KR101864929B1

KR101864929B1 - 쿠드라트리쿠스산톤 a를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101864929B1
Application number: KR1020160044085A
Authority: KR
Inventors: 정길생
Original assignee: 계명대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-11
Filing date: 2016-04-11
Publication date: 2018-06-05
Also published as: KR20170116402A

Abstract

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물인 CTXA은 파골세포 분화, 액틴 고리 형성 또는 골 흡수를 억제하였으며, RANKL에 자극을 받은 Raw 264.7 세포와 골수 유래 대식세포에서 MAPK 기전 전달 경로 중 ERK와 p38 인산화에 영향을 미치지 않고 JNK 인산화를 억제하였고, RANKL로 유도된 c-Fos와 NFATc1의 발현을 억제하는 효과를 보이므로, 이를 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 제공할 수 있다.

Description

쿠드라트리쿠스산톤 A를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating osteoporosis comprising Cudratricusxanthone A}

본 발명은 쿠드라트리쿠스산톤 A(Cudratricusxanthone A)를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

골다공증(骨多孔症)은 뼈 미세구조의 질적인 변화로 인해 뼈의 통합성과 강도가 약화되어 척추와 대퇴, 요골 등의 골절 위험도가 증가되는 대사성 질환이다.

최근 급속한 경제성장과 의학의 발전은 고령화 사회로의 진입을 가속시키고 있으며, 이에 따른 관련된 만성질환으로 고통받는 노인 인구가 빠르게 증가하고 있다. 노인인구의 증가에 따라 더불어 나타나는 대표적인 질환이 골다공증이다. 퇴행성 골다공증은 주변에서 흔히 볼 수 있는 것으로, 미국의 경우 전체 인구의 10%가 골다공증에 의해 골격 부피가 줄어들어 있음이 보고되고 있고, 해마다 골다공증에 의한 골절환자의 발생률이 늘면서 연간 의료비도 계속 늘어나고 있는 추세이다. 동양 여성의 경우 골밀도가 서양 여성에 비해 낮고, 폐경기 여성의 절반 정도가 척추골절을 보이고 있고, 칼슘 섭취가 낮고, 육체적 활동이 서양여성에 비해 적은 것으로 미루어 보아 서양보다 더 큰 문제가 될 것으로 예상할 수 있다.

뼈는 살아 있는 조직이기 때문에 오래된 뼈는 일정하게 파괴되고 다시 새로운 뼈를 만들어내는 재형성 과정을 거친다. 이러한 과정 중에서 파골세포는 오래되어 불필요하게 된 뼈 조직을 파괴하여 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지할 수 있도록 도와주고 조골세포는 파괴된 뼈를 다시 재생시키는 역할을 한다. 이 작용은 하루 24시간 계속 일어나며 1년에 성인의 뼈의 약 10 - 30%가 이런 식으로 다시 만들어진다. 그러므로 파골세포와 조골세포 간의 균형은 매우 중요하며, 이 균형은 여러 호르몬과 기타 몸의 화학 성분 등에 의해 조절된다. 폐경기 이후 여성이나 노인 남성의 경우 파골세포와 조골세포 간의 균형이 깨져 파골세포가 과다 증식해 뼈의 칼슘이 많이 빠져나가 골성분이 부족한 골다공증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 골다공증 예방과 치료를 위해서 파골세포에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.

세계보건기구(WHO)는 골다공증을 골강도의 약화로 골절의 위험성이 증가하게 되는 골격계질환으로 정의하고 있으며, 골강도는 골량과 골질에 의해 결정된다. 골량은 20대 중반 또는 30대 초반의 청장년 시기에 일생 중 최대 골량이 형성되고 그 이후 연령 증가에 따라 골 손실이 진행된다. 30대에서 50대까지는 대체로 골량이 유지되며, 이는 오래된 뼈는 제거되는 골흡수와 새로운 뼈를 형성하는 골형성이 항상성이 이루어지기 때문이다.

골(bone)은 형성과 흡수가 지속적으로 일어나는 역동적인 조직으로 여러 가지 종류의 자극에 반응한다. 이런 골 대사는 조골세포(osteoblast)와 파골세포(osteoclast)의 활성 정도에 따라 오래된 뼈가 파괴, 흡수되거나 새로운 뼈가 형성되는데, 정상적인 경우 이들 세포의 상호작용에 의해 골개조(bone remodeling)가 일어난다. 하지만, 이러한 골흡수와 골형성의 항상성은 여성의 경우 폐경 이후 급격한 골 손실이 더 일어나게 되어 균형이 깨지기 쉬우며, 노화로 골 형성 기능이 퇴화됨에 따라 골손실이 지속됨에 따라 골다공증이 일어나게 된다. 골다공증은 초기에 급격히 진행되는데 골흡수로 인해 골 손실이 일어나게 되지만, 골형성이 불충분하여 일어나기도 하므로 조골전구세포가 조골세포로 분화하는 능력에 의해서도 결정된다. 이에 조골세포의 분화를 촉진하거나 파골세포의 분화를 억제하여 골흡수를 감소시키는 것이 필요하다.

1. 한국등록특허 10-1593271호.

따라서 본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 또다른 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 쿠드라트리쿠스산톤 A(Cudratricusxanthone A, CTXA)이다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물인 쿠드라트리쿠스산톤 A(Cudratricusxanthone A, CTXA)은 파골세포 분화, 액틴 고리 형성 또는 골 흡수를 억제하였으며, RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 자극을 받은 Raw 264.7 세포와 골수 유래 대식세포에서 MAPK 기전 전달 경로 중 ERK(extracellular signal-regulated kinase)와 p38 인산화에 영향을 미치지 않고 JNK(Jun N-terminal kinase) 인산화를 억제하고, RANKL로 유도된 c-Fos와 NFATc1의 발현을 억제하는 효과를 보이므로, 이를 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 제공할 수 있다.

도 1은 꾸지뽕나무 뿌리에서 분획물을 추출한 과정을 나타낸 이미지이고,
도 2는 꾸지뽕나무 디클로로메탄 분획물로부터 화합물(Cudratricusxanthone A, CTXA)을 추출하는 과정을 나타낸 이미지이며,
도 3은 Raw 264.7 세포와(A) BMM(Bone marrow-derived macrophage) 세포(B)에서 추출한 화합물 CTXA의 세포독성을 확인한 결과이고,
도 4는 Raw 264.7 세포에서 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의해 유도된 파골세포 분화에 있어서 CTXA의 효과를 확인한 이미지(A), TRAP 양성 다핵세포(Tartrate-resistant acid phosphatase-positive multinuclear cells)를 계수한 그래프(B) 및 다핵세포에서 TRAP 활성을 정량화한 그래프(C)이며,
도 5는 BMM 세포에서 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의해 유도된 파골세포 분화에 있어서 CTXA의 효과를 확인한 이미지(A), TRAP 양성 다핵세포(Tartrate-resistant acid phosphatase-positive multinuclear cells)를 계수한 그래프(B) 및 다핵세포에서 TRAP 활성을 정량화한 그래프(C)이고,
도 6은 Raw 264.7 세포와 BMMs 세포에서 RANKL에 의해 유도된 액틴 고리(actin ring) 형성에 대한 CTXA의 효과를 확인한 결과이며,
도 7은 Raw 264.7 세포와 BMMs 세포에서 RANKL에 의해 유도된 골 흡수(bone resorption)에서 CTXA의 효과를 확인한 결과이고,
도 8은 Raw 264.7 세포와 BMMs 세포에서 RANKL에 의해 유도된 JNK(Jun N-terminal kinase) 시그널링 경로에 대한 CTXA의 억제 효과를 확인한 결과이며,
도 9는 Raw 264.7 세포와 BMMs 세포에서 RANKL에 의해 유도된 c-Fos 및 NFATc1(nuclear factor of activated T cells 1)에 대한 CTXA의 억제 효과를 확인한 결과이다.

본 발명의 발명자들은 골다공증에 효과가 있는 천연물에 대해 연구하던 중, 꾸지뽕나무로부터 추출한 화합물이 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의해 유도된 파골세포 분화, 액틴 고리 형성 또는 골 흡수를 억제하였으며, RANKL에 자극을 받은 Raw 264.7 세포와 골수 유래 대식세포에서 MAPK(Mitogen-activated protein kinases) 기전 전달 경로 중 ERK(extracellular signal-regulated kinase)와 p38 인산화에 영향을 미치지 않고 JNK(Jun N-terminal kinase) 인산화를 억제하였고, RANKL로 유도된 c-Fos와 NFATc1의 발현을 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 꾸지뽕나무에서 추출되는 화합물로 쿠드라트리쿠스산톤 A(Cudratricusxanthone A, CTXA)이며 간 보호 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 꾸지뽕나무를 에탄올로 추출한 후, 디클로로메탄으로 분획한 분획물에서 1 내지 5 : 0.5 내지 2 부피비율의 헥산 및 에탄올로 이루어진 용출용매로 추출하여 수득하는 것이 바람직하다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 파골세포 분화, 액틴 고리 형성 또는 골 흡수를 억제하며, RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의해 유도된 JNK(Jun N-terminal kinase) 인산화, c-Fos 발현 또는 NFATc1 발현을 억제할 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 유효성분인 화합물(CTXA)의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

더불어 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 1]

상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 유효성분인 화합물(CTXA)에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품에 함유된 화합물(CTXA)은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 참고예 1> 꾸지뽕나무 및 시약 준비

꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata Bureau)의 뿌리는 양령 약초 시장(Yangnyeong herbal medicine Market, Daegu, Korea)에서 구입하여 건조하였다. 식물의 바우처(voucher) 표본은 계명대학교 약학대학에서 제조하였다.

메탄올, 아세톤, 아세트산에틸, 클로로포름(chloroform), 헥산(hexane) 및 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 용액은 덕산화학(Duk-san chemical co.(Korea))에서 구매하였다. NMR 용액은 Euriso-top Inc(프랑스)에서 구입하였다.

재조합 대식세포콜로니자극인자(Recombinant murine macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)와 재조합 가용성(soluble) RANKL 리간드(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand, sRANKL)은 PeproTech EC Ltd(London, UK)에서 구매하였다. MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)는 Amresco Inc. (OH, USA)에서 구매하였다.

나프톨 AS-MX 포스페이트(Naphthol AS-MX phosphate), 패스트 레드-바이올렛 LB 솔트(fast red-violet LB salt), ρ-니트로-페닐포스페이트(ρ-nitro-phenylphosphate), DAPI(4-6-Diamidino-2-phenylindole)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich Fine Chemicals, St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. α-MEM(Minimum essential medium α), DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 및 FBS(fetal bovine serum)은 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구매하였다. 포스포-JNK(phospho-Jun N-terminal kinase), JNK, 포스포-ERK(phospho-extracellular signal-regulated kinase), ERK, 포스포-p38 또는 p-38에 대한 1차 항체와 래빗 다클론성항체(rabbit polyclonal antibodies)는 셀시그널링(Cell Signaling Technoloy Inc, Beverly, MA)에서 구매하였다. 안티-c-포스-항체(anti-c-Fos-antibody)는 산타크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하였다. 활성화된 T세포-c1(anti-nuclear factor of activated T cells-c1, NFATc1) 항체의 안티-뉴클레어 팩터(anti-nuclear factor)는 BD 바이오사이언스(BD biosciences, San Jose, CA, USA)에서 구매하였다. ECL(enhanced chemilu-minescence) 웨스턴 블롯팅 디텍션 시스템(western blotting detection system)은 어드밴스타(Advansta Inc, CA, USA)에서 구매하였다. 오스테오 분석 플레이트(Osteo Assay Plate)는 코닝(Corning, New York, USA)에서 구매하였다.

< 참고예 2> 세포 배양 및 파골세포( osteoclast ) 분화

뮤린 대식세포 세포주(murine macrophage cell line)인 Raw 264.7 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구매하였다. 루틴 서브배양(routine sub cultivation)을 위하여, 10% FBS, 페니실린(penicillin, 100/ units/ml) 및 스트렙토마이신(steptomycin, 100μg/ml)을 포함한 DMEM을 사용하였다.

상기 세포를 5% CO₂, 37℃ 가습 환경에서 플레이트 바닥을 95%만큼 차지할 때까지 배양하였고, 2일마다 계대배양하였다. 이를 24 웰 플레이트의 각 웰에 5 × 10³ cells/well로 분주하였다. 5일 후, RANKL(50ng/ml)을 포함하는 배지를 각 웰에 추가로 넣어주었다.

더불어 오리엔트 바이오(Orient Bio, Gyeonggido, Korea)에서 구매한 수컷 ICR 마우스(4-6 주 연령)에서 이전에 공지된 방법(Biol. Pharm. Bull. 36; 796-801)을 따라 BMM(Bone marrow-derived macrophage) 세포를 추출하였다.

BMMs 세포는 10% FBS, 100U/ml 페니실린, 100μg/㎖ 스트렙토마이신 및 M-CSF(100 ng/ml)을 포함한 α-MEM으로 배양하였다.

배양 4일 후, BMMs 세포는 부착되지 않은 세포를 제거한 후, 파골세포 전구체(precursors)로써 사용하였다. BMMs 세포를 24웰 플레이트의 각 웰에 5 × 10³ cells/well로 분주하고 M-CSF(100ng/ml)과 함께 2일간 배양한 후, RANKL(100ng/ml)을 처리하고 다핵성 성숙한 파골세포(multinucleated mature osteoclasts)로 분화할 때까지 4일동안 더 배양하였다.

< 실시예 1> 꾸지뽕나무 분획 및 화합물 추출

1. 꾸지뽕나무의 뿌리 추출 및 분획(도 1)

꾸지뽕나무의 건조된 뿌리(1.5kg)를 EtOH(10L× 3)로 실온에서 5일동안 추출하였다. 이에 압력을 가해 용매를 제거하여 193.89g의 EtOH 추출물을 얻었다.

상기 EtOH 추출물을 H₂O(1.2L)에 현탁한 후, 얻어진 H₂O 층(H₂O layer)을 헥산(hexane, 1.2L), CH₂Cl₂ (1.2 L) 및 EtOAc (1.2 L)로 연속하여 분획하였다. 그 결과 헥산 13.16g, CH₂Cl₂ 41.44g, EtOAc 36.32g 및 H₂O 96.82g으로 각각의 분획을 얻었다.

2. CH ₂ Cl ₂ 분획으로부터 화합물 추출(도 2)

생리활성(bioactive) CH₂Cl₂ 용해 분획(fraction) 41.44g을 헥산 : 아세톤(3:1-2:1, 단계 구배(step gradient))의 용출용매로 용출시키면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 이용하여 13 분획으로 나누었다(Fr. 1∼13).

Fr. 4(1 g)을 100g의 SNAP 카트리지(SNAP cartrige)상에서 중압 액체 크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography)를 수행하고, 헥산 : 아세톤(2:1)로 용출하여 화학식 1의 화합물(20 mg, KPS-5, CTXA)과 7개의 소분획물(subfractions, KPS-1, 2, 3, 4, 6, 7 및 8)을 얻었다.

상기 CTXA의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼의 결과는 하기와 같다.

¹H-NMR(500MHz, Dimethyl Sulfoxide-d ₆) 6.87 (1H, s, H-5), 6.36 (1H, dd, J=10.6, 17.4 Hz, H-14), 6.25 (1H, s, H-2), 5.28 (1H, m, H-17), 5.00 (1H, dd, J=1.2, 17.4 Hz, H-15a), 4.91 (1H, dd, J=1.2, 10.6 Hz, H-15b), 4.19 (2H, br d, J=6.8 Hz, H₂-16), 1.84 (3H, s, H₃-20), 1.63 (6H, s, H₃-12, H₃-13), 1.60 (3H, s, H₃-19)

¹³C-NMR(125MHz, Dimethyl Sulfoxide-d ₆) a=183.3 (C-9), 163.4 (C-3), 162.2 (C-1), 155.5 (C-4a), 153.0 (C-6), 152.3 (C-4b), 151.3 (C-14), 141.1 (C-7), 131.1 (C-18), 128.5 (C-8), 124.2 (C-17), 111.3 (C-8a), 110.6 (C-4), 107.6 (C-15), 104.2 (C-9a), 100.6 (C-5), 99.3 (C-2), 41.4 (C-11), 30.3 (C-12, C-13), 26.0 (C-16), 25.8 (C-19), 18.0 (C-20).

< 실시예 2> 세포 생존율(viability) 분석

Raw 264.7 및 BMM 세포를 96웰 플레이트에 1× 10³ cells/well로 분주하고 24시간이 지난 후, 다른 농도의 CTXA를 처리한 후, 세포의 생존율을 MTT로 확인하였다.

100μl의 배지에 10μl의 MTT(5 mg/ml)을 첨가한 후, 37℃에서 4시간 배양하였다.

MTT가 포함된 배지를 제거하고, 형성된 보라색의 포르마잔 크리스탈(formazan crystals)을 200 μl의 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해한 후, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 550nm에서 측정하였다.

그 결과 도 3과 같이, 대조군과 비교하였을 때 Raw 264.7 세포에서 CTXA는 10μM 이하의 농도에서도 독성을 보이지 않았고, BMM 세포에서도 10μM의 농도에서 독성을 보이지 않았다. 따라서 세포 독성을 배제하기 위해, 후속 시험에서 10μM 이하 농도의 CTXA를 사용하였다.

< 실시예 3> TRAP( Tartrate -resistant acid phosphatase ) 시그널링 및 TRAP 활성 측정

파골세포 형성에서 CTXA의 영향을 확인하기 위하여, Raw 264.7 세포에 RANKL 및 다양한 농도의 CTXA를 5일동안 처리하였다. 더불어 M-CSF 및 RANKL을 초기 BMMs 세포에 5일간 처리하여 성숙한 TRAP-양성 다핵 파골세포를 유도하였다.

Raw 264.7 및 BMM 세포는 10% 포름알데히드(formaldehyde)를 이용하여 10분, 에탄올:아세톤(1:1)에 1분간 처리하여 고정하였고, TRAP 용액으로 염색하였다. 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP-양성 다핵성(multinucleated) 세포를 계수하고, 현미경으로 포착하였다.

TRAP 활성을 측정하기 위해, 세포를 고정하고, 10 mM 소듐 타르타르산염(sodium tartrate)와 ρ-니트로-페닐포스페이트(ρ-nitro-phenylphosphate)를 포함하는 pH 4.6의 50mM 시트레이트 버퍼(citrate buffer)를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.

1시간 배양한 후, 반응 혼합물을 동등한 양의 0.1 N NaOH를 포함하는 새로운 플레이트로 옮기고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성을 대조군의 백분율로 계산하였다.

그 결과 CTXA는 농도 0.5 내지 5μM의 농도에서 Raw 264.7 세포의 다핵성의 파골세포 분화(multinuclear osteoclast differentiation)에 대해 억제 효과를 보였다(도 4A 및 도 4B). 또한 TRAP 활성을 농도 의존적으로 억제하였다(도 4C).

더불어 CTXA를 RANKL과 함께 BMMs에 처리하였을 때, 파골세포 형성은 CTXA에 의해 농도의존적으로 억제되었다(도 5A 및 5B). 반면, TRAP 활성은 CTXA에 의해 농도 의존적으로 감소하였다(도 5C).

이러한 결과를 통해 CTXA는 파골세포 형성 및 TRAP 활성에 중요한 억제 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> 파골세포 및 골 흡수에서 DAPI 염색, 액틴 고리(actin ring) 구조의 CTXA 분열의 효과

액틴 고리 형성은 비정상적인 세포 골격 구조이며, 그 형성은 성숙한 파골세포에 의한 골 흡수를 위해 필요하다.

따라서 액틴 고리 형성에 대한 CTXA의 효과를 확인하였다. 이를 위하여 먼저, Raw 264.7 및 BMM 세포 액틴 고리를 다양한 시간동안 CTXA 존재 또는 비존재 하에 배양하였다.

성숙한 파골세포의 액틴 고리를 암실에서 알렉사 플루어 488-결합된 팔로이딘(Alexa Fluor 488-conjugated phalloidin)으로 염색한 후, 차가운 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하였다. 그런 후, PBS 내 1mg/ml DAPI와 30분간 배양하였다. 세포들은 세포사멸로 간주되는 조각난 염색질(chromatin)을 보여주었다.

성숙한 파골세포의 액틴 고리와 DAPI 염색의 분포는 형광 현미경(Fluorescence microscope)으로 가시화하였다.

더불어 피트(Pit) 형성을 분석하기 위해, 264.7 및 BMM 세포를 코닝 오스테오 분석 표면 웰(Corning, NY, USA)에 분주하고, 다른 농도의 CTXA 또는 RANKL(50ng/ml)을 8일 동안 α-MEM 배지와 함께 처리하였다.

배양 후, 세포들을 5% NaCl로 5분간 제거하고, 증류수로 2번 세척한 후, 3 내지 5시간 건조하였다. 흡수 피트(Resorption pit)는 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰한 후, 흡수 지역은 IMT 격리 FL 9.1 소프트웨어(IMT isolation FL 9.1, Vancouver, BC, Canada)를 이용하여 산출하였다.

성숙한 파골세포와 액틴 고리에 CTXA를 3일동안 처리하여 세포의 형태(morphology) 변형과 액틴 고리 구조의 분열을 유도하였고, 팔로이딘을 이용한 알렉사-488 플루오르로 염색하였다(도 6A 및 6C).

CTXA가 세포 사멸을 유도할 수 있는지를 입증하기 위해, DAPI 염색을 통해 핵 응축(condensation) 또는 단편화(fragmentation)을 평가하였다(도 6B 및 6D).

이러한 결과를 통해 CTXA가 고리 구조 및 성숙한 파골세포에서 응축 또는 단편화를 유도한다는 것을 확인하였다.

다음으로, 상아질 슬라이스에서 Raw 264.7 세포와 BMMs로부터 성숙한 파골세포를 준비한 후, 다양한 농도의 CTXA를 처리하여 파골세포 기능에서 CTXA의 영향을 확인하였고, 상아질 슬라이스(dentin slice)의 골 흡수 활성을 측정하였다.

그 결과, 성숙한 파골세포의 많은 흡수 피트는 CTXA 존재하에 상당히 감소되었다(도 7).

이러한 결과를 통해 성숙한 파골세포에서 CTXA는 액틴 고리를 억제하며, 세포 생존율에 영향을 주지 않고 골 흡수를 억제하는 것을 확인하였다.

< 실시예 5> CTXA의 RANKL에 의해 유도된 MAPK 시그널링 (p38, ERK 및 JNK ), c-Fos 및 NFATc1 발현 억제 효과 확인

Raw 264.7 및 BMM 세포들을 PBS로 세척하고, 단백질가수분해효소(protease) 및 인산가수분해효소(phosphatase) 억제제 칵테일(Thermo, USA)을 포함하는 RIPA 분석 버퍼(Radioimmunoprecipitation assay buffer)로 용해한 후, 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하였다.

단백질 농도는 브래드-포드(Brad-ford) 방법으로 확인하였다. 각 용해물의 동등한 양을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel)로 분리하였다. 전기영동 후, 단백질을 PVDF 막(polyvinylidene fluoride membrane, Bio-rad, USA)으로 이동시켰다. 막을 5% 탈지유(skim milk)를 포함하는 TBS(Tris-buffered saline)으로 블럭한 후, 1차 항체(포스포-ERK, ERK, 포스포-p38, p38, 포스포-JNK, JNK)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다.

이를 세척하고, 겨자무과산화효소가 결합된 안티-래빗 IgG(anti-rabbit IgG) 및 안티-마우스 IgG(anti-mouse IgG)와 함께 배양하고, ECL-plus(GE Healthcare Life Science, Tokyo, Japan)로 검출하였다. 면역반응성(immunoreactive) 밴드는 LAS4000(GE Healthcare Life Science, Tokyo, Japan)으로 분석하였다.

파골세포 형성에서 CTXA의 억제 효과에 대한 분자적 메커니즘을 확인하기 위해, RANKL에 의해 유도된 MAPKs(p38, ERK 및 JNK)의 인산화에서 CTXA의 효과를 확인하였다.

Raw 264.7 세포 및 BMMs에 RANKL을 30분간 처리하고 시그널링 경로의 인산화를 조사하였다.

이 결과에서, 대조군과 비교하였을 때 RANKL 자극에 의해 JNK 인산화가 증가하였다. 그러나 CTXA 처리 후 JNK 인산화는 크게 영향을 받았다(도 8). c-Fos 및 NFATc1은 파골세포 형성에서 중요한 역할을 하므로 이 두 가지의 전사 인자(transcription factor)가 결핍되었을 때, 파골세포형성(osteoclastogenesis)은 중단되었다.

더욱이 활성화된 MAPK 시그널링 경로는 c-Fos 및 NFATc1(nuclear factor of activated T cells 1)의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다.

따라서, Raw 264.7 세포 및 BMMs 세포에서 두 가지 전사 인자의 발현을 확인하여 CTXA의 영향을 확인하였다.

그 결과 CTXA는 RANKL에 의해 유도된 c-Fos 및 NFATc1 발현을 농도 의존적으로 억제하였다(도 9).

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제 1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 꾸지뽕나무를 에탄올로 추출한 후, 디클로로메탄으로 분획한 분획물에서 1 내지 5 : 0.5 내지 2 부피비율의 헥산 및 에탄올로 이루어진 용출용매로 추출하여 수득한 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 파골세포 분화, 액틴 고리 형성 또는 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의해 유도된 JNK(Jun N-terminal kinase) 인산화, c-Fos 발현 또는 NFATc1 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
화학식 1]
제 5항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 꾸지뽕나무를 에탄올로 추출한 후, 디클로로메탄으로 분획한 분획물에서 1 내지 5 : 0.5 내지 2 부피비율의 헥산 및 에탄올로 이루어진 용출용매로 추출하여 수득한 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제 5항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 파골세포 분화, 액틴 고리 형성 또는 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제 5항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 RANKL에 의해 유도된 JNK 인산화, c-Fos 발현 또는 NFATc1 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.