KR102162787B1 - 사비넨을 유효성분으로 함유하는 근원세포에서 근관세포로의 분화 촉진용 조성물 - Google Patents
사비넨을 유효성분으로 함유하는 근원세포에서 근관세포로의 분화 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
Description
본 발명은 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유하는 근원세포에서 근관세포로의 분화를 촉진시키는 조성물에 관한 것이다.
근육재생(Muscle regeneration)은 긴장감퇴증(atony), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증 및 악액질(cachexia)과 같은 골격근 퇴행 질환을 극복하는 목적으로 주목되어 왔다(J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2015, 6, 197).
근육의 진행성 약화 및 기능 소실은 삶의 질을 위협하고 암환자의 생존율을 저하시킨다. 암환자 중 30% 이상이 근육 소실에 의한 체중 감소로 인하여 사망하며, 이러한 근육 기능 소실은 미오-단백질(myo-proteins) 변성 및 근섬유의 단면적(muscle fiber cross-sectional area), 근 강도(muscle strength), 근섬유 숫자(nuclear number of myofibers) 및 인슐린 반응성(insulin responsiveness) 감소 등을 공통적으로 동반한다.
암 이외에도 근육 손실은 노화의 진행과 다양한 만성 질환에 의해서도 야기될 수 있다. 노화가 진행됨에 따라, 새롭게 생성되는 골격근의 일부가 섬유 조직으로 대체되면서 인체의 골격 근육량 및 강도가 감소되는 근육감소증이 나타난다. 또한, 고혈압, 내당능 장애(impaired glucose tolerance) 및 당뇨, 비만, 이상지질혈증, 아테롬성 경화증 및 심혈관 질환 등 연령이 증가할수록 발병률이 증가되는 만성 질환에서도 근육 손실이 나타난다(Pharmacol Res. 2015, 99, 86).
근육 퇴행증 치료 전략은 염증성 분자 및 미오스타틴(myostatin)의 억제 또는 시클릭(cyclic) AMP, PGC(proliferator-activated receptor gamma coactivator)-1α 및 인슐린 신호 전달계의 활성화 등이 있다. 다수의 잠재적 약물들이 개발되었음에도 불구하고, 미국 식약청에서 승인된 근위축증 치료제로는 메게스테롤 아세테이트(megestrol acetate)가 유일하다. 근육퇴행증 치료 및 예방을 위한 약물들은 근육 단백질 이화작용(protein catabolism)을 저해하거나 또는 위성세포 기능(satellite cell functions)을 증진시키는 활성을 나타낸다.
근육에서는 동화작용과 이화작용이 균형을 이루며 근육 생성을 조절하는데, 이때 근육 세포 내에서는 이와 관련하여 여러 생체 신호전달 과정이 조절된다. 근육 단백질의 분해보다 합성을 유도하는 신호전달 반응이 활성화될 경우, 근육 단백질의 합성이 증가되어 근육 크기 증가(hypertrophy, 근비대)나 근섬유 수 증가(hyperplasia)를 유도하여 과도한 근육 생성을 초래한다.
근육 생성 유도 인자들은 근세포 내에서 PI3K(phosphatidylinositol-3 kinase)/ Akt 경로를 활성화시키고 그에 따라 하위 단계의 단백질을 인산화 함으로써 근육 단백질 합성을 유도한다.
근원세포의 분화와 근육 형성은 다양한 인자들에 의해 조절된다. 그 중, MyoD는 근원세포의 근육 분화와 관련된 특이적 유전자의 발현을 개시하여, 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)가 근원세포(myoblast)로 분화하는 것을 유도한다. MyoD에 의해 조절되는 미오게닌과 MHC(myosin heavy chain)은 근원세포의 융합(fusion)을 유도하여, 근관세포(myotube)와 근섬유가 형성되도록 한다. 이 같은 과정을 통해 형성된 근관세포 및 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다(5. Cell Mol Life Sci 2013, 70, 4117; 6. Brain Dev. 2013, 35, 349)
정상 조건 하에서 원시 줄기세포(primary stem cell)로서의 휴지상태의 위성세포(quiescent satellite cell)는 연속적으로 증식 및 분화를 진행한다. 손상된 근육은 근원세포로 지칭되는 근원성 위성세포(myogenic satellite cells) 증식을 활성화하는 다양한 성장인자를 분비한다. 활성화된 근원세포는 MyoD, Myf(myogenic
factor)-5, 미오게닌 및 Mrf-4과 같은 근원성 인자(myogenic factor)를 유도한다. MyoD는 근원세포 계열(myogenic lineage)에 특이적으로 발현되는 전사 인자로서, 근원세포 분화 개시에 중요한 역할을 수행한다.
특히, MyoD는 E 단백질, Mef-2 계열 단백질 및 전사 보조인자 등의 비근육성 특이 인자와의 결합을 통하여 MHC 및 미오게닌과 같은 근원성 단백질 발현을 유도한다.
본 발명의 목적은 근원세포에서 근관세포로의 분화를 촉진시키는 분화배지용 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 근육관련 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 근육관련 질환의 예방 및 개선할 수 있는 건강기능식품을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 근육관련 질환의 예방 및 개선할 수 있는 건강보조식품을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 근육관련 질환의 예방 및 개선할 수 있는 식품첨가제를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MYH2의 활성 증가를 확인하는 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 근원세포에서 근관세포로의 분화를 촉진시키는 분화배지용 조성물은 하기 [화학식 1]로 표시되는 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유할 수 있다;
[화학식 1]
상기 조성물은 인비트로(in vitro)로 상에서 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MYH2의 활성을 증가시킬 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 근육관련 질환을 위한 예방 및 치료용 약학 조성물은 상기 [화학식 1]로 표시되는 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 약학 조성물은 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MYH2 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 근육관련 질환은 긴장감퇴증(atony), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증 및 악액질(cachexia)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 근육질환일 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 근육관련 질환을 위한 예방 및 개선용 건강기능식품은 상기 [화학식 1]로 표시되는 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 티백제, 침출차, 또는 건강 음료 형태일 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 근육관련 질환을 위한 예방 및 개선용 건강보조식품은 상기 [화학식 1]로 표시되는 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 근육관련 질환을 위한 예방 및 개선용 식품첨가제는 상기 [화학식 1]로 표시되는 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MYH2의 활성 증가를 확인하는 방법은 상기 [화학식 1]로 표시되는 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용할 수 있다.
본 발명은 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유하여 근원세포에서 근관세포로의 분화를 촉진 또는 유도시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유하여 근육관련 질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물은 근육의 회복 및 운동이나 신경근육계의 질환에 의한 근육의 손상의 재생하기 위한 촉진제 또는 유도제로 사용될 수 있다.
도 1은 사비넨의 농도에 따라 근원세포의 분화를 정도를 촬영한 사진이다.
도 2는 사비넨의 농도에 따라 근원세포에서 근관세포로의 분화 정도를 촬영한 사진이다.
도 3은 사비넨의 농도에 따라 근원세포의 분화로 인한 근관세포로의 분화 마커인 MYH2의 발현 변화를 촬영한 사진이다.
도 4는 사비넨의 처리 유무에 따라 근관세포로의 분화 마커인 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MYH2의 발현을 나타낸 웨스턴 블롯이다.
도 2는 사비넨의 농도에 따라 근원세포에서 근관세포로의 분화 정도를 촬영한 사진이다.
도 3은 사비넨의 농도에 따라 근원세포의 분화로 인한 근관세포로의 분화 마커인 MYH2의 발현 변화를 촬영한 사진이다.
도 4는 사비넨의 처리 유무에 따라 근관세포로의 분화 마커인 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MYH2의 발현을 나타낸 웨스턴 블롯이다.
본 발명은 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유하는 근원세포에서 근관세포로의 분화를 촉진시키는 조성물에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 근원세포 분화 촉진용 및 유도용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인비트로(in vitro) 상에서 골격근세포 손상 후 일어나는 근원세포(Myoblast)의 근관세포(Myotube)로의 분화과정을 유도 또는 촉진을 위한 분화배지용 조성물로서의 사비넨(sabinene)의 용도에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 근원세포에서 근관세포로의 분화 촉진용 조성물 또는 근육관련 질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 조성물은 상기 [화학식 1]로 표시되는 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유한다.
상기 사비넨(sabinene)은 편백나무, 후추, 산국에센셜 오일 등의 성분 중 하나로서, 천식을 일으키는 병원균에 대한 항균효과가 알려져 있으며, 항산화와 항염, 피부재생 등에 대한 작용이 보고되어 있다. 그러나 근원세포의 분화에 미치는 영향에 대한 연구는 아직 없다.
본 발명에서는 상기 사비넨이 근원세포(myoblast)의 분화를 효과적으로 촉진하는 것을 확인하였으며, 이후 상기 근원세포의 근관세포로의 분화에 대한 효능을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 상기 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유하는 조성물은 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MYH2 발현을 증가시키는 효능을 확인하여 근육관련 질환의 예방, 개선 및 치료용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기 근육관련 질환은 긴장감퇴증(atony), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증 및 악액질(cachexia)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 근육질환을 들 수 있다.
본 발명의 사비넨(sabinene)은 광의로는 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 가공물, 예컨대 사비넨(sabinene) 분말도 포함하는 의미를 갖는다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 사비넨(sabinene)의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 사비넨(sabinene)은 10 내지 400 μM, 바람직하게는 100 내지 300 μM 의 농도로 사용된다. 사비넨(sabinene)은 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 사비넨(sabinene)의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사가 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 함유하여 근육관련 질환을 예방, 치료 또는 개선시킬 수 있는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류, 식품첨가제 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 사비넨(sabinene)을 포함하는 혼합물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 사비넨(sabinene) 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 포함하는 근육관련 질환의 예방, 치료 또는 개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 사비넨(sabinene)을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 사비넨(sabinene)의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 근육관련 질환의 예방, 치료 또는 개선용 의약 또는 식품의 제조를 위한 사비넨(sabinene)의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 사비넨(sabinene)은 근육관련 질환을 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 사비넨(sabinene)을 투여하는 것을 포함하는 근육관련 질환의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 엉겅퀴 및 양파를 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 사비넨(sabinene)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1.
화학식 1의 구조를 갖는 상용(Sigma-Aldrich)의 사비넨 시약을 구입하여 사용하였다.
<시험예>
근원세포(근아세포)의 근관세포로의 분화는 미오디(MyoD)의 발현이 선행되어야 진행되며, 미오디(MyoD) 단백질의 발현 증가는 근원세포에서 미오게닌(myogenin)을 과발현시킴으로써 분화의 속도를 촉진시킬 수 있다. 사비넨은 미오디(MyoD) 단백질의 발현을 증가시킴으로써 미오게닌(myogenin)의 발현을 유도하고 근원세포의 분화를 촉진하는 것을 광학현미경과 형광면역염색을 통해 확인하였다. 더불어 근원세포의 분화와 관련된 마커인 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 M2의 발현이 증가하는 것을 웨스턴 블롯법의 이용을 통해 증명하였다.
시험예 1. 근원세포의 분화(myoblast differentiation) 촉진 효과
24 well cell culture plate에 L6 rat myoblast 세포주를 1.5x10^5 cells/well 농도로 분주한 후, 70~80% confluency 확인한 다음 배양배지와 분화배지로 바꾸었다. 분화배지에는 사비넨(sabinene)을 농도별로 처리하여 8일 동안 분화시킨 후 광학현미경을 사용하여 사진을 쵤영하였다.
도 1은 사비넨의 농도에 따라 근원세포의 분화를 정도를 촬영한 사진이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 근원세포는 근관세포로 분화되는 것으로서 사비넨으로 처리 시 농도 의존적으로 근원세포에서 근관세포로의 분화가 촉진되는 것을 확인하였다(tube의 diameter가 증가함).
시험예 2. 근원세포의 분화 유도 효과
24 well culture plate에 L6 rat myoblast를 1.5x10^5 cells/well로 분주하여, 80~90% confluency 확인한 다음 배양배지에 사비넨을 농도별로 처리하여 8일간 배양 후 광학현미경으로 사진을 촬영하였다.
도 2는 사비넨의 농도에 따라 근원세포에서 근관세포로의 분화 정도를 촬영한 사진이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 사비넨 30 uM 이상부터 근원세포의 근관세포로의 분화가 유도되는 것을 확인하였다(농도별로 tube 형성이 증가함. tube의 길이와 면적으로 판단함).
시험예
3.
근관세포로의
분화
마커인
myh2
발현 변화를 이용하여
근원세포의 근관세포로의 분화 유도 효과확인
원형 커버글래스를 깔아둔 24 well culture plate에 1.5x10^5cells/well로 분주하여 80~90% confluency 확인한 후 배양배지에 사비넨을 농도별로 처리하여 8일간 배양하여 immunocytochemistry를 MYH2항체와 Alexa594 형광항체, DAPI를 이용하여 수행하고, 그 후 형광현미경을 이용하여 측정하였다. red: MYH2, Blue: DAPI
도 3은 사비넨의 농도에 따라 근원세포의 분화로 인한 근관세포로의 분화 마커인 MYH2의 발현 변화를 촬영한 사진이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 사비넨 30 uM 이상부터 근원세포의 분화가 활발해져 분화된 근관세포 마커인 MYH2(적색)의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다.
시험예 4. 근관세포로의 분화 마커인 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MYH2의 발현 변화를 이용하여 근원세포의
근관세포로의
분화 유도 효과확인
L6 rat myoblast 세포에 사비넨을 300μM 처리한 후, 3일과 6일에 샘플링을 하여 웨스턴 블롯을 MHY2, MyoD, myogenine을 사용하여 수행하였다.
도 4는 사비넨의 처리 유무에 따라 근관세포로의 분화 마커인 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MHY2의 발현을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 사비넨을 처리한 후 배양 6일경부터 근관세포로의 분화 마커인 미오디(MyoD), 미오게닌(myogenin) 및 MYH2의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
시험예 5. 세포독성실험
상기 실시예의 시료가 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 문헌에 기재된 MTT 어세이 법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
실험은 L6 세포에 대한 세포독성을 확인하기 위하여 L6 세포에 사비넨(sabinene)을 1, 10, 100 ng/mL 농도로 처리하고 MTT 어세이 법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 살아있는 세포는 미토콘드리아 기능이 잘 수행됨으로써 미토콘드리아의 환원효소(reductase)에 의해 수용성이며 노란색인 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide)가 불용성이며 보라색인 formazan 반응물로 전환될 수 있는데, 이러한 보라색 반응물의 고유 흡광도(560 nm)를 측정하여 그 값이 높을수록 살아있는 세포가 더 많다고 평가한다.
MTT 어세이를 위해 약 5 X 103의 근원세포(L6)를 96 웰 플레이트 각각 분주하여 24 시간 배양한 후, MTT 용액(0.5 mg/mL in 인산완충 생리식염수, Cat# M2128, Sigma) 100 ul를 가하고 37 ℃ CO2 배양기에서 3시간 방치한다. 배지를 제거하고 각 웰에 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 100 ul 넣고 5분 후, 마이크로 플레이트 리더기(GloMaxㄾMicroplate Multimode Reader, Promega)를 이용하여 560 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
사비넨(sabinene)에 대한 세포 생존율은 하기 [수학식 1]에 따라 측정하였으며, blank는 세포가 없이 DMSO만 넣은 웰의 흡광도이다.
[수학식 1]
세포 생존율(%)=100 X (추출물을 처리한 세포의 흡광도-blank)/(대조군의 흡광도-blank)
세포의 생존율이 감소할수록 시료의 독성이 증가한다고 볼 수 있는데, 상기 실험 결과, 사비넨(sabinene)을 각각 10, 30, 100 및 300 uM의 농도로 처리한 경우 세포 생존율이 각각 98.1%, 98.3%, 98.0% 및 98.1%로 측정된 것을 확인하였으며, 이에 따라 L6 세포에 대한 유의적인 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1에서 얻은 혼합 추출물 분말 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1에서 얻은 혼합 추출물 분말 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1에서 얻은 혼합 추출물 분말 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1에서 얻은 혼합 추출물 분말 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1에서 얻은 혼합 추출물 분말 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 혼합 추출물 분말 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 혼합 추출물 분말 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
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