KR20180131770A - 황련 추출물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

황련 추출물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황련 추출물 (또는 부탄올 분획물) 을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 황련 추출물을 대상으로 (1)근원세포의 분화촉진 효능을 평가하는 방법으로 웨스턴 블롯팅을 이용해, 황련의 부탄올 분획물에 의해 분화된 C2C12 세포에서의 MHC 발현이 가장 강력함을 확인하였다 (실험예 1); (2) 근원세포 분화(myoblast differentiation) 에 미치는 영향 실험 (실험예 2)을 통하여 myoD 전사 활성(transcriptional activity)이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 시료 처리에 의하여 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 수를 증가시켰고, 다핵성 근관세포 (multinuclear myotubes)수의 비율을 증가시켜, 근관세포를 형성하는 근원세포 분화를 촉진시킴을 입증하였다. (3) 황련 추출물은 p38MAPK 및 Akt 신호전달 과정을 활성화함으로써 근원세포 분화를 유도함을 확인하였다 (실험 예3), (4)황련 추출물의 효과는 세포 생존율과는 무관함을 관찰하였고, (5) CT-26 대장암 세포주의 배양액을 이용한 근육분화가 소실되는 in vitro 모델에서 본 발명의 시료는 MHC와 myoD의 발현을 회복하여, 근육 재생 능력이 있음을 확인하였다. 상기 실험 결과는 본 발명의 황련 부탄올 분획물이 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia) 등의 근육 질환 치료제 또는 보조제로 사용 가능함을 확인함으로서, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

황련 추출물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising extract of Coptis chinensis F. for treating and preventing muscle-related disorder}
본 발명은 황련 추출물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
[문헌 1] J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2015, 6, 197
[문헌 2] Pharmacol Res. 2015, 99, 86
[문헌 3] The Korea Journal of Sports Science. 2011, 30, 1551
[문헌 4] Mech Ageing Dev . 2010, 13, 202
[문헌 5]Cell Mol Life Sci 2013, 70, 4117
[문헌 6]Brain Dev . 2013, 35, 349
[문헌 7] J. Biol . Chem . 2002, 277, 49831
[문헌 8] 생약학, 생약학교재편찬위원회, 동명사, 2006
[문헌 9] 향약대사전, 영림사, 1998, 490-493
[문헌 10] Heyjin Lee, et al, Isoquinoline alkaloids from Coptis japonica stimulate the myoblast differentiation via p38 MAP- kinase and Akt signaling pathway, Bioorg . Med . Chem . Lett ., 27 (6), 1401-1404 (2017) , 2017-3-15.
[문헌 11] Bioorg Med Chem Lett . 2017, 15, 27
[문헌 12] J . Biol . Chem 2004, 279, 30966
[문헌 13] Mol . Biol . Cell. 2010, 21, 2399
[문헌 14] Int J Mol Med. 2015, 36, 1073
[문헌 15] Sci Rep. 2016, 11, 24214. doi: 10.1038/srep24214
본 발명은 황련 추출물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
근육재생(Muscle regeneration)은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)과 같은 골격근 퇴행 질환을 극복하는 목적으로 주목되어 왔다. (J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2015, 6, 197)
근육의 진행성 약화 및 기능 소실은 삶의 질을 위협하고 암환자의 생존율을 저하시킨다. 암환자 중 30% 이상이 근육 소실에 의한 체중 감소로 인하여 사망한다. 이러한 근육 기능 소실은 미오-단백질(myo-proteins) 변성 및 근섬유의 단면적(muscle fiber cross-sectional area), 근 강도(muscle strength), 근섬유 숫자(nuclear number of myofibers) 및 인슐린 반응성(insulin responsiveness) 감소 등을 공통적으로 동반한다.
암 이외에도 근육 손실은 노화의 진행과 다양한 만성 질환에 의해서도 야기될 수 있다. 노화가 진행됨에 따라, 새롭게 생성되는 골격근의 일부가 섬유 조직으로 대체되면서 인체의 골격 근육량 및 강도가 감소되는 근육감소증이 나타난다. 또한, 고혈압, 내당능 장애 (impaired glucose tolerance) 및 당뇨, 비만, 이상지질혈증, 아테롬성 경화증 및 심혈관 질환 등 연령이 증가할수록 발병률이 증가되는 만성 질환에서도 근육 손실이 나타난다. (2. Pharmacol Res. 2015, 99, 86).
근육 퇴행증치료 전략은 염증성 분자 및 미오스타틴(myostatin)의 억제 또는 시클릭(cyclic) AMP, PGC (proliferator-activated receptor gamma coactivator)-1α 및 인슐린 신호 전달계의 활성화 등이 있다. 다수의 잠재적 약물들이 개발되었음에도 불구하고, 미국 식약청에서 승인된 근위축증 치료제로는 메게스테롤 아세테이트(megestrol acetate)가 유일하다. 근육퇴행증 치료 및 예방을 위한 약물들은 근육 단백질 이화작용(protein catabolism)을 저해하거나 또는 위성세포 기능(satellite cell functions)을 증진시키는 활성을 나타낸다. (2. Pharmacol. Res. 2015, 99, 86).
근육에서는 동화작용과 이화작용이 균형을 이루며 근육 생성을 조절하는데, 이 때 근육 세포 내에서는 이와 관련하여 여러 생체 신호전달 과정이 조절된다. 근육 단백질의 분해보다 합성을 유도하는 신호전달 반응이 활성화 될 경우, 근육 단백질의 합성이 증가되어 근육 크기 증가(hypertrophy, 근비대)나 근섬유 수 증가 (hyperplasia)를 유도하여 과도한 근육 생성을 초래한다 (3. The Korea Journal of Sports Science. 2011, 30, 1551).
근육 생성 유도 인자들은 근 세포 내에서 PI3K(phosphatidylinositol-3 kinase)/Akt 경로를 활성화 시키고 그에 따라 하위 단계의 단백질을 인산화 함으로써 근육 단백질 합성을 유도한다. 이 중 PI3K/Akt 신호전달에 의한 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 활성은 세포 내에서 다양한 성장 신호를 통합하는 중심 성장신호전달 기전으로 인정되고 있다. mTOR가 활성화되면 두 개의 하위 타겟인 4EBP1(4E-binding protein)과 p70S6K (phosphorylated 70-kDa ribosomal S6 kinase)이 활성화됨으로써, 근육 단백질 합성이 유도되어 근육량이 증가한다 (3. The Korea Journal of Sports Science. 2011, 30, 1551; 4. Mech Ageing Dev. 2010, 13, 202).
mTOR 외에도 근원세포 세포의 분화와 근육 형성은 다양한 인자들에 의해 조절된다 (5. Cell Mol Life Sci 2013, 70, 4117). 그 중, myoD는 근육 분화와 관련된 특이적 유전자의 발현을 개시하여, 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)가 근원세포(myoblast)로 분화하는 것을 유도한다. MyoD에 의해 조절되는 미오게닌과 MHC(myosin heavy chain) 은 근원세포의 융합(fusion)을 유도하여, 근관세포 (myotube)와 근섬유가 형성되도록 한다. 이 같은 과정을 통해 형성된 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다 (5. Cell Mol Life Sci 2013, 70, 4117; 6. Brain Dev. 2013, 35, 349)
정상 조건 하에서 원시 줄기세포 (primary stem cell)로서의 휴지상태의 위성세포(quiescent satellite cell)는 연속적으로 증식 및 분화를 진행한다. 손상된 근육은 근원세포로 지칭되는 근원성 위성세포(myogenic satellite cells) 증식을 활성화하는 다양한 성장인자를 분비한다. 활성화된 근원세포는 Myo D, Myf(myogenic factor)-5, 미오게닌 및 Mrf-4 과 같은 근원성 인자 (myogenic factor)를 유도한다. MyoD 및 Myf-5 는 근원 세포 계열 (myogenic lineage)에 특이적으로 발현되는 전사 인자로써, 근원세포 분화 개시에 중요한 역할을 수행한다. (7. J. Biol . Chem . 2002, 277, 49831). 특히, Myo D는 E 단백질, Mef-2 계열 단백질 및 전사 보조인자등의 비근육성 특이 인자와의 결합을 통하여 MHC 및 미오게닌과 같은 근원성 단백질 발현을 유도한다.
황련(Coptis japonica Makino.)은 다년생초본인 콥티스 야포니카(Coptis japonica Makino), 콥티스 키넨시스 (Coptis chinensis) 등의 동속식물의 근경을 약재로 사용하며, [8. 생약학, 생약학교재편찬위원회, 동명사, 2006], 그 구성 성분으로는 베르베린(berberine), 매그노플로린(magnoflorine), 콥티신(coptisine), 워레닌(worenine), 팔마틴(palmatine), 야테오리진(jateorrhizine) 등의 성분이 알려져 있으며, 항암작용, 항미생물 작용 등이 보고된 바가 있다 (9. 향약대사전, 영림사, 1998, 490-493).
또한 본원 발명자들은 황련 메탄올 추출물 및 이로 분리된 6개 화합물, 즉, 매그노플로린 (magnoflorine), 야트로리진 (jatrohizzine), 에피베르베린(epiberberine), 8-히드록시-7,8-디히드로콥티신 (8-hydroxy-7,8-dihydrocoptisine), 팔마틴 (palmatine) 및 베르베린(berberine)들이 근원세포 분화 시 활성화되는 p38 MAPK 와 Akt 신호전달계를 활성화시킴으로 확인한 바 있다 ( Heyjin Lee, et al, Isoquinoline alkaloids from Coptis japonica stimulate the myoblast differentiation via p38 MAP- kinase and Akt signaling pathway, Bioorg. Med. Chem. Lett., 27 (6), 1401-1404 (2017), 2017-3-15. ).
그러나, 상기 문헌의 어디에도 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 치료 효과에 대하여 개시되거나 교시된 바가 없다.
그러나, 본원 발명자들은 보다 근육관련 질환의 치료 효과면에서 보다 치료 활성이 강력한 천연물 신약 또는 건강기능식품 소재로서의 개발 가능성을 높이고자 기존에 알려진 황련 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들보다 강력한 치료효과를 나타내는 추출물 또는 정제물을 분리하고자, 본원 발명의 황련 추출물을 대상으로 (1) 근원세포 분화 효능 평가 (실험예 1)를 위해 웨스턴 블롯팅 분석을 통해 분화된 C2C12 세포에서 MHC 발현 정도를 검토하여, 본 발명의 황련 부탄올 분획물을 가장 강력한 MHC 발현 조성물로 확인하였으며, (2) 근원세포 분화(myoblast differentiation)에 미치는 영향실험 (실험예 2)을 통하여 황련 추출물에 의해 MHC의 발현이 증가하며 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)로의 분화가 농도의존적으로 유도되었다. 또한 MHC와 myoD의 발현이 증가되었고, 미오스타틴의 발현은 억제됨을 확인하였고, myoD 전사 활성이 촉진됨을 밝혔으며 (3) 근원세포 분화 시 활성화되는 p38 MAPK 와 Akt 신호전달계를 활성화 시켰으며, (4) 이 때 황련 추출물에 의한 세포 독성은 나타나지 않았으며, (5) CT-26 대장암 세포주의 배양액을 이용한 근육 소실 생체내 (시험관 내)(in vitro) 실험 모델에서 본 발명의 시료에 의한 근육 분화 인자인 MHC와 myoD의 발현이 회복되어 근육 재생 능력을 확인하였으며, 본원 발명자들의 기존선행문헌들에 개시된 황련 추출물 및 이로 분리된 화합물들보다 탁월한 근육관련 질환 치료효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 과제는 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 황련은 콥티스 야포니카(Coptis japonica Makino), 콥티스 키넨시스 (Coptis chinensis) 등의 동속식물의 근경, 줄기, 전초 잎, 바람직하게는, 근경 또는 전초를 포함함을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물은 1 내지 100% (v/v) 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30 내지 100% (v/v) 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 70 내지 100% (v/v) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물은 본원의 조추출물로부터 헥산, 에틸에테르, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물만을 정제한 비극성 용매에 가용한 추출 분획물들을 제거하고 남은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출 분획물,
바람직하게는, 알칼로이드 성분만을 다량 회수하기 위하여 (a) 본원의 조추출물을 산처리한 후에, 에틸에테르 용매를 가하고 통상적인 공정으로 분획하여 에틸에테르 용매 분획물을 제거하여 산처리 층을 수득하는 제 1단계; (b) 상기 1단계의 상기 에틸에테르 용매 분획물을 제거하고 남은 산 처리층에 알칼리 용액을 가하여 중화시켜 중화 여액을 수득하는 제 2단계; (c) 상기 2단계의 중화된 중화여액에 클로로포름 또는 에틸아세테이트 용매를 이용하여 추가로 통상적인 공정으로 분획하여 클로로포름 또는 에틸아세테이트 용매가용 분획물을 제거하여 추가 정제물을 얻는 제 3단계; (d) 상기 추가 정제물에 부탄올을 가하여 본 발명의 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물을 얻는 제 4단계 공정을 통하여 수득된 다량의 4급 이소퀴놀린 (isoquinoline)계 알칼로이드를 포함한 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물을 포함한다.
상기 제조방법의 제 1단계에서 산처리는 0.5 M 내지 10 M 범위, 바람직하게는, 1 M 내지 5 M 범위의 염산, 황산 등의 강산; 또는 초산, 개미산 등의 약산 수용액을 처리함을 특징으로 한다.
상기 제조방법의 제 2단계에서 알칼리 용액은 염화나트륨, 수산화나트륨 등의 강염기 또는 암모니아수 또는 탄산수소나트륨 등의 약염기를 처리하여 pH를 7 내지 14, 바람직하게는, 8 내지 11로 조정하여 중화함을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 근육관련 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육질환, 구체적으로, 노인성근위축 또는 암으로 인한 근육관련 질환, 보다 구체적으로는, 노인성근 위축 또는 암으로 인한 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia), 노인성근육감소증(sarcopenia) 및 근육소실증을 포함한다.
또한 본 발명은 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 함유하는 암으로 인한 근육관련 질환의 예방 및 치료제 또는 항암 보조 치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물과 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 암에 의한 근육관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 항암치료 보조제 또는 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 기존 항암제는 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 메토트랙세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 독소루비신(Doxorubicin), 무스틴(Mustine), 비크리스틴(vincristine), 프로카바진(procarbazine), 프레드니솔론(prednisolone), 블레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 다카르바진(dacarbazine), 에토포시드 (etoposide), 시스플라틴(cisplatin), 에피루비신(Epirubicin), 시스풀라틴(cisplatin), 카페시타빈(capecitabine), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등을 포함한다.
본원에서 정의되는 암질환는 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 유방암, 두경부암, 식도암, 위암, 대장암(=결장암), 직장암, 항문암, 간세포간암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 폐암(비소세포성 폐암, 소세포성 폐암), 흉선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 육종, 위장관 기질성 종양(GIST, 기스트), 원발부위불명암, 중피종, 흑색종, 신경내분비 종양, 피부암, 혈액암 등을 포함한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 추출물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.
예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물은 하기와 같이 제조될 수 있다.
먼저, 본 발명의 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물은 (1) 건조된 황련을 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30~100% 에탄올을 수회 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1시간 내지 12시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 환류추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 조추출물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물은은 상기에서 (a) 본원의 조추출물을 산처리한 후에, 에틸에테르 용매를 가하고 통상적인 공정으로 분획하여 에틸에테르 용매 분획물을 제거하여 산처리 층을 수득하는 제 1단계; (b) 상기 1단계의 상기 에틸에테르 용매 분획물을 제거하고 남은 산 처리층에 알칼리 용액을 가하여 중화시켜 중화 여액을 수득하는 제 2단계; (c) 상기 2단계의 중화된 중화여액에 클로로포름 또는 에틸아세테이트 용매를 이용하여 추가로 통상적인 공정으로 분획하여 클로로포름 또는 에틸아세테이트 용매가용 분획물을 제거하여 추가 정제물을 얻는 제 3단계; (d) 상기 추가 정제물에 부탄올을 가하여 본 발명의 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물을 얻는 제 4단계 공정을 통하여 수득된 다량의 4급 이소퀴놀린 (isoquinoline)계 알칼로이드를 포함한 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물을 각각 정제 및 수득할 수 있다.
본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 추출물을 대상으로 한 (1) myoD 전사활성(transcriptional activity)을 측정하는 근원세포의 분화촉진 효능을 평가하기 위하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과, 부탄올 분획물이 분화된 C2C12 세포에서의 MHC 발현을 가장 강하게 증가시켰으며 (실험예 1), (2) 근원세포 분화(myoblast differentiation)에 미치는 영향실험 (실험예 2)을 통하여 황련 추출물이 근원세포 분화유도를 통한 MHC를 발현하는 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 수를 증가시켰고, MHC와 myoD의 단백질 발현을 증가 및 미오스타틴 발현을 억제하였다. myoD 전사 활성(transcriptional activity) 또한 유의적으로 증가함을 확인하였으며, (3) 황련 추출물은 p38MAPK 및 Akt 신호전달 과정을 활성화함으로써 근원세포 분화를 유도함을 확인하였다 (실험 예3), (4) 황련 추출물의 효과는 세포 생존율과는 무관함을 관찰하였으며, (5) CT-26 대장암 세포주의 배양액을 이용한 근육분화가 소실되는 in vitro 모델에서 본 발명의 시료는 MHC와 myoD의 발현을 회복하여, 근육 재생 능력이 있음을 확인함으로써, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 정제물을 0.01 내지 99% 중량으로 포함한다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 정제물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 추출물 또는 정제물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 정제물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 정제물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 마우스, 생마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 및 직장, 또는 정맥 등의 방법을 통하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 노인성근위축증 또는 악액질 치료제를 제공하며, 이러한 치료제는 노인성근위축증 또는 악액질의 병용요법에서 체중 변화나 식욕 회복의 개선 효과를 위한 것으로서, 악액질 치료에서 항암제 단독투여보다는 본 발명의 조성물을 이용한 병용요법을 제공한다.
또한, 본 발명은 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 근육관련 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 정제물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.
더욱이, 본 발명의 조성물은 근육관련 질환의 치료 및 개선을 목적으로 한 건강식품일 수 있다.
또한, 근육관련 질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
또한, 본 발명은 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품을 제공한다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 정제물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.
또한, 본 발명은 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 식품 또는 식품첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 추출물 또는 정제물을 식품첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물 또는 정제물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 추출물 또는 정제물은 목적 질환이 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 정제물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 황련 추출물을 대상으로 (1) myoD 전사활성(transcriptional activity)을 측정하는 근원세포의 분화촉진 효능을 평가하기 위하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과, 부탄올 분획물이 분화된 C2C12 세포에서의 MHC 발현을 가장 강하게 증가시켰으며 (실험예 1), (2) 근원세포 분화(myoblast differentiation)에 미치는 영향실험 (실험예 2)을 통하여 황련 추출물이 근원세포 분화유도를 통한 MHC를 발현하는 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 수를 증가시켰고, MHC와 myoD의 단백질 발현을 증가 및 미오스타틴 발현을 억제하였다. myoD 전사 활성(transcriptional activity) 또한 유의적으로 증가함을 확인하였으며, (3) 황련 추출물은 p38MAPK 및 Akt 신호전달 과정을 활성화함으로써 근원세포 분화를 유도함을 확인하였다 (실험 예3), (4) 황련 추출물의 효과는 세포 생존율과는 무관함을 관찰하였으며, (5) CT-26 대장암 세포주의 배양액을 이용한 근육분화가 소실되는 in vitro 모델에서 본 발명의 시료는 MHC와 myoD의 발현을 회복하여, 근육 재생 능력이 있음을 확인함으로써, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다. 이러한 상기 실험 결과는 본 발명의 황련 추출물 이 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia) 등의 근육 질환 치료제 또는 보조제로 사용 가능함을 확인함으로서, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품 등으로 유용함을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 부탄올 분획물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도이며 (여기에서, 1: 매그노플로린 (magnoflorine), 2: 야트로리진 (jatrohizzine), 3: 에피베르베린 (Epi-berberine), 4: 8-히드록시-7,8-디히드로콥티신 (8-hydroxy-7,8-dihydrocopisine), 5: 팔미틴 (palmitine), 6: 베르베린 (berberine)을 각각 나타냄);
도 2은 본 발명 추출물과 분획물의 MHC (myosin heavy chain) 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;.
도 3A는 본 발명 부탄올분획물의 myoD 전사활성(transactivation) 을 나타내며 (데이타는 mean ± SD으로 표기하여 *p< 0.05 vs. 대조군을 의미함); 도 3B는 MHC, myoD, 그리고 미오스타틴의 딘백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 3C는 다핵성 근관섬유에서의 MHC (myosin heavy chain) 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 4은 본 발명 부탄올분획물의 p38 MAP 키나제(kinase) 및 Akt 신호전달계 활성화에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 5은 본 발명 부탄올분획물의 C2C12 세포에 대한 세포독성을 나타낸 도이며;
도 6은 마우스 대장암 세포주 배양액을 분화된 근관세포에 처리하여 근육 손실을 유도한 모델에서, 본 발명 부탄올분획물의 근육 재생능력을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
비교예 1. 황련 메탄올 추출물의 제조
건조된 황련 (경동시장, 서울 한국, 숙명여자대학 약초표본실 보존 표본 SPH 1502) 5Kg에 메탄올 5ℓ를 넣고 9시간 동안 80℃에서 환류추출한 후, 여과하고 감압 조건하에서 농축하였다. 농축된 메탄올 추출물은 감압 조건하에서 냉동 건조기 (ScanVac, Labogene)로 동결 건조하여 540g의 황련 메탄올 추출물 분말 (이하, “CJM”이라 함)을 얻어 다음 실험에 비교예로 사용하였다.
실시예 1. 황련 조추출물의 제조
건조된 황련 (경동시장, 서울 한국, 숙명여자대학 약초표본실 보존 표본 SPH 1502) 5Kg에 70% 에탄올 5ℓ를 넣고 9시간 동안 80℃에서 환류추출한 후, 여과하고 감압 조건하에서 농축하였다. 농축된 에탄올 추출물은 감압 조건하에서 냉동 건조기 (ScanVac, Labogene)로 동결 건조하여 600g의 황련 에탄올 추출물 분말 (이하, “CJEA”이라 함)을 얻어 다음 실험에 사용하였다.
실시예 2. 황련 분획물의 제조예
실시예 1에서 얻은 건조된 항련 에탄올 추출물을 증류수 2M 염산 수용액 900ml에 현탁(suspension)하고, 당업계에 통상적인 분획방법에 따라 디에틸에테르로 분획하고, 남은 염산층을 20% 암모니아수를 이용하여 pH를 10으로 조정한 다음 클로로포름 및 n-부탄올(BuOH)로 차례대로 분획하고 감압 건조하여 디에틸에테르 가용분획물 38g, 클로로포름 가용분획물 70g, 및 부탄올 가용분획물 150g을 각각 얻어 동결건조하였다. (이하, 각각, “CJDE", “CJCH", 및 “CJBU"라 함).
실험예 1. 성분 분석
상기 실시예 시료의 성분 분석을 위해 실시한 HPLC 조건은 다음과 같다.
컬럼은 Intersil ODS-2 (5 um, 10 * 250 mm), 이동상: 아세토니트릴/인산완충액 (인산: 트리에틸아민:물=1:2:100)=26/74, Flow rate: 1ml/min, 검출파장: 265 nm
상기 실험 결과, 부탄올 분획물의 각 성분에 대한 분석결과 함량은 도 1에 기재된 바와 같다.
실험예 2. 근원세포의 분화촉진 효능 평가
상기 실시예의 황련 추출물의 근원세포의 분화(myogenic effect)에 미치는 영향을 알아보기 위하여 참고문헌을 토대로, 마우스 근원세포주인 C2C12 세포에 에탄올 추출물, 부탄올 분획층, 그리고 클로로포름 분획층을 각각 처리하여 근원세포 분화의 마커인 MHC 발현량을 통해 근원세포의 분화촉진 효능을 평가하였다 (16. Bioorg Med Chem Lett. 2017, 15, 27).
각각의 시료를 첨가하여 분화된 세포에서 세포 용해물을 획득하여 웨스턴 블롯법을 통해 MHC의 단백질 발현 수준을 평가하였다 (도 2).
2-1. 실험 과정
C2C12 근원세포 (Cat# CRL-1771, ATCC)에 황련의 에탄올 추출물, 부탄올 분획물, 그리고 클로포름 분획물(1, 10, 100 ng/mL)을 처리하여 분화 배지 (differentiation medium, 2% horse serum-containing DMEM, Cat# 11965-084, Gibco)상에서 3일간 처리하면서 분화를 유도하였다.
웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 위해 약 3 X 104 의 근원세포를 60 mm 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 분화 배지에 각 시료를 첨가하여 3 일간 분화시킨 후, 세포 용해 버퍼로 (lysis buffer, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), and protease inhibitor cocktail (Calbiochem, Darmstadt, Germany) 단백질 추출물을 얻고 25 μg의 단백질 추출물로 SDS-polyacrylamide gel electorphoresis (PAGE)를 실시하고, polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes로 이동시켰다. 이 블롯에 일차 마우스 항-MHC를 4 °C에서 12 시간 동안 결합시키고, 이어서 Horseradish peroxidase가 연결된 항 마우스 2차 항체 (goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2005, SantaCruz)를 결합한 후, 화학발광으로 MHC 단백질량을 분석하였다. 이 때 적재 대조군(loading control)으로 pan-cadherin(Cat# 3678, Sigma)을 사용하였다.
2-2. 실험 결과
도 2에서는 황련 추출물에 의한 MHC 발현에 대한 효과를 측정하였다. 근원세포의 분화 배지에 1, 10, 100 ng/mL의 농도로 처리하여 근관섬유로 3 일간 분화시키고 세포를 수확하여, 근관섬유로의 분화 마커인 MHC의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다.
분석 결과, 대조군세포에서의 MHC 발현을 1로 하였을 때, 황련 에탄올 추출물을 처리하였을 때는 MHC 발현이 평균 0.8배로 감소하였고, 부탄올 분획물을 처리한 세포군에서는 0.1, 1, 10, 그리고 100 ng/mL 농도에 따라, 4.3, 6.6, 6.1 6.6배로 크게 증가하였다. 클로로포름 분획물을 1, 10, 100 ng/mL 처리하였을 때 1.1, 2.5, 7.7배로 각각 증가하였다. 이러한 상기 실험 결과로부터 본 발명의 황련 부탄올분획물이 농도 의존적으로 근원세포분화(myogenic differentiation)를 촉진함을 확인하였다. (표 1 및 도 2)
화합물들의 MHC 발현에 대한 영향 실험결과 (도 2)
대조군 에탄올 추출물 부탄올 분획물 클로로포름 분획물
농도 [ng/mL] 1 10 100 0.1 1 10 100 1 10 100
MHC /pan-cadherin 발현 (배) 1 0.7 0.9 0.7 4.3 6.6 6.1 6.6 1.1 2.5 7.7
실험예 3. 근원세포 분화(myoblast differentiation) 에 미치는 영향
상기 실시예의 황련 추출물의 근원세포의 분화(myogenic effect)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 마우스 근원세포주인 C2C12 세포에 myoD-반응성 유전자와 루시퍼라제가 융합된 리포터 벡터(MyoD-responsive reporter 4RTK-luc)를 삽입하고, 추출물 처리에 따른 루시퍼라제 활성도 변화를 측정함으로써 myoD 전사활성을 분석하여 근원세포의 분화촉진 효능을 평가하였다 (17. J. Biol. Chem 2004, 279, 30966) (도 3A).
분화된 세포에서 세포 용해물을 획득하여 웨스턴 블롯법을 통해 MHC의 단백질 발현 수준을 평가하였고 (도 3B), 마우스 항(mouse anti)-MHC) 및 형광 물질에 결합된 마우스 항체로 (anti-mouse IgG2b Alexa-fluor 568) 면역 염색법을 수행하여 MHC 발현을 평가하였다 (도 3C).
3-1. 실험 과정
티미딘 키나제 프로모터(thymidine kinase promoter)에 융합된 4개의 부위(E-box sites)를 포함하는 리포터 벡터(MyoD-responsive reporter 4RTK-luciferase construct (숙명여자대학교 약학대학 배규운 교수 제공)를 MyoD 전사 활성을 평가하는데 사용하였다.
도 3A에 나타난 바와 같이, 골격근 성장연구를 위한 모델 세포로 간주되는 마우스 근원 세포주 C2C12에 일시적으로 myoD 발현 벡터 (myoD expression vector) 및 리포터 벡터 (MyoD-responsive reporter 4RTK-luc) (숙명여자대학교 약학대학 배규운 교수 제공)를 형질 주입(transfection)시켰다 (18. PLoS One. 2017, 12, e0175271). 형질 주입 24 시간 후, 세포들에 황련 추출물 (1, 10, 100 ng/mL)을 처리한 후, 추가로 24 시간 배양하였다. 배양한 세포는 인산 완충 생리 식염수로 2회 세척 후, 리포터 용해 버퍼로 (Cat#. E1941, Promega) 용해시킨 다음 세포 용해물을 5 μl를 취하여 루시퍼라제 분석용 96-웰 플레이트 (Cat# 31196, SPL)에 분주하고 루시퍼라제 기질 (Dual Luciferase Reporter Assay System, Cat# E1910, Promega) 30 μl를 더해 흡광도를 측정하였다. β-갈락토시다제 (galactosidase) 활성은 세포 용해물에 Stop and Glo 시약 (Ccat# E1910, Promega)을 30 μl 더하여 흡광도를 측정하였다. 데이터는 β-갈락토시다제 (galactosidase) 활성으로 나눈 상대적 루시페라제 활성 (relative luciferase activity (RLU)로 표시하고 평균(mean)±SD으로 표기하였다.
위와 같은 방법으로 각각의 시료를 첨가한 분화 배지에서 근원세포를 분화시켜, 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각의 분화 배지를 제거하고, 인산완충 생리식염수로 2회 세척 후, 4% paraformaldehyde로 20 분간 고정하였다. 다시 인산완충 생리식염수로 2회 세척하고, 0.1% tritonX-100에 20 분간 처리하였다. 인산 완충 생리식염수로 2회 세척하고, 5% 말 혈청 용액에서 블로킹한 후, 마우스 항-MHC (MAB4470, R&D systems)을 넣고 12 시간 동안 4°C에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 세척한 후 Alexa Flouor 568-결합된 2차 항 마우스 (A-21144, MicoProbes)와 DAPI (D9542, Sigma)을 이용하여 MHC 발현을 분석하였다. MHC-양성 근관세포 (positive myotubes)의 면역형광(Immunofluorescence) 결과는 적색으로 시각화하고 DAPI-표지된 핵은 청색으로 시각화하였다.
3-2. 실험 결과 (표 2 내지 표 4)
본 실험 결과, 대조군세포에서의 루시퍼라제 활성을 1로 하였을 때, 황련 부탄올분획물을 1 ng/mL 처리하였을 때는 2.6 배, 10 ng/mL 처리하였을 때는 3.1 배, 100 ng/mL 처리하였을 때는 1.5 배 각각 증가되어, 황련 부탄올분획물은 농도 의존적으로 MyoD 전사 활성(transcriptional activity)을 증가시킴을 확인하였다 (도 3A).
도 3B에서는 황련 부탄올분획물의 MHC, myoD 그리고 미오스타틴 발현에 대한 효과이다. 근원세포의 분화 배지에 1, 10, 100 ng/mL의 농도로 처리하여 근관섬유로 3 일간 분화시키고 세포를 수확하여, 근관섬유로의 분화 마커인 MHC와 myoD, 그리고 분화 억제 인자인 미오스타틴의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다.
분석 결과, 대조군세포에서의 MHC 발현을 1로 하였을 때, 황련 부탄올분획물을 10 ng/mL 처리하였을 때는 2.6 배, 100 ng/mL 처리하였을 때는 2.3 배 증가되었다. myoD의 경우, 황련 부탄올분획물을 10과 100 ng/mL 처리하였을 때 각각 2.8, 그리고 2.2 배 증가되었다. 근육 분화의 억제 인자인 미오스타틴의 경우 황련 부탄올분획물 10과 100 ng/mL 농도 처리 세포군에서 0.8과 0.4 배로 감소하였다.
황련 부탄올분획물은 Myo D 전사 활성화(transcriptional activation) 실험 결과와 일치하게, 분화된 C2C12 세포에서의 MHC와 myoD의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, 분화 억제 인자인 미오스타틴의 발현을 강력하게 감소시킴을 확인하였다.
도 3C에서는, 항(anti)-MHC 항체(antibodies) 및 DAPI을 이용한 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)으로 부탄올분획물의 근육분화 활성을 측정하였다. 증가된 적색형광(red-fluorescence)은 황련 부탄올분획물이 C2C12 세포에서의 MHC 발현을 농도 의존적으로 촉진함을 의미하며, DAPI 염색(counter staining)을 통해서는 MHC가 발현되는 실린더 형(cylinder-shaped) 근관세포가 다핵성(multinucleated)임을 확인할 수 있었다.
상기 실험에서 황련 부탄올분획물은 매우 낮은 농도에서, 근관세포에서의 MHC 발현과 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 수를 증가시킴을 알 수 있었으며 근육 세포 분화를 촉진시킴을 입증하였다.
본 발명 부탄올분획물의 myoD 전사활성(transactivation)(도 3A)
농도 [ng/mL] 0 1 10 100
myoD 리포터 활성 (배) 1.0 + 0.1 2.6 + 0.6 3.1 + 0.1 1.5 + 0.4
Figure pat00001
다핵성 근관섬유에서의 MHC (myosin heavy chain) 발현에 미치는 영향(도 3C)
농도 0 10 100
5개 이상의 핵을 가진 다핵성이며 MHC가 발현된 근관 섬유의 수(배) 1.0 6.2 5.8
실험예 4. 근원세포 분화(myoblast differentiation) 와 p38 MAPK 신호전달 체계 기전 연구
p38 MAPK와의 Akt (proteinkinase B, PKB) 신호전달계는 근원세포 분화(myoblast differentiation)에 매우 중요한 기전으로 알려져 있으므로 (Mol . Biol . Cell. 2010, 21, 2399), 상기 실시예의 황련 추출물이 근원세포 분화(myoblast differentiation) 동안 p38 MAPK 신호전달계에 영향을 주는지 알아보기 위하여 참고문헌에 기재된 방법을 실험을 수행하였다.
p38 미토겐-활성화 프로테인 키나제 (mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)은 MyoD 활성화에 중요한 역할을 수행하는데, p38MAPK는 근원세포 분화인자(myogenic factors) 발현을 유도하기 위한 Myo D의 이량화(dimerization)를 촉진한다 (19. Trends Cell Biol. 2006, 16, 36). p38 MAPK와 더불어 Akt는 근육 세포 내에서 근육-특이적인 유전자 발현을 유도하고 (20. Int J Mol Med. 2015, 36, 1073) 근육 분화에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
4-1. 실험 과정
본 발명자들은 분화된 근관세포(differentiated myotubes) 용해물(lysates)을 얻어 인산화된 p38 MAPK와 인산화된 Akt 수준을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다. 이를 위해 약 3 X 104 의 근원세포(C2C12)를 60 mm 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 2% 말 혈청을 첨가한 DMEM 분화 배지에 황련 추출물을 1, 10, 100 ng/mL 농도로 각각 첨가하여 3 일간 분화시킨 후, 처리된 세포에서 배지를 제거하고, PBS로 세척한 후, 세포 용해 버퍼로 세포를 용해시켰다. 30 분간 얼음에서 방치 후, 14000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 얻은 세포 용출물의 단백질 농도를 BCA법으로 측정하여 25 μg의 단백질 추출물을 전기영동하고 PVDF에 트랜스퍼하여, 블롯을 얻었다. 이에 일차 토끼-항 인산화 p38 MAPK(Cat# 9211, Cell Signaling Technology) 혹은 일차 토끼-항 인산화 Akt(Cat# 9271, Cell Signaling Technology)와 이에 대한 항 토끼 2차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2004, SantaCruz)을 반응시켜 인산화 p 38 MAPK 또는 인산화 Akt의 발현을 측정하였고, 이 때 각각의 적재 대조군(loading control)인 총 p38 MAPK과 총 Akt의 발현량을 분석하기 위해 일차 토끼-항 p38 MAPK(Cat# 9212, Cell Signaling Technology) 또는 일차 토끼-항 Akt(Cat# 9272, Cell Signaling Technology) 를 사용하였다.
4-2. 실험 결과
분석 결과, 대조군 세포에서의 p38 MAPK의 인산화 정도를 1로 하였을 때, 황련 부탄올분획물을 10 ng/mL 처리하였을 때는 1.5 배, 100 ng/mL 처리하였을 때는 1.4 배 유의적으로 증가되었다. Akt의 인산화 수준은 황련 부탄올분획물 10 ng/mL 처리에 의해 유의적으로 증가하였다.(표 5 및 도 4).
상기 실험 결과는 황련 부탄올분획물에 의해 근원세포 분화(myoblast differentiation)가 촉진되며 이 때 p38 MAPK 및 Akt의 활성화가 중요한 작용함을 의미한다.
p38 MAPK 및 Akt의 활성화에 대한 영향 실험결과 (도 4)
농도 0 1 10 100
phospho-p38/p38 발현량 (배) 1.0 0.9 1.5 1.4
phospho-AKt/Akt 발현량 (배) 1.0 1.1 1.3 1.0
실험예 5. 세포독성실험
상기 실시예의 시료의 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 문헌에 기재된 MTT 어세이 법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
5-1. 실험 과정
본 발명자들은 C2C12 세포에 대한 세포독성을 확인하기 위하여 C2C12 세포에 부탄올분획물을 1, 10, 100 ng/mL 농도로 처리하고 MTT 어세이 법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 살아있는 세포는 미토콘드리아 기능이 잘 수행됨으로써 미토콘드리아의 환원효소(reductase)에 의해 수용성이며 노란색인 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide)가 불용성이며 보라색인 formazan 반응물로 전환될 수 있는데, 이러한 보라색 반응물의 고유 흡광도(560nm)를 측정하여 그 값이 높을 수록 살아있는 세포가 더 많다고 평가한다.
MTT 어세이를 위해 약 2 X 103 의 근원세포(C2C12)를 96 웰 플레이트 각각 분주하여 24 시간 배양한 후, MTT 용액(0.5 mg/mL in 인산완충 생리식염수, Cat# M2128, Sigma) 100 ul를 가하고 37°C CO2 배양기에서 3시간 방치한다. 배지를 제거하고 각 웰에 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 100 ul 넣고 5 분 후, 마이크로 플레이트 리더기(GloMax®Microplate Multimode Reader, Promega)를 이용해 560 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
부탄올분획물에 대한 세포 생존율(%)은 100 X (추출물을 처리한 세포의 흡광도-blank)/(대조군의 흡광도-blank)로 나타내었고, 이 때 blank는 세포가 없이 DMSO만 넣은 웰의 흡광도이다. 따라서 세포의 생존율이 감소할수록 시료의 독성이 증가한다고 볼 수 있다.
5-2. 실험 결과
상기 실험 결과, 황련의 부탄올분획물은 본 실험에서 사용한 농도에서 C2C12 세포에 대한 유의적인 세포독성을 나타내지 않았다 (도 5).
실험예 6. 근육 소실 시험관내(in vitro) 모델에서의 근육 재생 효과
상기 실시예의 부탄올분획물의 근육 소실에 대한 억제 효과를 밝히기 위해 CT-26, 마우스 대장암 세포주 배양액을 근관세포에 처리하여 근육 소실의 in virto 모델을 확립하고 (21. Sci Rep. 2016, 11, 24214. doi: 10.1038/srep24214) 하기와 같이 실험을 진행하였다.
6-1. 실험 과정
본 발명자들은 근육 소실의 in vitro 모델을 확립하기 위해 5 X 106 개의 CT-26 마우스 대장암 세포를 T75 플라스크에 분주하여 배양 배지 (10% 우태 혈청을 포함한 DMEM)에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 인산 완충 생리 식염수로 2회 세척하고, 혈청이 없는 DMEM으로 1회 세척하였다. 혈청 내의 염증성 인자들의 영향을 배제하기 위해, 세척된 세포에 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지를 21 mL를 넣고 24 시간 동안 배양한 후, 배양을 취하여 syringe filter (idameter 25mm, pore size 20 μm, Hyundai Co., LTD)를 이용해 필터링한 후 -20°C에서 보관하였다.
약 3 X 104 의 근원세포(C2C12)를 60 mm 플레이트에 분주하고 24 시간 후 2% 말 혈청을 첨가한 DMEM 분화 배지에서 8 일 동안 배양하여 근관세포로 분화시켰다. 이 때 새로운 분화 배지로 3일 마다 교체해 주었다. 분화된 근관세포에 시료를 1, 10, 그리고 100 ng/mL 농도로 부탄올분획물을 첨가하여 3 시간 동안 배양한 후, CT-26 마우스 대장암 세포의 배양액을 최종 농도가 20% 되도록 첨가하여 3 일간 더 분화시켰다. 분화와 시료 처리가 완료된 세포를 인산 완충 생리 식염수로 세척하여 준비하였다. 준비된 세포를 이용해 각각 근육 분화 인자들의 단백질 발현을 보기 위한 웨스턴 블롯팅과 MHC 발현 확인을 위한 면역 형광 염색을 수행하였다.
6-2. 실험 결과 (표 6 내지 표 7)
각 세포군에서 MHC와 myoD 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법을 통해 분석한 결과, 대장암 배양액을 첨가하지 않은 대조군 (NC) 근관세포에서의 MHC 발현을 1로 하였을 때, 암세포주 배양액만을 처리하여 근육 손실을 유도한 근관 세포군에서의 MHC 발현은 0.6 배로 급격히 감소하였으나, 황련 부탄올분획물을 1 ng/mL을 처리한 경우에 1.0 배, 10 ng/mL은 1.2 배, 100 ng/mL은 1.1 배로 근육 손실이 유도되지 않은 대조군 근관세포군의 MHC 발현 수준으로 회복되었다.
근육 분화에 중요한 전사인자인 myoD의 발현도 대장암 배양액을 첨가하여 근육 손실을 유도한 근관 세포군에서는 0.8 배로 감소하였으나, 부탄올분획물의 농도에 따라 1 ng/mL을 처리한 경우에 0.9 배, 10 ng/mL은 1.3 배, 100 ng/mL은 0.9배로 증가하여 대조군 근관세포군의 myoD 발현 수준으로 회복됨이 관찰되었다. MHC와 myoD 모두 10 ng/mL에서 가장 높은 발현을 보였고 시료 농도에 따른 발현 증가 패턴을 보였다 (도 6A).
도 6B에 나타난 바와 같이, 암세포주 배양액에 의해 감소한 근육 재생 능력을 시료에 의한 회복능을 확인하기 위하여, 대장암 배양액을 첨가한 근관세포에서 적색형광의 수준으로 MHC 발현을 평가하였고, DAPI 판독 염색으로는 시료 처치에 의하여 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 형성을 평가하였다. 대장암세포 배양액을 첨가하지 않은 대조군 (NC) 근관세포와 비교하여, 암 세포주 배양액에 의해 근육분화가 현저히 억제되었다. 이때 황련의 부탄올분획물을 처리한 결과, 암 세포주 배양액에 의해 감소한 다핵성 (multinucleated) MHC-양성 세포(positive cells)수가 회복되었다. 본 발명의 시료에 의한 근육 재생이 효과적으로 촉진됨을 입증한 것이다.
Figure pat00002
Figure pat00003
하기에 본 발명의 시료 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
에탄올 추출물 (CJEA) ----------------------------------- 20 mg
유당 --------------------------------------------------- 100 mg
탈크 ---------------------------------------------------- 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
부탄올 가용분획물(CJBU) -------------------------------- 10 mg
옥수수전분 -------------------------------------------- 100 mg
유당 -------------------------------------------------- 100 mg
스테아린산 마그네슘 ------------------------------------- 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
에탄올 추출물 (CJEA) ----------------------------------- 10 mg
결정성 셀룰로오스 --------------------------------------- 3 mg
락토오스 --------------------------------------------- 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 --------------------------------- 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
부탄올 가용분획물(CJBU) -------------------------------- 10 mg
만니톨 ------------------------------------------------ 180 mg
주사용 멸균 증류수 ----------------------------------- 2974 mg
Na2HPO4,12H2O ------------------------------------------- 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
에탄올 추출물 (CJEA) ------------------------------------ 20 mg
이성화당 ------------------------------------------------- 10 g
만니톨 ---------------------------------------------------- 5 g
정제수 --------------------------------------------------- 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
부탄올 가용분획물(CJBU) ------------------------------- 1000 ㎎
비타민 혼합물 -------------------------------------------- 적량
비타민 A 아세테이트 ------------------------------------- 70 ㎍
비타민 E ----------------------------------------------- 1.0 ㎎
비타민 B1 --------------------------------------------- 0.13 ㎎
비타민 B2 --------------------------------------------- 0.15 ㎎
비타민 B6 ---------------------------------------------- 0.5 ㎎
비타민 B12 --------------------------------------------- 0.2 ㎍
비타민 C ------------------------------------------------ 10 ㎎
비오틴 -------------------------------------------------- 10 ㎍
니코틴산아미드 ----------------------------------------- 1.7 ㎎
엽산 ---------------------------------------------------- 50 ㎍
판토텐산 칼슘 ------------------------------------------ 0.5 ㎎
무기질 혼합물 -------------------------------------------- 적량
황산제1철 --------------------------------------------- 1.75 ㎎
산화아연 ---------------------------------------------- 0.82 ㎎
탄산마그네슘 ------------------------------------------ 25.3 ㎎
제1인산칼륨 --------------------------------------------- 15 ㎎
제2인산칼슘 --------------------------------------------- 55 ㎎
구연산칼륨 ---------------------------------------------- 90 ㎎
탄산칼슘 ----------------------------------------------- 100 ㎎
염화마그네슘 ------------------------------------------ 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
에탄올 추출물 (CJEA) ------------------------------------ 1000㎎
구연산 ------------------------------------------------- 1000 ㎎
올리고당 ------------------------------------------------- 100 g
매실농축액 ------------------------------------------------- 2 g
타우린 ----------------------------------------------------- 1 g
정제수를 가하여 ------------------------------------ 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (15)

  1. 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 황련은 콥티스 야포니카(Coptis japonica Makino), 콥티스 키넨시스 (Coptis chinensis) 등의 동속식물의 근경, 줄기, 전초 또는 잎임을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물은 1 내지 100% (v/v) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물임을 특징임을 특징으로 하는 약학조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물은 본원의 조추출물로부터 헥산, 에틸에테르, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물만을 정제한 비극성 용매에 가용한 추출 분획물들을 제거하고 남은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출 분획물임을 특징임을 특징으로 하는 약학조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물은 알칼로이드 성분만을 다량 회수하기 위하여 (a) 본원의 조추출물을 산처리한 후에, 에틸에테르 용매를 가하고 통상적인 공정으로 분획하여 에틸에테르 용매 분획물을 제거하여 산처리 층을 수득하는 제 1단계; (b) 상기 1단계의 상기 에틸에테르 용매 분획물을 제거하고 남은 산 처리층에 알칼리 용액을 가하여 중화시켜 중화 여액을 수득하는 제 2단계; (c) 상기 2단계의 중화된 중화여액에 클로로포름 또는 에틸아세테이트 용매를 이용하여 추가로 통상적인 공정으로 분획하여 클로로포름 또는 에틸아세테이트 용매가용 분획물을 제거하여 추가 정제물을 얻는 제 3단계; (d) 상기 추가 정제물에 부탄올을 가하여 본 발명의 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물을 얻는 제 4단계 공정을 통하여 수득된 다량의 4급 이소퀴놀린 (isoquinoline)계 알칼로이드를 포함한 (b) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 분리된 정제물임을 특징으로 하는 약학조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 근육관련 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육질환임을 특징으로 하는 약학조성물.
  7. 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물과 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 암에 의한 근육관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 기존 항암제는 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 메토트랙세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 독소루비신(Doxorubicin), 무스틴(Mustine), 비크리스틴(vincristine), 프로카바진(procarbazine), 프레드니솔론(prednisolone), 블레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 다카르바진(dacarbazine), 에토포시드 (etoposide), 시스플라틴(cisplatin), 에피루비신(Epirubicin), 시스풀라틴(cisplatin), 카페시타빈(capecitabine), 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin) 임을 특징으로 하는 약학조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 암질환는 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 유방암, 두경부암, 식도암, 위암, 대장암(=결장암), 직장암, 항문암, 간세포간암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 폐암(비소세포성 폐암, 소세포성 폐암), 흉선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 육종, 위장관 기질성 종양(GIST, 기스트), 원발부위불명암, 중피종, 흑색종, 신경내분비 종양, 피부암 또는 혈액암임을 특징으로 하는 약학조성물.
  10. 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 티백제, 침출차, 또는 건강 음료 형태인 건강기능식품.
  12. 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품.
  13. 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 식품첨가제.
  14. 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제.
  15. 황련의 (a) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물 또는 (b) 이로부터 분리된 정제물을 함유하는 항암 보조 치료제.
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