가지로 나눌 수 있다. Na⁺와 Cl^-의존성 신경 세포사는 글루타메이트에 노출된 후, 수 분 안에 일어나며 감극 물질(depolarizing agent)을 처리한 것과 유사한 신경 세포사를 보인다. 글루타메이트가 쿼스퀄산 수용기(quisqualate receptor)를 자극하여 Na⁺이온이 세포 내로 과량 유입되며, Na⁺이온의 유입과 함께 Cl^-, H₂O가 세포 내부로 들어와 세포가 팽윤(swelling)하여 결국 용해(lysis)된다.

Ca² ⁺ 의존성 신경 세포사는 딜레이드 신경 손상(delayed neuronal damage)로 글루타메이트 처리 후 수 시간이 지나서 일어나며, Ca² ⁺이온투과담체(ionophore)인 A23187을 처리하였을 때와 유사하다. Na⁺이온의 유입은 세포막의 탈분극(depolarization)을 야기하며 이로 인해 전압 민감성 있는 Ca² ⁺채널(voltage sensitive Ca² ⁺ channel, VSCC)과 Mg² ⁺에 의해서 닫혀 있던 NMDA 수용체 Ca² ⁺ 채널이 열리게 된다. 이로 인해 다량의 Ca² ⁺이 세포 내로 유입되게 된다. 이렇게 유입된 Ca² ⁺ion은 포스포리파아제(phospholipase A_2,PLA₂), 산화질소 합성효소(nitric oxide synthetase, NOS), 프로테아제(protease), 엔도뉴클레아제(endonuclease)등의 Ca² ⁺의존성 효소들을 활성화한다. 특히 PLA₂는 인지질(phospholipid)를 분해하여 아라키돈산(arachidonic acid)을 생성시키며, 아라키돈산의 대사과정 중에 과산화물(superoxide)과 같은 자유라디칼이 발생한다.

또한, 아라키돈산과 과산화물은 시냅스전 뉴런(presynaptic neuron)에서의 글루타메이트 분비를 촉진시켜 세포 외의 글루타메이트 농도를 더욱 증가시킨다. 크산틴산화효소(Xanthine oxidase)의 작용으로 과산화물들이 생성되며, NOS의 작용으로 생성된 산화 질소(nitric oxide)는 과산화물과 반응하여 페록시나이트라이트(peroxynitrite)를 거쳐 반응성이 큰 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)이 생성된다. 즉, PLA₂, NOS, 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 등의 효소 작용 결과 세포 내에 자유 라디칼이 과다하게 생성되어 이로 인한 산화 스트레스(oxidative stress)로 인하여 DNA, 단백질(protein), 지질(lipid) 등이 비선택적으로 파괴되어 신경세포가 죽게 되며 또한 엔도뉴클레아제(endonuclease)의 작용으로 세포자멸사(apoptosis)가 일어나기도 한다.

이러한 글루타메이트의 독성기작을 연구하기 위하여 글루타메이트 독성에 민감한 N18-RE-105 세포주가 이용되고 있다. 상기 N18-RE-105 세포주는 마우스 신경모세포종 클론(mouse neuroblastoma clone) N18TG-2와 18일된 피셔 랫(Fisher rat)의 배아의 신경 망막 세포(embryonic neural retina)의 세포융합에 의해서 제작된다.

N18-RE-105 세포주는 해마(hippocampus)에 존재하는 글루타메이트 수용기(glutamate receptor)와 유사한 수용기가 있고, 세포내 자유 라디칼의 축적을 통한 산화적 손상에 의한 세포 사멸을 일으키는 딜레이드 칼슘 의존성 세포 사멸(delayed calcium dependent cell death)을 보이며, 이는 글루타메이트 독성에 의한 실제 뇌신경 세포사멸과 매우 유사한 특징을 가진다. 따라서, 이러한 특성으로 인해 상기 N18-RE-105 세포주는 시험관 내 허혈 모델(in vitro ischemic model)로 이용되며, 글루타메이트 독성 기작 연구에 이용된다.

N18-RE-105 세포주에서의 글루타메이트 독성은 글루타메이트에 의한 시스테인 흡수(cystein uptake)의 저해에서 기인하는 것으로 알려져 있다. 시스테인은 세포 내에서 글루타시온(glutathione)을 구성하는 중요한 아미노산이다. N18-RE-105 세포에서는 상기 시스테인과 글루타메이트가 세포막을 통하여 서로 연관하면서 서로 반대방향으로 수송된다. 세포 외의 글루타메이트 농도가 증가하여 시스테인이 세포내로 유입되지 않으면 글루타시온의 농도가 감소하게 되며 세포 내에 자유 라디칼이 축적되어 결국 신경세포는 죽게 된다. 이러한 사실은 또한 배아의 대뇌피질성 신경(embryonic cortical neuron)의 초대 배양(primary culture)에서도 확인되어 쿼스퀄산-형 글루타메이트 독성(quisqualate-type glutamate toxicity)은 주로 산화 스트레스(oxidative stress)에 의한 것임이 시사되었다.

이상과 같이 글루타메이트가 뇌졸증(stroke), 뇌외상(trauma) 등과 같은 급성 뇌신경질환의 원인이 되며, 또한 PD, AD, HD와 같은 만성 뇌질환에서도 글루타메이트 독성에 의한 산화적 스트레스가 그 원인 중 하나라고 알려져 있다. 이에 따라 글루타메이트 독성에 의한 산화적 스트레스를 억제 또는 완화할 수 있는 지질과산화 억제물질과 같은 항산화 활성물질은 급성, 만성의 뇌신경 질환의 치료제로 기대된다. 이에 따라 in vivo에 가까운 조직(tissue) 또는 배양세포를 이용하여 글루타메이트 독성 억제물질을 탐색하면 지금까지 알려진 표적에 작용하는 물질뿐만 아니라, 새로운 신경세포 보호기작을 갖는 새로운 물질의 창출도 가능하리라 기대된다.

해조류는 다시마 · 미역 · 톳 · 실말 등의 갈조류와 김 · 우뭇가사리 등의 홍조류, 그리고 파래 등의 녹조류 세 가지로 크게 구분된다. 알칼리 식품인 해조류에는 단백질, 당질, 비타민, 무기질 등이 많이 함유되어 있다. 즉 해조류는 피를 맑게 해주고 자유 라디칼 생성을 억제하며, 식이섬유가 풍부하여 변비 예방에 좋은 것으로 알려져 있다. 해조류에 함유되어 있는 철은 빈혈(貧血)을 예방한다. 고혈압, 동맥경화 등 각종 성인병(생활습관병)과 장암 등 각종 암 발생을 예방하는 데 도움이 되는 것으로 알려져 있다.

글루타메이트에 의해서 야기되는 뇌졸중이 세계적으로 심각한 질병으로 대두하면서 이에 대한 치료제 개발이 활발히 진행되고 있다. 특히, 자유 라디칼가 글루타메이트 독성에 의한 신경 세포사의 주된 최종 원인 물질이기 때문에 새로운 자유 라디칼 제거제 또는 지질과산화 억제제와 같은 항산화 물질에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. Upjohn사가 개발한 21-아미노 스테로이드(21-amino steroid)의 아민 단위(amine unit)와 비타민 E(vitamin E)의 테트라메틸-크로만 링(tetramethyl-chroman ring)으로 구성된 지질과산화 저해물질 U78517F 화합물은 in vivo 실험에서 강한 뇌졸중 치료효과를 보인다고 보고되었으며, 벤조푸란(benzofuran)을 기본골격으로 하는 항산화 활성물질 IRFI-016은 뇌허혈후 재환류시 뇌세포의 손상을 크게 억제하는 효과를 나타낸다고 보고되었다. 또한 자유 라디칼 소거물질로 알려진 퀴논(quinonoe)계의 이데베논(idebenone)은 N18-RE-105 세포에서의 글루타메이트 세포독성을 강력하게 저해하는데, in vivo 실험에서도 뇌동맥경화증 및 뇌혈관 장애성 치매에 대하여 치료효과를 나타내어, 현재 일본에서 심장수술 후, 장기이식 후의 뇌대사 부활제로서 임상시험중인 물질로 알려져 있다. 1996년 6월에 일본 Takeda사에서 개발한 과산화 저해제인 TAK-218 화합물은 자유 라디칼와 비정상적인 자유 도파민(free dopamine)을 소거함으로써 신경보호(neuroprotective)와 항-허혈(anti-ischemic) 효과를 보인다고 보고되었다.

아울러, 글루타메이트 독성과 관련하여, 글루타메이트로 독성을 유발한 생쥐의 해마 유래 세포주인 HT22 세포주를 대상으로 백두산 자생식물 추출물이 세포생존율에 대한 증가 여부를 관찰하여 뇌 세포 보호 활성을 평가한 논문이 보고된바 있다(생약학회지, Kor. J. Pharmacogn. 39(3) : 213∼217(2008)). 또한, 국내·외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 뇌신경세포계 hybridoma N18-RE-105 세포주를 이용하여 신경세포 보호효과를 갖는 천연물의 탐색을 시도한 결과, 제비꽃(Viola mandshurica)으로부터 강력한 신경세포 보호효과를 확인하고 이에 대한 내용이 등록된바 있다(대한민국 등록특허 10-0982022). 아울러, 둥근마 조추출물 및 비극성 용매 가용추출물이 글루타메이트 및 과산화수소 신경 독성에 의한 세포사멸을 차단하여 뇌신경 세포 보호활성에 유의적인 효과를 확인한바 있다(대한민국 등록특허 10-0776347). 그러나, 해조류 추출물 또는 이의 분획물의 뇌신경 세포 보호활성에 관하여는 아직까지 보고된 바가 전혀 없다.

종합하여, 본 발명은 종래의 기술에서 제시하고 있지 않은 해조류 추출물 또는 이의 분획물의 신경세포 보호 효과를 밝힌 것으로, 상기 해조류 추출물 또는 이의 분획물이 신경세포에 대하여 세포 독성이 거의 없고, 글루타메이트 독성에 대한 산화적 스트레스를 억제할 수 있음을 확인하여, 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 뇌질환 치료용 약학적 조성물 또는 신경보호용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경보호용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경보호용 건강식품을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 다른 목적은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경보호용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경보호용 건강식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

도 1은 글루타메이트의 흥분독성(excitotoxic) 효과가 관여된 과정의 간략한 도식이다:
VSCC; 전압-민감성 칼슘 채널(voltage-sensitive calcium channel);
NOS; 산화 질소 합성효소(nitric oxide synthase);
PLA2; 포스포리파아제 A2(phospholipase A2);
AA; 아라키돈산(arachidonic acid);
DG; 디아실글리세롤(diacyl glycerol);
Glut; 글루타메이트(glutamate);및
IP3; 이노시톨 3인산염(inositol triphosphate).
도 2는 패 추출물의 N18-RE-105 신경세포 보호 활성을 나타낸 도이다:
A. Glutamate를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포;
B. Glutamate(20mM)를 처리한 N18-RE-105 세포; 및
C. Glutamate(20mM)과 패 추출물 45 ㎍/ml를 처리한 N18-RE-105 세포.
도 3은 패 추출물 및 이의 분획물의 N18-RE-105 신경세포주에 대한 글루타메이트 독성 억제 결과 나타난 세포 생존율을 나타낸 그래프이다:
(-) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포주;및
(+) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리한 N18-RE-105 세포주.
도 4는 모자반 추출물의 N18-RE-105 신경세포 보호 활성을 나타낸 도이다:
A. Glutamate를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포;
B. Glutamate(20mM)를 처리한 N18-RE-105 세포;및
C. Glutamate(20mM)과 모자반 추출물 45 ㎍/ml를 처리한 N18-RE-105 세포.
도 5는 모자반 추출물 및 이의 분획물의 N18-RE-105 신경세포주에 대한 글루타메이트 독성 억제 결과 나타난 세포 생존율을 나타낸 그래프이다:
(-) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포주;및
(+) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리한 N18-RE-105 세포주.
도 6은 지충이 추출물의 N18-RE-105 신경세포 보호 활성을 나타낸 도이다:
A. Glutamate를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포;
B. Glutamate(20mM)를 처리한 N18-RE-105 세포; 및
C. Glutamate(20mM)과 지충이 추출물 45 ㎍/ml를 처리한 N18-RE-105 세포.
도 7은 지충이 추출물 및 이의 분획물의 N18-RE-105 신경세포주에 대한 글루타메이트 독성 억제 결과 나타난 세포 생존율을 나타낸 그래프이다:
(-) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포주;및
(+) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리한 N18-RE-105 세포주.
도 8은 톳 추출물의 N18-RE-105 신경세포 보호 활성을 나타낸 도이다:
A. Glutamate를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포;
B. Glutamate(20mM)를 처리한 N18-RE-105 세포;및
C. Glutamate(20mM)과 톳 추출물 45 ㎍/ml를 처리한 N18-RE-105 세포.
도 9는 톳 추출물 및 이의 분획물의 N18-RE-105 신경세포주에 대한 글루타메이트 독성 억제 결과 나타난 세포 생존율을 나타낸 그래프이다:
(-) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포주;및
(+) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리한 N18-RE-105 세포주.
도 10은 미역 추출물의 N18-RE-105 신경세포 보호 활성을 나타낸 도이다:
A. Glutamate를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포;
B. Glutamate(20mM)를 처리한 N18-RE-105 세포; 및
C. Glutamate(20mM)과 미역 추출물 45 ㎍/ml를 처리한 N18-RE-105 세포.
도 11은 미역 추출물 및 이의 분획물의 N18-RE-105 신경세포주에 대한 글루타메이트 독성 억제 결과 나타난 세포 생존율을 나타낸 그래프이다:
(-) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포주;및
(+) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리한 N18-RE-105 세포주.
도 12은 다시마 추출물의 N18-RE-105 신경세포 보호 활성을 나타낸 도이다:
A. Glutamate를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포;
B. Glutamate(20mM)를 처리한 N18-RE-105 세포; 및
C. Glutamate(20mM)과 다시마 추출물 45 ㎍/ml를 처리한 N18-RE-105 세포.
도 13은 다시마 추출물 및 이의 분획물의 N18-RE-105 신경세포주에 대한 글루타메이트 독성 억제 결과 나타난 세포 생존율을 나타낸 그래프이다:
(-) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리하지 않은 N18-RE-105 세포주;및
(+) Glut: Glutamate(20 mM)를 처리한 N18-RE-105 세포주.
도 14는 해조류 추출물로부터 추출 분획물을 제조하는 방법을 나타낸 도식이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경보호용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₂ 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 해조류는 패(Ishige okamurai), 모자반(Sargassum fulvellum), 지충이(Sargassum thunbergii), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinnatifida) 및 다시마(Laminaria ochotensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 분획물은 해조류 추출물을 메탄올 또는 에탄올로 추출한 후, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 추출하여 제조된 것일 수 있고, 보다 구체적으로 클로로포름일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 해조류는 패(Ishige okamurai), 모자반(Sargassum fulvellum), 지충이(Sargassum thunbergii), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinnatifida) 및 다시마(Laminaria ochotensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 분획물은 해조류 추출물을 메탄올 또는 에탄올로 추출한 후, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 추출하여 제조된 것일 수 있고, 구체적으로 클로로포름일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 혈전증(thrombosis), 색전증(em-bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 소경색(lacune), 뇌졸중, 뇌일혈, 뇌경색, 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애 및 뇌 기능혼수로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 해조류 추출물의 추출 방법으로는 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출, 초임계추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 열수추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 3회 반복 추출하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 건조된 해조류에 0.1 내지 10배 첨가할 수 있으며, 0.3 내지 5배 첨가하는 것일 수 있다. 추출온도는 20 내지 40 ℃인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 12 내지 48시간인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 방법으로 추출한 해조류 추출물은 감압농축될 수 있고, 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 글루타메이트 독성에 민감한 신경 융합(neuronal hybridoma) 세포(mouse neuroblastoma cloneN18TG-2×Fisherrat18-day embryonic neuronalretina)인 N18-RE-105 세포주에 대하여 해조류 추출물 또는 이의 추출물 분획물이 고농도의 글루타메이트를 처리한 N18-RE-105 세포주의 사멸을 억제하여 신경세포를 보호하는 활성이 매우 뛰어나다는 것을 확인하였다.

구체적으로, 해조류 추출물은 패(Ishige okamurai), 모자반(Sargassum fulvellum), 지충이(Sargassum thunbergii), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinnatifida), 다시마(Laminaria ochotensis) 각각을 알콜과 물 혼합용액으로 추출한 다음 감압 농축하여 제조하였다. 상기 제조된 각 해조류의 추출물을 물에 현탁시키고, 클로로폼(CHCl₃), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(C₄H₉OH)을 사용하여 순차적으로 추출해내었다.

패, 모자반, 지충이 톳, 미역, 다시마 각각의 추출물의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였으며, 패, 모자반, 지충이 톳, 미역, 다시마 각각의 추출물 및 이의 분획물의 처리 농도에 따른 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성억제 활성을 세포 생존율(viability)을 측정하였고, 측정된 값으로부터 신경세포 보호활성을 산출하였다.

그 결과, 패추출물이 처리되지 않은 세포구에서는 글루타메이트 독성에 의하여 40%의 세포만이 살아 있으나 패 추출물(45 ㎍/ml)은 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 80% 이상의 세포가 살아 있게 하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었고(도 2 참조), 패 추출물 및 이의 분획물도 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 3 참조). 아울러, 신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 패 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 패 추출물의 IC₅₀은 32.4 ㎍/ml로 매우 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 15.1 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(34.3 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(53.2 ㎍/ml), 물 추출 분획물(71.4 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 1 참조).

모자반 추출물이 처리되지 않은 세포구에서는 글루타메이트 독성에 의하여 40%의 세포만이 살아 있으나 패 추출물(45 ㎍/ml)은 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 80% 이상의 세포가 살아 있게 하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타냈고(도 4 참조), 모자반 추출물 및 이의 분획물도 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 5 참조). 아울러, 신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 모자반 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 모자반 추출물의 IC₅₀은 33.0 ㎍/ml로 매우 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 17.7 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(49.0 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(66.6 ㎍/ml), 물 추출 분획물(76.6 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 2 참조).

지충이 추출물(45 ㎍/ml)은 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 80% 이상의 세포가 살아 있게 하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었고(도 6 참조), 지충이 추출물 및 이의 분획물도 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 7 참조). 아울러, 신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 지충이 추출물과 이의 용매 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 지충이 추출물의 IC₅₀은 29.4 ㎍/ml로 매우 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 13.8 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(31.8 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(54.6 ㎍/ml), 물 추출 분획물(82.3 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 3 참조).

톳 추출물(45 ㎍/ml)은 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 60% 이상 세포가 살아 있게 하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었고(도 8 참조), 톳 추출물 및 이의 분획물의 처리 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 9 참조). 아울러, 신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 톳 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 톳 추출물의 IC₅₀은 57.9 ㎍/ml로 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 27.3 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(55.4 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(73.6 ㎍/ml), 물 추출 분획물(101.3 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 4 참조).

미역 추출물(45 ㎍/ml)은 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 75% 이상의 세포가 살아있게 하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었고(도 10 참조), 미역 추출물 및 이의 분획물의 처리 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 11 참조). 아울러, 신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 미역 추출물과 이의 용매 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 미역 추출물의 IC₅₀은 35.5 ㎍/ml로 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 18.0 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(39.1 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(62.5 ㎍/ml), 물 추출 분획물(45.7 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 5 참조).

다시마 추출물(45 ㎍/ml)은 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 80% 이상의 세포가 살아있게 하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었고(도 12 참조), 다시마 추출물 및 이의 분획물도 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 13 참조). 아울러, 신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 다시마 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 다시마 추출물의 IC₅₀은 27.6 ㎍/ml로 매우 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 16.4 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(49.7 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(61.8 ㎍/ml), 물 추출 분획물(97.1 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 6 참조).

따라서, 상기 해조류 추출물 또는 이의 분획물이 신경세포에 대하여, 세포독성이 없고, 글루타메이트(glutamate) 독성 억제 활성이 우수한 것을 확인하였으므로, 상기 해조 추출물 또는 이의 분획물을 신경보호용 약학적 조성물 및, 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.

본 발명의 신경보호용 약학적 조성물 및, 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물은 해조류 추출물, 이의 활성 분획물을 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 해조류 추출물, 이의 활성 분획물 또는 이들의 혼합물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏일 수 있고, 구체적으로 0.001 ~ 1 g/kg일 수 있으며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 뇌질환 예방 및 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 또는 수술, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

아울러, 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 해조류 추출물, 이의 활성 분획물 또는 이들의 혼합물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물, 분획물 또는 혼합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 해조류 추출물은 열수 및 에탄올을 이용하여 추출하는 것이 바람직하며, 상기 에탄올의 농도는 50% 내지 100%인 것이 바람직하다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 해조류 추출물, 이의 활성 분획물 또는 이들의 혼합물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 해조류 추출물, 이의 활성 분획물 또는 이들의 혼합물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 해조류 추출물, 이의 활성 분획물 또는 이들의 혼합물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

따라서, 상기 해조류 추출물 또는 이의 분획물이 신경세포에 대하여, 세포독성이 없고, 글루타메이트(glutamate) 독성 억제 활성이 우수한 것을 확인하였으므로, 상기 해조 추출물 또는 이의 분획물을 신경보호용 건강기능식품 및, 뇌질환 예방 및 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 해조류 추출물 제조

해조류 추출물은 패(Ishige okamurai), 모자반(Sargassum fulvellum), 지충이(Sargassum thunbergii), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinnatifida), 다시마(Laminaria ochotensis) 각각을 알콜과 물 혼합용액 (알콜:물 8:2)으로 추출한 다음 감압 농축하여 제조하였다.

<1-1> 패 추출물의 제조

제주도 해안에서 채취한 후 음건한 패 500 g을 메탄올과 물 혼합 수용액 (메탄올:증류수 8:2) 5 리터로 추출한 다음 추출액을 여과지로 여과한 후 감압농축하여 패 추출물을 제조하였다. 상기 과정을 통해 수득한 패 추출물 각각의 수득량은 31.5 g 이었다.

<1-2> 모자반 추출물의 제조

제주도 해안에서 채취한 후 음건한 모자반 500 g을 메탄올과 물 혼합 수용액 (메탄올:증류수 8:2) 5 리터로 추출한 다음 추출액을 여과지로 여과한 후 감압농축하여 모자반 추출물을 제조하였다. 상기 과정을 통해 수득한 모자반 추출물 각각의 수득량은 46.8 g 이었다.

<1-3> 지충이 추출물의 제조

제주도 해안에서 채취한 후 음건한 지충이 500 g을 메탄올과 물 혼합 수용액 (메탄올:증류수 8:2) 5 리터로 추출한 다음 추출액을 여과지로 여과한 후 감압농축하여 지충이 추출물을 제조하였다. 상기 과정을 통해 수득한 지충이 추출물 각각의 수득량은 31.0 g 이었다.

<1-4> 톳 추출물의 제조

제주도 해안에서 채취한 후 음건한 톳 500 g을 메탄올과 물 혼합 수용액 (메탄올:증류수 8:2) 5 리터로 추출한 다음 추출액을 여과지로 여과한 후 감압농축하여 톳 추출물을 제조하였다. 상기 과정을 통해 수득한 톳 추출물 각각의 수득량은 33.4 g 이었다.

<1-5> 미역 추출물의 제조

제주도 해안에서 채취한 후 음건한 미역 500 g을 메탄올과 물 혼합 수용액 (메탄올:증류수 8:2) 5 리터로 추출한 다음 추출액을 여과지로 여과한 후 감압농축하여 미역 추출물을 제조하였다. 상기 과정을 통해 수득한 미역 추출물 각각의 수득량은 50.4 g 이었다.

<1-6> 다시마 추출물의 제조

제주도 해안에서 채취한 후 음건한 다시마 500 g을 메탄올과 물 혼합 수용액 (메탄올:증류수 8:2) 5 리터로 추출한 다음 추출액을 여과지로 여과한 후 감압농축하여 다시마 추출물을 제조하였다. 상기 과정을 통해 수득한 다시마 추출물 각각의 수득량은 39.8 g 이었다.

< 실시예 2> 해조류 추출물의 분획물의 제조

<2-1> 패 추출물의 분획물의 제조

상기 <실시예 1>에서 제조된 패 추출물 31.5 g 을 물 3.5 리터(liter)에 현탁시키고, 클로로폼(CHCl₃), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(C₄H₉OH)을 각 용매 4 리터(liter)를 사용하여 순차적으로 추출해내었다. 상기 실시예를 통하여, 클로로포름 분획물 7.5 g, 에틸아세테이트 분획물 8.0 g, 부탄올 분획물 7.2 g을 수득하였다. 이와 관련하여, 해조류 추출물의 추출 분획물 제조방법은 도 14에 기재하였다(도 14).

<2-2> 모자반 추출물의 분획물의 제조

상기 <실시예 1>에서 제조된 모자반 추출물 46.8 g 을 물 3.5 리터(liter)에 현탁시키고, 클로로폼(CHCl₃), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(C₄H₉OH)을 각 용매 4 리터(liter)를 사용하여 순차적으로 추출해내었다. 상기 실시예를 통하여, 클로로포름 분획물 19.5 g, 에틸아세테이트 분획물 14.1 g, 부탄올 분획물 10.2 g을 수득하였다.

<2-3> 지충이 추출물의 분획물의 제조

상기 <실시예 1>에서 제조된 지충이 추출물 31.0 g 을 물 3.5 리터(liter)에 현탁시키고, 클로로폼(CHCl₃), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(C₄H₉OH)을 각 용매 4 리터(liter)를 사용하여 순차적으로 추출해내었다. 상기 실시예를 통하여, 클로로포름 분획물 8.5 g, 에틸아세테이트 분획물 7.3 g, 부탄올 분획물 6.2 g을 수득하였다.

<2-4> 톳 추출물의 분획물의 제조

상기 <실시예 1>에서 제조된 톳 추출물 33.4 g 을 물 3.5 리터(liter)에 현탁시키고, 클로로폼(CHCl₃), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(C₄H₉OH)을 각 용매 4 리터(liter)를 사용하여 순차적으로 추출해내었다. 상기 실시예를 통하여, 클로로포름 분획물 12.5 g, 에틸아세테이트 분획물 7.3 g, 부탄올 분획물 6.7 g을 수득하였다.

<2-5> 미역 추출물의 분획물의 제조

상기 <실시예 1>에서 제조된 미역 추출물 50.4 g 을 물 4 리터(liter)에 현탁시키고, 클로로폼(CHCl₃), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(C₄H₉OH)을 각 용매 4 리터(liter)를 사용하여 순차적으로 추출해내었다. 상기 실시예를 통하여, 클로로포름 분획물 17.1 g, 에틸아세테이트 분획물 12.3 g, 부탄올 분획물 11.6 g을 수득하였다.

<2-6> 다시마 추출물의 분획물의 제조

상기 <실시예 1>에서 제조된 다시마 추출물 39.8 g 을 물 4 리터(liter)에 현탁시키고, 클로로폼(CHCl₃), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(C₄H₉OH)을 각 용매 5 리터(liter)를 사용하여 순차적으로 추출해내었다. 상기 실시예를 통하여, 클로로포름 분획물 5.9 g, 에틸아세테이트 분획물 10.3 g, 부탄올 분획물 11.6 g을 수득하였다.

< 실시예 3> N18 - RE -105 세포의 배양

N18-RE-105 세포주는 글루타메이트 독성에 민감한 신경 융합(neuronal hybridoma)세포이다. 상기 N18-RE-105 세포주는 뇌의 해마에 존재하는 글루타메이트 수용체(glutamate receptor)와 유사한 수용체를 가지고 있고, 세포내 자유 라디칼(free radical)의 축적을 통한 산화적 손상에 의한 세포 사멸을 일으키는 딜레이드(delayed) 칼슘의존성 세포사멸을 보이며, 이는 글루타메이트 독성에 의한 실제 뇌신경 세포사멸과 매우 유사한 특징을 가진다. 따라서, 본 발명에서는 글루타메이트에 의한 독성을 억제하는 활성을 측정하기 위하여, 상기 N18-RE-105 세포를 이용하였다. N18-RE-105 세포 배양은 하기와 같다.

N18-RE-105 세포주는 Dulbesco's modified Eagle's medium(DMEM)에 HAT supplement(0.1 mM hypoxanthin, 0.04 mM aminopterin, 0.14 mM thymidine)와 열처리한 우태혈청(fetal calf serum, FCS) 10%를 넣은 배지를 사용하여 배양하였다. 세포의 배양조건은 5% CO₂, 37℃이며 매 2일 마다 계대배양하였다. N18-RE-105 세포의 보관은 DMEM 배지에 10% DMSO와 20% 우태혈청을 넣은 배지를 사용하였으며, -75℃에서 24시간 둔 후 액체질소에서 보관하였다.

< 실험예 1> 해조류 추출물 또는 이의 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

<1-1> N18 - RE -105 세포 배양 및 해조류 추출물 또는 이의 분획물의 처리

N18-RE-105 세포주를 T-25 플라스크(flask)에서 48시간 배양한 후 트립신(trypsin) 용액(3 ml)을 사용하여 배양기에서 2분간 배양시켜 세포를 플라스크에서 분리하였다. 배지 1 ml을 넣어 트립신을 중화시킨 후, 1000 rpm에서 3분간 원심분리한 다음 상등액을 제거한 후 세포를 배지로 현탁하였다.

혈구계(Hemocytometer)를 이용하여 세포수를 계산하여 웰(well) 당 세포수가 5×10⁴개가 되도록 96 웰 마이크로플레이트(well microplate)에 100 ㎕씩 분주했다. 세포를 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양한 후 인산완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)에 녹인 글루타메이트(400 mM) 용액 5 ㎕을 처리하였다. 또한, 상기 글루타메이트 용액의 처리와 함께, 해조류 추출물의 글루타메이트 독성 억제 활성을 확인하고자, 상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>에서 제조된 각 해조류 추출물 또는 이의 분획물을 DMSO에 희석하고, 이 용액을 다시 PBS 용액으로 10배 희석하여 0.3 mg/ml, 0.5 mg/ml 및 1.0 mg/ml 농도의 시료를 제조한 다음 각 농도별 해조류 추출물 또는 이의 분획물 용액 5 ㎕를 처리하였다.

<1-2> 패 추출물 또는 이의 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

<1-2-1> 위상차 현미경을 이용한 패 추출물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-1>에서 제조된 패 추출물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 위상차 현미경(phase contrast microscope)를 이용해 관찰하였다.

위상차 현미경 관찰 결과, 본 발명의 패 추출물은 신경 융합(neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 억제하여, 뛰어난 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다. N18-RE-105 세포에 글루타메이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여 글루타메이트를 처리한 세포들에서는 팽윤(swelling)과 수포(blebbing) 및 용해(lysis)가 일어나 40%의 세포만이 살아 있었으나, 패 추출물 최종농도 45 ㎍ /ml이 첨가된 시료구의 세포들은 세포의 모양이 변하지 않았으며 글루타메이트에 의한 세포사멸을 80% 이상 억제하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다(도 2).

<1-2-2> 세포 생존율을 이용한 패 추출물 및 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-1>에서 제조된 패 추출물 및 실시예 <2-1>에서 제조된 패 추출물의 분획물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 각 실험군의 세포 생존율을 EZ-Cytox assay(dehydrogenase assay)를 이용하여 평가하였다.

이와 함께 EZ-Cytox assay(dehydrogenase assay)로 살아있는 세포를 측정하여 정량하였다. EZ-Cytox assay는 시료처리 후 24시간 동안 배양한 세포에 plate well 당 EZ-Cytox assay reagent 10 ㎕를 처리한 후 배양기내에서 3시간 동안 배양한 다음 반응 배양액 70 ㎕씩을 새로운 96-well plate에 옮긴 후 miroplate reader(Molecular devices사)로 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 하기 수학식 1을 이용하여 세포 생존율(cell viability)을 산출하였으며, 그 결과값을 다시 하기의 수학식 2를 이용하여 신경세포 보호활성을 산출하였다.

상기 A는 각 웰(well)의 흡광도; 및

Ac는 글루타메이트(Glutamate)를 처리하지 않은 웰(well)의 흡광도이다.

상기 Vc는 글루타메이트(Glutamate)를 처리하지 않은 웰(well)의 세포생존율이고;

Vg는 글루타메이트(Glutamate)를 처리한 웰(well)의 세포생존율이고; 및

Vs는 글루타메이트(Glutamate) 및 시료를 처리한 웰(well)의 세포생존율이다.

그 결과, 패 추출물 및 이의 분획물의 처리 농도에 따른 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성억제 활성을 세포 생존율(viability)을 측정하여 산출한 결과 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 3).

신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 패 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 패 추출물의 IC₅₀은 32.4 ㎍/ml로 매우 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 15.1 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(34.3 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(53.2 ㎍/ml), 물 추출 분획물(71.4 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 1).

시료	IC₅₀₍㎍/ml)
패 추출물	32.4
클로로포름 추출 분획물	15.1
에틸아세테이트 추출 분획물	34.3
부탄올 추출 분획물	53.2
물 추출 분획물	71.4

패 추출물 및 분획물은 활성유효농도보다 월등히 높은 80 ㎍/ml의 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않았다.

<1-3> 모자반 추출물 또는 이의 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

<1-3-1> 위상차 현미경을 이용한 모자반 추출물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-2>에서 제조된 모자반 추출물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 위상차 현미경(phase contrast microscope)를 이용해 관찰하였다.

위상차 현미경 관찰결과, 본 발명의 모자반 추출물은 신경 융합(neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 억제하여, 뛰어난 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다. N18-RE-105 세포에 글루타메이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여 글루타메이트를 처리한 세포들에서는 팽윤(swelling)과 수포(blebbing) 및 용해(lysis)가 일어나 40%의 세포만이 살아 있었으나, 최종농도 45 ㎍/ml의 모자반 추출물이 첨가된 시료구의 세포들은 세포의 모양이 거의 변하지 않았으며 글루타메이트에 의한 세포사멸을 80% 이상 억제하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다(도 4).

<1-3-2> 세포 생존율을 이용한 모자반 추출물 및 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-2>에서 제조된 모자반 추출물 및 실시예 <2-2>에서 제조된 모자반 추출물의 분획물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 각 실험군의 세포 생존율을 EZ-Cytox assay(dehydrogenase assay)를 이용하여 평가하였다.

그 결과, 모자반 추출물 및 이의 분획물의 처리 농도에 따른 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성억제 활성을 세포 생존율(viability)을 측정하여 산출한 결과 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 5).

신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 모자반 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 모자반 추출물의 IC₅₀은 33.0 ㎍/ml로 매우 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 17.7 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(49.0 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(66.6 ㎍/ml), 물 추출 분획물(76.6 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 2).

시료	IC₅₀₍㎍/ml)
모자반 추출물	33.0
클로로포름 추출 분획물	17.7
에틸아세테이트 추출 분획물	49.0
부탄올 추출 분획물	66.6
물 추출 분획물	76.6

모자반 추출물 및 분획물은 활성유효농도보다 월등히 높은 80 ㎍/ml 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않았다.

<1-4> 지충이 추출물 또는 이의 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

<1-4-1> 위상차 현미경을 이용한 지충이 추출물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-3>에서 제조된 지충이 추출물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 위상차 현미경(phase contrast microscope)를 이용해 관찰하였다.

위상차 현미경 관찰결과, 본 발명의 지충이 추출물은 신경 융합(neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 억제하여, 뛰어난 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다. N18-RE-105 세포에 글루타메이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여 글루타메이트를 처리한 세포들에서는 팽윤(swelling)과 수포(blebbing) 및 용해(lysis)가 일어나 40%의 세포만이 살아 있었으나, 45 ㎍ /ml의 지충이 추출물이 첨가된 시료구의 세포들은 세포의 모양이 전혀 변하지 않았으며 글루타메이트에 의한 세포사멸을 80% 이상 억제하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다(도 6).

<1-4-2> 세포 생존율을 이용한 지충이 추출물 및 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-3>에서 제조된 지충이 추출물 및 실시예 <2-3>에서 제조된 지충이 추출물의 분획물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 각 실험군의 세포 생존율을 EZ-Cytox assay(dehydrogenase assay)를 이용하여 평가하였다.

그 결과, 지충이 추출물 및 이의 분획물의 처리 농도에 따른 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성억제 활성을 세포 생존율(viability)을 측정하여 산출한 결과 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 7).

신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 지충이 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 지충이 추출물의 IC₅₀은 29.4 ㎍/ml로 매우 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 13.8 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(31.8 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(54.6 ㎍/ml), 물 추출 분획물(82.3 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 3).

시료	IC₅₀₍㎍/ml)
지충이 추출물	29.4
클로로포름 추출 분획물	13.8
에틸아세테이트 추출 분획물	31.8
부탄올 추출 분획물	54.6
물 추출 분획물	82.3

지충이 추출물 및 분획물은 활성유효농도 월등히 높은 80 ㎍/ml의 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않았다.

<1-5> 톳 추출물 또는 이의 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

<1-5-1> 위상차 현미경을 이용한 톳 추출물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-4>에서 제조된 톳 추출물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 위상차 현미경(phase contrast microscope)를 이용해 관찰하였다.

위상차 현미경 관찰 결과, 본 발명의 톳 추출물은 신경 융합(neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 억제하여, 뛰어난 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다. N18-RE-105 세포에 글루타메이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여 글루타메이트를 처리한 세포들에서는 팽윤(swelling)과 수포(blebbing) 및 용해(lysis)가 일어나 약 40%의 세포만이 살아있으나, 45 ㎍/ml의 톳 추출물이 첨가된 시료구의 세포들은 세포의 모양이 전혀 변하지 않았으며 글루타메이트에 의한 세포사멸이 억제되어 60% 이상의 세포가 살아있는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다(도 8).

<1-5-2> 세포 생존율을 이용한 톳 추출물 및 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-4>에서 제조된 톳 추출물 및 실시예 <2-4>에서 제조된 톳 추출물의 분획물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 각 실험군의 세포 생존율을 EZ-Cytox assay(dehydrogenase assay)를 이용하여 평가하였다.

그 결과, 톳 추출물 및 이의 분획물의 처리 농도에 따른 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성억제 활성을 세포 생존율(viability)을 측정하여 산출한 결과 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 9).

신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 톳 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 톳 추출물의 IC₅₀은 57.9 ㎍/ml로 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 27.3 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(55.4 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(73.6 ㎍/ml), 물 추출 분획물(101.3 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 4).

시료	IC₅₀₍㎍/ml)
톳 추출물	57.9
클로로포름 추출 분획물	27.3
에틸아세테이트 추출 분획물	55.4
부탄올 추출 분획물	73.6
물 추출 분획물	101.3

톳 추출물 및 분획물은 활성유효농도보다 높은 80 ㎍/ml의 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않았다.

<1-6> 미역 추출물 또는 이의 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

<1-6-1> 위상차 현미경을 이용한 미역 추출물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-5>에서 제조된 미역 추출물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 위상차 현미경(phase contrast microscope)를 이용해 관찰하였다.

위상차 현미경 관찰 결과, 본 발명의 미역 추출물은 신경 융합(neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 억제하여, 뛰어난 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다. N18-RE-105 세포에 글루타메이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여 글루타메이트를 처리한 세포들에서는 팽윤(swelling)과 수포(blebbing) 및 용해(lysis)가 일어나 약 40%의 세포만이 살아 있었으나, 45 ㎍/ml의 미역 추출물이 첨가된 시료구의 세포들은 세포의 모양이 변하지 않았으며 글루타메이트에 의한 세포사멸이 억제되어 75% 이상의 세포가 살아있어 글루타메이트에 의한 세포의 사멸을 억제하는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다(도 10).

<1-6-2> 세포 생존율을 이용한 미역 추출물 및 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-5>에서 제조된 미역 추출물 및 실시예 <2-5>에서 제조된 미역 추출물의 분획물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 각 실험군의 세포 생존율을 EZ-Cytox assay(dehydrogenase assay)를 이용하여 평가하였다.

그 결과, 미역 추출물 및 이의 분획물의 처리 농도에 따른 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성억제 활성을 세포 생존율(viability)을 측정하여 산출한 결과 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 11).

신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 미역 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 미역 추출물의 IC₅₀은 35.5 ㎍/ml로 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 18.0 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(39.1 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(62.5 ㎍/ml), 물 추출 분획물(45.7 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 5).

시료	IC₅₀₍㎍/ml)
미역 추출물	35.5
클로로포름 추출 분획물	18.0
에틸아세테이트 추출 분획물	39.1
부탄올 추출 분획물	62.5
물 추출 분획물	45.7

미역 추출물 및 분획물은 활성유효농도보다 월등히 높은 80 ㎍/ml 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않았다.

<1-7> 다시마 추출물 또는 이의 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

<1-7-1> 위상차 현미경을 이용한 다시마 추출물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-6>에서 제조된 다시마 추출물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 위상차 현미경(phase contrast microscope)를 이용해 관찰하였다.

위상차 현미경 관찰 결과, 본 발명의 다시마 추출물은 신경 융합(neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 억제하여, 뛰어난 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다. N18-RE-105 세포에 글루타메이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여 글루타메이트를 처리한 세포들에서는 팽윤(swelling)과 수포(blebbing) 및 용해(lysis)가 일어나 약 40%의 세포만이 살아 있었으나, 45 ㎍/ml의 미역 추출물이 첨가된 시료구의 세포들은 세포의 모양이 거의 변하지 않았으며 글루타메이트에 의한 세포사멸이 억제되어 80% 이상의 세포가 살아 있는 뚜렷한 뇌신경세포 보호효과를 나타내었다(도 12).

<1-7-2> 세포 생존율을 이용한 다시마 추출물 및 분획물의 N18 - RE -105 세포에 대한 글루타메이트 독성 억제 활성 측정

실시예 <1-6>에서 제조된 다시마 추출물 및 실시예 <2-6>에서 제조된 미역 추출물의 분획물을 상기 실험예 <1-1>과 같이 세포에 처리하고, 시료가 처리된 세포를 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 뒤에, 시료의 글루타메이트 독성억제활성을 통한 뇌신경세포 보호활성을 각 실험군의 세포 생존율을 EZ-Cytox assay(dehydrogenase assay)를 이용하여 평가하였다.

그 결과, 다시마 추출물 및 이의 분획물의 처리 농도에 따른 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성억제 활성을 세포 생존율(viability)을 측정하여 산출한 결과 농도 의존적으로 세포의 글루타메이트에 의한 세포사멸을 억제하여 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다(도 13).

신경 융합(Neuronal hybridoma) 세포인 N18-RE-105 세포주에 대한 글루타메이트 독성을 50% 억제하는 본 발명의 다시마 추출물과 이의 추출 분획물의 신경세포 보호활성을 측정한 결과 다시마 추출물의 IC₅₀은 27.6 ㎍/ml로 매우 우수하였다. 분획물 중에서는 클로로포름 추출 분획물이 16.4 ㎍/ml로 가장 높았고 이어서 에틸아세테이트 추출 분획물(49.7 ㎍/ml), 부탄올 추출 분획물(61.8 ㎍/ml), 물 추출 분획물(97.1 ㎍/ml) 순으로 높았다(표 6).

시료	IC₅₀₍㎍/ml)
다시마 추출물	27.6
클로로포름 추출 분획물	16.4
에틸아세테이트 추출 분획물	49.7
부탄올 추출 분획물	61.8
물 추출 분획물	97.1

다시마 추출물 및 분획물은 활성유효농도보다 월등히 높은 80 ㎍/ml의 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않았다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

실시예 <1-1>의 패 추출물 0.1 g

유당 1.5 g

탈크 0.5 g

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

실시예 <1-2>의 모자반 추출물 0.1 g

락토오스 7.9 g

결정성 셀룰로오스 1.5 g

마그네슘 스테아레이트 0.5 g

상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

실시예 <1-3>의 지충이 추출물 0.1 g

옥수수전분 5 g

카르복시 셀룰로오스 4.9 g

상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사제의 제조

실시예 <1-4>의 톳 추출물 0.1 g

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

<1-5> 액제의 제조

실시예 <1-5>의 미역 추출물 0.1 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100 로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

< 제조예 2> 건강식품의 제조

<2-1> 밀가루 식품의 제조

상기 실시예 <1-6>의 다시마 추출물 0.5 ~ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.

<2-2> 스프 및 육즙( gravies )의 제조

상기 실시예 <2-1>의 패 추출물의 클로로포름 추출 분획물 0.1 ~ 5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조

상기 실시예 <2-1>의 패 추출물의 에틸아세테이트 추출 분획물 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<2-4> 유제품( dairy products )의 제조

상기 실시예 <2-1>의 패 추출물의 부탄올 추출 분획물 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-5> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

상기 실시예 <2-2>의 모자반 추출물의 클로로포름 추출 분획물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 상기 실시예 <2-2>의 모자반 추출물의 클로로포름 추출 분획물을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

실시예 <2-2>의 모자반 추출물의 클로로포름 추출 분획물(3 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

<2-6> 건강보조식품의 제조

실시예 <2-2>의 모자반 추출물의 에틸아세테이트 추출 분획물 100 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

< 제조예 3> 건강 음료의 제조

구연산 100 ㎎

올리고당 100 ㎎

매실농축액 2 ㎎

타우린 100 ㎎

정제수를 가하여 전체 500 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

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패(Ishige okamurai), 모자반(Sargassum fulvellum), 지충이(Sargassum thunbergii), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinnatifida) 및 다시마(Laminaria ochotensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 헌팅턴병 또는 두부손상(head trauma) 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₂ 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하는 헌팅턴병 또는 두부손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 헌팅턴병 또는 두부손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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제 6항에 있어서, 상기 분획물은 패(Ishige okamurai), 모자반(Sargassum fulvellum), 지충이(Sargassum thunbergii), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinnatifida) 및 다시마(Laminaria ochotensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출물을 메탄올 또는 에탄올로 추출한 후, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 추가적으로 추출하여 제조된 것을 특징으로 하는 헌팅턴병 또는 두부손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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패(Ishige okamurai), 모자반(Sargassum fulvellum), 지충이(Sargassum thunbergii), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinnatifida) 및 다시마(Laminaria ochotensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 헌팅턴병 또는 두부손상 예방 및 개선용 건강식품.
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