KR102132862B1 - 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물에 관한 것으로, 굴 및 해조류를 발효시킨, 굴 및 해조류의 발효물로부터 추출한 발효 추출물을 포함하며, 상기 발효 추출물은 파골 세포의 활성을 억제하고, 조골 세포의 활성을 촉진하여 골 형성을 촉진할 수 있다.
본 발명에 의하면, 굴을 이용하여, 다량의 타우린과 비타민을 함유하게 되고 해조류로부터 천연 GABA(gamma-aminobutyric Acid) 및 해조 올리고당을 함유한 뼈 건강 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 골다공증 발생의 예방 및 억제 효과가 우수한 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물을 제공할 수 있다.

Description

굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물{Composition for bone health comprising functional fermented material using oyster}
본 발명은 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 굴을 이용하여 기능성 발효물을 제조하며, 상기 기능성 발효물에 의해 뼈 형성 촉진, 골다공정 예방 및 치료 효과가 우수한 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물에 관한 것이다.
골조직은 골량(bone mass) 및 골격의 항상성(skeletal homeostasis)을 유지하기 위해 흡수와 형성이 끊임없이 일어나는 동적인 조직이다. 이러한 뼈의 재형성(bone remodeling)에는 두 종류의 특수한 기능을 하는 세포가 관여한다.
파골세포는 뼈를 흡수하는 반면, 조골세포는 뼈기질을 합성하고 채우는 역할을 한다. 따라서 골량은 이러한 세포의 상대적인 기능에 의존하게 된다. 정상 성인에서는 골흡수 양과 골형성 양 사이에는 항상 균형이 유지되고 있다.
골개조는 일정한 주기를 통해 일어나며 국소적으로 좁은 부위에서 일어남으로써 골격계의 구조가 유지되는데 이러한 골격계의 구조와 기능은 전신적인 호르몬과 국소적 인자 사이의 복잡한 상호작 용에 의해 조절된다(Canalis, E., McCarthy, T. and Centrella, M.: Growth factors and the regulation of bone remodeling. J. Clin. Invest. 81:277-281 (1988), Raisz, L.G.: Hormonal regulation of bone growth and remodeling. in Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissue CIBA Foundation Symposium 136, pp 226-238, Wiley, NY (1988)).
조골세포와 파골세포 활성간의 불균형은 전체적인 뼈의 감소(osteoporosis) 나 증가(osteosclerosis)로 인한 골격의 이상으로 나타난다. 이러한 골대사 불균형은 일차적으로 조골세포의 기능저하에 의한 것인지, 혹은 골흡수의 증가 즉, 파골세포의 활성도 강화에 의한 것인지에 대하여는 여러 가지 이론과 주장이 제기되고 있으며 골다공증의 요인으로는 연령의 증가, 영양 결핍, 운동부족, 칼슘 섭취의 부족, 유전적 요소, 약물복용, 호르몬의 영향 등을 꼽는다(Ryan PJ, Evans P, Gibson T, Fogelman I. Osteoporosis and chronic back pain: A study with single-photon emission computed tomography bone scintigraphy. J Bone Miner Res. 7: 1455-1460 (1992)).
골대사 질환 중 고령사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증은 골의 화학적 조성에는 큰 변화 없이 단위 용적내의 골량이 감소하여 경미한 충격에도 쉽게 골절을 일으킬 수 있는 질환이다. 노인 특히 폐경 후 여성들의 경우 에스트로겐(estrogen)의 분비부족으로 인하여 가장 그 발생 빈도가 높게 나타난다고 알려져 있다(Jilka RL. Cytokines, bone remodeling and estrogen deficiency. Bone 23: 75-81 (1998)). 그러나, 남성이 라도 노화에 따라 골질량이 감소하는 경향이 나타나며(Stein GS, Lian JB, van Wijnen AJ, Montechino M. Transcriptional control of osteoblast growth and differentiation. Physiol Rew. 76: 593-629 (1996)).
최근 20년간 초·중학생의 골절률은 2배 이상 증가하고 있는 실정이다. 골 대사 불균형으로 인한 골질환의 예방 또는 치료 측면에서, 젊은 때부터 골질량을 높이는 것이 상당히 중요하며, 이와 같이 뼈의 건강을 유지하는 것은 성별이나 연령과 관계없이 중요한 문제이다.
현재 골다공증 예방 및 치료에 사용되고 있는 약제는 대부분 골흡수를 억제하는 작용을 하기 때문에 이미 진행된 골소실을 완전히 회복할 수 없으며, 따라서 궁극적인 목표인 골다공증의 발생을 완전히 예방할 수 없는 현실이다. 이에 골다공증의 예방과 치료를 위해 골형성 증가에 관한 연구가 최근 주목받고 있으며 골조직 재생능력에 미치는 영향 등에 대한 과학적인 접근이 필요한 실정이다 (Cho SH, Kim KG, Kim SR, Lee JA, Moon H, Hwang YY. The effects of 17- estradiol, medroxyprogesterone acetate and parathyroid hormone on the differentiation of osteoblast cell. Korean J Obstet Gynecol. 39: 1497-1506 (1996), Boonen A, Broos P, Deqeker J. The prevention of treatment of age-related osteoporosis in the elderly by systemic recombinant growth factor therapy (rhIGF-I or rhRGF-): a perspective. J Internal Medicine. 242: 285- 290 (1997)).
따라서, 뼈 파괴세포의 활성 억제, 뼈 형성 세포의 활성화를 통한 골 형성 촉진 효과가 우수하여 골다공증의 발생을 예방하고, 억제할 수 있는 뼈 건강 개선용 조성물에 대한 개발이 필요한 실정이다.
(특허 문헌 1) KR 10-2017-0116402 A1
본 발명의 목적은 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 굴을 이용하여, 다량의 타우린과 비타민을 함유하고 해조류로부터 천연 GABA(gamma-aminobutyric Acid) 및 해조 올리고당을 함유한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 파골 세포의 활성을 억제하고, 조골 세포의 활성을 촉진하여 골 형성 효과를 나타낼 수 있는 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골다공증 발생의 예방 및 억제 효과가 우수한 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물은 굴 및 해조류를 발효시킨, 굴 및 해조류의 발효물로부터 추출한 발효 추출물을 포함하며, 상기 발효 추출물은 파골 세포의 활성을 억제하고, 조골 세포의 활성을 촉진하여 골 형성을 촉진할 수 있다.
상기 발효 추출물은 타우린 및 GABA(gammaaminobutyric acid)를 포함한다.
상기 굴은 생굴, 굴의 가수분해액, 굴의 추출 농축액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 해조류는 다시마, 톳, 미역, 미역줄기, 우뭇가사리, 파래, 풀가사리, 꼬시래기, 매생이 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 굴 및 해조류의 발효물은 발효 미생물을 이용하여 발효시킨 것으로, 상기 발효 미생물은 유산균, 효모 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 약학 조성물은 상기 뼈 건강 개선용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 식품 조성물은 상기 뼈 건강 개선용 조성물을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물은 굴 및 해조류를 발효시킨, 굴 및 해조류의 발효물로부터 추출한 발효 추출물을 포함하며, 상기 발효 추출물은 파골 세포의 활성을 억제하고, 조골 세포의 활성을 촉진하여 골 형성을 촉진할 수 있다.
상기 굴 및 해조류를 발효시킨 발효물을 이용하여, 발효 추출물을 제조하여, 뼈 건강 개선을 위한 용도로 이용할 수 있다.
보다 구체적으로, 굴로부터 타우린(taurine)을 추출하며, 해조류로부터 해조 올리고당 및 천연 GABA를 추출하여, 상기 타우린, 해조 올리고당 및 천연 GABA를 주요 성분으로 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 뼈 건강 개선용 조성물은 발효 공정에 의해, 해조취 및 비린내가 제거되어, 식용 시 맛과 향이 탁월한 조성물을 제공할 수 있다.
상기 굴(Oyester)은 글리코겐, 비타민, 단백질 등 각종 영양소가 함유되어 있으며, 타이로신 글루탐산 등 18종 이상의 아미노산과 타우린 등의 기능성 물질뿐만 아니라 철분 요오드 등 필수 무기질 등이 풍부한 완전식품으로 인식되며 세계 10대 수산물로써 널리 이용되어 왔다. 통영을 비롯한 남해안에서 대량 양식되고 있는 굴은 1960-70 년대 경제개발 초기 수출 공신이었지만 최근에는 중국산 굴이 세계시장을 급속히 잠식하고 있으며, 냉동 또는 단순 가공품의 형태로 유통되고 있다.
해조류는 그 기능성과 더불어 수요가 확대되고 있으며 특히 풍부한 미네랄 및 기능성 다당류로 인하여 항균, 항산화, 항바이러스, 항암활성을 비롯하여 동맥경화, 심근경색, 고혈압, 협심증, 뇌졸중 등의 생활 습관병 예방에 효과적이라는 보고들과 함께 그 잠재적인 가능성이 부각되고 있는데, 이들 중 다시마는 굴과 함께 GABA의 전구물질인 글루탐산(glutamic acid)를 다량 함유한 천연 원료로써, 고농도 천연GABA의 생산을 위한 종래의 생산 방법인 MSG(화학적 합성품)의 인위적인 첨가 없이 발효공법을 통하여 다시마 유래의 고농도 천연 GABA를 생산할 수 있다.
이와 동시에 미생물에 의한 발효 과정에서 후코이단(Fucoidan) 등 고분자 기능성 해조 다당류의 저분자화를 통하여 갈조류 유래의 후코즈(Fucose) 등 단당류와 기능성 저분자 올리고당을 동시에 함유한다.
뿐만 아니라 해조류는 아미노산(Glutamic Acid 및 Aspartic Acid 등)을 다량 함유하고 있으며, 고기능성 천연소 재로 각광을 받고 있는 해조 올리고당 (Fucoidan 등) 또한 풍부하여 이상적인 천연식품으로써 인식되고 있을 뿐 만 아니라 다양한 미네랄과 비타민 등이 풍부하게 함유되어 있고, 최근 해조류의 생리 효용성에 관한 국내·외 전문가들의 활발한 연구 수행 결과 해조류가 다이어트 작용, 정장 작용에 의한 변비 치료, 중금속 및 방사능 물질 의 체외 배출 작용 등에 깊이 관여하는 것으로 밝혀지고 있다. 그리고 후코이단으로 통칭되는 함황 다당류의 경 우는 항균, 항산화, 항바이러스, 항암활성을 비롯하여 동맥경화, 심근경색, 고혈압, 협심증, 뇌졸중 등의 성인병 예방에 효과적이라고 보고된 바 있다.
그러나 해조류 및 굴과 같은 해양자원의 이용은 그 대부분이 단순 건조 등의 1차 가공품이나 사료로 사용되는 것에 그치고 있다. 상기와 같이 단순 건조 등의 1차 가공품이나 사료로만 이용하는 경우에는, 해조류 및 굴과 같은 해양 자원에 존재하는 각종 생리활성물질을 최대한 이용하지 못하는 문제가 발생할 뿐만 아니라, 풍부한 비타민이나 무기질 등의 천연 성분을 그대로 유지할 수 없는 문제가 있다.
이에, 본원 발명에서는 해조류 및 굴을 이용하여, 발효시키고, 굴 및 해조류의 발효물로부터 추출한 발효 추출물을 이용함에 따라, 해조류 및 굴에 존재하는 각종 생리활성물질을 최대한 이용할 수 있고, 풍부한 비타민이나 무기질 등의 천연 성분을 그대로 유지할 수 있다.
GABA(gamma-aminobutyric acid)는 분자량이 103.2 달톤(Dalton)으로 피페리인산으로 불리며 용융점이 202℃로 열에 안정한 편이며 C4H9NO2의 분자식을 가지고, 물에 대한 높은 용해성을 가지는 비단백질성 아미노산의 일종으로 포유동물의 뇌나 척수에 존재하는 흥분 억제성 신경전달물질(Inhibitory Neurotransmitter)이다. GABA는 인체의 많은 생리적인 메카니즘의 조절에 관여하여 뇌의 혈류를 활발하게 하고 산소 공급량을 증가시켜 뇌세포의 대사기능을 항진시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
또한 성장호르몬의 분비 조절에도 관여하며 혈압강하 및 통증완화, 정신안정작용, 간, 신장기능 개선작용, 대장암 억제작용 등 여러 생리 조절 작용에 관여하는 것으로 알려져 있어 약리적으로 매우 주목받는 물질이다. 그러나 일반적으로 식품 등을 통하여 섭취되는 타우린과 GABA의 양은 많지 않아 약리작용을 발휘하기 위한 필요량을 식품에서 섭취하는 것은 용이하지 않다.
이에 본원 발명은 자연섭취로는 양적 제한을 가진 타우린과 GABA를 생리활성이 기대되는 양까지 높여 섭취할 수 있도록 굴과 해조류 내에 존재하는 글루탐산을 GABA로 대량 전환하면서도 글루탐산 이외의 타우린과 같은 기능성 물질에는 영향을 주지 않는 발효 균주를 이용하여, 발효공법에 의한 인체에 유용한 후코이단 등의 고분자 해조 다당류를 저분자화하고, 굴과 해조류의 추출 가공시 필연적으로 발생하는 해조취와 비린내 등의 이미, 이취를 제거함으로써 종래의 기능성 식품소재로써의 기호성을 유지한 채 다량의 타우린과 천연GABA 및 저분자 해조 올리고당을 비롯한 해조미네랄을 함유하는 기능성 발효물을 제조하여, 이를 뼈 건강 개선용 조성물로 제공하고자 한다.
본원발명에 이용되는 굴과 해조류는 수세, 탈염, 분쇄의 전처리 공정이 동일하며, 굴은 생굴, 굴의 가수분해액 또는 굴의 추출농축액을 사용할 수 있다. 굴, 해조류 또는 이들의 혼합물이 30%(v/v)를 초과하는 경우, 굴과 해조류의 염분 에 의하여 최종 조성물의 맛에 영향을 미치기 때문에 굴, 해조류 또는 이들의 혼합물은 10 내지 30%(v/v)이 적당하다.
상세하게는 굴, 굴의 가수분해액, 굴의 추출농축액 및 해조류를 발효원으로써 단독으로 사용할 경우, 이들을 전체 중량의 10 내지 30%(v/v)가 되도록 하며, 이들의 혼합물을 발효원으로써 발효할 경우, 굴, 굴의 가수분해액 또는 굴의 추출농축액과 해조류를 선택적으로 혼합하여, 10 내지 30%(v/v)로 첨가함에 있어 그 비율이 굴, 굴의 가수분해액 또는 굴의 추출농축액과 해조류가 1:2 내지 2:1의 범위에서 선택적으로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 굴은 생굴, 굴의 가수분해액, 굴의 추출 농축액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 굴의 가수분해액은 전처리된 굴에 물을 혼합한 후, 50 내지 70℃의 온도에서 교반하면서 알카라제를 첨가하여 가수분해하는 단계; 상기 가수분해된 굴의 잔사를 40 내지 200mesh의 진동체로 제거하고 굴의 가수분해액을 수거하는 단계; 및 상기 수거된 굴의 가수분해액을 공경(pore size)이 0.05 내지 0.1㎛인 모듈을 가지는 외부순환식 감압형 분리막을 이용하여 수용성 물질만을 정밀여과하는 단계를 포함하는 제조 방법에 따라 제조될 수 있다.
정밀여과하는 단계 이후, 정밀여과된 가수분해액을 첨가하기에 용이하도록 포장하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 굴의 추출 농축액은 굴을 수세, 탈염, 분쇄의 방법으로 전처리하는 단계; 상기 전처리된 굴에 물을 혼합하여 70 내지 90℃에서 20 내지 60분간 교반하면서 추출하는 단계; 상기 추출된 굴의 잔사를 40 내지 200mesh의 진동체로 제거하고 굴의 추출액을 수거하는 단계; 상기 추출이 완료된 굴의 추출액을 공경(pore size)이 0.05 내지 0.1㎛인 모듈을 가지는 외부순환식 감압형 분리막을 이용하여 수용성 물질만을 정밀여과하는 단계; 및 상기 정밀여과된 굴의 추출액을 30 내지 50℃의 온도에서 감압하여 brix가 20 내지 40%가 되도록 농축하는 단계를 포함하는 제조 방법에 따라 제조될 수 있다.
농축하는 단계 이후, 농축된 농축액을 첨가하기에 용이하도록 포장하는 단계가 추가될 수 있다.
굴의 가수분해액과 추출농축액은 정밀여과 장치인 "외부순환식 감압형 분리막 장치"를 이용하여 정밀여과 공정을 거침으로써 0.05 내지 0.1um의 수용성 물질만이 여과되어 발효공정에 사용되며, 상기 여과 시스템은 여과 과정에서 외부의 노출이 방지됨으로써 여과시 발생하는 향미의 손실을 최소화할 수 있다.
또한 "외부 순환식 감압형 분리막 시스템"은 외부의 환경과 격리된 막분리공정으로서 기존의 가압식 공정과는 달리 여과액이 나오는 부분에 자흡식 펌프를 부착하여 감압식으로 70 내지 400mmHg 사이의 마일드한 조건에서 운전함 으로써, 압력에 따른 막의 부담을 최소화시킬 뿐만 아니라 여과액 방출부로부터 자흡식 펌프로 액을 흡입하여 여과하기 때문에 펌프와 농축액이 직접적으로 접촉하는 일이 없으며, 항상 저압에서 운전하고 별도의 농축 탱크가 필요 없고, 배관, 밸브 및 시스템의 비용이 최소화되어 매우 경제적이다.
또한 각각의 멤브레인(모듈)의 하단으로부터 지속적으로 공기를 방출하여 막의 외부 표면에 흡착될 수 있는 오염물질을 지속적으로 떨어낼 수 있도록 설계됨에 따라 여과공정이 진행되면서 막의 오염이 가속화되지 않고 지속적으로 안정한 투과성을 가지는 장점을 가지며, 또한 여과액을 분획분으로 분리하여 제조할 수 있다.
본 발명의 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물은 (1) 굴, 굴의 가수분해액 또는 굴의 추출농축액 및 전처리된 해조류를 전체 중량의 10 내지 30%(v/v)가 되도록 물을 혼합하여 멸균하고, 30 내지 37℃까지 냉각하여 배지를 준비하는 단계; (2) 상기 배지에 발효 미생물로 유산균, 효모 또는 이들을 혼합하여 접종한 후 발효시키는 단계; (3) 발효가 끝난 발효액을 고온가압 멸균하여 발효기간 중에 대수적으로 증식한 발효 미생물을 사멸시키는 단계; 및 (4) 멸균된 발효액을 0.05 내지 0.1um 이하의 맑고 깨끗한 수용성 물질만을 정밀여과하는 단계의 순서로 제조할 수 있다.
상기 해조류는 다시마, 톳, 미역, 미역줄기, 우뭇가사리, 파래, 풀가사리, 꼬시래기, 매생이 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본원발명의 뼈 건강 개선용 조성물은 상기의 생굴 또는 해조류를 단독 또는 혼합하여 전제 중량의 10 내지 30%가 되도록 첨가한 후, 115 내지 125℃에서 15 내지 20분간 고온에서 가압하여 멸균한 후, 30 내지 37℃까지 냉각하여, 발효미생물로써 유산균 및 효모를 단독 또는 혼합하여 1 내지 5%(v/v)이 되도록 접종하여 2 내지 7일간 발효함으로써, 다량의 타우린과 천연GABA 및 해조올리고당을 비롯한 미네랄 등을 함유하는 조성물을 제조할 수 있다.
본원발명의 뼈 건강 개선용 조성물은 상기의 굴 가수분해액 또는 해조류를 단독 또는 혼합하여 전제 중량의 10 내지 30%가 되도록 첨가한 후, 115 내지 125℃에서 15 내지 20분간 고온에서 가압하여 멸균한 후, 30 내지 37℃까지 냉각하여, 발효 미생물로써 유산균 및 효모를 단독 또는 혼합하여 1 내지 5%(v/v)이 되도록 접종하여 2 내지 7일간 발효함으로써, 다량의 타우린과 천연GABA 및 해조올리고당을 비롯 한 미네랄 등을 함유하는 조성물을 제조할 수 있다.
본원발명의 뼈 건강 개선용 조성물은 상기의 굴의 추출농축액 또는 해조류를 단독 또는 혼합하여 전체 중량의 10 내지 30%가 되도록 첨가한 후, 115 내지 125℃에서 15 내지 20분간 고온에서 가압하여 멸균한 후, 30 내지 37℃까지 냉각하여, 발효미생물로써 유산균 및 효모를 단독 또는 혼합하여 1 내지 5%(v/v)이 되도록 접종하여 2 내지 7일간 발효함으로써, 다량의 타우린과 천연GABA 및 해조 올리고당을 비롯한 미네랄 등을 함유하는 조성물을 제조할 수 있다.
본원발명의 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물에 의하면, 파골 세포의 크기를 감소시킬 수 있고, 파골 세포의 수를 농도 의존적으로 억제할 수 있다. 파골 세포는 뼈 흡수 과정동안 골격형성을 수행하며 뼈에 부착을 하면서, 일반적인 세포외 공간을 구분하기 위해 파골세포의 액틴(actin)이 하나의 큰 링(ring)으로 조직화되므로, 액틴 링(actin ring)의 형성은 파골세포의 뼈 흡수 능력에 대한 중요한 표지인데, 분화된 파골세포에 대해 본원발명의 조성물은 농도 의존적으로 액틴 링의 형성을 억제할 수 있다.
또한, 파골세포의 분화와 관련한 단백질 발현을 억제할 수 있다.
본원발명의 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물에 의하면, 조골 세포 형성에 필수 유전자인 Alp, RUNX2, Col1a1, OSX, Bglap, BMP2, BMP의 발현이 강력하게 증가된다. 또한, 뼈형성에 핵심인자인 Alp 활성이 증가한다.
뿐만 아니라, 본원발명의 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물에 의하면, 골 밀도 감소 억제 효과가 우수하며, 골 파괴를 방지할 수 있다. 또한, 뼈의 미네랄 함량(BMD, bone mineral density), 상대적인 뼈의 양(BV/TV, bone volume/trabecular volume), 뼈내 섬유조직(해면의 두께)(Tb.Th(mm), trabecular thickness), 해면의 수(Tb.N(1/mm), trabecular number) 및 해면 내 공간(Tb.Sp(mm), trabecular spacing)에 대한 수치가 향상된다.
상기 발효 단계에서 이용하는 유산균과 효모의 일 예시로, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) BJ20(기탁번호: KCTC 11377BP) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) MBP-27를 이용할 수 있다.
상기 균주의 경우, 해조취 등의 이미, 이취를 제거에 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있고, 항산화 및 항고혈압 효과가 우수한 기능성 발효물을 제거하는데 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
다만, 상기 유산균과 효모를 사용하여 발효물을 제조하는 경우, 항산화 및 항고혈압에 우수한 효과가 있음이 확인되었으나, 뼈 건강에 영향을 미치는 파골 세포의 활성을 억제하고, 조골 세포의 활성을 촉진하여 골 형성을 촉진에는 큰 효과를 나타내지 않음을 실험을 통해 확인하였다.
이에, 본원발명에서는 유산균 및 효모로, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) JS(균주기탁번호 KCCM10499) 및 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus Usamii)를 이용할 수 있다.
상기 균주의 경우, 해조취 등의 이미, 이취를 제거에 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있고, 뼈 건강에 영향을 미치는 파골 세포의 활성을 억제하고, 조골 세포의 활성을 촉진하여 골 형성을 촉진에는 큰 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 약학 조성물은 상기 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용 제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구 또는 비경구의 여러가지 제형일 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다.
또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 뼈 건강 개선용 조성물은 인체에 대한 독성이 전혀 없어 장기적으로 섭취 가능하므로 건강기능식품으로도 사용될 수 있다. 건강기능식품으로 제조되는 경우 음료, 스낵 및 제과 제빵류, 죽 및 스프류에 포함된 형태가 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명에 따른 상기 뼈 건강 개선용 조성물을 통상의 감미제, 비타민류, 아미노산류, 미네랄류, 유기산류, 방향제 또는 방부제 등과 함께 용해시켜 수용액, 수현탁액, 또는 통상의 복용 형태의 제형으로 제조하면, 뇌세포 대사 촉진 및 혈류촉진과 더불어 부족한 영양소들을 보충할 수 있는 우수한 건강식품이 될 수 있다.
따라서 상기 본 발명의 해조추출발효액 또는 해조발효분말을 주성분으로 함유하고, 필요에 따라 생약 엑기스, 비타민류, 아미노산류, 감미제, 미네랄류, 유기산류, 방향제, 과일즙 또는 방부제 등에서 선택되는 1 종 이상의 보조 성분을 첨가하고, 여기에 물을 적당량 가하고 멸균하거나, 또는 통상의 복용 형태의 제형으로 하여 얻어지는 신규의 식품을 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 보조 성분은 통상적으로 당업자가 사용할 수 있는 성분을 의미하는 것으로 여기에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게 본 발명의 식품 조성물은 기호도를 높이기 위하여, 자귀나무 추출물 및 감초 추출물을 더 포함할 수 있다.
상기 자귀나무 추출물 및 감초 추출물을 더 포함하는 경우, 자귀나무 추출물 및 감초 추출물에 의해, 미세하게 잔존하는 해조취 등의 이미, 이취를 제거할 수 있다. 또한, 감초의 단맛으로 인해 기호성이 높은 식품 조성물을 제공할 수 있다. 다만, 감초만을 사용하는 경우에 비해, 자귀나무 추출물을 혼합하여 사용하는 경우, 감초 고유의 단맛을 상승시킬 수 있다.
상기 자귀나무는 부부의 금실을 상징하는 나무로 합환수(合歡樹), 합혼수, 야합수, 유정수라고도 한다. 이런 연유로 산과 들에서 자라는 나무를 마당에 정원수로 많이 심었다. 자귀대의 손잡이를 만드는데 사용되는 나무였기 때문에 자귀나무라고 하며 소가 잘 먹는다고 소쌀나무라고 부르는 곳도 있다.
또한, 나무의 줄기는 굽거나 약간 드러눕는다. 높이 3∼5m이고 큰 가지가 드문드문 퍼지며 작은 가지에는 능선이 있다. 겨울눈의 아린(芽鱗, 겨울눈을 싸고 있는 단단한 비늘 조각)은 2-3개가 있지만 거의 보기 어려울 정도로 작다. 잎은 어긋나고 2회깃꼴겹잎이다. 작은잎은 낫 같이 굽으며 좌우가 같지 않은 긴 타원형이고 가장자리가 밋밋하다. 작은잎의 길이는 6 내지 15mm, 너비는 2.5 내지 4.0mm 정도로서 양면에 털이 없거나 뒷면의 맥 위에 털이 있다.
꽃은 연분홍색으로 6 또는 7월에 피고 작은 가지 끝에 15 내지 20개씩 산형(傘形)으로 달린다. 꽃받침과 화관은 얕게 5개로 갈라지고 녹색이 돈다. 수술은 25개 정도로서 길게 밖으로 나오고 윗부분이 홍색이다. 꽃이 홍색으로 보이는 것은 수술의 빛깔 때문이다. 열매는 9월 말에서 10월 초에 익으며 편평한 꼬투리이고 길이 15cm 내외로서 5 또는 6개의 종자가 들어 있다. 특이한 점은 신경초나 미모사는 외부의 자극에 잎이 붙어버리지만 자귀나무는 해가 지고 나면 펼쳐진 잎이 서로 마주보며 접혀진다.
감초는 콩과 식물에 속하는 다년생 초본으로 아시아계에서 한약재로 많이 이용되는 약용 식물로 알려져있다. 감초의 주성분으로는 glycyrrhizin이 알려져 있고, liquiritin 및 isoliquiritin등의 플라보노이드 배당체, 그리고 아이소플라보노이드인 licoricidin 등이 보고되어 있다. 감초는 항산화, 면역 증강 및 항균 효과 등이 있는 것으로 보고되고 있다.
보다 바람직하게, 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품 조성물로, 상기 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물을 포함하며, 상기 뼈 건강 개선용 조성물 100 중량부에 대하여, 자귀나무 추출물 5 내지 10 중량부 및 감초 추출물 5 내지 10 중량부를 포함할 수 있다. 상기 범위 내에서, 미세하게 잔존하는 해조취 등의 이미, 이취를 제거할 수 있다. 또한, 감초의 단맛으로 인해 기호성이 높은 식품 조성물을 제공할 수 있다. 다만, 감초만을 사용하는 경우에 비해, 자귀나무 추출물을 혼합하여 사용하는 경우, 감초 고유의 단맛을 상승시킬 수 있다.
본 발명의 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물에 의하면, 굴을 이용하여, 다량의 타우린과 비타민을 함유하게 되고 해조류로부터 천연 GABA(gamma-aminobutyric Acid) 및 해조 올리고당을 함유한 뼈 건강 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 파골 세포의 활성을 억제하고, 조골 세포의 활성을 촉진하여 골 형성을 촉진하여, 골다공증 발생의 예방 및 억제 효과가 우수한 굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 뼈 건강 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물의 파골세포 분화에 미치는 영향에 대한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물의 파골세포 분화와 관련된 단백질의 발현에 미치는 영향에 대한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물의 파골세포 분화과정에서 생성되는 산화적 스트레스에 미치는 영향에 대한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물의 ROS생성 억제에 의한 파골세포 관련 단백질의 발현 변화에 대한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물의 조골 세포에 미치는 영향(MTT assay)에 대한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물의 조골세포 형성에 필요한 필수 유전자의 발현에 미치는 영향에 대한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물의 조골세포 형성에 필요한 필수 유전자의 발현에 미치는 영향에 대한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물의 Alp 활성화에 대한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물에 대한 제브라피쉬 발생 단계에서의 뼈 형성 촉진에 대한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물에 대한 제브라피쉬 발생 단계에서의 뼈 형성 촉진에 대한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물에 대한 Micro-CT를 이용해 얻은 3차원 영상 이미지 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 뼈 건강 개선용 조성물에 대한 경골의 골 형질 변수에 대한 효과 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예 1: 뼈 건강 개선용 조성물의 제조]
1. 생굴 및 톳을 이용한 뼈 건강 개선용 조성물(FO)의 제조
생굴과 톳을 수세 및 탈염을 진행하여, 불순물 및 염을 제거하였다. 이후, 건조시키고 분쇄하여 굴 및 톳의 혼합 분쇄물을 제조하였다.
상기 굴 및 톳의 혼합 분쇄물을 전체중량의 10 내지 30%(v/v)이 되도록 물을 혼합한 후, 121℃에서 15분간 멸균하여 잡균을 제거하였다. 발효적정 온도인 30 내지 37℃까지 냉각하였다.
발효 균주로 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) BJ20(기탁번호: KCTC 11377BP) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) MBP-27를 혼합하여 접종하고, 30℃ 내지 37℃의 온도에서 발효하였다. 이때 발효 미생물은 전체 중량의 1 내지 5%(v/v)가 되도록 접종하며, 발효미생물을 접종하고 발효미생물에 의한 발효가 충분히 일어날 수 있도록 2 내지 7일간 발효하였다. 발효가 끝난 발효액을 121℃에서 15 내지 20분간 고온가압 멸균하여 발효기간 중에 대수적으로 증식한 발효미생물을 사멸시켰다. 멸균된 발효액을 0.05~0.1um이하의 수용성 물질만을 정밀 여과하여 맑고 깨끗한 발효액 만을 취하였다. 정밀 여과된 발효액을 분말로 제조하기 위하여 분무건조 또는 동결건조 등의 방법으로 건조한 후, 분쇄하여 분말화하였다.
2. 굴의 가수분해액 및 톳을 이용한 뼈 건강 개선용 조성물의 제조
2-1. 굴의 가수분해액의 제조 공정
사용하고자 하는 굴을 수세, 탈염, 분쇄하여 효소에 의한 가수분해가 용이하도록 준비하였다. 전처리된 굴과 물을 1:1로 혼합하여 50 내지 70℃에서 20 내지 60분간 교반하면서 0.2%(v/v)의 알카라제를 첨가하여 가수분해하였다. 가수분해된 굴의 잔사를 40 내지 200mesh의 진동체로 제거하고 굴의 가수분해액을 수거하였다. 수거된 굴의 가수분해액을 공경(pore size)이 0.05 내지 0.1um인 모듈을 가지는 외부순환식 감압형 분리막을 이용하여 수용성 물질만을 정밀여과하였다.
2-2. 뼈 건강 개선용 조성물의 제조
톳을 수세 및 탈염을 진행하여, 불순물 및 염을 제거하였다. 이후, 건조시키고 분쇄하여 톳의 분쇄물을 제조하고, 상기 2-1.의 굴의 가수분해액과 혼합하였다.
상기 굴의 가수분해액 및 톳의 혼합물을 전체중량의 10 내지 30%(v/v)이 되도록 물을 혼합한 후, 121℃에서 15분간 멸균하여 잡균을 제거하였다. 발효적정 온도인 30 내지 37℃까지 냉각하였다.
발효 균주로 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) BJ20(기탁번호: KCTC 11377BP) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) MBP-27를 혼합하여 접종하고, 30℃ 내지 37℃의 온도에서 발효하였다. 이때 발효 미생물은 전체 중량의 1 내지 5%(v/v)가 되도록 접종하며, 발효미생물을 접종하고 발효미생물에 의한 발효가 충분히 일어날 수 있도록 2 내지 7일간 발효하였다. 발효가 끝난 발효액을 121℃에서 15 내지 20분간 고온가압 멸균하여 발효기간 중에 대수적으로 증식한 발효미생물을 사멸시켰다. 멸균된 발효액을 0.05~0.1um이하의 수용성 물질만을 정밀 여과하여 맑고 깨끗한 발효액 만을 취하였다. 정밀 여과된 발효액을 분말로 제조하기 위하여 분무건조 또는 동결건조 등의 방법으로 건조한 후, 분쇄하여 분말화하였다.
3. 굴의 추출농축액 및 톳을 이용한 뼈 건강 개선용 조성물의 제조
3-1. 굴의 추출농축액의 제조 공정
사용하고자 하는 굴을 수세, 탈염, 분쇄하여 추출이 용이하도록 준비하였다. 전처리된 굴에 10 내지 20배수의 물을 혼합하여 70 내지 90℃에서 20 내지 60분간 교반하면서 추출하였다. 추출된 굴의 잔사를 40 내지 200mesh의 진동체로 제거하고 굴의 추출액을 수거하였다. 수거된 굴의 추출액을 공경(pore size)이 0.05 내지 0.1um인 모듈을 가지는 외부순환식 감압형 분리막을 이용하여 수용성 물질만을 정밀여과하였다. 정밀여과된 굴의 추출액을 30 내지 50℃의 온도에서 감압하여 brix가 20~40%가 되도록 농축하였다.
3-2. 뼈 건강 개선용 조성물의 제조
톳을 수세 및 탈염을 진행하여, 불순물 및 염을 제거하였다. 이후, 건조시키고 분쇄하여 톳의 분쇄물을 제조하고, 상기 3-1.의 굴의 농축추출액과 혼합하였다.
상기 굴의 가수분해액 및 톳의 혼합물을 전체중량의 10 내지 30%(v/v)이 되도록 물을 혼합한 후, 121℃에서 15분간 멸균하여 잡균을 제거하였다. 발효적정 온도인 30 내지 37℃까지 냉각하였다.
발효 균주로 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) BJ20(기탁번호: KCTC 11377BP) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) MBP-27를 혼합하여 접종하고, 30℃ 내지 37℃의 온도에서 발효하였다. 이때 발효 미생물은 전체 중량의 1 내지 5%(v/v)가 되도록 접종하며, 발효미생물을 접종하고 발효미생물에 의한 발효가 충분히 일어날 수 있도록 2 내지 7일간 발효하였다. 발효가 끝난 발효액을 121℃에서 15 내지 20분간 고온가압 멸균하여 발효기간 중에 대수적으로 증식한 발효미생물을 사멸시켰다. 멸균된 발효액을 0.05~0.1um이하의 수용성 물질만을 정밀 여과하여 맑고 깨끗한 발효액 만을 취하였다. 정밀 여과된 발효액을 분말로 제조하기 위하여 분무건조 또는 동결건조 등의 방법으로 건조한 후, 분쇄하여 분말화하였다.
[실험예 1: 파골 세포의 활성 억제]
1. 파골세포 배양 및 분화
본 연구에 사용된 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 세포 배양을 위해 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle’s media(DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
RAW 264.7을 파골전구세포로 하여 10% FBS가 첨가된 α-MEM 배지에 분화인자인 RANKL 100 ng/mL과 생굴 및 톳을 이용한 뼈 건강 개선용 조성물(이하 FO라 한다) 0, 200, 400, 600μg/mL 농도가 되도록 혼합한 배양액을 분주하여 이틀마다 배지를 교환하면서 5일간 배양하였다.
2. 파골세포 생성 측정
RAW 264.7 세포를 DMEM에 24h간 안정화시킨 후 α-MEM에 RANKL(100 ng/mL)와 FO를 0, 200, 400, 600μg/mL의 농도별로 첨가하여 분주하였다. 5일째에, TRAP용액으로 염색하여 TRAP 양성 세포를 파골세포로 인정하였다. 염색된 파골세포 중 3개 이상의 핵을 함유하는 세포의 개수를 통계에 이용하였다.
3. Actin Ring 형성 측정
RAW 264.7 세포에 RANKL (100 ng/mL)을 처리하여 파골세포로 분화시킨 후, α-MEM에 배양하면서 FO를 0, 200, 400, 600μg/mL의 농도별로 처리하고 성숙한 파골세포를 Alexa Flour 488이 결합된 phallodin으로 염색시킨 후, 30분 동안 DAPI로 염색하였다. Actin ring과 DAPI 염색은 형광현미경으로 관찰하였다.
4. 웨스턴 블롯(western blot) 분석
RANKL에 의한 신호전달과정을 관찰하기 위해 RAW 264.7 세포를 lysis buffer (50mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease inhibitors)로 용해하였다. 전체 용해물을 원심분리(14,000 rpm, 30 min)하여 상층액을 얻었다. 정량 후 SDS-PAGE로 분리하여 PVDF막에 옮긴 후 특정 항체를 이용하여 반응시키고 단백질 발현양은 image analyzer를 사용하여 확인하였다.
5. 세포 내 ROS 생성 측정
RAW 264.7 세포를 5x10⁴cells/well으로 6-well plate에 분주하여 24h시간 동안 안정화시킨 후, RANKL(100 ng/mL)로 분화 유도하여, FO 농도별로 처리하고 5일간 배양한 후, 10μM DCF-DA를 처리하여 37℃에서 30분간 염색 후 Flow cytometry를 사용하여 측정하였다.
6. RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화에 FO가 미치는 영향(도 1)
RAW 264.7세포에 RANKL을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도시키고, 다양한 농도(0, 200, 400, 600 ㎍/㎖)의 FO를 처리하여 파골세포 분화 및 생성에서의 FO 효과를 측정하였다. 파골세포를 TRAP staining 하여 현미경으로 관찰한 결과, FO의 농도가 증가할수록 TRAP 양성 세포의 크기가 감소함을 확인할 수 있었다(A). 그리고 TRAP 양성 세포 수를 측정한 결과, 마찬가지로 농도 의존적으로 억제됨이 관찰되었다(B, C). 파골세포는 뼈 흡수 과정동안 골격형성을 수행하며 뼈에 부착을 하면서, 일반적인 세포 외 공간을 구분하기 위해 파골세포의 actin이 하나의 큰 ring으로 조직화되므로, actin ring의 형성은 파골세포의 뼈 흡수 능력에 대한 중요한 표지이다. 분화된 파골세포에 FO를 농도별로 처리하여 actin ring 형성을 관찰한 결과, 농도 의존적으로 형성이 억제됨을 확인하였다(D).
7. FO가 파골세포의 분화와 관련한 단백질 발현에 미치는 영향(도 2)
RAW 264.7 세포에 RANKL(100 ng/mL)을 사용하여 파골세포 형성을 유도한 후 FO에 의한 분화 관련 단백질 발현을 비교하였다. RANKL에 의한 신호 전달체계에서 중요한 신호 전달 인자인 TRAF6와 c-Src의 발현이 FO 농도 의존적으로 감소하였으며 또한 PI3K의 인산화가 조절됨을 알 수 있다. 그리고 파골세포 분화 과정에서 RANKL이 IκB-α 발현을 증가시키고 p65의 nuclear translocation를 촉진시키는 반면에, FO 처리군에서는 억제됨을 확인하였다. FO가 파골세포 분화과정에 필수 전사인자인 NF-kB pathway를 억제시킴을 알 수 있다.
8. FO가 파골세포 분화과정에 생성되는 산화적 스트레스에 미치는 영향(도 3)
RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화과정 동안에 세포 내 산화적 스트레스가 발생된다고 알려져 있다. 그러므로 RANKL 유도 ROS 생성에 미치는 FO의 영향을 DCF-DA 염색을 통해 확인하였다. RANKL 처리된 파골세포에서의 증가된 ROS가 FO 처리군에서는 현저히 감소하였다. 이러한 현상은 항산화제인 NAC에서도 유사하게 관찰됨을 현미경을 이용하여 확인하였다.
9. FO의 ROS생성 억제에 의한 파골세포 관련 단백질의 발현 변화(도 4)
NADPH Oxidase는 ROS의 주요 요소 중 하나인데, NOXs 구성원들 중에서 파골세포 생성에 관여하는 NOX1과 조절 단백질인 Rac1의 발현이 FO 농도 의존적으로 감소하였다. 파골세포 분화에 미치는 FO의 영향에서 NOX1의 역할을 확인하기 위해서 NOX1을 사일런싱하여 파골세포 분화 관련 단백질들의 발현을 분석하였다. 그 결과, RANKL에 의해 유도된 TRAF6, c-Src, p-PI3K 신호들이 FO처리군에서는 감소하였고, NOX1 si RNA와 FO군에서는 상당히 억제되었음을 확인하였다. 따라서, FO는 RANKL에 의해 유도된 NOX1 의존적 ROS 생성을 저해함으로서 파골세포 분화 신호 전달 기전을 억제할 수 있다.
[실험예 2: 조골 세포의 활성화 유도]
1. 조골 세포의 배양 및 분양
본 실험에 사용한 MC3T3-E1 세포는 mouse calvaria 유래의 조골세포로서 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였고, 세포 배양에 필요한 α-MEM(α-minimum essential mediu m)배지, FBS (fetal bovine serum), penicillin-streptomycin 등은 GIBCO(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)사 로부터 구입하였다. MC3T3-E1 세포는 10% FBS와 1% 항생제(penicillin-streptomycin)가 포함된 α-MEM 배지를 이용하여 37℃의 CO2 배양기에서 배양하였다. 배지는 처음 2일 후에 교환하고 그 이후에는 4일마다 교환하였다. 2일 내지 3일간 배양 후 일차배양 세포가 70 내지 80%의 밀도에 이르렀을 때, 0.025% 트립신 용액을 이용하여 계대 배양하였다.
2. MTT assay
조골세포의 증식정도는 살아있는 세포의 생존율을 구하는 MTT assay로 측정하였다. MC3T3-E1 세포를 1 x 104 cells/well의 농도로 96 well plate에 100 μl씩 분주한 후 24시간 동안 37℃의 CO2 배양기에서 배양 후, 배지를 제거하고 FBS가 첨가되지 않은 배지에 다양한 농도(0, 50, 100, 200 ㎍/㎖)의 FO를 배분시켜 만든 새로운 배양액을 분주하였다. 48시간 배양한 후 배지를 제거하고 0.05 mg/ml 농도의 MTT시약(10μl/well)을 분주한 다음, 4시간 더 배양 후 배양액을 제거하고 침전물을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 microplate reader(Bio-rad, Benchmark, Hercules, CA, US A)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 배지만 넣고 배양시켰고, 대조군의 흡광도를 기준으로 세포 생존율을 산출하였다.
3. 조골 세포의 염기성 인산분해 효소 활성 측정
MC3T3-E1 세포를 96 well culture plate에 well당 1 x 104 세포를 접종하고 24시간 배양하고, 다양한 농도(0, 50, 100, 200 ㎍/㎖)의 FO가 함유된 배지로 교환하여 48시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 1% Triton X-100으로 세포를 용해하고 sonication하였다. 0.4 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl2, 4 mM p-nitrophenol phosphate (PNPP)이 함유된 완충용액 50 μl/well을 가한 후 30분간 반응시키고 150 μl의 1N NaOH를 가하여 반응을 중지시킨 후 분해된 pnitrophenol(PNP)을 microplate reader(Bio-rad, Benchmark, Hercules, CA, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 양은 bovine serum albumin protein assay reagent를 이용하여 측정하였으며 효소 활성은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
4. 제브라피쉬 모델에서의 뼈 형성 촉진 측정
in vivo에서의 FO의 뼈 형성 촉진 효과를 확인하기 위하여, 35일 동안 다양한 농도(0, 50, 100 ㎍/㎖)의 FO를 공급한 제브라피쉬에 calcein에 노출시켜 염색하였다
구체적으로 다양한 농도(0, 50, 100 ㎍/㎖)의 FO를 공급한 제브라피쉬와 이를 공급하지 않은 제브라피쉬 calcein에 노출시켜 염색시키고, 적절히 염색이 되면 용액을 버리고 PBS로 세척한 후 건조시켰다. 그 다음, Nikon Eclipse Ti현미경을 사용하여 이미지를 얻었으며, 상기 이미지 중, 염색 강도를 측정하여 평가하였다.
5. FO가 조골세포에 미치는 영향(도 5)
FO처리군에서 3일째부터 세포간에 클럼프를 형성함을 확인할 수 있었고, MTT활성화가 3일째부터 급격히 증가하였다. 실제 총세포수의 변화와 세포의 생존에 미치는 영향을 확인한 결과, 실험시간동안 총 세포의 생존률은 약물을 처리하지 않은 군과 동일하게 나타났지만, 5일째부터 총세포수가 눈에 띄게 감소(조골세포로의 분화로 인해서 총세포수가 감소함)하였다.
6. FO가 조골세포형성에 필수 유전자 발현에 미치는 영향(도 6 및 도 7)
FO(100 ug/ml)가 조골세포형성에 필수적인 유전자의 발현에 미치는 영향을 파악하기 위해서 처리 후 7일간 처리 후, 1, 3, 5, 7일째 유전자의 발현을 확인한 결과, Alp, RUNX2, Col1a1, OSX, Bglap, BMP2, BMP의 발현이 강력하게 증가하였다.
7. 뼈형성에 핵심인자인 Alp활성화(도 8)
FO 50 ㎍/ml과 100 ㎍/ml를 MC3T3-E1 세포에 투여하여, 골재형성과 재생이 일어나는 부위에서 국소적 인산이온 농도를 증가시키는 ALP의 합성을 측정하였다. 3일째에는 실험군과 대조군간 유의한 차이는 없었으나, 5일째부터 유의적으로 두 FO처리군에서 ALP활성이 증가하였다. Dex는 positive control로 사용하였다.
8. 제브라피쉬 발생단계에서 뼈형성 촉진(도 9 및 도 10)
3일째부터 9일까지 FO(50 ug/ml과 100 ug/ml)을 처리한 후 제브라피쉬에서 뼈형성을 확인하였다. 약 9일 후에 척추뼈의 형성이 FO의 처리에 의해서 촉진됨을 확인하였다. 전체 생성된 척추뼈의 면적과 형광강도도 증가함을 확인하였다.
[실험예 3: 난소적출모델에서의 골다공증 치료 효과]
1. 골다공증 동물 모델 제작
생후 8주된 암컷 ICR 마우스를 구입하여 1주일 동안 순응시킨 후, 8마리씩 5군으로 나누어 실험하였다.
각 군은 1)난소를 적출하지 않고 피부와 근육층을 봉합한 비 난소 절제 정상대조군(Sham), 2)난소를 절제하여 골다공증을 유발한 대조군(OVX), 3)난소 절제 후 FO를 100 mg/kg씩 매일 경구 투여한 실험군(OVX+FO 100 mg/kg), 4)난소 절제 후 FO를 200 mg/kg씩 매일 경구 투여한 실험군(OVX+FO 200 mg/kg), 5)난소 절제 후 17-beta-estradial(E2)를 매일 복강 투여한 양성대조군(OVX+E2)으로 분류하였다.
ICR 마우스는 Avertin 으로 마취 후 등의 털을 제거하고 미세가위로 피부와 근육층을 절개 후 양측의 난소를 완전하게 절제하고 봉합사로 봉합하였다.
2. Micro-CT 분석
난소절제 4주후, 실험동물을 희생시키고 경골을 절취하여 고정한 후 micro-CT(Skyscan 1272, Bruker, Kontich, Belgium)를 이용하여 3차원 영상 이미지를 재건하고 다양한 골 지표(BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp)를 분석하였다.
3. 골다공증 치료 효과(도 11 및 도 12)
Micro-CT를 이용해 얻은 3차원 영상 이미지를 통해 비 난소 절제 정상대조군에 비해 골다공증을 유발한 대조군에서 골 손실이 심화되었으며, 이러한 골손실은 FO를 100 mg/kg와 200 mg/kg 로 구강투여한 모든 군에서 억제되었다.
FO 투여에 의해 골밀도(BMD)와 골 부피(BV/TV(%))에 있어 유의한 개선효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 골소주 수(trabecular number), 골소주 간격(trabecular separation) 및 골소주 두께(trabecular thickness)도 유의하게 회복되었음을 확인하였다.
따라서 FO는 골다공증의 개선에 유효한 효과를 보이는 것으로 판단된다.
[실험예 4: 뼈 건강 개선용 조성물의 뼈 건강 개선 효과 비교]
1. 생굴 및 톳을 이용한 뼈 건강 개선용 조성물(FO')의 제조
생굴과 톳을 수세 및 탈염을 진행하여, 불순물 및 염을 제거하였다. 이후, 건조시키고 분쇄하여 굴 및 톳의 혼합 분쇄물을 제조하였다. 이후, 발효 균주로 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) JS 및 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus Usamii)를 이용한 것을 제외하고 제조예 1과 동일하게 뼈 건강 개선용 조성물을 제조하였다.
2. 뼈 건강 개선용 조성물(FM1)의 제조
FO 및 FO'을 1:0.5의 중량 비율로 혼합하여 뼈 건강 개선용 조성물(FM1)을 제조하였다.
3. 뼈 건강 개선용 조성물(FM2)의 제조
FO 및 FO'을 1:1의 중량 비율로 혼합하여 뼈 건강 개선용 조성물(FM2)을 제조하였다.
4. 뼈 건강 개선용 조성물(FM3)의 제조
FO 및 FO'을 1:2의 중량 비율로 혼합하여 뼈 건강 개선용 조성물(FM3)을 제조하였다.
2. 파골 세포 형성 억제 효과에 대한 비교
FO, FO', FM1, FM2 및 FM3에 대한 파골 세포 형성의 억제 효과를 비교하여, 평가하였다. FO에 대한 파골 세포 형성 억제 효과를 지수 5로 설정하고, FO', FM1, FM2 및 FM3에 대한 파골 세포 형성 억제 정도를 평가하여 지수로 나타내었다.
지수가 높을수록 효과가 우수함을 의미한다.
파골세포 분화 억제 파골세포의 분화와 관련된 단백질 발현 산화적 스트레스 ROS 생성 억제에 의한 파골세포 관련 단백질의 발현 변화
FO 5 5 5 5
FO' 6 7 7 7
FM1 3 4 3 3
FM2 8 8 8 7
FM3 5 5 4 5
(단위 지수)상기 표 1에 따르면, 발효 균주의 차이에 따라, FO에 비해 FO'에서 파골 세포 형성 억제 효과가 우수함을 확인하였다.
보다 구체적으로, FO 및 FO'를 동일한 농도 범위에서 처리한 이후, actin ring 형성을 관찰하였으나, FO에 비해 FO'에서 actin ring의 형성이 억제됨을 확인하여, 이를 토대로, 파골 세포 분화를 억제함을 확인하였다.
뿐만 아니라, 신호 전달 인자인 TRAF6와 c-Src의 발현이 FO에 비해 FO'에서 감소하였으며, PI3K의 인산화가 조절되었다. 또한, FO에 비해 FO'에서 NF-kB pathway를 억제 효과가 우수함을 확인하였다.
RANKL 처리된 파골세포에서의 증가된 ROS가 FO에 비해 FO'에서 현저히 감소하였으며, RANKL에 의해 유도된 TRAF6, c-Src, p-PI3K 신호들이 FO'처리군에서는 더욱 감소함을 확인하여, 종합적으로 FO에 비해 FO'에서 파골 세포 형성 억제 효과가 우수하다.
또한, FO 및 FO'을 혼합한 FM 1 내지 3의 경우에, FO 및 FO'의 혼합 비율에 따라 파골 세포 형성 억제 효과의 차이를 나타내었는데, 이중 FM2에서 가장 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
3. 조골 세포의 활성화 유도 효과에 대한 비교
FO 및 FO'에 대한 조골 세포의 활성화 유도 효과를 비교하여, 평가하였다. FO에 대한 조골 세포의 활성화 유도 효과를 지수 5로 설정하고, FO', FM1, FM2 및 FM3에 대한 조골 세포의 활성화 유도 정도를 평가하여 지수로 나타내었다.
지수가 높을수록 효과가 우수함을 의미한다.
총 세포수 필수 유전자의 발현(Alp, RUNX2, Col1a1, OSX, Bglap, BMP2, BMP의 발현) Alp 활성화 뼈 형성 촉진(제프라피쉬 발생 단계)
FO 5 5 5 5
FO' 7 7 7 7
FM1 4 4 4 3
FM2 8 8 8 7
FM3 5 5 5 5
(단위 지수)상기 표 2에 따르면, 발효 균주의 차이에 따라, FO에 비해 FO'에서 조골 세포의 활성화 유도 효과가 우수함을 확인하였다.
보다 구체적으로, 조골세포의 분화로 인해, 총 세포수의 감소가 FO에 비해 FO'에서 확연히 감소하였으며, 필수 유전자의 발현 또한, FO에 비해 증가하였음을 실험을 통해 확인하였다.
또한, 뼈 형성의 핵심 인자인 Alp 활성 역시, FO에 비해 FO'에서 증가하였으며, 제브라피쉬 발생 단계에서의 척추뼈의 면적과 형광 강도 또한 상당 부분 증가하였음을 확인하였다.
또한, FO 및 FO'을 혼합한 FM 1 내지 3의 경우에, FO 및 FO'의 혼합 비율에 따라 조골 세포의 활성화 유도 효과의 차이를 나타내었는데, 이중 FM2에서 가장 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (7)

  1. 굴 및 해조류를 발효시킨, 굴 및 해조류의 발효물로부터 추출한 발효 추출물을 포함하며,
    상기 굴 및 해조류는 굴 및 톳이며,
    상기 발효 추출물은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) JS(균주기탁번호 KCCM10499), 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus Usamii) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 발효 미생물을 이용하여 발효시킨 것으로,
    상기 발효 추출물은 파골 세포의 활성을 억제하고, 조골 세포의 활성을 촉진하여 골 형성을 촉진하는
    굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 발효 추출물은 타우린 및 GABA(gammaaminobutyric acid)를 포함하는
    굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 굴은 생굴, 굴의 가수분해액, 굴의 추출 농축액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는
    굴을 이용한 기능성 발효물을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 따른 조성물을 포함하는
    골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 따른 조성물을 포함하는
    골다공증 예방용 식품 조성물.
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