KR102230883B1 - 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암용 조성물에 관한 것으로, 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 의하면 정상 세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서도, 암 세포에만 특이적으로 증식을 억제하는 항암 효과를 가지고 있으며, 암 세포 전이를 억제할 수 있다.
보다 구체적으로, 황기, 사삼, 상백피 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 생약 추출물을 활용하여 폐암의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있는 생액 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료제에 관한 것이다.

Description

생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물{Anticancer composition comprising herbal extract}
본 발명은 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 정상 세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서도, 암 세포에만 특이적으로 증식을 억제하는 항암 효과를 가지고 있으며, 암 세포 전이를 억제하는 우수한 효과를 가지고 있어, 암의 예방 또는 치료, 및 항암 치료 보조에 유용하게 이용될 수 있는 항암용 조성물에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제1위의 질병으로서 연간 약 10 만명 이상이 진단되고, 약 6 만명 이상이 사망하고 있다.
이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독 성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.
서양의학의 암치료법은 화학요법, 방사선요법, 수술요법, 면역요법등이 시행되고 있는데, 암세포뿐만 아니라 인체의 정상조직과 기관에 대한 독성이 강하여 환자에게 소화기 장애, 골수기능억제, 면역기능저하, 염증반응, 신체쇠약 등의 부작용을 유발하는 단점이 많이 나타나고 있어, 최근 한약에서 부작용이 없으면서도 항암효과를 나타내는 치료제 개발이 연구되고 있다.
한의학에서의 암치료법은 건비익기(健脾益氣), 양혈자음(養血滋陰), 양음생진(養陰生津), 보신온탕(補腎溫陽), 건비익신(健脾益腎)등의 부정법(扶正法)과 청열해독(淸熱解毒), 활혈화어(活血化瘀), 화담소어(化痰消瘀), 이기소종(理 氣消腫) 등의 거사법(祛邪法)과, 부정법(扶正法)과 거사법을 배합한 부정거사법(扶正祛邪法)으로 요약된다. 부정법중 건비익기법은 암의 임상증후나 항암제, 화학요법제를 사용했을때 자주 나타나는 식욕부진, 납소, 오심, 구토, 설사 및 복부창만 등의 소화장애와 면역기능저하에 사용될 수 있는 방법으로, 대표처방인 사군자탕(四君子湯), 육군자탕(六君子湯), 보중익기탕(補中益氣湯) 등이 실험적으로 암치료 또는 화학 및 방사선 요법 등으로 나타나는 부작용 개선에 효과가 있음과, 임상적으로도 소화기암, 간암, 폐암에 활용 가능함이 보고 되었다.
상기 한의학적 익기양음법(益氣養陰法) 및 거담법(祛痰法)을 활용하여, 부작용이 없으면서도 항암 효과를 나타낼 수 있는 치료제를 개발하여, 단독 항암제 또는 항암 보조용법으로 활용할 수 있는 치료제의 개발이 필요하다.
(특허 문헌 1) KR 10-2003-0023243(2003.03.19.)
본 발명의 목적은 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 정상 세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서도, 암 세포에만 특이적으로 증식을 억제하는 항암 효과를 가지고 있으며, 암 세포 전이를 억제할 수 있는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 황기, 사삼, 상백피 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 생약 추출물을 활용한 폐암 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항암용 조성물은 황기(Astragalus mongholicus Bunge), 사삼(Adenophoratriphylla var. japonica Hara), 상백피((Mori Cortex Radicis) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 생약 추출물 또는 이들의 분획물을 유효 성분으로 포함할 수 있다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올, 에테르, 클로로포름， 에틸아세테이트， 메틸렌클로라이드 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 것이다.
상기 분획물은 황기, 사삼, 상백피 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 생약 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 분획하는 것이다.
상기 항암용 조성물은 전립선암, 자궁암, 간암, 직장암, 폐암, 유방암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암의 예방 또는 치료 효과가 우수한 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 약학 조성물은 상기 항암용 조성물을 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 항암용 조성물을 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 기능성 식품 조성물은 상기 항암용 조성물을 포함하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항암용 조성물은 황기(Astragalus mongholicus Bunge), 사삼(Adenophoratriphylla var. japonica Hara), 상백피((Mori Cortex Radicis) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 생약 추출물 또는 이들의 분획물을 유효 성분으로 포함한다.
보다 구체적으로, 황기, 사삼 및 상백피 추출물을 각각 항암용 조성물로 이용하거나, 황기 및 상백피 추출물의 혼합물, 황기 및 사삼 추출물의 혼합물, 사삼 및 상백피 추출물의 혼합물 또는 황기, 사삼 및 상백피 추출물의 혼합물을 항암용 조성물로 이용할 수 있다.
상기 황기(Astragalus mongholicus Bunge)는 콩과(Leguminosae)에 속하는 다년생초본의 뿌리를 캐어 껍질을 벗겨 건조한 것으로 파 종 후 2년째 가을에 수확하는 것이 보통이나 때에 따라서는 당 년 또는 3년째 가을에 수확하여 사용하기도 한다. 황기의 뿌리에는 40여 종의 트리테펜 글리코사이드(사포닌), 아스트가람 I, II 등과 같은 폴리사카라이드, 캠패올, 쿼센틴과 같은 후라보노이드, 20여 종 이상의 유리 아미노산, 철, 마그네슘 등 20여 종의 미량원소들이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.
상기 사삼(Adenophoratriphylla var. japonica Hara)은 인삼(人蔘), 현삼(玄蔘), 단삼(丹蔘), 고삼(苦蔘)과 함께 오삼(五參) 중의 하나이다. 우리나라에서는 그 기원으로 도라지과(Campanulaceae)에 속하는 잔대의 뿌리를 말한다. 잔대는 우리나라, 일본, 중국 등지에 자생하는 높이 50 내지 100cm내외의 다년생 초본으로 지상부 전체에 털이 밀생하고 뿌리는 비대하며 꽃은 7 내지 9월에 자색의 종모양으로 핀다.
사삼은 북한 약전에 도라지과의 더덕(Cordonopsislanceolata)의 뿌리로 기재되어 있고 중화민국 약전에는 층층잔대 및 동속식물의 외피를 제거한 뿌리로 기재되어 있다. 식품의약품안전처 식품 원재료 베이스에 따르면 사삼은 잔대의 생약명으로 딱주, 남사삼, 지모, 무희, 양유, 대사삼, 선사삼, 포삼 또는 Japanese Lady Bell로 불린다.
특성으로는 초롱꽃과(Campanulaceae)의 여러해살이 풀로 어린순은 나물로 먹고 뿌리는 해독과 거담제로 쓰이며 한국, 일본, 중국에 분포한다. 주요성분으로는 아데노폴산메틸에스테르, 베타시토스테롤, 도코스테롤, 루페온, 트라이피롤이 알려져 있으며 약리작용으로는 거담, 강심, 면역조절 및 항진균, 항산화 작용이 보고되어 있다.
상기 상백피(Mori Cortex Radicis)는 뽕나무과(Moraceae)에 속한 낙엽교목인 뽕나무 속 식물의 근피로, 뽕나무 뿌리껍질로서 두께는 1 내지 4 mm이며 외표면은 백색 또는 담황백색으로 비교적 평탄하고 황색 또는 황갈색의 비늘무늬가 있다. 예로부터 상백피는 해열, 항경련, 항알러지, 항당뇨, 항염증 작용과 더불어 최근에는 간 보호 효과 및 탈모증에 대한 모발 성장 효과를 비롯한 미백, 항산화, 이뇨촉진, 신경성 염증반응 억제 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다(Hikino et al., 1985; Kim et al., 1999,; Kim et al., 1995).
상기 황기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 탄소수 1 내지 6의 알코올, 에테르, 클로로포름， 에틸아세테이트， 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출될 수 있다. 상기 '황기 추출물'이란 황기로부터 추출하여 수득한 추출물을 의미한다.
상기 황기 추출물은 건조한 황기를 분쇄한 분쇄물을 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 탄소수 C1 내지 C6의 알코올과 같은 극성 용매, 또는 알코올과 물의 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합 용매로 용출할 수 있으며, 보다 상세하게는 추출 용매로 에탄올을 이용할 수 있다. 이 때, 추출 온도는 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 추출한 추출물 일 수 있다.
상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72 시간 동안 방치될 수 있으며, 상세하게는 1 내지 24시간 동안 방치될 수 있다.
여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명의 항암 효과를 나타낼 수 있는 황기 추출물인 한, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.
상기 사삼 추출물 및 상백피 추출물 또한, 황기 추출물과 동일한 방식을 이용하여 사삼 추출물 및 상백피 추출물을 제조할 수 있다.
바람직하게 상기 황기 추출물은 황기 분획물을 이용할 수 있고, 상기 황기 분획물은 보다 구체적으로 황기 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 이용할 수 있다.
상기 사삼 추출물은 사삼 분획물을 이용할 수 있고, 상기 사삼 분획물은 보다 구체적으로 사삼 추출물의 헥산 분획물 또는 사삼 추출물의 에틸 아세테이트 분획물을 이용할 수 있다.
상기 상백피 추출물은 메틸렌클로라이드를 추출 용매로 이용한 상백피 메틸렌클로라이드 추출물을 이용할 수 있다.
바람직하게, 황기 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 사삼 추출물의 헥산 분획물, 사삼 추출물의 에틸 아세테이트 분획물, 상백피 메틸렌클로라이드 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 생약 추출물을 항암용 조성물로 이용할 수 있다.
상기 황기 추출물, 사삼 추출물 및 상백피 추출물을 항암용 조성물로 이용할 경우, ROS(활성산소, Reactive Oxygen Species) 유발에 의한 AKT(a protein cloned from the v-akt oncogene of retrovirus AKT8) 활성 감소 효과로 인해, 암 세포주에 효과가 있다.
또한, 기질 세포와 암 세포간 상호작용(Interaction) 저해 효과가 우수하고, M2 Macrophage 분화 억제 효과가 우수하여, 우수한 종양 미세 환경 조절 효과를 나타낼 수 있다.
뿐만 아니라, fibroblast 및 macrophage의 암 세포로의 이동을 저해하고, 암 세포의 암 악화인자 분비를 억제함으로써 암세포 및 기질세포간의 상호 작용을 감소시키고, M2 macrophage 분화를 억제함으로써 종양미세환경을 암에게 불리하게 조절할 수 있다.
상기 황기 추출물, 사삼 추출물 및 상백피 추출물은 각각 단독으로 사용 시에도, 상기와 같이 우수한 ROS 유발에 의한 AKT 활성 감소 효과, 기질 세포와 암 세포간 상호작용(Interaction) 저해 효과, M2 Macrophage 분화 억제 효과, 암세포 및 기질세포간의 상호 작용 억제 효과를 나타낼 수 있으나, 황기 추출물, 사삼 추출물 및 상백피 추출물을 혼합하여 사용할 때, 보다 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.
바람직하게, 상기 황기 추출물, 사삼 추출물 및 상백피 추출물은 1:1:1 내지 1:1:0.5의 중량 비율로 혼합하여 사용하는 것으로, 상기 중량 범위 내에서 우수한 ROS 유발에 의한 AKT 활성 감소 효과, 기질 세포와 암 세포간 상호작용(Interaction) 저해 효과, M2 Macrophage 분화 억제 효과, 암세포 및 기질세포간의 상호 작용 억제 효과를 나타낼 수 있고, 상기 범위 값 미만 이거나 초과인 경우에는 이러한 항암 효과가 발생하지 않는다.
보다 바람직하게 황기 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 사삼 추출물의 헥산 분획물 및 상백피 메틸렌클로라이드 추출물을 혼합한 생약 추출물 또는 황기 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 사삼 추출물의 에틸 아세테이트 분획물 및 상백피 메틸렌클로라이드 추출물을 혼합한 생약 추출물을 이용할 때, 각 구성 성분 간의 혼합 사용에 따른 상승 작용으로 인해 항암 효과가 상승한다.
즉, 상기 구성 성분 간의 혼합 비율에 따라, 구성 성분간의 혼합 사용에 따른 상승 작용으로 생약 추출물을 단독으로 사용하는 경우에 비해, 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다고 할 것이다.
상기 항암용 조성물은 전립선암, 자궁암, 간암, 직장암, 폐암, 유방암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암의 예방 또는 치료 효과가 우수한 것으로, 바람직하게는 폐암의 예방 또는 치료 효과가 우수한 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 약학 조성물은 상기 항암용 조성물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 폐암의 예방 및 치료용 약학 조성물은 상기 항암용 조성물을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 황기 추출물, 사삼 추출물 및 상백피 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 머루근 추출물은 상세하게는 체중 1 kg당 10 내지 1000 mg 정도를 투여할 수 있으며, 보다 상세하게는 체중 1 kg당 50 내지 500 mg 정도 투여할 수 있다.
본 발명의 황기 추출물, 사삼 추출물 및 상백피 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 건강기능식품은 상기 항암용 조성물을 포함한다.
바람직하게, 상기 건강기능식품으로 이용하기 위한 항암용 조성물은 황기 추출물, 사삼 추출물 및 상백피 추출물의 복합 혼합물에, 땅비싸리(Kirilow indigo) 추출물 및 수호초(Pachysandra terminalis) 추출물을 포함할 수 있다.
상기 황기, 사삼 및 상백피 추출물만 이용하여 항암용 조성물을 제조하는 경우, 황기, 사삼 및 상백피 특유의 쓴맛으로 인해 항암용 조성물의 기호도가 떨어지는 문제가 있다.
이에, 땅비싸리 추출물 및 수호초 추출물을 소량 첨가하여, 복합 조성물을 제조하는 경우, 항암 효과는 유지하며, 기호도는 높일 수 있다.
보다 바람직하게, 조성물은 황기 추출물, 사삼 추출물 및 상백피 추출물의 복합 혼합물 100 중량부에 대하여, 땅비싸리(Kirilow indigo) 추출물 5 내지 10 중량부 및 수호초(Pachysandra terminalis) 추출물 5 내지 10 중량부를 포함할 수 있다. 상기 추출물을 더 포함하는 경우 황기, 사삼 및 상백피의 텁텁한 맛 및 쓴 맛이 중화되고 다른 추출물과 혼합에 의하여 향미가 향상되어 보다 기호성 높은 식품 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출 혼합물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 의하면 정상 세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서도, 암 세포에만 특이적으로 증식을 억제하는 항암 효과를 가지고 있으며, 암 세포 전이를 억제할 수 있다.
보다 구체적으로, 황기, 사삼, 상백피 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 생약 추출물을 활용하여 폐암의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있는 생액 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료제에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 ROS에 대한 유세포 분석(Flow cytometry) 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 MTT 분석 및 색소배제 능력 분석(Trypan blue exclusion assay) 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 sub-G1 phase 및 nnexin V-positive cell population에 대한 유세포 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 p-AKT 발현 정도에 대한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 세포 생존율 측정 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 인체 폐암 세포주에서의 항암 효과 측정 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 H1299 세포의 세포 증식 억제 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 H1299 세포의 세포 생존율 및 colony 형성에 대한 MTT 분석, 색소배제 능력 분석 및 soft agar 분석 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 p-EGFR, p-STAT3, p-SRC의 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 p-EGFR, p-STAT3, p-SRC의 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 fibroblast와 암세포 간의 상호 작용에 대한 Transwell 분석 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 fibroblast와 암세포 간의 상호 작용을 억제하는 것에 대한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 M2 macrophage 분화에 영향을 미치는 요소에 대한 분석 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 혈관내피세포 및 암세포 간 상호 작용에 대한 Transwell 분석 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 cell adhesion 분석 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 Transwell 분석 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따라 암세포가 분비하는 다양한 요인(factor)에 영향을 미치는지 여부에 대한 확인 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 HP-1 macrophage의 recruitment를 억제하는지 여부에 대한 Transwell 분석 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 HP-1 macrophage의 recruitment를 억제하는지 여부에 대한 Transwell 분석 결과이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 WI38 fibroblast의 recruitment를 억제하는지 여부에 대한 Transwell 분석 결과이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 WI38 fibroblast의 recruitment를 억제하는지 여부에 대한 Transwell 분석 결과이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 PMA로 유도된 H1299의 p-p65, p-STAT3, p-SRC, p-AKT 및 p-ERK 발현 정도에 대한 확인 결과이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)의 Mrna의 발현 정도에 대한 확인 결과이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 cytokine array 분석 결과이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 WI38 fibroblast와 Raw264.7 macrophage에서의 기질세포의 폐암 세포로의 이동을 확인하기 위한 Transwell 분석 결과이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 arginase-1, MRC-1 및 IL-10의 mRNA 발현 정도에 대한 분석 결과이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 Lewis lung carcinoma(LLC) cell의 migration에 미치는 영향을 확인하기 위한 Transwell 분석 결과이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 생약 추출물의 처리에 따른 cell adhesion 분석 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예 1: 천연 추출물의 제조]
본 실험에 사용된 황기, 사삼 및 상백피는 주식회사 누리허브에서 구입한 것으로 화순한약재유통에서 대한민국약전을 기준으로 표준품 확인 및 순도 시험을 거친 것이다. 황기 에탄올 추출물(ethanol extract of Astragali membranaceus, EAM) 및 사삼 에탄올 추출물 (ethanol extract of Adenophora triphilla var. japonica, EAT)을 얻기 위해 황기와 사삼의 건조된 분말 100 g에 80% 에탄올을 각각 1.5 L씩 첨가한 후 초음파분쇄기에 30분씩 5회 추출하여 필터를 통해 상층액만 분리하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻어진 상층액을 감압농축 및 동결건조하여 얻은 분말을 dimethylsulfoxide (DMSO)에 200 ㎎/㎖ 농도로 용해시켜 사용하였다.
상백피 메틸렌클로라이드 추출물(methylenechloride extract of Mori Cortex Radicis, MEMC)을 얻기 위해, 추출 용매로 메틸렌클로라이드를 이용한 것을 제외하고, 상기 EAM 및 EAT의 제조 방법과 동일한 제조 방법을 이용하여 MEMC를 제조하였다.
상기 EAM, EAT 및 MEMC는 물 10 L에 현탁시키고， 용매로 부탄올, 헥산 및 에틸 아세테이트를 각각 10L씩 3회 순차적으로 추출하여, 부탄올 분획물(BEAM, BEAT 및 BMEMC), 헥산 분획물(HEAM, HEAT 및 HMEMC) 및 에틸아세테이트 분획물(EEAM, EEAT 및 EMEMC)을 제조하였다.
세포 배양에 사용된 RPMI 1640, fatal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (PS), phosphate-buffered saline (PBS), Trypsin-EDTA는 WelGENE (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 단백질 분석을 위한 모든 1차 및 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, 별도 표기하지 않은 모든 시약은 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
[실험예 1: 폐암세포주에 대한 항암 효과 실험]
1. 실험 방법
세포 배양
본 연구에 사용된 H1299 인체 폐암세포주는 서울대학교 약학대학 이호영교수님으로부터 제공받았다. 세포의 배양을 위해 90%의 RPMI 1640에 10% FBS와 1% PS를 첨가하여 사용하였으며, 세포는 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
MTT assay
H1299 세포를 2.5×103 cells/well 농도로 96 well plate에 seeding한 후 EAM, EAT 및 MEMC를 각각 제시된 농도로 처리하였다. 72h 배양 후 tetrazolium bromide salt (MTT)를 0.5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 분주하고 2 h 동안 배양하였다. 그 후 상층액을 모두 제거하고 DMSO 100 ㎕를 넣어 각 well의 formazin을 녹인 후 multiplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에서 540 nm로 흡광도를 측정하였다.
Trypan blue exclusion assay
H1299 세포를 3×104 cells/well 농도로 12 well plate에 seeding한 후 EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖) 및 MEMC (500 ㎍/㎖)를 각각 제시된 시간동안 처리하였다. 그 후 세포를 모아 0.1% trypan blue 용액으로 suspension한 후 세포 숫자를 counting하였다. 푸른색으로 염색된 세포는 죽은 세포로 판단하여 counting에서 제외하였고, 염색되지 않은 세포만 live cell로 판단하여 counting 하였다.
Soft agar assay
4% low-melting agarose (Lonza, Rockland, ME)를 미리 PBS에 녹여 준비한 후, 따뜻한 배지를 첨가하여 1% bottom agar를 만들고, 1 ㎖씩 24 well plate에 분주하여 상온에서 굳혔다. 그 후 H1299 세포를 5×102 cells/0.5 ㎖ 농도로 0.4% top agar에 suspension하여 각 well당 0.5 ㎖씩 분주한 후 상온에서 굳혔다. Agar가 다 굳은 후 배지 500 ㎕에 EAM과 EAT를 각각 처리하여 top agar 위에 분주하였다. 상층액은 3일에 한번씩 교체하였으며, seeding 후 2주간 배양하였다. 그 후 상층액에 MTT solution을 0.5 ㎎/㎖로 처리하여 2 h incubation 시킨 후 염색된 colony를 디지털카메라(EOS750D, Canon, Japan)로 촬영하였다. Colony 숫자는 Image J software를 통해 counting 하였다.
DAPI staining
EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖) 및 MEMC (500 ㎍/㎖)를 72 h 처리한 H1299 세포들을 모아서 3.7% paraformaldehyde로 상온에서 30분 동안 고정하였다. 그 후 cold PBS로 2회 wash 후 cytospin으로 세포를 slide glass 위에 부착시키고, PBS와 DW에 번갈아 세척하여 건조시켰다. 건조된 세포를 2.5 ㎎/㎖로 희석된 DAPI solution으로 약 30분간 암실에서 염색시키고, PBS와 DW에 번갈아 세척 및 건조시킨 후 mounting하여 형광현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 400배의 배율로 핵의 형태를 관찰하였다.
Flow cytometry를 통한 cell cycle 분석
EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖) 및 MEMC (500 ㎍/㎖)를 72h 처리한 H1299 세포들을 모아 80% 에탄올로 4℃에서 1h 고정한 후 원심분리시켜 500㎕의 propidium iodide solution (450㎕ PBS, 50 ㎕ 0.5 ㎎/㎖ propidium iodide, 1.5㎕ 10㎎/㎖ RNase A)에 suspension하여 30분간 핵을 염색하였다. 그 후 원심분리시켜 상층액을 제거한 후 500 ㎕ PBS에 suspenstion하여 DNA flow cytometer (BD FACSCalibur)와 CellQuest software를 사용하여 cell cycle을 histogram으로 분석하였다.
Annexin V/PI double staining assay
EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖) 및 MEMC (500 ㎍/㎖)를 72h 처리한 H1299 세포들을 모아 Annexin VFITC apoptosis detection kit(PharMingen, San Diego, California)의 사용설명서에 따라 염색하였다. 15분간 암실에서 세포를 염색한 후 DNA flow cytometer와 CellQuest software를 사용하여 Annexin Vpositive apoptotic cell을 분석하였다.
Western blotting
EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖) MEMC (500 ㎍/㎖)를 72 h 처리한 H1299 세포들을 모아 lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% Triton X-100, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM EDTA, 10% Glycerol, a complete protease inhibitor cocktail tablet (Roche diagnostics, Mannheim, Germany), phosphatase inhibitors (1 Mm Na3VO4, 100 mM NaF, and 10 mM NaPP)) 에 1 h lysis시킨 후 Bio-rad 단백질 정량 시약과 그 사용방법에 따라 정량하였다. 그 후 20 ㎍의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동시키고, electroblotting을 통해 2 h 동안 PVDF membrane (Millipore Corporation, Bedford, MA)에 옮긴 후 3% bovine serum albumin (BSA, MP Biomedicals Europe, Illkirch, France)로 1 h blocking하고 1차 항체를 붙여 4℃에서 overnight incubation하였다. 그 후 TBST로 세척하고 상온에서 1h 동안 2차 항체를 붙인 후 다시 세척하고 Enhanced Chemilunimoecence (ECL) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Height, IL, USA)을 뿌려 암실에서 X-ray film (Agfa-Gevaert, Melbourne, Australia)에 감광시켰다.
활성산소종 생성 측정
6 well plate에 H1299 세포를 5×104개 seeding한 후 overnight으로 안정화시키고 EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖) 및 MEMC (500 ㎍/㎖)를 시간별로 처리한 후 배양액에 5-(and 6)-carboxy-2’7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)를 10 μM 처리하여 20분간 37℃, 5% CO2 조건에서 배양시켰다. 염색된 세포들을 모아 PBS (pH 6.9) 500 ㎕에 부유하여 DNA flow cytometer (BD FACSCalibur)와 CellQuest software를 사용하여 상대적인 활성산소종 생성 변화를 관찰하였다.
Cell cycle 분석
60Φ dish에 H1299 세포를 1×105개 seeding한 후 overnight으로 안정화시키고 EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖), MEMC (500 ㎍/㎖), NAC(Co-treatment of N-acetyl-L-cysteine, 5mM)을 처리하였다. 72 시간 후 세포들을 모아 80% 에탄올로 4 ℃에서 1 h 고정하였다. 원심분리한 세포를 500 ㎕의 propidium iodide solution (450 ㎕ PBS, 50 ㎕ 0.5 ㎎/㎖ propidium iodide, 1.5 ㎕ 10 ㎎/㎖ RNase A)에 부유하여 30분간 핵을 염색하였다. 그 후 원심분리시켜 상층액을 제거한 후 500㎕ PBS (pH 6.9)에 부유하여 DNA flow cytometer와 CellQuest software를 사용하여 cell cycle을 histogram으로 분석하였다.
Annexin V/PI double staining assay
6 well plate에 H1299 세포를 5×104개 seeding한 후 overnight으로 안정화시키고 EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖), MEMC (500 ㎍/㎖), NAC (5 mM)을 처리하였다. 72 시간 후 H1299 세포들을 모아 Annexin V-FITC apoptosis detection kit (PharMingen, San Diego, California)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 염색하였다. 15분간 암실에서 세포를 염색한 후 DNA flow cytometer와 CellQuest software를 사용하여 형광을 분석하였다. Annexin V-positive cell을 apoptotic cell로 해석하여 수치를 분석하였다.
통계적 분석
모든 실험 결과는 mean±SD으로 표시하였으며, 통계적 유의성 검증은 Student’s t-test를 이용하여 P<0.05인 것을 유의성 있다고 판단하였다.
2. 실험 결과
EAM-EAT 병용처리가 활성산소종 생성에 미치는 영향
EAM과 EAT의 항암시너지 효과가 활성산소종 발생과 관련있는지 알아보기 위해 항암시너지 효과가 나타나는 농도인 500 ㎍/㎖에서 EAM과 EAT를 단독 혹은 병용처리한 후 활성산소종 생성량을 flow cytometry로 조사하였다.
그 결과 EAM과 EAT 단독처리에 비해 병용처리 시 활성산소종 생성이 급격히 증가하였으며, 시간의존적으로 활성산소종이 증가하여 EAM과 EAT 병용처리 2h 후보다 6 h 후에 더욱 증가하는 경향을 보였다(도 1A). EAM 및 EAT 단독처리에 비해 병합처리시 apoptosis가 현저히 증가하는 결과와 연관되어 EAM과 EAT의 항암시너지 작용이 활성산소종 발생과 관련있을 가능성을 보여주었다.
또한 EAM과 EAT를 시간별로 병용처리했을 때 활성산소종은 6h 후부터 48h 후까지 지속적으로 발생되어 활성산소종에 의한 signaling pathway가 장시간동안 활성화되었을 것임을 예측할 수 있었다(도 1B).
활성산소종이 EAM-EAT 병용처리에 의한 세포생존율 저하에 미치는 영향
EAM-EAT 병용처리에 의한 세포생존율 저하에 활성산소종이 미치는 영향을 조사하기 위해 EAM-EAT와 함께 항산화제인 NAC을 처리하였다. 먼저 현미경으로 cell density를 관찰한 결과 EAM-EAT 병용처리에 의해 현저히 감소했던 세포밀집도가 NAC 처리에 의해 다시 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2A).
또한 MTT assay와 trypan blue exclusion assay로 세포생존율을 측정한 결과 EAM-EAT 병용처리에 의해 급격히 감소한 세포생존율이 NAC으로 활성산소종 생성을 억제하자 상당 부분 다시 회복되는 것을 관찰하였다(도 2B 및 도 2C). 이러한 결과는 활성산소종이 EAM-EAT 병용처리에 의한 세포생존율 감소에 핵심적인 역할을 담당함을 의미한다.
활성산소종이 EAM-EAT 병용처리에 의한 apoptosis 유발에 미치는 영향
다음으로 활성산소종이 EAM-EAT 병용처리에 의한 apoptosis 유발에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 annexin V/PI double staining 후 flow cytometry로 annexin V-positive cell을 분석하였다. Apoptosis 초기에는 세포막 내부에 위치하는 phosphatidylserine (PS)이 세포막 외부로 이동하여 annexin V와 결합하므로 annexin V+/PI- 상태의 세포가 증가하고, apoptosis 후기에는 세포막에 pore가 형성되면서 PI에 의해 핵이 염색되므로 annexin V+/PI+ 상태의 세포가 증가한다. 따라서 apoptosis가 일어난 세포는 stage에 상관없이 공통적으로 annexin V가 양성으로 나타난다. 이를 바탕으로 데이터를 해석한 결과 EAM-EAT 병용 처리에 의해 현저히 증가한 apoptotic cell population이 NAC 처리에 의해 control 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 3A). Cell cycle 분석결과 역시 같은 패턴을 보여 apoptotic cell을 의미하는 sub-G1 phase cell population이 EAM-EAT 병용처리에 의해 증가했다가 NAC 처리에 의해 감소하는 경향을 보였다 (도 3B). 이러한 결과는 EAM-EAT 병용처리에 의한 apoptosis 유발이 활성산소종 생성에 의한 것임을 보여준다.
EAM-EAT 병용처리에 의한 활성산소종 생성이 AKT signaling pathway에 미치는 영향
AKT는 암세포의 apoptosis를 억제하여 세포생존에 기여하는 신호분자로서 다양한 암종에서 과활성화되어 있다. 따라서 AKT의 ATP-binding site나 regulatory domain을 조절함으로써 kinase 활성을 억제할 수 있는 약물들이 개발되고 있다. EAM-EAT 병용처리에 의한 항암 시너지작용이 AKT signaling pathway 조절과 관련되어 있는지 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 시행한 결과 EAM과 EAT 단독처리 시보다 병용처리 시 AKT의 인산화가 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 4A). EAM-EAT 병용처리에 의해 감소한 AKT의 인산화는 NAC으로 활성산소종 생성을 차단하자 다시 증가하였다(도 4B). 이를 통해 EAM-EAT 병용처리에 의한 AKT의 활성 감소가 활성산소종 발생에 의한 것임을 알 수 있었다.
EAM-EAT 병용처리에 의한 AKT 인산화 억제가 항암 시너지 작용에 미치는 영향
AKT 인산화 억제만으로도 H1299 세포주에 세포증식억제와 apoptosis가 유발되는지 확인하기 위하여 LY294002를 농도별로 처리한 후 cell cycle 분석을 시행하였다. 그 결과 농도의존적으로 H1299 세포주의 sub-G1 phase cell population이 증가하는 것을 확인함으로써 AKT 인산화 억제가 apoptosis를 유발하여 세포증식을 억제함을 알 수 있었다(도 5A).
다음으로 EAM-EAT 병용처리에 의해 억제된 AKT의 인산화가 항암 시너지 작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 AKT 저해제인 LY294002를 처리한 후 MTT assay로 세포생존율을 측정하였다. 그 결과 항암 시너지 작용이 유의하게 나타나지 않았던 농도인 EAM과 EAT 각 100 ㎍/㎖과 250㎍/㎖ 처리군에서 LY294002를 함께 처리하자 세포생존율이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5B). 이러한 세포증식억제가 apoptosis 유발에 의한 것인지 확인하기 위하여 cell cycle 분석을 시행한 결과 LY294002와 EAM-EAT의 병용처리에 의해 sub-G1 phase cell population이 대폭 증가하였으며(도 5C), 이와 함께 apoptosis marker 단백질인 cleaved-PARP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 5D).
이러한 결과는 LY294002 단독처리에 의해서는 약하게 감소하였던 p-AKT의 발현이 LY294002와 EAM-EAT의 병용처리에 의해 현저히 감소하는 결과와 함께 AKT의 인산화 수준이 H1299 세포주의 apoptosis 유발과 밀접하게 연관되어 있음을 보여주었다(도 5E). 따라서 EAM-EAT 병용처리가 apoptosis 유발을 통해 항암 시너지 작용을 나타내는 데 AKT의 인산화 억제가 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
다음으로 EAM-EAT 병용처리에 의한 AKT의 인산화 억제가 활성산소종 생성 및 세포사멸과 관련 있는지 다시 한 번 확인하기 위해 NAC과 LY294002를 함께 처리한 후 MTT assay를 시행하였다. 그 결과 EAM-EAT 병용처리에 의해 현저히 감소한 세포생존율이 NAC 처리에 의해 회복되고, 이는 다시 LY294002 처리에 의해 EAM-EAT 병용처리군 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5B). 활성산소종 생성 억제에 의해 상승한 세포생존율이 AKT 활성 저해에 의해 다시 감소하는 것은 결국 활성산소종 생성에 의한 EAM과 EAT의 항암 시너지 작용이 AKT의 활성 억제에 의해 매개됨을 의미하는 것이다.
황기 및 사삼 유효 성분의 암세포 사멸 효과 및 기전 분석
황기 및 사삼의 추출분획물 중 각각 에틸아세테이트층과 헥산층이 가장 현저한 항암효과를 보였으므로 이들 분획에서 추출된 것으로 알려져 있는 유효성분 중 타 암종에서 항암작용이 밝혀진 AGIV와 formononetin(FMN)(이상 황기 유효성분) 및 lupeol(사삼 유효성분)을 후보물질로 상정하여 폐암세포주에서의 세포사멸효과와 그 기전을 분석하였다.
H1299 세포에 AGIV, FMN, lupeol을 처리한 결과 lupeol에서 가장 현저한 세포증식억제효과를 나타내었다(도 7).
Lupeol은 농도의존적으로 H1299 세포의 세포생존율과 colony 형성을 감소시킴을 MTT assay, trypan blue exclusion assay, soft agar assay로 확인하였다.
이러한 증식억제효과는 apoptosis 유도에 의한 것임을 DAPI 염색을 통한 염색질 응축과 apoptotic body formation 및 flow cytometry를 통한 sub-G1 phase cell population 증가를 통해 확인하였다(도 8).
Lupeol은 농도의존적으로 p-EGFR, p-STAT3, p-SRC의 발현을 감소시켰다. 이 중 가장 현저히 감소한 STAT3를 STAT3 Y705D transfection을 통해 과활성화시킨 후 lupeol에 대한 감수성을 확인한 결과 control vector와 유의한 차이가 나타나지 않았다(도 9 및 도 10).
종양 미세 환경 조절
EAM과 EAT를 각각 헥산층(HEAM, HEAT)과 에틸 아세테이트층(EEAM, EEAT) 및 부탄올층(BEAM, BEAT)으로 분획하여 총 6종류의 분획물을 기질세포인 WI38 fibroblast와 Raw264.7 macrophage에 처리하여 독성이 없는 조건(세포생존율 90% 이상)을 잡은 후 실험을 진행하였다.
추출분획물이 fibroblast와 암세포 간 interaction에 영향을 미치는지 transwell assay를 통해 조사한 결과 HEAT 100 μg/ml 처리군에서 WI38 fibroblast와 H1299 세포간 interaction이 가장 현저히 억제되었다(도 11).
HEAT이 암세포가 분비하는 다양한 factor에 영향을 미치는지 확인하기 위해 PMA로 stimulation 시킨 H1299 세포에 HEAT을 처리한 후 conditioned media(CM)를 받아 transwell의 down chamber에 넣고 WI38을 upper well에 로딩하여 migration ability를 확인한 결과 PMA 처리시 증가한 migration이 HEAT 처리에 의해 control 수준으로 감소하였다.
이는 fibroblast와 암세포 간 interaction을 돕는 factor가 암세포로부터 분비되는 것을 HEAT이 억제함을 의미한다고 할 것이다(도 12).
황기와 사삼 추출분획물이 M2 macrophage 분화에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 M2 macrophage의 핵심 marker인 IL-10의 mRNA 발현을 조사한 결과 EEAT와 BEAT 처리군에서 가장 현저하게 억제되었다.
이에 EEAT와 BEAT를 농도별로 처리한 후 추가로 arginase-1, MRC-1 및 IL-10의 mRNA 발현을 조사한 결과 공통적으로 EEAT 처리군에서만 발현이 감소하였다. IL-4 signaling pathway를 매개하여 이들의 발현을 조절하는 p-STAT6 역시 EEAT 처리군에서 농도의존적으로 감소하였으며, BEAT 처리군에서는 유의한 감소가 나타나지 않았다(도 13).
추출분획물이 혈관내피세포와 암세포 간 interaction에 영향을 미치는지 transwell assay를 통해 조사한 결과 WI38 fibroblast와 마찬가지로 HEAT 처리군에서 HUVEC 인체혈관내피세포와 H1299 세포간 interaction이 가장 현저히 억제되었다(도 14).
황기 추출분획물보다 사삼 추출분획물이 더욱 현저한 tube formation 억제효과를 보였으며 이 중 HEAT과 EEAT가 가장 탁월한 억제능을 보였다.
종합적으로 분석한 결과, 기질세포와 폐암세포간 interaction 저해 효과는 HEAT가 현저하고, M2 macrophage 분화 억제 효과는 EEAT가 가장 탁월하다고 할 것이다.
상백피 추출물의 종양 미세 환경 조절
상백피 메틸렌클로라이드 추출물(MEMC)을 기질세포인 WI38 fibroblast와 Raw264.7 macrophage 및 macrophage로 분화시킨 THP-1 세포(THP-1 macrophage)에 처리하여 독성이 없는 조건(세포생존율 90% 이상)을 잡은 후 실험을 진행하였다.
Transwell assay를 통해 MEMC가 농도의존적으로 Raw264.7과 H1299 사이의 interaction을 억제함을 확인하였다. 또한 MEMC 처리에 의해 p-EGFR과 p-p38의 발현이 현저히 감소되는 것을 관찰하였다(도 16).
MEMC가 암세포가 분비하는 다양한 factor에 영향을 미치는지 확인하기 위해 PMA로 stimulation 시킨 H1299 세포에 MEMC를 처리한 후 conditioned media(CM)를 받아 transwell의 down chamber에 넣고 WI38을 upper well에 로딩하여 migration ability를 확인한 결과 PMA 처리시 증가한 migration이 MEMC 처리에 의해 농도의존적으로 감소하였다(도 17).
MEMC가 THP-1 macrophage와 H1299 세포간 interaction을 억제하고, H1299에서 분비되는 factor를 조절하여 THP-1 macrophage의 recruitment를 억제함을 transwell assay로 확인하였다. 또한 MEMC는 THP-1 macrophage의 p-SRC, p-JNK 발현을 감소시켰다(도 18 및 도 19).
MEMC가 WI38 fibroblast와 H1299 세포간 interaction을 억제하고, H1299에서 분비되는 factor를 조절하여 WI38 fibroblast의 recruitment를 억제함을 transwell assay로 확인하였다. 또한 MEMC는 WI38의 p-EGFR, p-STAT3, p-SRC, p-FAK, p-AKT 및 p-JNK의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(도 20 및 도 21).
PMA로 유도된 H1299의 p-p65, p-STAT3, p-SRC, p-AKT 및 p-ERK 발현증가가 MEMC 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다(도 22).
NF-kB에 의해 발현이 증가하며 암을 악화시키는 인자로 알려져 있는 plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)의 mRNA가 PMA에 의해 증가했다가 MEMC 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 또한 MEMC 처리에 의해 억제되었던 H1299 폐암세포주와 WI38 및 THP-1 macrophage 간 interaction이 recombinant PAI-1 처리에 의해 다시 증가하는 것을 관찰하였다. 이를 통해 MEMC가 H1299의 PAI-1 분비를 저해하여 기질세포의 recruitment를 억제함을 의미한다 할 것이다(도 23).
H1299 세포에 PMA를 단독 처리하거나 MEMC와 동시 처리한 후 얻은 CM으로 cytokine array 결과 MEMC 처리에 의해 CXCL12 분비가 줄어드는 것을 확인하였다(도 24).
종합적으로 MEMC는 fibroblast 및 macrophage의 폐암세포로의 이동을 저해하고, 폐암세포의 암 악화인자 분비를 억제함으로써 폐암세포와 기질세포간의 interaction을 감소시키고, M2 macrophage 분화를 억제함으로써 종양미세환경을 암에게 불리하게 조절하는 것을 확인하였다.
황기 및 사삼 유효 성분의 종양미세환경 조절
FMN, Lupeol 및 AGIV의 종양미세환경 조절효과를 WI38, Raw264.7, THP-1 macrophage를 이용하여 조사함. 모두 세포생존율 90% 이상 조건에서 실험을 진행하였다.
Transwell assay를 통해 기질세포의 폐암세포로의 이동을 확인한 결과 WI38 fibroblast와 Raw264.7 macrophage에서는 FMN, Lupeol, AGIV가 모두 유의한 감소를 일으켰으며, THP-1 macrophage에서는 FMN만이 이동을 억제하였다(도 25).
황기와 사삼 유효성분이 M2 macrophage 분화에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 M2 macrophage의 핵심 marker인 arginase-1, MRC-1 및 IL-10의 mRNA 발현을 조사한 결과 Lupeol과 AGIV 처리군에서 공통적으로 농도의존적으로 발현이 감소하였다. IL-10을 통해 M2 macrophage 분화를 조절하는 p-STAT3 역시 Lupeol과 AGIV 처리군에서 농도의존적으로 감소하였으나, p-STAT6 발현은 상대적으로 미미하게 감소하였다(도 26).
Lupeol과 AGIV의 M2 macrophage 분화 억제가 mouse 폐암세포주인 Lewis lung carcinoma(LLC) cell의 migration에 미치는 영향을 transwell assay로 확인한 결과 두 약물 모두 IL-4 처리에 의해 증가한 LLC cell의 migration을 농도의존적으로 유의하게 억제하였다. 또한 Lupeol과 AGIV 모두 Raw264.7 세포에 독성을 나타내지 않는 농도에서 LLC 세포에 독성을 보여 암세포 특이적인 독성을 가지는 것을 확인하였다(도 27).
FMN, Lupeol, AGIV 모두 HUVEC과 암세포 간 interaction이나 tube formation에는 영향을 미치지 않았다(도 28).
종합하면 FMN이 폐암세포와 fibroblast 및 macrophage 간 interaction을 공통적으로 억제하였으며, Lupeol과 AGIV는 M2 macrophage 분화를 억제하였다.
EAM-EAT-MEMC 병용처리에 의한 항암 시너지 작용에 미치는 영향
EAM, EAT 및 MEMC의 병용 처리에 의한 항암 시너지 작용을 확인하기 위하여, EAM, EAT 및 MEMC를 1:1:0.1, 1:1:0.5, 1:1:1, 1:1:1.5의 중량비율로 혼합한 복합 추출물을 처리한 후, 활성산소종 생성량을 flow cytometry로 조사하였다.
상대적인 비교를 위하여, EAM 및 EAT를 1:1로 병용 처리하고 6h이 경과한 이후, 활성 산소종의 증가량을 지수 5로 놓고, 상기 복합 추출물의 활성 산소종 증가량을 지수로 평가하였다. 지수는 1 부터 10까지로 평가하며, 높을수록 우수한 효과를 나타냄을 의미한다.
DD1 DD2 DD3 DD4 DD5
활성 산소종 5 3 6 7 4
(DD1은 EAM 및 EAT 1:1, DD2는 EAM, EAT 및 MEMC를 1:1:0.1로, DD3은 EAM, EAT 및 MEMC를 1:1:0.5로, DD4는 EAM, EAT 및 MEMC를 1:1:1로, DD5는 EAM, EAT 및 MEMC를 1:1:1.5로 처리한 것이다)상기 표 1에 따르면, EAM 및 EAT를 병용 처리한 경우에 비해, EAM, EAT 및 MEMC를 처리한 경우에, apoptosis가 현저히 증가하는 결과함을 확인하였다.
EEAM-HEAT-MEMC 병용처리에 의한 항암 시너지 작용에 미치는 영향
EEAM, HEAT 및 MEMC의 병용 처리에 의한 항암 시너지 작용을 확인하기 위하여, EEAM, HEAT 및 MEMC를 1:1:0.1, 1:1:0.5, 1:1:1, 1:1:1.5의 중량비율로 혼합한 복합 추출물을 처리한 후, 활성산소종 생성량을 flow cytometry로 조사하였다.
상대적인 비교를 위하여, EAM 및 EAT를 1:1로 병용 처리한 경우(DD1)를 지수 5로 놓고, 상기 복합 추출물의 활성 산소종 증가량을 지수로 평가하였다. 지수는 1 부터 10까지로 평가하며, 높을수록 우수한 효과를 나타냄을 의미한다.
DD1 DD4 DDT1 DDT2 DDT3 DDT4
활성 산소종 5 7 5 7 9 4
(DD1은 EAM 및 EAT 1:1, DD4는 EAM, EAT 및 MEMC를 1:1:1로, DDT1는 EEAM, HEAT 및 MEMC를 1:1:0.1로, DDT2는 EEAM, HEAT 및 MEMC를 1:1:0.5로, DDT3은 EEAM, HEAT 및 MEMC를 1:1:1로, DDT4는 EEAM, HEAT 및 MEMC를 1:1:1.5로 처리한 것이다)상기 표 2에 따르면, EAM, EAT 및 MEMC를 병용 처리한 경우에 비해, EEAM, HEAT 및 MEMC를 처리한 경우에, apoptosis가 현저히 증가하는 결과함을 확인하였다.
복합 추출분획물이 fibroblast와 암세포 간 interaction에 영향을 미치는지 transwell assay를 통해 조사하였다. 가장 현저한 억제 효과를 나타낸 HEAT 처리군을 지수 5로 놓고, EEAM, HEAT 및 MEMC를 1:1:0.1, 1:1:0.5, 1:1:1, 1:1:1.5의 중량비율로 혼합한 복합 추출물을 처리한 처리군에 대한 transwell assay 결과를 지수로 평가하였다.
HEAT DDT1 DDT2 DDT3 DDT4
transwell assay 5 4 8 9 4
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, HEAT 처리군에 비해, DDT1 처리군은 억제 효과가 미비하였으나, DDT2 및 DDT3 처리군에서는 현저한 헉제 효과를 나타냄을 확인하였다. EAM-EAT-MEMC를 포함하는 복합 조성물의 제조
상기 황기 에탄올 추출물 및 사삼 에탄올 추출물의 제조 방법과 동일한 방법을 이용하여, 땅비싸리 에탄올 추출물(KAM) 및 수호초 에탄올 추출물(PAM)을 제조하고, 하기와 표 4와 같은 중량 범위에서 항암용 조성물을 제조하였다.
DDM1 DDM2 DDM3 DDM4
EAM-EAT-MEMC 100 100 100 100
KAM 1 5 10 15
PAM 1 5 10 15
(단위 중량부)관능성 실험
상기 DDM1 내지 DDM4의 복합 조성물을 차로 제조한 이후, 성인남여 15명을 대상으로 기호도 평가를 진행하였다.
관능성 평가는 향과 맛을 기초로 기호성에 따라 1 내지 10의 지수로 평가하여 평균지수로 구분하였고 그 결과를 표 5에 나타내었다.
한편, 하기의 지수는 그 숫자가 높을수록 기호성이 높은 것이다.
DDT3 DDM1 DDM2 DDM3 DDM4
향 3 5 8 9 5
맛 1 4 7 9 4
기호성 2 4 8 9 5
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, DDT3의 경우, 땅비싸리 추출물 및 수호초 추출물이 포함되지 않아, 향, 맛 및 기호도가 낮은 것을 확인하였다.
상기 표 5의 결과에 비추어 살펴보면, DDM 2 및 3과 같이 본 발명의 범위 내에서 땅비싸리 추출물 및 수호초 추출물을 사용하는 경우, 잡향, 텁텁한 맛 및 쓴 맛이 중화되어, 각 추출물의 상호 조합에 따라 차 음료의 향미와 맛이 크게 증진된다는 사실을 확인하였다.
결과적으로, 황기, 사삼 및 상백피 추출물만을 건강기능 식품으로 이용하고자 하는 경우에는 항암 효과에 비해 기호도가 떨어지는 문제가 있었으나, 복합 조성물로 제조 시, 항암 효과는 유지하며, 전체적으로 향미와 맛이 우수하게 조합되어 보다 기호성이 높은 기능성 식품 또는 기능성 차로 널리 보급될 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (7)

  1. 황기(Astragalus mongholicus Bunge) 에틸아세테이트 분획물, 사삼(Adenophoratriphylla var japonica Hara) 헥산 분획물 및 상백피(Mori Cortex Radicis) 메틸렌클로라이드 추출물을 유효 성분으로 포함하고,
    상기 황기 에틸아세테이트 분획물, 사삼 헥산 분획물 및 상백피 메틸렌클로라이드 추출물은 1:1:0.5 내지 1:1:1의 중량 비율로 포함하는
    항암용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항암용 조성물은 전립선암, 자궁암, 간암, 직장암, 폐암, 유방암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암의 예방 또는 치료 효과가 우수한
    항암용 조성물.
  5. 제1항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 항암용 조성물을 포함하는
    약학 조성물.
  6. 제1항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 항암용 조성물을 포함하는
    폐암의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  7. 삭제
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