KR20220151480A - 무궁화로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 골질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 무궁화 꽃잎 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명은 골다공증의 치료에서 골흡수 억제제를 이용한 기존 치료의 한계에서 벗어나 새로운 뼈의 형성과 성장을 돕는 효과로 골다공증을 비롯한 골질환의 예방 또는 치료용 의약품 또는 건강식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 골질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 무궁화 꽃잎 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
인체의 골조직은 조골세포와 파골세포의 특수한 작용으로 형성(bone modeling)과 재형성(bone remodeling)이 끊임없이 일어나는 동적인 조직으로 파골세포는 뼈를 흡수하는 반면, 조골세포는 뼈기질을 합성하고 채우는 역할을 한다. 골 질량(bone mass)은 이러한 두 종류의 세포의 상대적인 기능에 의존하고, 정상 성인에서는 골흡수와 골형성 사이에 항상 균형이 유지되고 있다.
그런데 조골세포의 활성도가 낮아져 골형성이 감소되거나 파골세포의 활성도가 강해져 골흡수가 증가되는 등의 조골세포와 파골세포 간의 활성 불균형이 일어나게 되면 조직 내 화학조성에는 큰 변화가 없지만 골 질량이 감소하여 골다공증(osteoporosis)과 같은 골 대사질환이 유발될 수 있다. 또한, 고령화 사회 및 식생활의 변화로 골흡수가 증가되어 골조직이 취약해져 골다공증, 골절 등의 각종 골질환들이 증가하고 있다.
현재 골질환 예방 및 치료에 사용되고 있는 약제는 대부분 골흡수를 억제하는 작용을 하기 때문에 이미 진행된 골손실을 완전히 회복할 수 없다. 이에 골 항상성 유지를 위한 골형성 촉진제의 개발이 요구되어 왔으며 최근에는 조골세포를 효과적으로 생산하고 이를 이용하여 골조직의 기능을 강화하거나 손상을 치료하고자 하는 노력이 증가하고 있다. 이처럼 골다공증의 예방과 치료를 위해 골형성 증가에 관한 연구가 최근 주목받고 있으며 골조직 재생능력에 미치는 영향 등에 대한 과학적인 접근이 필요한 실정이다.
안토시아닌(Anthocyanin)은 많은 과일, 꽃과 채소의 파랑, 보라, 빨강 등의 색을 내는 생물활성 플라보노이드(flavonoids)의 하위 집단에 속한다. 안토시아닌은 심혈관계 질환(cardiovascular disease), 암, 염증 보호 효과를 가지고 있다(Middleton et al. 2000; Fang 2014). 추가적인 최근 연구들은 안토시아닌이 구강 건강에 있어 긍정적인 효과를 가지고 있음을 입증하였는데, 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutants)와 후소박테리움 뉴클레이툼(Fusobacterium nucleatum)을 포함하는 구강 세균들에 대한 항생 활성뿐만 아니라 치주 조직에 있어서 치조골(alveolar bone) 치료, 세포보호와 항염 활성 효과를 나타낸다고 알려져 있다(Desjardins et al. 2012; Al-Obaidi et al.2014; Hrynash et al. 2014). 그러나 안토시아닌이 골형성 및 골 무기질화를 촉진할 수 있는지의 여부는 아직 알려지지 않았다.
본 발명자들은 MC3T3-E1 마우스 조골세포와 인간 조골세포와 유사한 MG-63 세포 및 제브라피쉬 유충을 대상으로, 안토시아닌을 성분으로 하는 무궁화 추출물이 조골세포 분화를 촉진하고 골형성을 유도할 수 있으며, 프레드니솔론을 매개로 한 골다공증을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 조골세포의 분화를 촉진함으로써 골형성을 유도하는 무궁화 꽃잎 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 무궁화 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.
상기 분획물은 알코올 분획물일 수 있다
상기 안토시아닌은 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피라노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피라노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 안토시아닌은 알칼린 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP), 런트-관련 전사 인자2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2) 및 오스테릭스(Osterix, OSX)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 안토시아닌은 Wnt/β-카테닌 신호전달계 활성을 통해 조골세포 분화를 촉진하여 골형성을 유도하는 것일 수 있다.
상기 골질환은 골다공증, 골결손, 골연화증, 골감소증, 골형성 부전증, 골형성 장애, 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 퇴행성 골질환, 골 관절염, 골절, 골괴사, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수 질환 및 파제트병 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 무궁화 추출물은 에탄올 추출물일 수 있고, 이의 분획물은 알코올 분획물일 수 있다.
본 발명은 Wnt/β-카테닌 신호전달계를 활성을 촉진하고 조골세포 분화의 지표인 ALP, RUNX2 및 OSX의 발현을 증가시키며, 조골세포의 분화를 촉진함으로써 골형성을 유도한다. 따라서 본 발명은 골다공증의 치료에서 골흡수 억제제를 이용한 기존 치료의 한계에서 벗어나 새로운 뼈의 형성과 성장을 돕는 효과로 골다공증을 비롯한 골질환의 예방 또는 치료용 의약품 또는 건강식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리 농도에 따른 MC3T3-E1 세포에서의 세포생존율, 사멸세포 및 총 세포수를 분석한 결과를 나타내는 것이다. (A) 7일 및 14일 후 세포의 위상차 현미경 이미지, (B) 7일 후 (C) 14일 후, MTT 분석을 통한 상대적 세포 생존율 분석결과, (D) 7일 후 (E) 14일 후, 유세포 분석에서의 세포생존율 및 사멸 세포 분석 결과이다.
도 2는 MC3T3-E1 세포에서의 조골세포 분화 관련 유전자 발현을 나타내는 것이다. (A) 2% 알라자린 레드 염색을 사용한 위상차 현미경 이미지, (B) TRACP & ALP 이중 염색 분석 키트를 사용한 ALP 활성 분석 위상차 현미경 이미지, (C) 7일 후 ALP, RUNX2 및 OSX 유전자 발현 (D) 14일 후 ALP, RUNX2 및 OSX 유전자 발현 결과이다.
도 3은 MG-63 세포에서의 MTT 분석 및 조골세포 분화 관련 단백질 발현을 나타내는 것이다. (A) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리 7일 후 위상차 현미경 이미지 (B) 세포생존율 (C) 2% 알라자린 레드 염색을 사용한 위상차 현미경 이미지, (D) TRACP & ALP 이중 염색 분석 키트를 사용한 위상차 현미경 이미지, (E) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리농도에 따른 ALP, RUNX2 및 OSX 단백질 발현 결과이다.
도 4는 제브라피쉬 유충에서의 (A) 척추형성, 골 밀도 및 척추의 수 (B) ALP, RUNX2 및 OSX 유전자 발현을 나타내는 것이다.
도 5는 (A-B) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)과 GSK-3β간의 결합에 의한 펩타이드 백본 형성과 (C) MG-63 세포에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리 7일 후 GSK-3β 단백질 발현을 나타내는 것이다.
도 6은 (A) MG-63 세포에서의 β-카테닌 발현, (B) β-카테닌 핵전좌 염색결과 (C) 제브라피쉬 유충에서의 Wnt/β-카테닌 억제제 처리군과 비처리군에서의 척추형성, 골 밀도 및 척추의 수를 나타내는 것이다.
도 7은 프레드니솔론(PDS) 매개 골다공증이 유발된 MC3T3-E1 세포에서의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군에 의한 조골세포 분화 관련 단백질 발현을 나타내는 것이다. (A) 2% 알라자린 레드 염색을 사용한 위상차 현미경 이미지, (B) TRACP & ALP 이중 염색 분석 키트를 사용한 위상차 현미경 이미지, (C) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리농도에 따른 ALP, RUNX2 및 OSX 단백질 발현 결과이다.
도 8은 프레드니솔론(PDS) 매개 골다공증이 유발된 MG-63 세포에서의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군에 의한 조골세포 분화 관련 단백질 발현을 나타내는 것이다. (A) 2% 알라자린 레드 염색을 사용한 위상차 현미경 이미지, (B) TRACP & ALP 이중 염색 분석 키트를 사용한 위상차 현미경 이미지, (C) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리농도에 따른 ALP, RUNX2 및 OSX 단백질 발현 결과이다.
도 9는 프레드니솔론(PDS) 매개 골다공증이 유발된 제브라피쉬 유충에서의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군에 의한 척추 형성 및 조골세포 분화 관련 유전자 발현을 나타내는 것이다. (A) 5dpf 제브라유충을 2시간 프레드니솔론 처리한 후 9dpf로 노출한 도식, (B) 0.03% 카제인 염색한 척추형성 이미지와 척추의 수 및 골밀도, (C) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리농도에 따른 ALP, RUNX2 및 OSX 유전자 발현 결과이다.
도 2는 MC3T3-E1 세포에서의 조골세포 분화 관련 유전자 발현을 나타내는 것이다. (A) 2% 알라자린 레드 염색을 사용한 위상차 현미경 이미지, (B) TRACP & ALP 이중 염색 분석 키트를 사용한 ALP 활성 분석 위상차 현미경 이미지, (C) 7일 후 ALP, RUNX2 및 OSX 유전자 발현 (D) 14일 후 ALP, RUNX2 및 OSX 유전자 발현 결과이다.
도 3은 MG-63 세포에서의 MTT 분석 및 조골세포 분화 관련 단백질 발현을 나타내는 것이다. (A) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리 7일 후 위상차 현미경 이미지 (B) 세포생존율 (C) 2% 알라자린 레드 염색을 사용한 위상차 현미경 이미지, (D) TRACP & ALP 이중 염색 분석 키트를 사용한 위상차 현미경 이미지, (E) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리농도에 따른 ALP, RUNX2 및 OSX 단백질 발현 결과이다.
도 4는 제브라피쉬 유충에서의 (A) 척추형성, 골 밀도 및 척추의 수 (B) ALP, RUNX2 및 OSX 유전자 발현을 나타내는 것이다.
도 5는 (A-B) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)과 GSK-3β간의 결합에 의한 펩타이드 백본 형성과 (C) MG-63 세포에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리 7일 후 GSK-3β 단백질 발현을 나타내는 것이다.
도 6은 (A) MG-63 세포에서의 β-카테닌 발현, (B) β-카테닌 핵전좌 염색결과 (C) 제브라피쉬 유충에서의 Wnt/β-카테닌 억제제 처리군과 비처리군에서의 척추형성, 골 밀도 및 척추의 수를 나타내는 것이다.
도 7은 프레드니솔론(PDS) 매개 골다공증이 유발된 MC3T3-E1 세포에서의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군에 의한 조골세포 분화 관련 단백질 발현을 나타내는 것이다. (A) 2% 알라자린 레드 염색을 사용한 위상차 현미경 이미지, (B) TRACP & ALP 이중 염색 분석 키트를 사용한 위상차 현미경 이미지, (C) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리농도에 따른 ALP, RUNX2 및 OSX 단백질 발현 결과이다.
도 8은 프레드니솔론(PDS) 매개 골다공증이 유발된 MG-63 세포에서의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군에 의한 조골세포 분화 관련 단백질 발현을 나타내는 것이다. (A) 2% 알라자린 레드 염색을 사용한 위상차 현미경 이미지, (B) TRACP & ALP 이중 염색 분석 키트를 사용한 위상차 현미경 이미지, (C) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리농도에 따른 ALP, RUNX2 및 OSX 단백질 발현 결과이다.
도 9는 프레드니솔론(PDS) 매개 골다공증이 유발된 제브라피쉬 유충에서의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군에 의한 척추 형성 및 조골세포 분화 관련 유전자 발현을 나타내는 것이다. (A) 5dpf 제브라유충을 2시간 프레드니솔론 처리한 후 9dpf로 노출한 도식, (B) 0.03% 카제인 염색한 척추형성 이미지와 척추의 수 및 골밀도, (C) 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리농도에 따른 ALP, RUNX2 및 OSX 유전자 발현 결과이다.
본 발명자들은 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)이 조골세포 분화를 촉진하고 골형성을 유도함을 시험관내 및 생체내에서 입증하였으며, 프레드니솔론(PDS)을 매개로 한 골다공증을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서의 "무궁화"는 쌍떡잎식물 아욱목 아욱과의 낙엽관목으로 동남아시아 대부분의 지역에 분포한다. 학명은 Hibiscus syriacus L., 높이는 3-4m에 달하며, 어린 가지에는 털이 많으나 점차 없어진다. 무궁화의 꽃, 열매, 뿌리 줄기 등은 다양한 약리학적 활성을 보였으며 한약재의 원료로 널리 사용되어 왔다. 현대 약리학 보고에 따르면 무궁화 품종 Pulsae의 꽃잎에서 추출한 안토시아닌 추출물은 B16F10 흑색종 세포와 제브라피쉬 유충에서 멜라닌 생성을 강력하게 억제하고 TLR4 / MD2 매개 NF-κB 신호 전달 경로를 억제하여 지질 다당류 유발 염증 및 독성 쇼크를 약화 시켰으며 Nrf2 / HO-1 세포 신호 전달 경로를 활성화하여 산화 스트레스를 억제하는 효과가 있다.
본 발명에서 무궁화 추출물은 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다. 구체적으로 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1)내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 수득될 수 있다. 또한, 상기 알코올은 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 무궁화 불새 품종의 꽃잎을 동결건조하여 분쇄한 후 48시간 추출하고 여과하여 무궁화 에탄올 추출물을 수득하였다.
따라서 본 발명의 무궁화는 구체적으로 불새(학명 : Hibiscus syriacus 'Pulsae') 품종일 수 있다. 본 발명의“불새"는 홍단심계의 홀꽃인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 무궁화 추출물은 무궁화의 꽃잎 추출물일 수 있으며, 구체적으로 무궁화 불새 품종의 꽃잎을 추출한 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 무궁화 불새 품종의 꽃잎을 에탄올 용매로 추출한 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 “분획물”은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다.
또한, 상기 분획물은 무궁화 추출물을 증류수(물)에 현탁한 후, 탄소수 1(C1)내지 4(C4)의 알코올, 에틸아세테이트, n-헥산 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획함으로써 수득되는 것 일수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 무궁화 불새 품종의 꽃잎 에탄올 추출물을 Diaion® HP-20를 이용하여 흡착하고 알코올을 이용해 용리시켜 분획물을 수득하였다.
상기 무궁화 추출물 또는 이의 분획물로부터 크로마토그래피를 통해 안토시아닌을 분리할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 무궁화 에탄올 추출물의 분획물에서 분리된 안토시아닌 성분을 분석한 결과, 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피라노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피라노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside), 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))의 17종의 화합물을 포함함을 확인하였다.
본 발명의 조성물은 상기 17종의 화합물 중 선택되는 1종 이상을 포함하며, 상기 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다. 따라서, 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네 이트(토실레이트)염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 조골세포 등의 부족으로 인한 골형성에 문제가 있는 질환에 제한 없이 사용될 수 있으며, 구체적으로 프레드니솔론(PDS) 같은 코르티코 스테로이드를 장기간 사용함으로써 유발된 골파괴와 염증성 질환 등이 포함된 골다공증, 골결손, 골연화증, 골감소증, 골형성 부전증, 골형성 장애, 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 퇴행성 골질환, 골 관절염, 골절, 골괴사, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수 질환 및 파제트병(Paget's disease) 등과 같은 병리학적 골질환으로 골파괴를 촉진하는 질환이 포함될 수 있다.
조골세포 분화는 호르몬, 뼈형성 단백질(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)과 같은 사이토카인, 런트-관련 전사 인자2(Runt-related transcription factor 2, Runx2), 오스테릭스(Osterix, Osx), 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase: ALP) 그리고 β-카테닌을 포함하는 신호 단백질들 그리고 일련의 전사 인자들에 의해 조절되는 다중 세포 신호 경로를 경유하여 간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)로부터 분화된다.
런트-관련 전사 인자2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)는 간엽 줄기 세포를 전조골세포(preosteoblasts)로 분화시키는 주요 전사 인자이다. 오스테릭스(Osterix, Osx)는 전조골세포를 성숙한 조골세포로 분화함에 있어서 필수적이며 Runx2의 하위경로(downstream)에서 기능한다. 이러한 전사 인자들은 조골세포 분화 및 골 무기질화를 촉진하기 위해 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP), 오스테오폰틴(osteopontin, Opn), 오스테오칼신(osteocalcin, Bglap), 및 다른 조골세포 분화 마커들의 발현을 직접 조절한다.
최근에는 Wnt / β-카테닌 세포 신호 전달 경로가 다른 조절 인자와 상호 작용하여 조골 세포 분화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. Wnt 단백질은 주름진 수용체와의 결합을 통해 여러 세포 신호 전달 경로를 지시할 수있는 작은 신호 전달 당 단백질 계열이다. Wnt 부재 조건에서 β-카테닌은 글리코젠 합성효소-3β(GSK-3β), 키나제1, axin 단백질 및 아데노마투스 다포화성 대장균(adenomatous polyposis coli)과 함께 파괴 복합체를 형성하여 유비퀴틴 매개 단백질(proteasomal) 경로를 통해 분해된다. 구조적 연구에 따르면 Wnt 자극 조건 하에서 GSK-3β의 N 말단은 ser9에서 인산화되어 파괴 복합체에서 β-카테닌을 방출하여 핵 전이 β-카테닌을 촉진한다. β-카테닌의 핵 전이는 RUNX2, OSX 및 ALP와 같은 골형성 분화 관련 인자의 발현을 촉진하여 Wnt 경로 활성화가 적절한 뼈 발달에 중요함을 나타낸다.
본 발명에서, 무궁화 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌은 GSK-3β 인산화를 유도해 경로를 억제하고 Wnt/β-카테닌 신호전달계를 활성화시켜 조골세포 분화를 촉진한다.
따라서, 무궁화 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌은 Runx2, Osx 및 ALP의 발현을 증가시켜 조골세포 분화를 촉진한다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리 톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰 로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조 에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함 될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 골질환, 상처, 탈모 및 대사성 질환 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 육류, 초콜렛, 과자류, 아이스크림류, 비타민 복합제 및 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에서 "건강 기능성 식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의 약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍 미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실험재료 및 방법>
1. 무궁화 추출물의 제조 및 안토시아닌 분리
무궁화(Hibiscus syriacus L.)는 국립산립과학원(대한민국, 수원)의 무궁화 클론 아카이브((N 371505.56”, E 12657016.11”)에서 재배된 불새(Pulsae) 품종을 사용하였다. 바우처 표본은 산림청에 기탁하였다(NF-H8-F).
무궁화 불새의 꽃잎을 3일 동안 동결건조하여 추출 전까지 -20℃ 이하의 온도로 보관하였다. 꽃잎 1.5kg을 분쇄한 후, 상온(25℃)에서 48시간동안 40.0L 에탄올로 3회 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 회전 증발기를 이용하여 30℃이하에서 용매를 제거 후 동결건조 하였다.
상기 추출물은 Diaion® HP-20 (일본 미츠비시 케미컬 컴퍼니)를 이용하여 흡착하고 알코올을 이용하여 용리시켜 풍부한 안토시아닌 분획물을 제조하였으며, 이중 안토시아닌이 풍부한 분획물을 동결건조하여 120g의 무궁화 안토시아닌 분획물(Anthocyanins from Hibiscus syriacus L., AHs)을 제조하였다. 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)은 0.2㎜ 폴리테트라 플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE) 필터로 여과하였으며, UPLC-QTOF-MS 및 생물학적 활성 분석을 수행하였다
추출용액은 EP 등급을 용액을 이용하였고, 크로마토그래피 용매는 LC-MS 등급을 이용하였다. UPLC 시스템을 이용하여 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)에서 안토시아닌을 분리하였다. 분리된 안토시아닌을 분석결과 표 1과 같이 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피라노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피라노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside)) 화합물(17종)을 포함한다.
2. 시약 및 항체
시약은 최소 필수 배지(α-MEM), 태아 소 혈청 (FBS), 항생제 혼합물 및 트립신-에틸렌디아민테트라 아세트산 용액, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT), 카제인, 알리자린 레드, 3 % 젤라틴, 당나귀 혈청, 4'6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 및 β-글리세로포스페이트(GP, Sigma Aldrich, USA)를 사용하였다. 또한, Alexa Fluor 488(Abcam, 영국), Dako 파라마운트 수성 마운팅 미디어(Dako, USA)를 사용하였다. RUNX2(sc-101145), OSX(sc-393325), ALP(sc-398461), C23(sc-13057), β-catenin(sc-59737), GSK-3β(sc-81462), p-GSK-3β(sc-37800) 및 β-actin (sc-69879)은 Santa Cruz(CA, USA)에서 구입하였다. 과산화효소 면역 글로불린(KO211708)은 코마 바이오텍(대한민국)에서 구입하였다. 기타 다른 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
3. 세포배양 및 세포 생존율 분석
마우스 MC3T3-E1 전조골세포와 인간의 조골세포와 유사한 MG-63 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 항생제 및 10% FBS를 포함하는 α-MEM 배지에서, 37℃ 온도의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 유지 배양하였다.
무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리 농도에 따른 세포 생존율을 분석하고자, MTT 분석 및 유세포 분석을 수행하였다.
MC3T3-E1 세포(1 × 104 cell /㎖)에 0-400 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)로 24 시간 동안 처리하고 7일 및 14일동안 배양하였다. 그리고 MG-63 세포(1 × 104 cell /㎖)에 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)을 0-40 ㎍/㎖ 농도로 24 시간 동안 처리하고 7일 배양하였다. 이후 세포에 MTT 용액을 처리하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 용액을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 첨가한 다음 마이크로 플레이트 분광 광도계 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하고 위상차 현미경 (Macrotech, 경기도 고양시)을 이용하여 세포 형태를 분석하였다.
다음으로 세포 생존율, 사멸 세포 및 전체 세포의 수를 분석하기 위하여, 유세포 분석을 수행하였다. MC3T3-E1 세포 및 MG-63 세포를 1 × 104 cell /㎖의 밀도로 24웰 플레이트에 접종하고 AHs(0 -400 ㎍/㎖)로 7일 및 14일동안 처리하였다. 이후 세포를 수득하고 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하였다. 이후 Muse Cell Count & Viability Kit (Luminex Corp., Austin, TX, USA)로 5 분 동안 세포를 염색하고 Muse Cell Analyzer (Luminex Corp.)로 분석하였다.
4. 조골세포 분화 및 골다공증 유도
MC3T3-E1 또는 MG-63 세포를 1 × 104 cell /㎖의 밀도로 접종하고 7일 및 14일까지 표시된 농도의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)로 처리하고 병행 실험에서 10 μM 프레드니솔론(PDS)을 자극하기 전에 2 시간 동안 7일까지 표시된 농도의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)로 처리하였다. 배지는 프레드니솔론(PDS) 및 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)과 함께 3 일마다 교체되었다. 그런 다음 ALP 활성, 알리자린 레드, 유전자 발현 및 단백질 발현 분석을 사용하여 프레드니솔론(PDS)의 존재 및 부재에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 효과를 평가하였다.
(1) 알칼린 포스파타제(ALP) 활성
ALP 활성은 제조업체의 프로토콜에 따라 타르트레이트 내성 포스파타제(TRACP) 및 알칼린 포스파타제(ALP) 이중 염색 키트 (Takara Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan)로 측정하였다. 세포를 PBS로 3회 헹구고 고정 완충액과 함께 5분 동안 배양한 후 ALP 기질을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 45 분 동안 배양하였다. 각 웰의 대표 이미지는 위상차 현미경 (경기도 고양시 마크로 텍)에서 촬영했다.
(2) 알리자린 레드 염색
2 % 알리자린 레드로 염색하여 체외 칼슘 침착을 측정하였다. 세포를 PBS로 세척하고 37 ℃에서 10분 동안 4 % 파라포름 알데히드로 고정시킨 후, 탈이온수로 세척하고 2 % 알리자린 레드 용액으로 30분 동안 염색하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하여 과도한 염료를 제거하였다. 각 웰의 대표 이미지는 위상차 현미경(경기도 고양시 마크로 텍)에서 촬영하였다.
MC3T3-E1 유전자에 대한 총 세포 mRNA 및 역전사 효소 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 분리는 제조사의 지시에 따라 easy-BLUE ™ total RNA 추출 키트 (iNtRON Biotechnology, 대한민국 성남)를 이용하여 총 mRNA를 추출하였다. MMLV 역전사 효소 (Bioneer, 대전, 대한민국)를 사용하여 2 개의 마이크로 그램 RNA를 역전사 하였다. cDNA는 EzWay Neo Taq PCR MasterMix (KOMA BIOTECH)에 의해 이전 연구에서 설계된 특정 프라이머를 사용하여 증폭되었다(표2).
(3) 웨스턴 블롯 분석
총 세포 단백질은 RIPA 용해 완충액 (iNtRON Biotechnology)을 사용하여 준비하였다. 세포를 얼음 위에서 40분 동안 RIPA 용해 완충액으로 용해시키고 용 해물을 4℃에서 10분 동안 원심 분리하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 결정되었다. 단백질은 -80℃에 보관하거나 즉시 웨스턴 블롯팅에 사용하였다. 단백질을 SDS-폴리아크릴 아미드 겔에서 분리하고 니트로 셀룰로오스막 (Amersham, Arlington Heights, IL, USA)으로 옮긴 다음 표시된 1차 (200 μg/mL, 1 : 1,000 희석) 및 2차 항체(400 μg/mL, 1 : 3,000 희석)로 면역 블롯팅하였다. 마지막으로 이미지는 화학 발광 검출 시스템(Amersham)을 사용하여 각 단백질 발현 수준을 분석하였다 ImageQuant LAS 500(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, 스웨덴). 단백질의 발현 값은 β- 액틴 수준으로 정규화하였다.
(4) 면역 염색
MG-63 세포를 3 % 젤라틴 코팅 커버 슬립에서 배양하고 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)을 0-20 ㎍/mL 농도 및 글리세롤디하이드 3-포스페이트 디하이드로제나제(GP) 2 mM 로 7 일동안 처리하였다. 세포를 4 % 파라포름 알데히드로 고정하고 0.1 % Triton X-100으로 투과시켰다. 그런 다음 세포를 10% 당나귀 혈청으로 차단하고 β- 카테닌 항체 (10 % 당나귀 혈청에서 1 : 100)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 마지막으로, 대조 염색하기전에 세포는 300 nM DAPI로 실온에서 2 시간 동안 배양된 Alexa Fluor 488과 함께 배양하였다. 그런 다음 커버 슬립을 Dako faramount 수성 장착 매체로 유리 슬라이드에 장착하고 형광 이미지를 CELENA S 디지털 이미징 시스템(Logos biosystems, 경기도 안양시)로 분석하였다.
(5) 분자 도킹
재조합 GSK-3β (PDB : 1J1B)는 RCSB 단백질 데이터베이스 뱅크 (PDB, http://www.rcsb.org)에서, 그리고 안토시아닌은 PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)에서 얻은다음 Autodoc Vina를 사용하여 분자 도킹 점수를 mcule로 계산하였다. 4개의 도킹 포즈가 제공되었으며 UCSF Chimera (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera)를 사용하여 대표 이미지를 표시하였다.
5. 제브라피쉬(Zebrafish) 유지 관리
제브라피쉬(zebrafish)는 제주대학교 축산 이용위원회의 표준 지침(2020-0018)에 따라 유지 관리하였다. 14/10 시간의 명암 주기로 28.5℃에서 자랐다. 자연 산란된 배아는 28℃에서 1% 메틸렌 블루가 첨가된 배아 배지(34.8g NaCl, 1.6g KCl, 5.8g CaCl2.2H2O 및 9.78g MgCl2.6H2O, 1L 증류수, pH 7.2)에서 배양하였다.
6. 제브라피쉬 유충의 척추 형성 관찰
제브라 피쉬의 척추 형성은 0.05% 카제인 녹색 형광 마커로 모니터링하였다. 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 골형성 가능성을 평가하기 위해 3dpf 제브라피쉬 유충을 0-200 μg/mL 농도의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 또는 글리세롤디하이드 3-포스페이트 디하이드로제나제(GP) 4 mM 로 9dpf까지 처리하였다. 병행 실험에서 9dpf 제브라피쉬 유충은 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)처리 전 2 시간 동안 20 μM 프레드니솔론으로 전처리하였다. 배지는 2일마다 교체되었다. 그 후 유충을 0.05% 하소 용액에 10분 동안 담그고 0.04% 트리카인 메탄설포네이트(tricaine methanesulfonate)용액에서 마취한 후 CELENA S 디지털 이미징 시스템 (Logos biosystems, 경기도 안양시)으로 형광 이미지를 분석하였다.
제브라피쉬 유전자에 대한 총 세포 mRNA 및 역전사 효소 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분리는 제조업체의 지시에 따라 easy-BLUE ™ total RNA 추출 키트 (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 총 mRNA를 추출하였다. 2 μg mRNA는 MMLV 역전사 효소(Bioneer)를 사용하여 역전사 되었고, cDNA는 특정 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다(표 3).
7. 통계 분석
RT-PCR 및 웨스턴 블로팅에 대한 이미지는 ImageJ 1.50i(미국 메릴랜드 주 베데스다에있는 국립 보건원, www.imagej.net)를 사용하여 정량화하였다. 모든 데이터는 최소 3회 실험의 평균을 나타내며 평균 ±중앙값의 표준 오차(SEM)로 표현되었다. 통계 분석은 Sigma Plot 12.0 소프트웨어에서 Student's t-test 및 Bonferroni 보정을 사용하는 ANOVA (unpaired one-way analysis of variance)에 의해 수행되었다. 통계적 유의성은 p <0.05 (*), p <0.01 (**) 및 p <0.001 (*** 및 ###)로 설정되었다.
<실험 결과>
실험예 1: 세포독성 분석
1. MC3T3-E1 세포에서의 세포독성 분석
도 1A에 나타난 바와 같이, MC3T3-E1 세포에서 14일째, 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 200 μg/mL 농도 이후부터 비정상적인 형태학적 변화를 일으켜 세포 덩어리로 나타났다. 그러나 7일에서는 어떠한 형태학적 변화도 없었다. MTT 분석에 따르면, 7일째, 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 400 μg/mL의 농도는 대조군과 비교하여 상대 세포 생존율이 73.4 ± 3.4 %로 약간 감소했으며(도 1B), 14일째 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 400 μg/mL 및 200 μg/mL의 농도에서 대조군과 비교하여 각각 78.6 ± 0.2 % 및 56.0 ± 0.2 %로 크게 감소하였다(도 1C).
무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)이 세포 생존율, 사멸세포 및 총 세포 수에 미치는 영향을 추가로 확인하기 위해 동일한 조건에서 유세포 분석을 수행하였다. 도 1D에 나타난 바와 같이, 7일째 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 비처리 대조군에서 세포 생존율은 92.9 ± 0.5 %, 사멸세포 7.9 ± 1.0 %에 비교하여 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 400 μg/mL의 농도에서 세포 생존율은 87.1 ± 0.6 %로 감소하고 사멸세포는 12.9 ± 0.6 %로 증가하였다. 14일째, 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 비처리 대조군에서 세포 생존율은 94.9 ± 0.6 %, 사멸세포 5.1 ± 0.6 %에 비교하여 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 400 μg/mL의 농도에서 세포 생존율은 61.7 ± 1.1 %로 크게 감소하고 사멸세포는 38.3 ± 1.1 %로 크게 증가하였다. 전체적으로, 이러한 결과는 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 200μg/mL 미만의 농도일 때, MC3T3-E1 세포에서 세포 독성이 없음을 나타낸다. 따라서 이후 실험에서 200 μg/mL 미만의 농도로 이용하였다.
2. MG-63 세포에서의 세포독성 분석
MG-63 세포에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 40 μg/mL로 처리 후 7일째 비처리 대조군에 비교하여 최대 76.4 ± 6.5 %까지 세포 생존율이 감소함을 확인하였다(도 3A, 도 3B). 따라서 이후 실험에서는 40 μg/mL 미만의 낮은 농도로 이용하였다.
실험예 2: 조골세포 분화 활성 분석
1. MC3T3-E1 세포에서의 조골세포 분화 활성 분석
카제인 및 ALP 염색에서 얻은 결과에 따르면, 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군은 대조군에 비해 농도 의존적으로 7일 및 14일에서 석회화 및 ALP 활성을 현저하게 상향 조절하였다(도 2A 및 도 2B). 7일 및 14일 모두에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 100 μg/mL 농도의 효과는 2mM GP와 비슷하였다. 또한 mRUNX2, mALP 및 mOSX 발현과 같은 조골세포 분화 관련 마커 유전자를 농도 의존적으로 상향 조절함을 나타내었다(도 2C 및 도 2D).
카제인 및 ALP 염색을 정렬하면, 표적 유전자 발현에 대한 최고 농도 (100 μg/mL)의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 효과는 7일 및 14일 모두에서 2mM GP와 비슷하였다. 종합하면, 이러한 데이터는 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)이 MC3T3-E1 세포에서 조골세포 분화 및 골형성 마커 유전자 발현을 상당히 촉진한다는 것을 나타내는 것이다.
2. MG-63 세포에서의 조골세포 분화 활성 분석
카제인 및 ALP 염색에서 얻은 결과에 따르면, 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군은 비처리 대조군에 비해 농도 의존적으로 7일 및 14일에서 석회화 및 ALP 활성을 현저하게 상향 조절하였다(도 3C 및 도 3D). 석회화 및 ALP 활성에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 20 μg/mL 농도의 효과는 2mM GP와 비슷하였다. 또한 도 3E의 결과에 따르면 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군은 7일째에서 농도 의존적으로 OSX, RUNX2 및 ALP와 같은 조골세포 특이적 마커 단백질의 발현을 유의하게 증가시켰다. 이러한 데이터는 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)이 인간의 조골세포와 유사한 MG-63 세포에서 조골세포 분화 및 골형성 마커 유전자 발현을 상당히 촉진함을 나타내는 것이다.
실험예 3: 제브라피쉬 유충의 척추 형성 촉진 분석
제브라피쉬 모델에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 골형성 잠재력을 확인하였다. 수정 후 3일된 3dpf 제브라피쉬 유충을 0-200 μg/mL농도의 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)로 최대 9dpf까지 처리하고 0.05% 카제인 염색을 사용하여 척추 광물화를 평가하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)은 9dpf 유충에 존재하는 척추의 수를 50, 100 및 200 μg/mL 에서 농도 의존적으로 각각 9.3 ± 0.3, 12.2 ± 0.1, 16.9 ± 0.3으로 크게 증가시켰다. 비처리 대조군은 6.4 ± 0.3으로 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 처리군에 비하여 낮은 수를 나타내었다 (도 4A 왼쪽하단).
또한, 9dpf 제브라피쉬 유충의 골밀도도 비처리 대조군에 비해 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 50, 100 및 200 μg/mL 처리군에서 각각 1.5 배, 2.7 배 및 6.3 배 반응하여 증가하였다(도 4A 오른쪽 하단). 9dpf 제브라피쉬 유충에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 200 μg/mL에서의 효과는 4 mM GP (척추의 수 13.7 ± 0.4 배 및 골밀도 4.4 배)와 비슷하게 나타났다.
추가적으로 RT-PCR을 수행하여 9dpf 제브라피쉬 유충의 zRUNX2a, zALP 및 zOSX와 같은 조골세포 분화 관련 마커 유전자의 발현을 확인하였다. 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 농도 의존적으로 모든 테스트된 골형성 마커 유전자 발현을 크게 향상시키고(도 4B), 4 mM GP와 비슷한 수준을 나타내었다. 결과적으로 이러한 데이터는 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)이 조골세포 분화 관련 유전자 발현의 유도를 통해 제브라피쉬 유충의 척추 형성을 촉진한다는 것을 밝혔다.
실험예 4: GSK-3β 결합 분석
GSK-3β는 Wnt / β-카테닌 세포 신호 전달 경로의 호르몬 조절에 관여하여 조골세포 분화를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. 이에 GSK-3β(PDB : 1J1B)에 대한 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 잠재적 결합 친화성을 평가하였다.
표 4에서 보는 바와 같이, 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 17개 안토시아닌은 GSK-3β(PDB : 1J1B)에 결합하여 펩타이드 백본을 형성하였다.
그 중 6IOG(이소비텍신-4-0-글루코시드)의 결합 친화력이 결합 점수; -7.3으로 가장 강하게 나타났으며, 아미노산 결합에서 GLY47(O), GLY47(N) 및 ASN361(O)을 통해 1.925 Å, 3.17 Å 및 2.535 Å의 거리로 강력한 펩타이드 백본을 형성하였다(도 5A 및 도 5B).
또한 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)과 GSK-3β간의 상호작용을 정확히 평가하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 진행한 결과, 도 5C에서 볼 수 있듯이 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 농도 의존적으로 ser9에서 GSK-3β 인산화를 상당히 증가시켰으며 20 μg/mL 농도에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 효과는 2mM GP와 비슷하였다. 종합하면, 이러한 데이터는 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)이 GSK-3β와 긴밀히 상호작용하여 ser9에서 인산화함으로써 GSK-3β 경로를 억제함을 나타내는 것이다.
실험예 5: Wnt / β-카테닌 세포경로 활성 분석
ser9에서 GSK-3β의 인산화는 β-카테닌의 방출을 초래하여 결과적으로β-카테닌의 핵 전좌를 촉진하여 조골세포 분화를 유도한다. 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)이 MG-63 세포에서 농도 의존적으로 세포질 및 핵 구획 모두에서 β-카테닌의 존재를 상향 조절하여 β-카테닌이 파괴 복합체를 형성함을 나타내는 것을 관찰하였다(도 6A).
결과는 Alexa Fluor를 사용하여 β-카테닌의 면역 염색으로 추가 검증하였으며, 도 6B에 나타난 것처럼 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)은 β-카테닌의 핵 전좌를 촉진하였고 2mM GP 처리군과 비슷하였다. 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)을 200 μg/mL 또는 4 mM GP로 처리하기 전에 24시간 동안 표준 Wnt / β-카테닌 억제제인 FH535로 3dpf 제브라피쉬 유충을 사전 처리하였다. 도 6C의 오른쪽 상단 그림에서 보는 바와 같이, 카제인 염색 결과를 보면 FH535 전처리한 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs) 및 GP 처리군에서 각각 14.0 ± 0.4 ~ 7.1 ± 0.6, 12.1 ± 0.2 ~ 9.1 ± 0.3로 척추 형성이 억제되었고, 도 6C의 오른쪽 하단 그림을 보면 골밀도는 2.3 및 2.1배 억제되었다. 전체적인 결과에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)은 표준 Wnt / β- 카테닌 신호 전달 경로를 통해 조골세포 분화 및 골형성을 유도함을 확인하였다.
실험예 6: 프레드니솔론(PDS) 매개 골다공증에서의 AHs 효과 분석
프레드니솔론(PDS)은 장기간 사용시 골다공증을 유발하는 것으로 알려진 코르티코 스테로이드이다. 따라서, 프레드니솔론(PDS) 전처리 조건에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 조골세포 분화를 유도하는 능력을 평가하였다. 프레드니솔론 처리군은 비처리 대조군과 비교하여 7일째 MC3T3-E1 및 MG-63 세포 모두의 석회화 및 ALP 활성을 현저하게 하향 조절하였다. 이에 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)을 처리한 결과에서 농도 의존적으로 프레드니솔론-억제 석회화 및 ALP 활성을 상당히 회복시킬 수 있음을 도 7A, 도 7B 및 도 8A, 도 8B에서 나타내었다.
마찬가지로, 프레드니솔론(PDS) 처리한 MC3T3E-1 및 MG-63 세포 모두에서 RUNX2, ALP 및 OSX와 같은 조골세포 특이적 마커 단백질의 발현을 조사한 결과, 프레드니솔론(PDS) 전처리군은 대조군에 비해 RUNX2, ALP 및 OSX 단백질의 발현을 현저하게 감소시켰다. 이에 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)을 처리한 결과 농도 의존적으로 조골세포 마커 단백질의 발현을 현저하게 증가하여 회복시킬 수 있었다(도 7C 및 도 8C).
이러한 데이터를 종합하면 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)은 인간과 마우스 세포 모두에서 프레드니솔론(PDS)으로 인한 골다공증을 완화시키는 강력한 약물 후보라는 것을 보여주는 것이다.
다음으로 제브라피쉬 유충의 프레드니솔론(PDS) 처리 조건에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)의 효과를 평가하였다. 프레드니솔론(PDS) 처리한 9dpf 제브라피쉬 유충에서 척추의 수는 6.3 ± 0.2에서 4.3 ± 0.6으로, 골밀도는 28.9 ± 5.6 %로 현저하게 감소하였다. 이에 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)을 50, 100 및 200 μg/mL 농도로 처리하였더니 농도 의존적으로 척추의 수를 각각 7.2 ± 0.2, 9.2 ± 0.3, 13.7 ± 0.4로 유의하게 증가시킬 수 있었다(도 9B, 오른쪽 상단). 골밀도 역시 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)을 50, 100 및 200 μg/mL 농도로 처리하였더니 농도 의존적으로 각각 34.7 ± 4.3 %, 66.9 ± 9.8 %, 81.5 ± 8.2 %로 유의하게 증가시킬 수 있었다(도 9B, 오른쪽 하단).
마지막으로, 프레드니솔론(PDS) 처리 조건에서 조골세포 관련 마커 유전자 발현을 평가하였다. 도 9C에 나타난 바와 같이, 프레드니솔론(PDS) 처리군은 비처리군과 비교하여 골형성 마커 발현의 억제를 초래하는 반면, 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)을 처리하였더니 농도 의존적으로 발현을 회복시켰다. 종합적인 결과에서 무궁화 안토시아닌 분획물(AHs)은 제브라피쉬 유충에서 프레드니솔론(PDS) 매개 골다공증을 완화시킬 수 있음을 나타내었다.
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<223> zebrafish beta-actin reverse
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gaccgtcagg cagctcatag 20
Claims (9)
- 무궁화 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 무궁화 추출물은 무궁화 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 분획물은 알코올 분획물인 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 안토시아닌은 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피라노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피라노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 안토시아닌은 알칼린 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP), 런트-관련 전사 인자2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2) 및 오스테릭스(Osterix, OSX)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 안토시아닌은 Wnt/β카테닌 신호전달계 활성을 통해 조골세포 분화를 촉진하여 골형성을 유도하는 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 골질환은 골다공증, 골결손, 골연화증, 골감소증, 골형성 부전증, 골형성 장애, 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 퇴행성 골질환, 골 관절염, 골절, 골괴사, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수 질환 및 파제트병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 무궁화 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 제 8항에 있어서,
상기 무궁화 추출물은 무궁화 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN116370485A (zh) * | 2023-04-28 | 2023-07-04 | 暨南大学附属第一医院(广州华侨医院) | 2-羟基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷在制备促进血管-骨形成试剂中的应用 |
CN116370485B (zh) * | 2023-04-28 | 2024-04-19 | 暨南大学附属第一医院(广州华侨医院) | 2-羟基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 |
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