KR101794080B1 - 삼백초, 황금 등의 혼합 추출물을 이용한 폐암에 대한 항암제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 삼백초(Saururus chinensis), 황금, 하고초(Prunella vulgaris), 자근, 청피 및 쇠비름(Portulaca oleracea) 혼합물의 추출물을 이용한 폐암 대한 항암제 조성물을 개시한다. 본 발명의 항암제 조성물 등은 기존의 암세포 사멸 억제 활성에 기초한 항암제와 달리 항암제 내성의 원인인 암 줄기세포에 작용하여 그 사멸을 유도하고 그 증식과 그 전이를 억제함으로써 기존 항암제의 한계인 암의 전이·재발을 차단하여 근본적인 암 치료 가능성을 가진다.

Description

삼백초, 황금 등의 혼합 추출물을 이용한 폐암에 대한 항암제 조성물{Anti-cancer Composition for Lung Cancer Using of Extracts of the Mixture of Saururus chinensis, Scutellariae Radix, etc.}

본 발명은 삼백초, 황금 등의 혼합 추출물을 이용한 폐암에 대한 항암제 조성물에 관한 것이다.

최근까지 암은 정상세포가 발암물질이나 바이러스 등이 원인이 되어 유전 변이를 일으켜 발생하는 것으로 보아 왔으며, 따라서 항암제 개발과 치료는 정상세포에서는 발현되지 않고 암세포에서만 특이적으로 발현되는 유전자나 단백질을 표적으로 하여 왔다. 이러한 항암제는 단독으로 또는 다른 치료법 (방사능요법 등)과 병행하여 현재까지 암을 치료하기 위한 가장 일반적이며 효율적인 치료 방법이다. 이러한 항암제에 의한 암의 치료는 암세포를 사멸시킬 수 있는 능력에 기인하는데, 문제는 암세포뿐만 아니라 정상세포도 사멸시켜 빈번하게 탈모, 식욕부진, 오심, 구토, 호흡곤란, 구내염, 호중구 감소성 발열 등의 부작용을 유발한다는 것이다. 환자의 일반적인 건강 상태에 따라 이와 같은 부작용은 항암제 치료를 불가능하게 하거나 적어도 환자에게 극도의 불쾌감과 불편함을 줄 수 있으며, 암 환자의 남은 여생 동안의 삶의 질을 심각하게 훼손시킬 수 있다.

사실 암은 대개 항암제에 대한 최초 반응 이후 빠르게 진행될 수 있고, 더 많은 전이를 형성할 수 있다. 그러한 재발성 또는 전이성 암은 항암제에 대해 고도의 내성을 보인다. 항암제에 대한 이러한 내성은 암 줄기세포(cancer stem cells (CSCs) or tumor initiating cancer stem-like cells (TICSCs))에 의해 유발되는 것으로 간주되고 있다(Acta Pharmacol Sin 34: 732-740, 2013). 항암제 투여 후 80 ~ 90%의 일반적인 암세포는 재발 능력이 없지만, 나머지 10 ~ 20 %의 암 줄기세포는 죽지 않고 남아서 다시 암을 발생시킨다.

이처럼 암 줄기세포는 암 발생, 진행, 항암제 내성뿐만 아니라 암의 재발과 전이와도 직접적으로 관련되어 있으며(Cell Res. 2007 Jan;17(1):3-14; Cancer Biol. 2012 Jun;22(3):187-93; Acta Pharmacol Sin 34: 732-740, 2013; Pharmacol Ther. 2013 May;138(2):285-93), 종양이란 다양한 잠재적 능력(pulprint potency)과 자가재생능력(self renewal)을 보이는 특정한 세포군에 의하여 기인한다(J. Clin. Oncol. 26(2008) 2795-2799; Proc Natl Acad Sci USA 108:10544-10549, 2011).

따라서 암세포 재발과 전이를 막고 암을 근본적으로 치료하기 위해서는 암세포만을 공격하는 현재의 항암제가 가지고 있는 한계를 넘어, 암 줄기세포를 표적으로 하여 암 줄기세포를 제거하는 항암제의 개발이 필요하다.

암 줄기세포를 다른 암세포나 일반 줄기세포와 구분할 수 있는 바이오마커들 예컨대 CD133(prominin-1 또는 AC133), CD44(Hyaluronate receptor 또는 Pglycoprotein 1), ALDH1(Aldehyde dehydrogenases 1) 등이 밝혀져 있다(Cancer Metastasis Rev 27: 459-470, 2008; Cancer Invest 31: 404-411, 2013). 이 중 CD133(trans-membrane protein Prominin 1)는 혈관내피전구세포, 조혈모세포, 교모세포종(glioblastoma), 신경줄기세포(neuronal glial stem cells), 기타 신체 기관에서도 흔히 발견되는 바이오바커이다(Blood 93: 1435-1437, 1999; N Engl J Med 353: 811-822, 2005; Int J Biochem Cell Biol 37: 715-719, 2005; Molecule of the moment. J Pathol 214: 3-9, 2008; Cancer Invest 31: 404-411, 2013).

암 줄기세포는 상피간엽이행(epithelial-mesenchymal transition; EMT) 상태 또는 그 역의 현상인 간엽상피이행(mesenchymal-epithelial transition; EMT) 상태로 존재할 수 있다(Genes Dev 27: 2192-2206, 2013). 이 중 상피간엽이행이란 상피세포(epithelial cell)가 간엽세포(mesenchymal cell)의 성질을 획득하는 현상을 말한다(Genes Dev 27: 2192-2206, 2013; Cancer Res 72: 1290-1300, 2012). 상피세포에 존재하는 생물학적 구조체의 형태 변이와 재구축 과정에서 세포 간 결합이 느슨해지면서 세포의 골격이 변하고 운동성을 획득하게 되는데, 상피간엽이행은 배아의 발생, 상처 치유, 장기 섬유화, 암 전이 등에서 중요한 과정이다(Genes Dev 27: 2192-2206, 2013; Cancer Res 72: 1290-1300, 2012). 분명한 것은 상피간엽이행이 유도되었을 경우 암 줄기세포는 암을 유발하고 전이를 유발하는 데 있어 뛰어난 능력을 보여준다는 점이다(Cancer Res 72: 1290-1300, 2012). 상피간엽이행이 진행되는 동안 상피세포의 특성과 관련된 E-cadherin, TJP-1 등의 발현은 감소하고 간엽세포의 특성과 관련된 vimentin, Twist-1, SNAI2 등의 발현은 증가한다(Cancer Res 71: 245-254, 2011; Cancer Res72: 3406, 2012). 상피간엽이행은 NF-κB의 신호 전달 과정과도 밀접하게 관련되어 있는데, 유방상피세포에서 NF-κB의 과발현은 EMT의 유도와 Twist-1의 과발현을 촉진한다는 것이 알려져 있다(Cancer Res 72: 1290-1300, 2012).

LCN2(Human Lipocalin-2)은 폐암을 비롯한 다양한 암과 염증 질환 등의 바이오마커이다(J Clin Invest 114: 569-581, 2004). LCN2는 항암제의 암세포 사멸 작용에 저항성을 부여하고 MMP9(matrix metalloproteinase-9)와 결합하여 침윤을 촉진하고 종양의 성장을 돕는다고 알려져 있다(Oral Dis 18: 734-740, 2012). 또한 LCN2는 상피간엽이행을 유도함으로써 다양한 암의 발생을 촉진하고 암세포의 침윤과 전이를 유발한다고도 알려져 있다(Anal Chem 84: 8763-8770, 2012).

본 발명은 식품 원료로 사용되고 있어 안전성에 문제가 없는 삼백초, 황금 등 혼합물의 추출물이 A549 폐암 줄기세포(A549-TICSCs)와, 상피간엽이행(EMT)이 유도된, LCN2 유전자 도입 A549 폐암 줄기세포(LCN2-A549-TICSCs) 모두에서 그 증식 억제 및 사멸을 유도하고 그 전이를 억제함을 확인함과 함께 그와 관련된 분자적 기전을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명의 목적은 삼백초, 황금 등의 혼합 추출물을 이용한 골육종(osteosarcoma)에 대한 항암제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 삼백초, 황금 등의 혼합 추출물을 이용한 암 줄기세포의 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포의 전이 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여, 먼저 폐암 세포인 A549 세포에서 Human anti-CD133 마이크로 자성비드(Mongre RK et al., Int J Oncol 2015 46: 2573-85)를 사용하여 세포 표면에서 CD133를 발현하고 있는 A549 폐암 줄기세포(A549-TICSCs)를 분리·확인하고, 여기에 LCN2 유전자를 도입·과발현시켜 상피간엽이행(EMT)이 유도된 A549 폐암 줄기세포(LCN2-A549-TICSCs)를 얻은 후에, 이들 암 줄기세포 A549-TICSCs 및 LCN2-A549-TICSCs에, 본 발명의 유효성분에 해당하는, 삼백초, 황금, 하고초, 자근, 청피 및 쇠비름 혼합물의 열수 추출물을 처리하였을 때, LCN2-A549-TICSCs 세포에서 A549-TICSCs 세포보다 뚜렷하게 증가하였던 CD133과 LCN2의 발현이 감소함을 확인하였고(도 1 및 도 2), LCN2-A549-TICSCs 세포와 A549-TICSCs 세포 모두에서 초기 세포사멸과 관련된 특징인 염색체 응축 현상(chromosomal condensation; pyknosis), 핵 단편화 현상(nuclear fragmentation; karyorrhexis) 현상, 세포질 수축 현상 등을 확인하였으며, 핵 내 DNA 단편화 현상도 확인하였다(도 2). 또한 세포독성 실험 결과에 있어서도 LCN2-A549-TICSCs 세포와 A549-TICSCs 세포 모두에 대해 상기 시료가 농도 의존적으로 세포독성을 보이고, 세포 응축 등에 관여하는 SMC2(Condensin)을 발현을 증가시킴을 확인하였으며(도 3), 세포주기 분석 실험 결과에서도 상기 시료가 처리된 LCN2-A549-TICSCs 세포와 A549-TICSCs 세포 모두에서 세포주기 진행에 관련된 cyclin D(CCND 1)의 발현을 감소시키고, 초기 세포 사멸과 관련된 Caspase-3의 발현을 촉진하며, G2/M을 증가시킴을 확인하였다(도 4). 이러한 결과들은 모두 양성대조군으로 사용한, 폐암 등에 대한 항암제인 독소루비신에 비해 모두 우수한 것으로 나타났다.

나아가 본 발명자들은 상피간엽이행(EMT) 바이오마커의 발현 변화를 확인하였는데, 상기 시료가 처리될 경우, LCN2-A549-TICSCs 세포에서, A549-TICSCs 세포보다 뚜렷하게 증가하였던 종양단백질인(oncoprotein)인 Twist-1과 간엽세포 마커인 Vimentin 그리고 세포사멸 억제 기능을 지니는 SNAI2의 발현이 감소하였고, A549-TICSCs 세포보다 뚜렷하게 감소하였던 세포와 기질 간 부착에 관여하는 E-cadherin이 증가함을 확인하였다(도 5). 이러한 결과들도 Twist-1의 결과를 제외하고는 모두 양성대조군인 독소루비신에 비해 우수하였다.

본 발명자들은 또 나아가 A549-TICSCs 세포와 LCN2-A549-TICSCs 세포 각각을 마우스에 주입하여 in vivo 상에서 상기 시료가 이들 주입된 세포의 증식과 전이에 미치는 영향을 2주, 3주 및 4주째에 확인하였는데, 4주째에는 종양이 마우스 전체의 조직에 걸쳐 거의 관찰되지 않아 상기 시료가 종양의 크기를 현저히 감소시킬 뿐만 아니라 종양의 전이도 억제함을 알 수 있었다(도 6). 이러한 결과들도 양성대조군인 독소루비신에 비해 뚜렷하게 우수하였다.

마지막으로 본 발명자들은 상기 시료가 LCN2 유전자의 도입에 의하여 증가하였던 NF-κB의 발현을 감소시키고 NF-κB에 의하여 유도되는 MMP9의 발현도 감소킴을 확인하였는데, NF-κB는 종양 형성 및 전이에 관여는 전사인자로 신호전달 경로에서 MMP9의 발현을 직접적으로 유도하는 것이 알려져 있다(Mol Carcinog. 2007 May;46(5):402-13; J Biochem Mol Biol. 2007 Jan 31;40(1):88-94; Chem Biol Interact. 2010 Mar 30;184(3):403-12.;Stem Cell Res. 2012 Jul;9(1):9-23). 이들 결과에 있어서도 상기 시료는 양성대조군인 독소루비신에 비해 뚜렷하게 우수하였다.

전술한 바는 종합하면, 본 발명의 유효성분에 해당하는 삼백초, 황금 등 혼합물의 열수 추출물이 in vitro 및 in vivo 상에서 A549 폐암 줄기세포(A549-TICSCs)와, 폐암 등의 종양세포 전이와 관련된 상피간엽이행(EMT)의 특성을 보이는 LCN2 유전자의 도입 A549 폐암 줄기세포(LCN2-A549-TICSCs) 모두에서 그 증식 억제 및 사멸을 유도하고 그 전이를 억제함을 확인하고 그와 관련된 분자적 기전을 명확히 확인할 결과라 할 수 있다.

따라서 본 발명은 일 측면에 있어서 폐암에 대한 항암제 조성물로 파악할 수 있고, 다른 측면에 있어서 폐암 줄기세포 억제용 조성물로 파악할 수 있으며, 또 다른 측면에 있어서는 폐암 전이 억제용 조성물로 파악할 수 있다.

이러한 본 발명의 조성물은 삼백초(Saururus chinensis), 황금, 하고초(Prunella vulgaris), 자근, 청피 및 쇠비름(Portulaca oleracea) 혼합물의 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다. 여기서 황금은 속썩은풀(Scutellaria baicalensis)의 뿌리를 말하고 자근은 지치(Lithospermum officinale)의 뿌리를 말하며 청피는 청귤(Citrus nippokoreana)의 과피를 말한다.

생약명으로 추출 부위까지 특정되는 황금, 자근 및 청피를 제외한 나머지 삼백초, 하고초 및 쇠비름은 그 추출 부위에 특별한 제한이 없이 뿌리, 줄기, 잎, 수피 등이 모두 사용될 수 있지만, 아래의 실시예를 고려할 때 삼백초는 그 줄기가 바람직하고 하고초는 그 잎이 바람직하며, 쇠비름은 전초 특히 그 잎, 줄기 또는 이들의 혼합물이 바람직하다.

본 명세서에서, "추출물"이란 추출 대상을 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 물 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방식이 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 일부 또는 전부 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 물(특히 열수) 추출물을 의미한다.

또 본 명세서에서, "폐암"이란 비소세포폐암(non small cell carcinoma)과 소세포페암(small cell carcinoma)을 포함하는 의미이다. 비소세포폐암은 당업계에 공지된 바와 같이 조직형에 따라 편평상피암, 선암, 대세포암으로 구분된다.

또 본 명세서에서, "항암"이란 암세포의 사멸, 암세포의 증식 억제, 암이 가지는 병리적 증상의 개선, 치료 또는 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "암 줄기세포 억제"는 암 줄기세포의 사멸 유도 또는 그 증식 억제, 암의 재발 억제, 암 줄기세포의 악성화(malignance) 억제 및 암 줄기세포 침윤 활성(invasive) 억제, 전이 억제를 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "암 전이 억제"는 암 줄기세포가 그것이 발생한 부위 또는 기관에서 다른 부위 또는 기관으로 이동하는 것을 억제한다는 의미이다.

또 본 명세서에서, "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 항암제 조성물은 그 유효성분을 제형, 배합 목적 등에 따라 의도하는 항암 활성, 암 줄기세포의 사멸 활성 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 암세포나 암 줄기세포의 사멸, 암세포나 암 줄기세포의 증식 억제, 암세포나 암 줄기세포의 전이 억제, 암이 가지는 병리적 증상의 개선, 치료 또는 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 항암제 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 건강기능식품에관한법률에 따른 건강기능식품이거나, 식품위생법의 식품공전(식약처 고시, 식품의 기준 및 규격)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 두유류, 발효음료류, 특수용도식품(특히 체중조절용 조제식품) 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해되는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 복용되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품위생법에 따른 식품첨가물공전(식약처 고시, 식품첨가물 기준 및 규격)에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 화학적 합성품, 천연 첨가물, 혼합 제제류로 구분하여 한정적으로 규정되어 있다.

이들 식품첨가물은 기능적 측면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분될 수 있다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.

약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 치료적으로 유효한 투여량은 투여 경로, 그 제형, 목적 부위, 환자의 상태, 성별, 나이 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 인체에 투여 시 그 투여량은 안전성과 유효성 함께 고려하여 의사, 약사 등 의료 전문가의 의견, 처방 등에 따라 적정량으로 결정될 수 있다. 이러한 투여량의 결정에는 동물실험의 결과, 임상시험의 결과, 시판 후의 그것의 사용례 등이 고려될 것이다. 이러한 투여량의 결정에는 문헌[Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001)], 문헌[Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.] 등을 참조할 수 있으며, 이들 문헌은 본 명세서의 일부로 간주된다.

통상적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로 등을 고려하여 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위에서 결정될 것이며, 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 삼백초, 황금 등의 혼합 추출물을 유효성분으로 하는 폐암에 대한 항암제 조성물, 폐암 줄기세포 억제용 조성물, 폐암 전이 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물 등은 기존의 암세포 사멸 억제 활성에 기초한 항암제와 달리 항암제 내성의 원인인 암 줄기세포에 작용하여 그 사멸을 유도하고 그 증식과 그 전이를 억제함으로써 기존 항암제의 한계인 암의 전이·재발을 차단하여 근본적인 암 치료 가능성을 가진다.

도 1과 도 2는 폐 선암종 유래 A549-TICSCs 세포에 LCN2를 도입(LCN2+-A549-TICSCs)한 후 형태 및 성질 변화를 확인한 결과이다. 또한 LCN2+-A549-TICSCs에 BRM270을 처리하여 LCN2 발현에 끼치는 영향과 세포의 형태 변화를 확인하였다.
도 3은 BRM270 처리에 따른 TICSCs 세포사멸 효과(생존율 변화)를 확인한 그림이다. 또한 SMC2와 CD133 발현 변화를 확인하였다.
도 4는 BRM270 처리에 따른 TICSCs의 세포주기 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 LCN2+-A549-TICSCs 세포에서 BRM270처리에 따른 EMT 관련 mRNA와 단백질 발현 변화를 확인한 그림이다.
도 6은 BRM270 처리에 따른 종양 누드 마우스 모델의 항암효과를 확인한 결과이다(종양의 in vivo 분자 영상 및 종양 누드 마우스의 생존율)
도 7은 BRM270 처리에 따른 종양 누드 마우스 모델의 항암효과를 확인한 결과이다(종양의 무게 및 크기 변화 측정).
도 8은 BRM270의 NF-κB 관련 항암 기전을 확인한 결과이다.
도 9는 BRM270의 항암 기전을 도식화한 그림이다.

이하 본 발명의 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 시료 BRM270 의 폐암 줄기세포의 사멸 유도 및 증식 억제 활성 및 그 분자적 기전의 확인

Ⅰ. 재료 및 실험방법

1. 시료 BRM270 의 제조

전통적으로 사용되어 온 한약재를 조합하여 항암효과가 우수한 BRM270을 제조하였으며 그 배합비율은 하기의 [표 1]에 기재하였다. BRM270을 제조하기 위하여 식품공전 등에서 정하는 기준 및 규격에 적합한 원료만을 사용하였다.

BRM270 추출물(10brix) 배합비율

원재료	배합비율(%)	사용부위
삼백초	21.13	줄기
황금	21.13	뿌리
하고초	18.3	어린잎
자근	18.3	뿌리
귤(청피)	14.09	열매껍질
쇠비름	7.05	어린잎, 줄기
합계	100

전자저울을 이용하여 모든 원료를 배합 배율에 맞춰 칭량하였다. 배합된 원료를 광목천에 담아 추출기에 넣고 8배수의 추출수를 투입한 후 95℃ 내지 100℃의 온도로 10 내지 14시간 동안 추출하였다.

상기 추출이 완료된 추출액을 필터로 여과하여 교반탱크로 이송한 후 농축기를 이용하여 10브릭스(brix)의 당도가 되도록 농축하여 사용하였다.

2. 세포배양

한국세포주은행(Korean cell line bank, Seoul, Korea)에서 분양받은 인간 폐암(폐선암종; lung adenocarcinoma) 유래 세포주인 A549를 실험에 사용하였다. A549 세포는 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; Hyclone, South Logan, UT, USA)과 1% 항미생물제(antibiotic-antimycotic; Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 포함된 Dulbecco’s Modified Eagles medium(DMEM) 배양액에서 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다. 세포들은 80% 포화된 후 계대배양 하였으며 계대(passage) 3의 세포를 실험에 사용되었다.

또한 한국세포주은행에서 구입한 59세 백인(Caucasian) 남성 유래 골수 세포(Human bone marrow cells; hBMCs, KCLB no. 10,246)가 대조군으로 사용되었다. hBMC는 20% 우태아혈청과 1% 항미생물제 및 1nM 표피성장인자(epithelial growth factor; EGF, E9644-Sigma, USA)가 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양되었다.

Human anti-CD133 마이크로 자성비드(Mongre RK et al., Int J Oncol 2015 46: 2573-85)를 사용하여 A549세포의 TICSCs(Tumor initiating cancer stem-like cells) 성질을 확인, 분리 배양하였으며(A549-TICSCs 또는 CD133+-A549) 누드 마우스에 주입한 7일 후 종양 형성을 관찰하였다.

3. EMT 유도된 암전이 동물모델

일본 SLC, Inc에서 구매한 6주령의 수컷 BALB/cSIc nu/nu 마우스를 동물실험에 사용하였다. 마우스는 10주령, 11주령 또는 12주령이 되었을 때 제주대학교의 표준 프로토콜에 따라 희생되었으며 해당 실험 절차들은 제주대학교의 기관감사위원회(institutional review board)에 따라 진행되었다. 34마리의 마우스에 종양을 유도하였으며 종양 형성 및 전이 실험을 위한 마우스 실험군은 6군으로 나누었다. EMT 및 전이를 유도한 실험군(LCN2-A549 TICSCs induced tumor group)과 대조군(non-LCN2-A549 TICSCs induced tumor group)으로 각 6마리 마우스를 사용하였으며 BRM270를 처리한 실험군(LCN2-A549 TICSCs BRM270-treated group)으로 6마리를 사용하였다. 4 마리는 hBMCs가 주사된 음성 대조군으로 사용되었다. 종양 형성 효율을 분석하기 위하여 A549 TICSCs과 LCN2-A549 TICSCs 세포를 5×10⁶세포/ml의 농도로 희석한 후 누드 마우스의 우측 하단 측면에 micro-needle 실린지(29 gauge x 1/2”12.7 mm needle, Ultra-Thin Plus™, Korea)를 이용하여 주사하였다.

A549-TICSCs의 주사를 통한 누드 마우스의 종양 형성은 LI-COR Pearl animal image analyzer와 IRDye® 800CW 2DG(2-deoxy-D-glucose)를 통하여 확인하였으며 [도 1. F]에 나타내었다.

4. 종양 전이의 분자영상 확인 방법(Optical probe guided molecular imaging of tumor metastasis)

In vivo 상에서 종양 형성의 위치를 확인할 수 있도록, LI-COR, Biosceiences(USA)의 IRDye® 800CW 2-DG (2-deoxy-D-glucose) 광 프로브(LI-COR, Biosciences, USA.)를 사용하였다. 누드 마우스에 A549 TICSCs를 주입한 군과 LCN2-A549 TICSCs를 주입한 군의 종양 형성 정도를 확인하기 위하여 해당 세포를 주입한 후 7일 뒤에 자발 암전이(spontaneous metastasis)를 관찰하였다. 초기에는 암세포를 주입한 자리에 종양을 형성하게 되며 림프나 혈액 순환에 따라 암세포가 이동하면서 전이가 이루어진다. 프로브를 1X 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)에 녹인 후 1 ml/kg의 Zoletil 50 (Virbac, Carros, France)로 마취시킨 종양 누드 모델 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 모든 실험은 실험동물을 마취한 상태로 시간 간격을 두고 진행하였으며 암 전이 관련 근적외선형광(NIRF) 분자 영상 결과를 획득하였다.

5. LCN2 유전자 클로닝 및 페암 A549 세포주로의 LCN2 유전자 도입

인간 유전자의 상동 부위(Gene Bank accession no. NC_000009)를 기초로 하여 LCN2를 클로닝 하기 위한 프라이머를 제작하였다. LCN2 유전자의 C-말단 코딩 부위를 획득하기 위하여 5'-RACE(rapid amplification of cDNA ends)와 3'RACE 방법을 사용하였으며 primer 3.0 tool을 사용하였다[F-ATGTCACCTCCGTCCTGTTT(서열번호 1), R-GTCAGCTCCTTGGTTCTCC(서열번호 2)]. A549 세포의 cDNA를 확보하고 Prime Taq Premix (2X)(GenetBio, Korea)를 사용하여 총 20ul가 되도록 한 후 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였으며 증폭된 DNA를 pUC57에 삽입하였다. 정제된 PCR 산물의 LCN2 서열은 Cosmo Genetech, Korea에 의뢰하여 확인하였다.

발현을 위하여 PiggyBac system(Clontech, USA)을 사용하였으며 플라스미드를 증폭하기 위하여 E. coli Oneshot Top10 (Invitrogen,USA) 형질전환수용성세포(competent cells)을 사용하였다. EcoRⅠ과 HindⅢ의 제한효소 서열을 포함한 프라이머를 이용하여 LCN2 유전자를 sub-클로닝 하였다.

PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔에 로딩하여 크기에 따라 분리하였으며, Expin Gel (GeneAll Biotech, South Korea) 키트를 이용하여 추출하였다.

Nucleofector™-Amaxa Lonza System을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 A549-TICSCs 세포에 LCN2 유전자를 도입하였다.

6. 세포독성 확인실험( Cytotoxicity assay)

100ul의 배양액에 담겨 있는 5,000개 세포를 96웰 플레이트(96-well plate; Nunc, Weisbaden, Germany)에 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에 24시간 동안 배양하였다. 세포독성을 확인하기 위하여 배양된 세포에 15.6~125㎍/ml의 농도로 BRM270을 처리하거나 양성대조군으로서 항암제인 독소루비신(Dox)을 10uM/ml로 24시간 동안 처리한 후 샘플로 사용하였으며 이후 실험에서는 BRM270을 125㎍/ml의 농도로 24시간 처리한 샘플을 사용하였다. 수용성 tetrazolium salt를 이용한 EZ-CyTox 키트(Daeil Lab Service Co., Seoul, Korea)를 세포 생존율을 확인하기 위하여 사용하였으며, EZ-CyTox 용액 10ul를 각 웰에 첨가하여 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 추가로 배양한 후 450nm의 파장으로 흡광도(Model 680 microplate-reader; Bio-Rad, Berkeley, CA, USA)를 측정하였다.

7. DNA 단편화 실험(DNA fragmentation assay)

CD133+ A549 TICSCs 세포 또는 LCN2 유전자가 도입된 A549 TICSCs (1x10⁶ cells)를 6웰 microtitre 플레이트(NuncNunclon™ Delta, USA)에 접종한 후 BRM270을 125ug/ml의 농도로 24시간 처리하였다.

세포사멸(Apoptosis)로 인한 세포 핵 염색체의 형태학적 변화는 Hoechst33258로 염색하여 확인하였다. 세포를 인산완충식염수(Phosphate-Buffered saline; 10X PBS, Gibco, Life technologies, USA)로 세척하고 4% 포름알데히드 용액으로 10분 동안 고정하였다. 그 후 50uM Hoechst33258 용액을 5분 동안 처리한 후 차가운 1X 인산완충식염수로 3회 세척, 획득한 샘플을 형광현미경(Olympus, IX-70, Japan)으로 분석을 수행하였다. 그 후 게놈 DNA를 분석하기 위하여 AccuPreP® Genomic DNA Extraction 키트(Bioneer, Korea)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 획득한 DNA 5ug을 1.2%의 아가로스겔에 전기영동한 후 에티디움브로마이드(EtBr)로 염색하고 UV광을 사용하여 확인하였다.

8. 유동세포계수법(flow cytometry )과 세포주기 분석

세포주기를 확인하기 위하여 PI 염색을 수행하였으며 형광이용세포분류기(Fluorescence activated cell sorter; FACS caliber, Becton-Dickinson, USA)를 사용한 유동세포계수법으로 분석하여 결과를 나타내었다. CD133+ A549세포(CD133 발현 A549세포)와 LCN2-A549 세포에 BRM270(100ug/ml) 또는 Dox(10uM/ml)를 24시간동안 처리하였으며 1×10⁶세포/ml이 되도록 회수하였다. 그 후 세포를 70%에탄올을 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안(O/N) 고정화하였다. 고정화된 세포를 차가운 인산완충용액을 사용하여 2회 세척하였으며 30분간 Ribonulease A(#R-5125, Sigma, 8ug/ml) 및 PI(10ug/ml)를 처리하였다. 그 후 각 세포 샘플은 meshed blue capped 튜브(BD Falcon Tubes #352235)에 옮겨졌다. 형광신호는 FL2채널을 통하여 검출되었으며 세포 주기상의 DNA는 ModfitLT Version 3.0(Verity Software House, Topsham, ME, USA)를 사용하여 분석하였다.

9. 면역염색법( immunocyto / histochemistry ; ICC)에 의한 EMT 유도된 암전이 분석

CD133+ LCN2-A549-TICSCs 세포와 A549 TICSCs 세포를 1X 인산완충식염수로 세척한 후 4% 포름알데히드로 상온에서 25분간 고정하였다. 차가운 1X 인산완충식염수로 3회 세척하고 세포의 투과성을 높이기 위하여 1X 인산완충식염수에 희석된 1% Triton X-100을 상온에서 15분간 처리하였다. 다시 1X 인산버퍼식염수로 3회 세척한 뒤 1% 우혈청알부민(BSA)으로 한시간 동안 bloking 하였다. 이후 1% 우혈청알부민(BSA)를 포함하는 1X 인산버퍼식염수에 1차 항체를 희석한 후 4℃에서 하룻밤동안(O/N) 반응시키고 0.2% 트윈-20 (tween-20, Sigma, USA)를 포함하는 1X 인산버퍼식염수에 FITC-2차 항체를 희석한 후 세포와 상온, 암조건에서 1시간동안 반응시켰다. 2차 항체와 반응이 완료된 세포를 차가운 인산버퍼식염수로 세척 한 후 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 5분간 대비염색하였다. Mounting 용액 1ml을 샘플 슬라이드에 첨가한 후 형광현미경(Olympus, Milan, Italy)을 이용하여 Alexa Flour 488, FICT, GFP(green fluorescence protein) 또는 PE(phycoerythrin)의 파장을 검출하였다.

10. RNA 추출 및 정량적인 실시간 PCR 방법(Quantitative real-time polymerase chain reaction; qPCR )

2×10⁶개의 세포를 T25-mm 플라스크(Nunc, Thermo Scientific, Korea)에 접종한 후 계대 3이 될 때까지 배양하였다. 24시간 동안 배양하여 70% 포화 상태가 되었을 때 2% 우태아혈청(FBS)이 포함된 RPMI-1640 배지로 교체하였다. 5% 트립신-EDTA(Gibco, Life technologies, USA)를 사용하여 세포를 플라스크 회수한 후 easyBlue(Intron Biotech, Seongnam-si. Korea)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 정제된 RNA는 Photometer(Bio-Rad Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하였다. SuperscriptⅢ first strand cDNA Synthesis 키트, 올리고 dT 프라이머(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 정제된 RNA 1ug을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 qPCR에 사용되었으며 Cosmo Genetech, Korea에서 구매한 hLCN2, E-cadherin, Vimentin, Twist-1, TJP-1, SNAI2, p65, 및 c-Myc의 프라이머를 활용하여 mRNA 발현을 확인하였다.

11. 정량적인 웨스턴 블로팅 (Quantitative western blotting)

세포 분석 샘플을 획득하기 위하여 60mm 플레이트에 세포를 접종한 후 하룻밤 동안 배양하고 저농도 혈청 배지(1% FBS) 상태에서 16시간동안 배양하였다. 그 이후에 단백질 합성을 저해하는 G418가 포함된 10% 우혈청배지나 10% DMEM 배지 조건에서 추가적으로 배양하였다.

A549-TICSCs 세포 또는 LCN2-A549 TICSCs 세포를 주입하여 종양을 유도한 누드 마우스의 증상을 완화시키기 위하여 BRM270을 5mg/ml/day로 2 내지 4주간 처리하였으며 웨스턴블로팅을 통하여 단백질 발현을 분석하였다.

세포의 전체 단백질은 얼음으로 냉각된 RIPA buffer PMSF(Sigma-Aldrich Corp., USA)를 사용하여 획득하였으며 protease inhibitor cocktails (Fermentas, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 처리하였다. 단백질 농도는 Pierce® BCA Protein Assay 키트(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하였으며 14ug의 단백질을 전기영동을 위한 시료로 사용하였다. Bio-Rad western blotting system (Bio-Rad, Berkeley, CA, USA)을 사용하여 단백질은 12% 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel)에서 크기에 따라 분리되었으며 폴리비닐리덴 디프루오라이드 멤브레인(PVDF, Sigma-Aldrich Corp.)으로 옮겨졌다. 멤브레인의 단백질을 Santa Cruz Biotechnology에서 구입한 1차 항체(NF-κB, Lipocalin-2, E-cadherin, Vimentin, SNAI2, Twist-1, MMP-9, TJP-1 and SMC2 rabbit 다클론항체) 및 beta-actin과 하룻밤 동안 반응시켰으며, 2차 항체와 한 시간 동안 반응시켰다. 이후 화학발광키트와 LAS400(GE Healthcare, NJ, USA)를 사용하여 원하는 단백질을 검출하였다.

12. 통계분석

실시간 PCR 방법과 웨스턴블로팅 실험 결과를 이용한 유전자/단백질 발현의 상대적인 정량값은 ANOVA(분산분석법)를 이용하여 나타내었다.

종양이 유도된 마우스의 전체 생존율을 나타내는 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 커브는 log-rank (Mantel-Cox)와 Gehan-Breslow-Wilcoxon test 방법으로 GraphPad Prism 6 소프트웨어(CA, USA)를 사용, 도출하였다

암세포를 주사한 7일 뒤 마우스에서 발생한 종양의 크기는 버니어캘리퍼스(Vernier calipers)를 사용하여 관찰되었으며 부피(mm³)는 다음과 같은 식을 통하여 계산되었다.

부피 = (넓이)²(길이/2)

In vivo 조건에서 종양의 크기와 전이 정도의 측정은 LI-COR Pearl animal image analyzer (LI-COR Biosciences, USA)를 사용하여 이루어졌다.

P<0.05 값 또는 P<0.001의 값을 보유한 각 유전자간의 유의한 발현량 차이는 Tukey's b-test에 의하여 분석되었으며 각 수치는 mean ± SEM으로 표현되었다.

Ⅱ. 실험결과

1. LCN2 도입을 통한 폐암 유래 TICSCs 세포주의 특성 확인

Nucleofector™-Amaxa Lonza System을 이용하여 LCN2을 과발현하는 A549-TICSCs 세포(CD133+)를 확보하고 그 특성을 확인하였다. [도 1. A] 에서는 LCN2 유전자를 도입한 세포(LCN2-A549-TICSCs)에서 LCN2 발현을 확인하였으며 대조군으로 GFP 유전자 발현 세포를 사용하였다.

[도 1. B]에서는 LCN2를 과발현 하는 A549-TICSCs(LCN2-A549-TICSCs)의 형태가 10% 우태아혈청을 포함한 DMEM/F12 배지에서 간엽세포(mesenchymal cell)의 형태로 변한 것을 확인하였다. 또한 LCN2-A549-TICSCs를 DAPI와 CD133으로 면역염색한 결과, 대조군(A549-TICSCs)에 비하여 세포의 증식이 증가하였으며 전이성 세포 형태가 관찰되었다(화살표)[도 1.C].

LCN2-A549-TICSCs는 대조군에 비하여 TICSCs 바이오마커인 CD133의 발현이 증가하였으며[도 2.A,B], TICSCs가 타원형으로 응집하여 형성하는 종양편구(tumorsphere) 형태를 보였다[도 2.C].

상기 결과에서 나타나는 바와 같이, 폐암 유래 A549-TICSCs는 LCN2 유전자 도입에 의하여 CD133 발현이 증가하였으며, 간엽세포 형태 및 전이성 세포 형태를 나타내었다. 이러한 결과는 LCN2가 종양세포에서 상피간엽이행(epithelial-mesenchymal transition;EMT) 유도에 관여한다는 사실을 시사한다.

본 발명의 BRM270이 LCN2이 과발현된 폐암 유래 세포에 어떤 영향을 끼치는지 확인하기 위하여 LCN2+-A549-TICSCs세포에 BRM270를 처리하고 qPCR과 웨스턴 블로팅을 수행하였으며 그 결과를 [도 1.D,E]에 나타내었다. 대조군인 A549-TICSCs에 비하여 LCN2-A549-TICSCs에서 LCN2의 발현이 증가하였으나 본 발명의 BRM270을 처리하였을 때 LCN2의 발현이 다시 감소하는 결과가 나타났다. 또한 BRM270는 LCN2의 세포 도입에 의하여 증가한 CD133의 발현을 감소시키는 역할을 하였다[도 2.B].

이처럼 BRM270은 LCN2-A549-TICSCs 세포에서 CD133과 LCN2의 발현을 감소시켰다.

2. BRM270 의 종양세포 사멸 효과

폐암 유래 TICSCs 세포를 대상으로 BRM2의 처리에 의한 세포의 형태변화 및 생존율(세포독성) 등을 확인하였다.

위상차 현미경을 이용하여 세포 형태를 관찰한 결과, BRM270를 24시간, 48시간 동안 처리한 A549-TICSCs는 programmed cell death(PCD) 또는 mitotic cell death(MCD)가 일어날 때 나타나는 세포의 수축 현상을 나타내었다[도 2.D]. 또한 A549-TICSCs와 LCN2-A549-TICSCs에 BRM270을 처리하고 시간대별로 세포의 핵을 DAPI 염색한 결과, BRM270을 처리한 군에서 초기 세포사멸 세포의 특징인 염색체 응축현상(chromosomal condensation; pyknosis), 핵 단편화(nuclear fragmentation; karyorrhexis) 현상 및 세포질 수축현상이 관찰되었으며 BRM270 처리에 의한 핵 내 DNA 단편화 현상도 전기영동 실험으로 확인되었다[도 2.E].

세포 생존율 확인 실험을 통하여 관찰한 결과, BRM270은 농도 의존적으로 TICSCs 세포(A549-TICSCs 및 LCN2-A549-TICSCs)의 생존율을 감소시켰으며 80㎍/ml에서 세포 생존율은 0%에 가까웠다[도 3.A]. 양성 대조군인 DOX 마찬가지로 TICSCs 세포 생존율을 감소시켰으나 BRM270보다 적은 비율로 감소시켰으며[도 3.B], 이처럼 DOX와 같은 화합물에 어느 정도 저항을 보이는 A549-TICSCs 세포 등에 BRM270가 효과적으로 작용할 수 있는 것을 알 수 있다. LCN2는 줄기세포 바이오마커인 CD133의 과발현을 유도하는 등 폐암 유래 세포의 줄기세포능(stemness)을 증가시켰으나, BRM270와 Dox는 LCN2-A549-TICSCs 세포에서 CD133의 발현을 저해하고 세포 응축에 관여하는 Condensin(SMC2) 복합체의 형성에 영향을 끼치는 것으로 확인되었다[도 3.C,D].

FACS를 통한 세포주기분석 결과에서, BRM270은 cyclin D(CCND 1)를 조절하여 세포주기 억류(arrest)를 일으키고 G2/M 이행을 유도하였다. 이러한 결과는 A549-TICSCs 및 LCN2-A549-TICSCs에서 동일한 경향을 나타내었다. 또한 초기 세포사멸에 관여하는 것으로 알려져 있는 전세포사멸 단백질(pro-apoptotic protein)인 Casp-8(caspase-8)(Kallenberger SM et al., Sci Signal. 2014 Mar 11;7(316):ra23.)의 mRNA 발현이 BRM270 처리에 의하여 증가하였으며 cyclin D mRNA 발현의 감소가 qPCR을 수행한 결과에서 확인되었다[도 4].

Dox의 처리는 상기 실험 결과에서 BRM270를 처리한 경우와 유사한 경향을 나타내었으나, BRM270의 처리에 따른 세포 사멸 및 관련 유전자 발현 변화보다는 그 영향이 적은 것으로 확인되었다.

상기 결과에서 나타나는 바와 같이, BRM270는 A549-TICSCs와 LCN2-A549-TICSCs의 세포주기를 조절하고 세포사멸을 유도, 생존율을 감소시키는 역할을 하는 것으로 나타났다.

3. LCN2 에 의한 폐암 세포의 상피간엽이행(EMT)과 BRM270 의 효과

EMT 세포는 폐 선암종과 같은 상피세포 종양의 전이 과정에서 핵심적인 역할을 한다. 이에 따라 BRM270에 의한 A549-TICSCs 및 LCN2-A549-TICSCs 세포의 EMT 바이오마커 변화를 확인하였다.

A549-TICSCs에 LCN2 유전자를 과발현시키고(LCN2-A549-TICSCs) 세포염색을 수행한 결과, 세포와 기질 간 부착에 관여하는 E-cadherin과 조직 간의 밀착연접 기능을 하는 TJP-1(tight junction protein-1)의 발현이 감소하였다. 세포 또는 조직 간의 연결에 관여하는 해당 단백질의 발현 감소는 암세포 전이성을 지니는 EMT의 주요 특징으로 파악될 수 있다. 반면에 LCN2-A549-TICSCs에서 종양단백질인(oncoprotein)인 Twist-1의 발현과 간엽세포 마커인 Vimentin의 발현은 증가하였다[도 5.A].

또한 E-cadherin, Vimentin 및 Twist-1의 mRNA 발현 및 단백질 발현 변화를 qPCR과 웨스턴 블로팅으로 다시 확인하였으며, EMT 과정에 관여하며 세포사멸 억제(anti-apoptotic protein) 기능을 지니고 E-cadherin의 발현을 억제하는 것으로 알려진 SNAI2(Clin Cancer Res. 2005 Feb 1;11(3):1174-80;Cancer Cell. 2005 Sep;8(3):197-209)의 발현도 함께 확인하였다[도 5, B,C,D].

LCN2를 과발현시킨 A549-TICSCs 세포에서 E-cadherin의 발현은 감소하였으며 BRM270 또는 Dox를 처리하였을 때 다시 증가하는 경향을 나타냈다. Vimentin, SNAI2 및 Twist-1는 LCN2-A549-TICSCs에서 증가하였으며 BRM270 또는 Dox를 처리했을 때 다시 감소하였다. BRM270는 특히 감소된 E-cadherin 단백질 발현을 증가시키는 효과와 Vimentin의 단백질 발현을 감소시키는데 있어서 양성대조군으로 사용된 Dox보다 우수한 효과를 나타내었다[도 5, B,C,D].

상기 나타난 바와 같이, BRM270은 EMT 바이오마커의 발현을 감소시키고, 세포 부착 관련 단백질의 발현을 회복시켰다.

4. BRM270 의 in vivo 항암효과

A549-TICSCs에 LCN2를 도입하고 누드 마우스에 주입하여 종양의 발달과 전이에 끼치는 LCN2의 영향을 확인하였으며, BRM270를 처리하여 in vivo 항암 효과를 확인하였다.

누드 마우스의 우측 하단 측면에 TICSCs 세포를 피하주사 하였으며 7일이 지난 후 종양 형성을 확인하였다. 15일째 되는 날부터 BRM270(10 mg/kg/day로 주 2회) 또는 Dox를 처리하고 2주, 3주, 및 4주가 되는 날에 LI-COR Pearl animal image analyzer와 IRDye 800CW 2DG를 사용하여 종양세포의 증식 및 전이를 확인하였다.

[도 6.A,B]에 나타난 바와 같이, A549-TICSCs를 주사한 군보다 LCN2-A549-TICSCs를 주사한 군에서 2주, 3주 및 4주 모두에서 더 큰 종양이 생성되고 전이가 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 이는 LCN2가 종양 형성, 종양 증식 및 전이를 유도하는 기능을 지녔음을 시사한다. LCN2-A549-TICSCs 주사군에 BRM270 또는 Dox를 처리하였을 경우, 종양의 크기 감소 및 전이가 억제되는 것이 관찰되었으며 특히 BRM270을 처리한 4주 군에서는 종양이 거의 관찰되지 않았다. 음성대조군인, hBMS를 주사한 군에서는 종양 형성이 관찰되지 않았다.

또한 [도 6.C]와 같이 카플란-메이어(Kaplan-Meier)를 이용하여 실험동물(누드 마우스)들의 생존율을 확인한 결과, A549-TICSCs 주사군의 생존율은 30.2098%, LCN2-A549-TICSCs 주사 누드 마우스군은 11.4286%인데 반하여 LCN2-A549-TICSCs 주사군에 BRM270를 처리한 군은 40~65.625%의 생존율을 보여 양성대조군인 Dox의 57.2727%보다 우수한 효과를 나타냈다.

누드 마우스에서 적출된 종양의 무게를 측정하였으며, 버니어캘리퍼스를 사용하여 체내 종양이나 적출된 종양의 크기를 관찰하였다[도 6.D]. 그 결과는 [도 7.A]와 [도 7.B]에 나타내었다.

종양의 무게를 측정한 결과, LCN2-A549-TICSCs를 주사한 군의 종양의 중량이 가장 컸으며 BRM270을 처리하였을 경우 그 중량이 다시 감소하였다. 특히 LCN2-A549-TICSCs을 주사하고 BRM270을 처리한 4주 군에서는 A549-TICSCs를 주사한 대조군보다 낮은 중량을 나타내었다. 실험에 사용된 누드 마우스의 몸무게는 LCN2-A549-TICSCs가 가장 많이 감소하였다[도 7.D]. 종양의 크기는 시간이 경과할수록 LCN2-A549-TICSCs + BRM270 군에서 확연하게 감소하여, LCN2-A549-TICSCs으로 유도된 종양 형성이 BRM270에 의하여 억제되는 것을 알 수 있다.

[도 7.C]에서는 종양 조직의 IHC 염색과 H&E 염색(헤마톡실린&에오신 염색)을 통하여, LCN22-A549-TICSCs 주입으로 유도된 종양에서 세포의 증식이 A549-TICSCs 군보다 증가 되어있는 것을 확인하였다.

이처럼, BRM270는 폐암 유래 세포의 in vivo 종양 형성 및 전이 억제 효과를 지니는 것으로 확인되었다.

5. NF -κB와 연관된 BRM270 의 항암 기전

상기 결과에서 나타나는 바와 같이, LCN2는 암세포를 증식시키고 세포간의 결합에 영향을 끼쳐 전이를 일으키는 EMT 과정이 일어나도록 한다. 이에 따른 구체적인 분자 기전을 파악하기 위하여 단백질간의 상호작용을 bioinformatics STRING을 통하여 분석하였다[도 8.A]. TWIST1에 의하여 활성화된 EMT는 SNAI2와 연관되어 있으며, 이는 LCN2의 MMP9 결합을 촉진한다. 또한 LCN2의 과발현은 MMP9의 발현을 유도하는데, 이러한 과정에서 NF-κB가 관여할 수 있다. 종양 형성 및 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NF-κB(Cytokine Growth Factor Rev. 2010 Feb;21(1):11-9;Clin Oncol (R Coll Radiol). 2007 Mar;19(2):154-61)는 신호전달 경로 중에서 MMP9의 발현을 직접적으로 유도하는 것이 알려져 있다(Mol Carcinog. 2007 May;46(5):402-13;J Biochem Mol Biol. 2007 Jan 31;40(1):88-94; Chem Biol Interact. 2010 Mar 30;184(3):403-12;Stem Cell Res. 2012 Jul;9(1):9-23). 이에 따라 A549-TICSCs의 NF-κB의 mRNA와 단백질 발현 변화를 확인하여 [도 8.B] 내지 [도 8.D] 에 나타내었다. qPCR, 면역세포염색 및 웨스턴 블로팅을 실시한 결과, 과발현된 LCN2는 A549-TICSCs의 MMP9과 NF-κB의 발현을 증가시켰으며 BRM270와 Dox는 이러한 발현을 다시 감소시켰다. 음성 대조군으로는 hNMCs를 사용하였다.

결론적으로, LCN2의 과발현에 의해 유도된 폐암 유래 TICSCs의 EMT는 간엽세포의 마커 발현을 증가시키고 NF-κB의 활성 또는 발현을 증가시켜 종양형성 및 전이를 유도하지만, 이러한 과정에서 BRM270는 twist1과 NF-κB의 작용을 억제하여 항암 활성을 나타내는 것을 알 수 있다[도 9].

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5. 삼백초(Saururus chinensis)의 줄기, 황금 뿌리, 하고초(Prunella vulgaris) 잎, 자근 뿌리, 청피(귤 껍질) 및 쇠비름(Portulaca oleracea)의 잎과 줄기 혼합물의 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 줄기세포 억제용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 혼합물은 삼백초 줄기 21.13 중량%, 황금 뿌리 21.13 중량%, 하고초 잎 18.3 중량%, 자근 뿌리 18.3 중량%, 청피(귤 껍질) 14.09 중량%, 및 쇠비름 잎과 줄기 혼합물 7.05 중량%로 구성된 혼합물인 것을 특징으로 하는 폐암 줄기세포 억제용 조성물.
   
7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 폐암 줄기세포 억제용 조성물.
   
8. 제5항 또는 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 폐암 줄기세포 억제용 조성물.
   
9. 삼백초(Saururus chinensis)의 줄기, 황금 뿌리, 하고초(Prunella vulgaris) 잎, 자근 뿌리, 청피(귤 껍질) 및 쇠비름(Portulaca oleracea)의 잎과 줄기 혼합물의 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 줄기세포의 폐 이외의 다른 기관으로의 전이 억제용 조성물.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 혼합물은 삼백초 줄기 21.13 중량%, 황금 뿌리 21.13 중량%, 하고초 잎 18.3 중량%, 자근 뿌리 18.3 중량%, 청피(귤 껍질) 14.09 중량%, 및 쇠비름 잎과 줄기 혼합물 7.05 중량%로 구성된 혼합물인 것을 특징을 하는 폐암 줄기세포의 폐 이외의 다른 기관으로의 전이 억제용 조성물.
    
11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 폐암 줄기세포의 폐 이외의 다른 기관으로의 전이 억제용 조성물.
    
12. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 폐암 줄기세포의 폐 이외의 다른 기관으로의 전이 억제용 조성물.
    

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