KR101647489B1

KR101647489B1 - 쉬나무 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약제조성물

Info

Publication number: KR101647489B1
Application number: KR1020140173660A
Authority: KR
Inventors: 최강열; 황정하; 이동환
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2016-08-11
Also published as: KR20160069014A

Abstract

본 발명은 쉬나무 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약제 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 뼈의 분해 억제가 아닌 뼈 형성을 촉진하여 골 질환의 치료에 효과적이며 부작용이 없다.

Description

쉬나무 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약제조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of bone diseases comprising extract of Euodia sutchuenensis Dode}

본 발명은 쉬나무 추출물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약제 조성물에 관한 것이다.

골 질환은, 신체 내에서 뼈를 생성하는 역할을 하는 조골세포(osteoblast)와 뼈를 파괴하는 역할을 하는 파골세포(osteoclast) 간의 활성에 조화가 깨어지게 되면서 초래된다. 파골 세포(osteoclast)는 뼈가 성장하는 과정에서 불필요하게 된 뼈조직을 파괴 또는 흡수하는 대형의 다핵세포이다. 성숙된 파골세포는 다핵 세포이며 조혈모세포에서 기원된다. 중간엽 간세포에서 분화된 조골세포는 약 34개월간 생존하여 활성화된 파골세포가 낡은 뼈를 분해시킨 자리에서 새로운 뼈를 만든다. 수많은 조골세포가 골기질을 만들고 점차 기질이 무기질화되면서 골형성이 마무리된다. 이후 조골세포의 약 70% 이상은 사멸되고 일부는 골세포(osteocyte) 및 골표면세포(bone lining cell)로 분화되어 생존한다. 뼈의 양은 파골세포와 조골세포의 균형에 의해 유지되므로 파골세포에 대해 중요한 역할을 하는 분자들을 표적으로 한 치료제 개발이 중요하다. 즉, 뼈를 흡수하는 파골세포의 활성이 증가하게 되면, 뼈의 분해가 촉진, 뼈가 얇아지고 쉽게 부러지는 골다공증과 같은 질병이 일어나게 되므로, 파골 세포의 활성을 조절할 수 있는 단백질들이 골 질환의 치료제로서 연구되고 있다(Gregory R. Mundy, Journal of Bone and Mineral Metabolism (1996) 14:59-64; Chad Deal, nature clinical practice RHEUMATOLOGY (2009) vol 5 no 1; Kalervo Vaananen, Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 959-971).

최근 들어 뼈의 형성과 관련된 여러 종류의 단백질과 유전자의 기능이 밝혀짐으로써 이러한 단백질 및 유전자들을 표적으로 하는 "뼈 형성 촉진제"의 개발에 대한 다양한 시도가 이루어지고 있다. Wnt/β-카테닌 신호전달계는 이 신호전달계인 보조수용체인 LRP5가 골밀도 감소로 인해 나타나는 대표적인 유전질환인 골다공증위신경교종증후군(osteoporosis pseudoglioma syndrome, OPPG)의 원인이라는 것이 보고된 이래, 뼈 성장 및 골밀도 조절에 대한 관련성이 활발히 연구되고 있으며, 골다공증 치료에 있어 효과적이고 안전한 약물 치료 표적으로 각광받고 있다(Boyden et al., N. Engl. J. Med. 2002; Little et al., Am. J. Hum. Genet. 2002; Einhorn et al., Science Translational Medicine, 2010; Yavropoulous et al., Exepert Review of Endocrinology and Metabolism, 2010; Wagner et al., Current Molecular Pharmacology, 2011).

현재 골다골증 치료제의 대부분은 병의 증상을 완화하거나 진행을 막는 것을 목표로 하는 골흡수 억제제(antiresorptive drug)로서, 골 흡수에 관여하는 파골세포의 기능을 약화시켜 뼈 손실을 막는다. 이러한 골 흡수 억제제는 비스포스포네이트(bisphosphonate) 제제가 주류이다. 그러나, 이들 치료제는 뼈의 형성을 촉진하는 것이 아닌 분해를 억제하는 것이므로 뼈를 푸석푸석하게 할 뿐 아니라, 지속적인 사용시 추가적인 골절로 이어질 수 있다.

본 발명자는 효과적이면서 부작용이 없고 안전한 골 질환 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 쉬나무 추출물을 처리하면 β-카테닌의 양이 증가하며 그로 인해 골 형성이 촉진됨을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 골 질환의 예방 또는 치료용 약제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 쉬나무 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

쉬나무는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과의 낙엽교목을 의미한다. 쉬나무 추출물은 메탄올을 추출용매로 사용하여 추출한 것 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 "골 질환"은 대사성 골 질환인 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)관련 골재흡수 질병, 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 이들이 동시다발적으로 발생하는 대사증후군 및 이들로 인하여 발생하는 질환을 총칭한다.

대표적인 대사성 골 질환인 골다공증은, 뼈를 흡수하는 파골세포와 뼈를 형성하는 조골세포의 골향상성 조절 불균형으로 인해 발생하는 질환으로, 골절 위험성이 증가될 수 있는 약해진 골강도를 특징으로 하는 골격장애를 말한다(미국 국립보건원 정의 NIH, 2000). 이는 골밀도가 감소하고 골조직의 미세구조가 퇴화해 골절위험증가를 보이는 전신질환을 의미한다. 즉, 낡은 뼈의 소멸과 새로운 뼈의 생성이 균형있게 유지되면서 골밀도가 유지되는데 노화가 진행되면서 새로운 뼈의 대체가 원활히 이루어지지 않아 뼈가 엉성해지고 이런 과정이 반복되면서 뼈가 얇아지고 부러지거나 부서질 위험성이 커지게 되는 것이다. 골강도는 2가지 요인, 즉 골밀도(BMD)와 골질(bone quality)에 의해 영향을 받는다. 골의 질을 구성하는 요소는 골의 구조와 골교체율, 미네랄화와 미세골절, 콜라젠 등의 뼈의 구성 성분이다. 골다공증은 정상적인 활동을 유지하는데 뼈의 칼슘량이 줄어드는 등 필요한 골량이 감소되어, 즉, 골밀도가 감소되어 가벼운 충격에도 쉽게 골절이 유발되는 질환이다. 한편, 골다공증이 되기전 상태를 골감소증이라고 하며 뼈가 계속 얇아지고 가벼워 지면서 구멍이 뚤리기 전까지의 상태를 말한다. 또한, 골연화증은 비타민 D가 부족하거나 칼슘을 대량으로 배설하는 신장질환이 있는 경우 뼈에 칼슘이 섞이지 않고 물렁뼈가 생겨버리는 상태로 뼈가 구부러지는 증상을 의미하고, 골 위축은 뼈의 퇴행 축소, 즉, 이미 완성된 골 조직의 골량이 줄어드는 증상을 의미한다.

그 밖에도, 신부전으로 인한 골 질환인 신성 골이영양증(renal osteodystrophy), 만성 신부전 환자의 대사성 골 질환 중 최근 점차 빈도가 증가하고 있는 무력성 골 질환(adynamic bone disease), 화농성균의 감염에 의해 초래된 염증성 질환인 감염성 골 질환 등이 골 질환에 포함된다.

골감소증(osteopenia)은 골다공증의 전단계를 지칭하며 발생원인은 파골세포의 흡수(resorption) 및 형성에 기인한다고 알려져 있다(T. Hirayama, L. et al., Rheumatology 2002; 41: 1232-1239). 류마티스에서 나타나는 골위축증(bone atrophy) 또한 파골세포의 흡수와 관련이 있다(Kobayashi S., Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi. 1982 Aug;56(8):727-38). 섬유이형성증(fibrous dysplasia)은 파골세포작용이 활발하여 나타난다(Riminucci M, et al., Bone. 2003 Sep;33(3):434-42.). 페이젯병(Paget disease)과 고칼슘혈증(hypercalcemia)은 파골세포 기능 억제를 통한 치료제가 이용되고 있다(Singer FR., Nat Rev Rheumatol. 2009 Sep; 5(9):483-9. Epub 2009 Aug 4.; Lumachi F,, Anticancer Res. 2009 May;29(5):1551-5.) 파골세포를 억제하면 뼈의 종양성 파괴(neoplastic bone metastases)를 억제할 수 있으며(Kawatani M,, Cancer Sci. 2009 Nov; 100(11):1999-2005. Epub 2009 Jul 21.), 골용해(osteolysis)와 골관절염(osteoarthritis)은 파골세포의 흡수 증가 또는 파골세포의 분화 증가에 의해 발생한다(Wei S, et al., Pathol Res Pract. 2008; 204(10):695-706. Epub 2008 Aug 30; Tat SK, et al, Keio J Med. 2009 Mar;58(1):29-40.).

본 발명의 약제 조성물은 쉬나무 추출물 외에도 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라, 항산화제, 완충액, 정균제 등 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 의석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 조성물의 일일 투여량은 약 10ng/kg 내지 10mg/kg, 바람직하게는 약 80~400ng/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 쉬나무 추출물을 포함하는 골 질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 쉬나무 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량%에 1 내지 15 중량% 포함되도록 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 쉬나무 추출물은 뼈의 분해 억제가 아닌 뼈 형성을 촉진하여 골 질환의 치료에 효과적이며 부작용이 없다.

도 1a는 wnt/β-카테닌 신호전달계를 활성화시키는 천연물 스크리닝 결과이다.
도 1b는 쉬나무 추출물의 농도에 따른 루시퍼라아제 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 쉬나무 추출물의 농도에 따른 β-카테닌 함량의 변화를 나타낸 것이다.
도 3a는 쉬나무 추출물의 처리군에서 두개관 골막의 두께 변화를 나타낸 것이다.
도 3b는 쉬나무 추출물을 처리한 뼈조직 세포에서의 β-카테닌 양의 변화를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 설명하기 위한 것으며, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포 배양과 시약

HEK293-TOP 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지(Dulbeccos Modified Eagles Medium, Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였다.

조골세포는 생후 4일의 ICR 쥐(Koatec Inc., Pyungtaek, Korea)의 머리덮개뼈에서 분리하여 최소 필수 배지(α-MEM, Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였다.

쉬나무는 어린 가지와 잎의 복합물을 사용하였으며, 황화디메틸(DMSO)에 1μg/ml 및 5μg/ml 농도로 녹여 사용하였다.

실시예 2. 루시퍼라아제 활성 평가

HEK293-TOP 세포를 24웰 플레이트에 고정시킨 후, 쉬나무 추출물 등을 5μM 농도로 24 시간 동안 처리하였다. 그 후, 전체 세포의 용해물을 추출하여 각 웰 당 5X 리포터 용해 버퍼(Promega, Madison, WI, USA) 25μl를 넣고, 루시퍼린 (Wako, Osaka, Japan) 25μl를 추가하였다. 루시퍼라아제 활성은 FLUOSTAR(BMG labtech, Offenburg, Germany)을 이용하여 측정하였다.

실시예 3. 웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯 분석을 위해 쉬나무 추출물을 24시간 동안 처리하였다. 조골세포의 경우 배양 접시에서 100%의 세포 밀집도(confluency)가 되게 배양한 후 수확하였다. 수확된 샘플들을 세포 용해한 후 단백질을 정량하였고, 10% 또는 12% SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동 한 후 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

실시예 4. 두개관 배양과 면역조직화학법

생후 4일된 ICR 쥐(Koatec Inc., Pyungtaek, Korea)의 두부로부터 머리덮개뼈를 절개하여 인산완충용액으로 세척하고 12웰 플레이트에서 7일 동안 분화를 유도하였다. 이때, 이틀마다 신선한 배지로 교체하면서 배양하였다. 그 후 두개관을 인산완충용액으로 세척하고 4℃에서 12시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정된 두개관을 4% 포르믹산과 4% 염산을 이용하여 2일 동안 탈회(decalcification)시켰다. 이후, 탈수 및 파라핀 블록 생성 과정을 거친 후 4μm의 얇기로 조직을 섹션하였다. 섹션된 조직은 재수화 과정을 거친 후 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 면역형광으로 염색하였다.

실시예 5. Wnt /β- 카테닌 신호전달계를 활성화시키는 천연물 스크리닝 및 발굴

Wnt/β-카테닌 신호전달계를 활성화시키는 물질을 찾기 위하여, HEK293-TOP 세포에 100종의 천연물 라이브러리(International Biological Material Research Center, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology, Daejeon, Korea)를 5μg/ml 농도로 처리한 뒤, 24시간 후에 β-카테닌의 전사 수준을 리포터를 통하여 측정하였다. 그 결과, 스크리닝을 통해 β-카테닌의 전사를 가장 많이 증가시키는 물질로서 쉬나무(Euodia sutchuenensis Dode)를 선별하였다(도 1a). 또한, 루시퍼라아제 활성은 쉬나무 추출물의 농도에 의존하여 증가하였다(도 1b).

실시예 6. 쉬나무 추출물에 의한 β- 카테닌의 함량 증가

쉬나무 추출물이 조골세포에서 β-카테닌의 함량 증가에 미치는 영향을 알아보기 위하여 조골세포를 이용하여 웨스턴블롯을 수행하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 쉬나무 추출물의 농도가 높아질수록 조골세포에서의 β-카테닌의 함량이 증가되었다.

실시예 7. 쉬나무 추출물에 의한 생체 외 두개관 뼈 성장

쉬나무 추출물이 생체 외(ex vivo) 두개관 두께 증가에 미치는 영향을 확인하기 위해 쉬나무 추출물을 조직에 처리하였다. 쥐의 두개관을 적출하여 생체 외에서 배양한 쉬나무 추출물을 처리 후 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행하였다. 그 결과, 대조군에 비해 쉬나무 추출물을 처리한 군에서 두개관 골막에서 골의 두께가 증가하였다(도 3a). 또한, 면역조직화학법을 수행해 본 결과, 쉬나무 추출물을 처리한 조직들의 뼈세포에서 β-카테닌의 양도 증가하였다(도 3b).

Claims

쉬나무 추출물을 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약제 조성물.
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제 1항에 있어서, 쉬나무 추출물이 wnt/β-카테닌을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약제 조성물.
쉬나무 추출물을 포함하는 골다공증 개선용 건강 기능식품.
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제 5항에 있어서, 쉬나무 추출물이 wnt/β-카테닌을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 개선용 건강 기능식품.