KR102191314B1 - 감잎 유래 다당 분획물을 함유하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

감잎 유래 다당 분획물을 함유하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골 관련 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것으로 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유함으로써, 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있다.

Description

감잎 유래 다당 분획물을 함유하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for improving, preventing and treating bone-related disease comprising polysaccharide fraction isolated from persimmon leaf}
본 발명은 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유함으로써, 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
뼈(골, Bone)는 인체의 연한 조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸고 있어서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호하는 역할을 한다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱하며, 체내의 칼슘, 인 또는 마그네슘과 같은 다른 필수 무기질 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.
성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈를 제거하고 제거된 오래된 뼈 대신 새로운 뼈를 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적이며 지속적으로 반복재생 하면서 균형을 유지한다. 이를 골 재형성(Bone remodeling)이라고 하는데, 오래된 뼈를 제거하고 이를 새로운 뼈로 대체하는 뼈의 순환은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다. 상기 골의 재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있는데, 상기 두 종류의 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(Osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(Osteoclast)이다.
상기 조골세포는 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)과 이것의 유도 수용체인 오스테오프로테제린(Osteoprotegerin, OPG)을 생성한다. 상기 RANKL이 파골 전구세포 표면에 있는 수용체인 RANK에 결합하면 파골세포의 전구세포가 파골세포로 성숙화되어 골 흡수가 일어난다. 그러나, 오스테오프로테제린(OPG)이 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 골 흡수가 일어나지 않게 된다.
골 관련 질환의 대표적인 질환인 골다공증(Osteoporosis)은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 뼈의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 말한다. 낮은 골 질량(Mass) 상태로 정의되어 온 골다공증은 중요한 사회적 문제 중 하나로서, 미국의 경우 매년 약 26만 명의 여성들에게 유발되고 있으며 이중 약 12 내지 24% 정도는 사망에 이른다. 사회가 점점 더 노령화되고 여성들의 사회참여가 활발해 지고 있는 상황에서 노인들이나 폐경 후 여성들의 골다공증 및 골다공증으로 인한 골절은 심각한 문제를 야기한다.
낮은 골 밀도의 원인은 유전적 요인, 조기 폐경, 스테로이드 등의 약제, 동반 질환, 흡연 및 알코올 등이며, 골절의 원인은 낮은 골밀도, 저체중, 과거 골절력, 부모 또는 형제의 골절력, 흡연 및 알코올 등이다. 즉, 뼈를 구성하는 미네랄 (특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골 재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골 작용보다 증가된 상태에서 발생한다. 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 골 미세구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 질환이다.
상기 골다공증은 노년층에서 골 취약성(Fragility)의 증가 및 결과적인 골절 위험의 증가를 초래하는 골 조직의 마이크로 구조상(Micro architectural)의 퇴보를 특징으로 하는 질환이다. 이와 같이 골다공증은 50세 이상 여성의 50%와 50세 이상 남성의 30% 보다 많은 인원이 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 여성에게는 폐경기 직후 또는 그 후 몇 년 동안 골 손실의 속도가 가속화된다. 대부분은 증상이 없지만 골절이 발생하면 통증이 생기고, 골절이 발생한 부위에 따라 다양한 증상이 나타날 수 있다. 모든 부위에서 골절이 일어날 수 있지만, 특히 손목뼈, 척추, 고관절(대퇴골)에서 골절이 자주 발생한다. 또한, 연령에 상관없이 질병이나 약물, 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 이차 골다공증으로 분류 할 수 있다.
현재 골다공증의 치료 약제로 사용되고 있는 물질로는 전통적으로 폐경기 여성에게 많이 사용되는 여성호르몬 제제(Estrogen), 남성화 스테로이드 호르몬(Androgenic anagolic steroids), 비스포스포네이트(Bisphosphonate) 제제, 부갑상선호르몬, 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D3 등이 있다. 상기 여성호르몬은 골절 감소의 효과가 있지만 혈전증과 유방암의 위험을 높이기 때문에 주의해서 사용되어야 하며, 에스트로겐은 조골세포의 세포 사멸을 억제하여 세포의 생존 기간을 증가시키고 파골세포의 세포 사멸을 촉진하여 세포의 생존 기간을 감소시켜 폐경 증상의 치료와 골밀도 유지에 어느 정도 효과적인 방법이지만, 자궁내막 증식증 등을 유발하는 부작용이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(Selective estrogen receptor modulator, SERM)가 개발되었다. 이 계열의 약제로는 라록시펜(Raloxifene)이 있으며, 척추 골절 예방의 효과가 있을 뿐만 아니라 일부에서 유방암의 발생을 낮추었다는 보고가 있다. 또한, 상기 비스포스포네이트 제제는 가장 널리 사용되는 골다공증 치료제로서, 파골세포의 기능을 저하시키고 그 수를 줄여 뼈의 파괴를 막는다. 뿐만 아니라, 스트론튬(Strontium ranelate)은 먹는 골다공증 치료제로서 골 형성을 증가시키는 반면, 골 흡수가 억제되는 문제점이 있다.
따라서, 골 관련 질환의 예방, 개선 및 치료할 수 있으며 부작용이 없는 천연물질로 제조된 조성물이 요구되고 있다.
대한민국 등록특허 제1468015호 대한민국 등록특허 제1827326호
본 발명의 목적은 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선 또는 예방할 수 있는 식품 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 감잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid) 18 내지 39 중량%, DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid)로 이루어진 KDO 유사 물질 0.5 내지 10 중량%을 포함할 수 있다.
상기 감잎 유래 다당 분획물은 단백질 0.5 내지 20 중량%를 더 포함할 수 있다.
상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것이며; 상기 중성 다당은 아라비노오스, 람노오스, 갈락토오스, 푸코스, 글루코오스 및 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II 지표 다당류를 포함할 수 있다.
상기 다당 분획물은 (a) 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
상기 골 관련 질환은 골다공증, 골관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성관절염 및 치조골 파괴에 의한 치주질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 즉, 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 파골세포 유도인자인 RANKL을 억제시키고 관절파괴를 일으키는 파골세포로의 분화를 효과적으로 억제(파골세포 분화 초기 마커인 TRAP의 활성 억제)할 수 있기 때문에 상기와 같은 골 관련 질환, 특히 골다공증, 골관절염, 퇴행성관절염, 류마티스 관절염 등을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 소재로 사용될 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골 관련 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물은 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명의 골 관련 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물은 파골세포 분화를 억제하고, RANKL 처리에 의해 증가된 단백질 발현을 감소시킬 뿐만 아니라 골밀도(BMD), 총부피(TV), 뼈부피(BV), 뼈표면적(BS), 골표면적비(BS/TV), 골소주 평균두께(Tb.Th), 단위길이 당 평균 개수(Tb.N)가 향상된다.
또한, 본 발명의 골 관련 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물은 골 관련 질환 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의해 파골세포 분화를 억제하는 효과를 현미경을 관찰한 이미지이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의해 유도된 RANKL 신호전달계의 활성을 측정한 도면이다.
도 3a는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의한 c-Fos 및 NFATc1의 단백질 발현활성을 측정한 도면이며, 도 3b는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의한 c-Fos mRNA 발현을 수치로 나타낸 그래프이고, 도 3c는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의한 NFATc1 mRNA 발현을 수치로 나타낸 그래프이다.
도 4a는 1군 내지 6군으로 구분된 마우스의 대퇴골을 마이크로 컴퓨터단층촬영 시스템으로 촬영한 사진이며; 도 4b는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 골체적(BV/TV)을 나타낸 그래프이고; 도 4c는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 소주골 두께(Tb.Th)를 나타낸 그래프이며; 도 4d는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 소주골 개수(Tb.N)를 나타낸 그래프이고; 도 4e는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 골밀도(BMD)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 혈중 CTX를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유함으로써, 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 감잎 유래 다당 분획물의 원재료로 사용되는 감잎에는 비타민 C가 100 mg/100 g으로 함유되어 있는데 이는 비타민 C가 많다고 알려진 레몬의 약 20배 분량으로서, 괴혈병, 고혈압, 빈혈에 뚜렷한 효과가 있다고 알려져 있다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid) 18 내지 39 중량%, KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid) 유사 물질 0.5 내지 10 중량%를 포함한다. 또한, 단백질 0.5 내지 20 중량%를 더 포함할 수 있다.
상기 우론산은 갈락투론산(galacturonic acid) 및 글루쿠론산(glucuronic acid)으로 이루어지며; 상기 중성 다당은 아라비오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose), 푸코스(fucose), 글루코오스(glucose) 및 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II 지표 다당류를 포함한다.
바람직하게 상기 중성 다당은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 아라비노오스 20 내지 40 mole%, 람노오스 10 내지 40 mole%, 갈락토오스 10 내지 40 mole%, 푸코스 1 내지 10 mole%, 글루코오스 1 내지 10 mole% 및 람노갈락투로난-II 지표 다당류 0.4 내지 26 mole%인 다당을 포함한다.
더욱이, 상기 람노갈락투로난-II 지표 다당류는 상기 감잎 유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 2-메틸퓨코오스 0.1 내지 8 mole%, 2-메틸자일로스 0.1 내지 8 mole%, 아피오스 0.1 내지 5 mole%, 아세릭산 0.1 내지 5 mole%인 다당으로 구성된다.
또한, 상기 KDO 유사 물질은 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)로 이루어진 것이다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 (a) 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된다. 또한, (c) 상기 (b) 단계에서 회수된 분획물에서 분자량 5 내지 30 kDa의 분획물을 회수하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
먼저, 상기 (a)단계에서는 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리한다.
펙틴 가수분해 효소는 감잎 분말 중량 대비 1 내지 20 중량%로 첨가되며, 바람직하게는 5 내지 15%로 첨가되고, 더욱 바람직하게는 10 중량%로 첨가될 수 있다.
본 발명에서 감잎은 건조되지 않은 것 또는 건조된 것을 사용할 수 있으며, 분쇄된 것 또는 분말화된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게 효소를 처리하는 상기 감잎 분말은 증류수로 5배 내지 15배(w/v) 정도로 현탁하여 사용할 수 있다.
상기 가수분해 효소 처리는 1 내지 5일 동안 처리하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 2 내지 4일 일 수 있다.
상기 (a) 단계는 효소 처리 후에 잔존 펙틴 가수분해 효소를 90 내지 110 ℃에서 10 내지 60분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 공정을 추가로 수행할 수 있다. 상기 가열로 인해 가용성 다당 성분의 용출을 증가시키며, 일부 불순물로 포함되어 있는 고분자 단백질을 변성 및 침전시킴으로써 원심분리에 의한 다당 추출물 획득 및 순도를 증진시킨다.
또한, 상기 (a) 단계는 효소 처리 전에 감잎 분말을 탈색하는 공정을 포함할 수 있다. 탈색하기 위한 용매로는 인체에 무해하여 그 사용이 허가된 탈색 용매라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 에탄올, 아황산칼륨, 아황산나트륨, 이산화황 및 과산화벤조로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 들 수 있다.
다음으로, 상기 (b)단계에서는 상기 효소처리된 감잎에서 원심분리, 용매분획 또는 여과 등의 방법으로 잔사를 제거하여 다당 추출물을 수득한 후 이를 분자량 3 내지 300 kDa로 분획하여 분획물을 회수한다.
상기 분획물을 수득하는 방법은 분자량을 기준으로 정제하는 방법이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 한외여과, 용매분획 또는 겔 여과 크로마토그래피를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 한외여과를 들 수 있다. 또한, 최종 다당 분획물의 형태는 추출물, 농축물 또는 분말일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 상기 펙티나아제(Pectinase)로 처리하여 얻은 감잎 유래 분획물을 상기와 같은 방법을 이용하여 분자량 3 kDa 미만의 것과 분자량 300 kDa 초과된 것을 제거하여 감잎 유래 조다당 분획물(PLE-0)을 수득하였다.
상기 수득된 감잎 유래 조다당 분획물(PLE-0)의 구성당을 기체 크로마토그래피로 분석한 결과, 전체 다당 대비 중성 다당 71.3 중량%, 우론산 26.2 중량%, 단백질 0.7 중량%, KDO 유사 물질 1.8 중량%이며; 상기 중성 다당의 성분을 분석한 결과, 전체 중성 다당 대비 2-메틸퓨코오스 1.6 mole%, 람노오스 15.6 mole%, 퓨코오스 2.4 mole%, 2-메틸자일로오스 2.0 mole%, 아라비노오스 26.3 mole%, 자일로오스 6.7 mole%, 아피오스 4.5 mole%, 아세릭산 1.4 mole%, 만노오스 2.1 mole%, 갈락토오스 32.3 mole%, 글루코오스 5.1 mole%인 것을 확인하였다. 상기 중성 다당 중 2-메틸퓨코오스, 2-메틸자일로오스, 아피오스, 아세릭산은 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II(RG-II) 지표 물질이다([표 2] 참조). 또한, KDO 유사 물질인 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaricacid (DHA)도 RG-II의 지표 물질이다.
다음로, 상기 (c)단계에서는 상기 (b) 단계에서 회수된 분획물에서 분자량 5 내지 30 kDa의 분획물을 다시 회수한다.
즉, 상기 (b) 단계에서 회수된 감잎 유래 조다당 분획물(PLE-0)을 한외여과하여 분자량 5 내지 30 kD의 분획물을 다시 회수한다(PLE-II). 이때, 수득된 분획물(PLE-II)은 상기 (b)단계에서 수득된 감잎 유래 조다당 분획물(PLE-0)에 비하여 골 관련 질환에 대한 효능이 다소 떨어진다.
상기 회수된 분획물(PLE-II)의 구성당을 기체 크로마토그래피로 분석한 결과, 전체 다당 대비 중성 다당 69.5 중량%, 우론산 27.2 중량%, KDO 유사 물질 3.3 중량%이며; 중성 다당의 성분을 분석한 결과, 전체 중성 다당 대비 2-메틸퓨코오스 4.0 mole%, 람노오스 27.9 mole%, 퓨코오스 4.9 mole%, 2-메틸자일로오스 4.7 mole%, 아라비노오스 28.2 mole%, 아피오스 2.9 mole%, 아세릭산 3.5 mole%, 만노오스 0.4 mole%, 갈락토오스 19.6 mole%, 글루코오스 3.9 mole%인 것을 확인하였다. 상기 중성 다당 중 2-메틸퓨코오스, 2-메틸자일로오스, 아피오스, 아세릭산은 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II(RG-II) 지표 물질이다. 또한, KDO 유사 물질인 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaricacid (DHA)도 RG-II의 지표 물질이다.
펙틴물질(pectic substance)들은 고등식물의 1차 세포벽과 중엽(middle lamella)에 주로 존재하는 다당류로써 매우 복잡한 구조를 가지고 있다고 보고되어 있다. 상기 펙틴은 전체 분자의 많은 부분이 호모갈락투로난(homogalacturonan)으로 구성되어 있지만(Kwon MH et al., Food Sci. Ind.;30:30-43,1997), 여기에 다양한 올리고-(oligo-) 및 다당류(polysaccharide)로 분지된 람노갈락투로난(rhamnogalacturonan)-I(RG-I) 및 람노갈락투로난(rhamnogalacturonan)-II(RG-II)가 공유적으로 결합되어 있는 것으로 알려져 있다(Kim JM et al., Biochem. Bioph. Res. Co.;344:765-771,2006).
또한, 상기 최종 다당 분획물에 50~100%의 탄소수 1 내지 4의 알코올을 첨가하여 저분자 물질 및 불순물을 제거하는 다당 정제 단계를 추가할 수 있다.
본 명세서에서 감잎을 언급하면서 사용되는 용어 '분획물'은 추출용매를 처리하여 얻은 분획물뿐만 아니라 감잎 유래 다당 분획물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 감잎 유래 다당 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 광의로는 감잎을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 감잎 다당 가공물, 예컨대, 감잎 다당 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 감잎 유래 다당 분획물로 실험을 진행하긴 하였으나, 감잎 다당 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 감잎 유래 다당 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 감잎 유래 다당 분획물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 감잎 유래 다당 분획물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 감잎 유래 다당 분획물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 감잎 유래 다당 분획물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 감잎 유래 다당 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 감잎 유래 다당 분획물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 감잎 유래 다당 분획물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 감잎 유래 다당 분획물은 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 감잎 유래 다당 분획물을 투여하는 것을 포함하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 감잎 유래 다당 분획물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 감잎 유래 다당 분획물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 감잎 유래 조다당 분획물(PLE-0)
감잎(persimmon leaf)은 ㈜백장생에서 시판하는 감잎(감잎, 경북영천)을 분말화하여 사용하였다. 90% 에탄올을 건조분말 중량의 10배(w/v)가 되도록 건조분말에 첨가하여 48시간 동안 교반시키고, 여과 및 건조 과정을 거쳐 탈색을 완료하였다.
상기 탈색 건조분말을 증류수 10배(w/v), pH 4에 현탁하여 pectinase(Rapidase C80MAX, 비전비이오켐)를 원료당 10 중량%로 첨가한 후 50 ℃ 인큐베이터에서 3일간 효소 처리하였다. 그 후 상기 효소 처리 반응액을 101 ℃에서 30분간 가열처리하여 가용성 다당의 추출 및 잔존 pectinase를 불활성화시켰다.
상기 효소 처리를 마친 상기 시료를 4 ℃에서 6,500ㅧg로 15분 동안 원심분리를 수행하여 잔사를 제거하고, 한외여과로 여과시켜 분자량이 3 kDa 미만 및 300 kDa 초과인 미세한 물질들을 제거함으로써 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)을 얻었다.
비교예 1. 감잎 유래 조다당 분획물(PLW-0)_비효소처리(열수추출)
탈색한 감잎 건조분말은 상기 실시예 1의 것과 동일한 것을 사용하였다. 상기 탈색한 건조분말을 증류수(10배(w/v))에 현탁하여 100 ℃에서 3시간 동안 가열처리하여 열수 추출물을 수득하였다. 상기 열수 추출믈을 4 ℃에서 6,500ㅧg으로 15분 동안 원심분리한 후 상등액을 분리하여 상등액의 4배 부피(v/v)의 80% 에탄올을 가하여 24시간 동안 정치함으로써 다당을 침전시켰다. 상기 침전된 다당을 투석(분자량 cut-off : 6,000~8,000)시켜 열수추출 조다당 분획물(PLW-0)을 수득하였다.
<시험예>
시험예 1. 분획물의 구성당 분석
구성당 분석은 Albersheim 등의 방법을 일부 변형하여 가수분해후 각 구성당을 알디톨 아세테이트(alditol acetate)로 유도체화 하여 GC(Gas Chromatography)로 분석하였다. 실시예 1의 다당 시료를 2 M TFA(trifluoroacetic acid) 중에서 121 ℃로 1.5시간 동안 반응시켜 가수분해한 후, 그 가수분해물을 Dowex-1(acetate form)resin에 의해 중성당과 산성당으로 분리하였다. 1 mL의 1 M NH4OH(Ammoniasolution)에 용해하여 10 mg의 NaBH4로 4시간 환원시켰다. 아세트산을 적당량 가하여 잔존 NaBH4를 제거한 후 메탄올을 가하며 반복 건조함으로써 과량으로 가해진 아세트산을 제거함으로써 각 구성당에 상당하는 알디톨(alditol)로 전환하였다. 이 후 각각의 알디톨에 1 mL의 아세트산 무수물(acetic anhydride)을 가하여 121 ℃에서 30분 동안 반응시켜 알디톨 아세테이트(alditol acetate)로 전환시켰으며, 이를 클로로포름/H2O2상 용매계로 분리하여 추출하고, 상기 추출물은 건조 후 소량의 아세톤에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다.
알디톨 아세테이트(alditol acetate) 유도체의 GC분석 조건은 하기 [표 1]과 같으며, 각 구성당의 mole%는 각 유도체의 파크(peak)면적, 분자량 및 FID(Flame ionization detector)에 대한 molecular response factor를 각각 산출하여 계산하였다.
Apparatus GC ACME-6100(Young-Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)
Detector Flame ionization detector(FID)
(Young-Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)
Column SP-2380 capillary column (Supelco, Bellefonte, USA)
Column size 0.25 mm 30 m, 0.2 m film thicknes
Oven temp. 60 (1 min) 220 (12 min) 250 (15 min)
30 /min 8 /min
Injector temp. 250
Detector temp. 270
Carrier gas N2(1.5mL/min)
하기 [표 2]에서 KDO-liked material은 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaricacid(DHA)를 지칭하는 것이고; Uronic acid는 Galacturonic acid, Glucuronic acid를 지칭하는 것이다. 중성당을 구성하는 당들은 전체 중성 다당을 기준으로 성분의 함량을 표시한 것이다.
Chemical composition(단위: 중량%) 실시예 1(PLE-O) 비교예 1(PLW-O)
Neutral sugar 71.3 60.4
Uronic acid 26.2 38.3
Protein 0.7 0.0
KDO-liked material 1.8 1.3
Component of neutral sugar(단위: mole%)
2-Mefuc 1.6 0.3
Rha 15.6 7.1
Fuc 2.4 1.2
2-Mexyl 2.0 0.5
Ara 26.3 33.6
Xyl 6.7 5.7
Api 4.5 3.9
Aceric acid 1.4 2.5
Man 2.1 1.2
Gal 32.3 28.5
Glc 5.1 15.5
위 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)은 비교예 1의 열수추출 조다당 분획물(PLW-0)과 달리, 단백질을 함유하며, 중성 다당의 함량이 높은 것을 확인하였다.
시험예 2. 파골세포 실험
세포 배양
파골세포 분화에 대한 분획물의 효과를 알아보기 위하여, 골수세포 유래 대식세포를 수득하여 파골세포 전구세포로 사용하여 실시예 및 비교예에서 제조된 각 분획물의 처리 농도에 따른 파골세포 수와 TRAP 활성을 분석하였다. 마우스의 골수 세포를 대식세포증식자극인자(Macrophage Colony Stimulating Factor, M-CSF)(60 ng/㎖)와 10% FBS를 함유한 α-MEM 배지에 3일 동안 배양하여 골수세포 유래 대식세포(Bone Marrow Macrophage, BMM)를 수득하였으며, 이를 파골세포 전구세포로 사용하였다.
시험예 2-1. 파골세포 생존능 측정
상기 수득한 BMM을 M-CSF(60 ng/㎖)를 포함하는 배지에 2일 동안 실시예 및 비교예의 분획물을 다양한 농도(0, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖)로 첨가하여 배양하였다. 세포 계수 키트-8(Cell counting Kit-8, CCK-8, Dojindo Inc.)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율(Cell viability, %)을 확인하였고, 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타내었다.
구분 실시예 1(PLE-O) 비교예 1(PLW-O)
㎍/㎖ 0 100 100
1.56 110.6 101.5
3.125 105.1 103.0
6.25 111.8 105.6
12.5 112.6 108.1
25 116.4 104.4
50 120.7 103.9
100 115.7 102.1
200 107.2 100.8
위 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0) 및 비교예 1의 열수추출 조다당 분획물(PLW-0)은 모든 농도에서 세포 생존능이 우수한 것을 확인하였다.
시험예 2-2. 파골세포 분화에 대한 효과 분석
상기 수득한 BMM을 M-CSF(60 ng/㎖) 및 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)(100 ng/㎖)을 포함하는 배지에 4일 동안 배양하였고, 같은 배양조건에서 BMM에 실시예 및 비교예의 분확물을 다양한 농도(0, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖)로 처리하였다. 세포를 10% 포르말린으로 고정한 후 TRAP 효소활성 특이적 기질(q-나이트로페닐포스페이트, q-nitrophenyl phosphate)을 사용하여 10분간 반응시킨 후 405 nm 흡광도에서 측정하였다. 반응이 끝난 뒤 파골세포 염색을 위하여 나프톨 AS-MS 포스페이트 및 패스트 레드 바이올렛 LB 염(Fast red violet LB salt)을 이용하여 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 수행하고, 핵이 3개 이상인 TRAP 양성세포(TRAP+ Multi-Nuclei Cells (MNCs))를 계수하였다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타냈으며, 하기 [표 4]는 TRAP 활성을 나타낸 것이고, [표 5]는 다핵거대세포 형성을 나타낸 것이다.
구분 실시예 1(PLE-O) 비교예 1(PLW-O)
㎍/㎖ 0 1.23 1.23
1.56 0.47 1.20
3.125 0.24 1.11
6.25 0.08 1.05
12.5 0.03 0.71
25 0.02 0.75
50 0.01 0.62
위 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)은 비교예 1의 열수추출 조다당 분획물(PLW-0)에 비하여 파골세포 분화 초기 마커인 TRAP의 활성 억제 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
구분 실시예 1(PLE-O) 비교예 1(PLW-O)
㎍/㎖ 0 158.8 158.8
1.56 112.4 153.5
3.125 58.9 151.7
6.25 9.6 148.0
12.5 0 144.9
25 0 140.6
50 0 135.4
파골세포 분화의 최종단계를 확인할 수 있는 다핵거대세포 형성에 분획물이 미치는 영향을 확인한 결과, 위 표 5에 나타낸 바와 같이 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)은 비교예 1의 열수추출 조다당 분획물(PLW-0)에 비하여 억제능이 우수한 것을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의해 파골세포 분화를 억제하는 효과를 현미경을 관찰한 이미지이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)의 농도가 높을수록 파골세포 분화를 억제하는 효과가 우수한 것을 확인하였다.
시험예 2-3. RANKL 신호전달계의 효과 분석
실시예 1에 따라 제조된 분획물이 RANKL 신호전달계에 미치는 영향을 조사하기 위하여, RANKL 신호전달계의 효과를 분석하였다. 상기 BMM 세포를 담체(Vehicle)인 증류수(D.W.) 또는 실시예 1의 분획물 25 ㎍/㎖로 1시간 동안 전처리 후 RANKL(100 ng/㎖)로 0, 5, 15, 30, 60분 동안 처리하여 단백질을 얻은 다음 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 단백질의 활성화는 특정 아미노산의 인산화(Phosphorylation)에 선택적인 항체를 사용하여 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였다
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의해 유도된 RANKL 신호전달계의 활성을 측정한 도면이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의해 유도된 p38, ERK 및 JNK 단백질은 활성이 억제되는 것을 확인하였다.
시험예 2-4. 파골세포 분화의 핵심 전사인자 발현에의 효과 분석
파골세포 분화의 핵심 전사인자인 c-Fos 및 NFATc1 발현에 대한 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)의 효과를 확인하기 위하여, BMM 세포 배양에 담체(Vehicle)인 증류수 또는 실시예 1의 분획물 25 ㎍/㎖를 1시간 동안 전처리 후 RANKL(100 ng/㎖)를 처리하여 0, 1, 2, 3, 4일에 mRNA 및 단백질을 수득하였다. mRNA 발현은 Real-time PCR을 사용하여 그 결과를 18S RNA로 일반화한(normalozed) 2-△△CT 법으로 상대 정량하고 평균 ㅁ 표준편차로 나타내었고, 단백질 발현은 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였다.
도 3a는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의한 c-Fos 및 NFATc1의 단백질 발현활성을 측정한 도면이며, 도 3b는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의한 c-Fos mRNA 발현을 수치로 나타낸 그래프이고, 도 3c는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)에 의한 NFATc1 mRNA 발현을 수치로 나타낸 그래프이다.
도 3a에 도시된 바와 같이, BMM에서 RANKL 처리에 의한 c-Fos 및 NFATc1의 단백질 발현 증가는 실시예 1의 분획물에 의해 감소되는 것을 확인하였다.
또한, 도 3b 및 도 3c에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 분획물을 처리 시 대조군과 비교하면 c-Fos mRNA 발현이 1, 2, 3 및 4일에 각각 72.7%, 59.2%, 76% 및 30% 감소되었고, NFATc1 mRNA 발현의 경우 1, 2, 3, 및 4일에 각각 79.1%, 88%. 91.2% 및 78.4% 감소되는 것을 확인하였다.
시험예 3. 동물실험
실험동물
28 내지 30 g의 12주된 암컷 Crl:CD1(ICR) 마우스(Orient Bio Inc., Seoul, Korea)를 실험에 사용하였다. 실험 전 마우스는 7일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 동안 22±1 ℃ 온도 및 55±10% 습도가 조절된 사육실에서 자유식이로 사육하였으며, 명암 주기는 12시간 주기로 조절하였다. 그 후 sham-operate(Sham, n=10) 또는 난소 절제술(OVX, n=50)을 실시하였다. 동물실험은 한국한의학연구원 동물실험운영규정에 준하여 취급하였다.
상기 난소 절제(OVX) 마우스는 수술 일주일 후 각 10마리씩 나누고, 7주 동안 실시예 1 및 비교예 1의 분획물을 두 농도(0.10 g/kg 및 0.20 g/kg)로 경구 투여 하였다. 본 실험에서 사용된 양성 대조군으로는 B사에서 판매하고 있는 백수오 제품을 사용하였으며 1일 섭취량 기준으로 투여량을 결정하였다.
-8개 군의 마우스-
1군(Sham, 대조군): 분획물 대신 식수 투여
2군(OVX): OVX 후 분획물 대신 식수 투여
3군(P2L): OVX 후 백수오 0.25 g/kg 투여
4군(P2H): OVX 후 백수오 0.50 g/kg 투여
5군(PLE-O-L): OVX 후 효소처리 조다당 분획물(PLE-0) 0.10 g/kg 투여
6군(PLE-O-H): OVX 후 효소처리 조다당 분획물(PLE-0) 0.20 g/kg 투여
7군(PLW-O-L): OVX 후 열수추출 조다당 분획물(PLW-0) 0.10 g/kg 투여
8군(PLW-O-H): OVX 후 열수추출 조다당 분획물(PLW-0) 0.20 g/kg 투여
시험예 3-1. Mitro-computed tomography(Micro-CT) 분석
3D 골격 구조 분석을 위하여 마이크로 컴퓨터단층촬영 시스템(Quantum GX, PerkinElmer, USA)으로 촬영하였다. X-ray 촬영조건은 90 kV, 88 ㎂, 10 mm 시야각범위(복셀사이즈, 90 ㎛; 스캔타임, 14분)로 설정하였다. 컴퓨터단층촬영 3차원 이미지는 Quantum GX의 내장 소프트웨어인 3D Viewer로 최대 해상도 4.5 ㎛로 이미지화하였다. 마우스 소주골의 미세구조 분석은 Analyze 12.0 분석프로그램(AnalyzeDirect, Overland Park, KS, USA)을 이용하여 분석하였으며; 마우스 대퇴골의 골밀도는 hydroxyapatite(HA) 팬텀(QRM-MicroCT-HA, Quality Assurance in Radiology and Medicine GmbH, Germany)을 사용하여 측정하였다. 또한, 골밀도(BMD), 총부피(TV), 뼈부피(BV), 뼈표면적(BS), 골표면적비(BS/TV), 골소주 평균두께(Tb.Th), 단위길이 당 평균 개수(Tb.N) 등의 구조적 파라미터를 관심영역 안에서 측정하였다.
모든 실험결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었으며, 대퇴골에서 스캐너 영역은 초기의 해면상의 proximal tip으로부터 약 1.4 mm 확장한 말초 골간단에 한정하였으며, 그룹간 비교는 Duncan 분석으로 수행하였다.
도 4a는 1군 내지 6군으로 구분된 마우스의 대퇴골을 마이크로 컴퓨터단층촬영 시스템으로 촬영한 사진이며; 도 4b는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 골체적(BV/TV)을 나타낸 그래프이고; 도 4c는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 소주골 두께(Tb.Th)를 나타낸 그래프이며; 도 4d는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 소주골 개수(Tb.N)를 나타낸 그래프이고; 도 4e는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 골밀도(BMD)를 나타낸 그래프이다.
도 4a에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)을 저농도(PLE-0-L) 및 고농도(PLE-0-H)로 처리한 군은 마우스 대퇴골의 골밀도가 다른 군에 비하여 우수한 것을 확인하였다.
또한 도 4b 내지 4e에 도시된 바와 같이, Sham 군에 비하여 OVX군은 골 체적(percent bone volume, BV/TV)이 57.9% 감소, 소주골 두께(Trabecular Thinckness, Tb.Th)가 19.1% 감소, 소주골 개수(Trabecular number, Tb.N)가 48.2% 감소, 골밀도(bone mineral density, BMD)가 14.4% 감소한 것을 확인하였다.
이와 같이 난소적출 후 유발된 골 손실은 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)을 저농도(PLE-0-L) 및 고농도(PLE-0-H)로 처리 시 골 체적, 소주골 두께, 소주골 개수 및 골밀도에서 모두 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 골 체적의 경우에는 난소 적출 후 Sham 군 대비 57.9% 감소된 것이 저농도(PLE-0-L) 및 고농도(PLE-0-H)의 효소처리 조다당 분획물을 투여 시 각각 10.6%, 23.3% 수준까지 증가되었고; 소주골 개수의 경우에는 난소 적출 후 Sham 군 대비 48.2% 감소된 것이 저농도(PLE-0-L) 및 고농도(PLE-0-H)의 효소처리 조다당 분획물을 투여 시 각각 2.2% , 18.4% 수준까지 증가되었으며; 소주골 두께의 경우에는 난소 적출 후 Sham 군 대비 19.1% 감소된 것이 저농도(PLE-0-L) 및 고농도(PLE-0-H)의 효소처리 조다당 분획물을 투여 시 각각 9.4%, 5.9% 수준까지 증가된 것을 확인하였다.
또한, 난소적출 후 Sham 군 대비 14.4% 감소된 골밀도에 있어서도 효소처리 조다당 분획물을 경구 투여 시 저농도(PLE-0-L) 및 고농도(PLE-0-H)에서 모두 정상군인 sham 그룹과 유사한 수준의 골밀도를 유지할 수 있는 것을 확인하였다.
또한, 저농도(PLW-0-L) 및 고농도(PLW-0-H)의 열수추출 조다당 분획물은 모든 경우에서 난소 적출 후에 비하여 향상되지 못한 것을 확인하였다.
시험예 3-2. 혈중 골대사 마커 분석
골대사에 있어서 골 교체율을 대표할 수 있는 대표적인 혈중 지표로는 CTX와 PINP를 들 수 있다. 상기 CTX(carboxy terminal telopeptide)의 경우에는 파골세포에 의한 골 흡수 시 골을 구성하고 있는 단백질인 type 1 collagen이 분해되어 생성되는 것으로서 골 흡수 활성을 나타내는 혈중 지표로 활용할 수 있으며; 상기 PINP(procollagen type I N-terminal propeptide)는 골을 구성하고 있는 type 1 collagen의 전구 단백질인 type I procollagen의 아미노 말단 부위로서 골 형성 시 증가되어 골 형성 혈중 지표로 활용될 수 있다.
도 5는 1군 내지 8군으로 구분된 마우스 대퇴골의 혈중 CTX를 나타낸 그래프이다. 상기 1군 내지 8군의 시료투여에 따른 난소 절제(OVX) 마우스의 대퇴골에서 골손실에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 5에 도시된 바와 같이, Sham 군에 비하여 OVX군은 혈중 CTX의 농도가 38% 증가하는 것을 확인하였다. 이와 같이 난소적출 후 증가된 혈중 CTX의 농도가 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)의 경구 투여 시 모든 농도군에서 정상군인 sham군과 유사한 수준으로 감소되는 것을 확인하였다.
시험예 4. 복귀돌연변이 독성시험
상기 실시예 1에 따라 제조된 조다당 분획물(PLE-0)의 복귀돌연변이 시험에 의한 독성을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 Maron과 Ames(1983)이 제시한 방법을 일부 수정하여 실험하였다(Maron, D.M. and Ames B.N. (1983) Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutat. Res. 113: 173-215).
특정성분들에 대한 돌연변이 유발성 검색을 위해서 균주(Salmonella typhimurium) TA98, TA100, TA1535, TA1537 균주를 사용하였다. 시험물질의 처리는 대사활성 효소계(S-9 mix)가 적용 또는 미적용된 직접 플레이트 삽입(direct plate incorporation) 방법으로 하였다. 복귀돌연변이 시험에 사용한 Salmonella typhimurium TA98 균주는 Molecular Toxicology Inc.(USA)에서 구입하였다. 균주는 냉동 보관 되어있는 시험균주 용액 50 μL를 25 mL의 액체배지(2.5 % Oxoid Nutrient broth No. 2)에 접종해 진탕 배양기(shaking incubator, VS-8480SFN, (주) 비젼과학)를 이용하여 37 ℃에서 약 10 시간 배양한 후 사용하였다. 최소배지 (minimal glucose agar plate)는 1.5% Bacto agar(214010, BD Difco)와 Vogel-Bonner medium E 및 2% glucose를 함유해서 만들었고 톱 아가(top agar)는 0.6 % agar와 0.5 % NaCl로 조제하였으며, 톱 아가(top agar)에는 0.05 mM의 histidine(43011, Fluka)-biotin(47868, Supelco)을 첨가하였다.
고압증기 멸균한 톱 아가(top agar)를 건조 배쓰(dry bath, 11-718-4, Fisher Scientific)에서 45 ℃로 예열한 멸균 tube에 2 mL 씩 분주한 다음, 시험물질 용액 0.1 mL과 균배양액 0.1 mL을 톱 아가에 혼합하고 즉시 진탕 혼합기(vortex mixer, 37600, Thermolyne)로 2~3초간 진탕하여 최소배지(minimal glucose agar plate)에 부어 여러 방향으로 기울여 고루 퍼지게 하여 굳게 하였다. 부형제군(음성대조군)은 시험물질 용액 대신 부형제 0.1 mL을, 양성대조군은 양성대조물질 용액(2-Aminoanthracene (2AA), 규격 : Sigma A1381)을 같은 방법으로 가하여 실시하였다. 톱 아가가 굳은 후 플레이트 뚜껑을 닫은 상태에서 플레이트를 뒤집어 37 ℃에서 약 48 시간 배양 후 집락을 계수하였다.
균주 대사활성
효소계		 복귀돌연변이 균수/plate
0 g/plate 500 g/plate 1000 g/plate
TA98 -S9 19±1 14±2 23±4
+S9 19±2 16±3 15±5
TA100 -S9 86±9 108±13 93±10
+S9 78±11 84±6 92±3
TA1535 -S9 6±1 8±2 7±1
+S9 8±3 7±1 8±1
TA1537 -S9 2±2 3±1 5±1
+S9 8±3 7±1 6±2
위 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 조다당 분획물(PLE-0)은 본 시험 조건하에서 사용한 균주에 대해 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 확인되었다.
시험예 5. Chinese Hamster Lung(CHL) 세포를 이용한 체외 염색이상시험
상기 실시예 1에 따라 제조된 조다당 분획물(PLE-0)이 배양한 Chinese Hamster Lung(CHL) 세포의 염색체에 구조적 혹은 수적 이상을 유발하는지 확인하는 실험으로서, Chinese hamster lung (CHL) 세포를 이용하여 대사활성계 적용 및 비적용 하에 염색체이상시험을 수행하였다. 대사활성계로는 Aroclor-1254로 유도한 랫드의 간균질액에 보효소(cofactor)를 첨가한 것을 사용하였다.
시험물질은 생리식염 주사액에 현탁하여 처리하였다. 최고농도는 Relative Increased Cell Count(RICC)를 세포독성의 지표로 하여 결정하였다. 음성(부형제)대조군 및 양성대조군을 포함하여 다음 표와 같이 농도군을 설정하였으며, 농도군당 1 개의 플라스크를 사용하였다.
활발히 증식 중인 세포를 분리하여, 배양면적 25 cm2의 플라스크에 5 x 104 세포를 5 mL의 배양액에 파종하여 약 3 일간 배양한 후 시험물질을 처리하였다. 처리개시로부터 24 시간 후에 염색체 검체를 제작하여, 농도군당 150 개의 중기상으로부터 염색체이상을 계수하였다.
대사활성계 적용 6시간 처리
플라스크로부터 세포를 분리, 계수하여 얻은 세포 수로 다음 수식에 의해 Relative Increased Cell Count (RICC)를 산출하여 세포독성의 지표로 하였다.
[수학식 1]
Figure 112018102950662-pat00001
S9 농도
(g/mL)		 세포수 RICC(%) 이상중기상
(%)		 PP+ER(%)
+ 0 5063±88 100 0.00 0.00
400 4333±98 76 0.00 0.00
500 3968±27 64 0.00 0.00
550 4037±17 66 0.00 0.00
600 4007±42 65 0.00 0.00
700 4034±1 66 0.00 0.00
800 3334±29 43 0.00 0.00
Benzo[a]pyrene 3682±25 54 31.33 0.00
시험물질 500 μg/mL 이상 농도군에서 혼탁이 관찰되었다.
위 표 7에 나타낸 바와 같이, 구조적 이상중기상의 빈도(이하 gap 제외)는 음성대조군, 시험물질 400, 500, 550, 600, 700 및 800 μg/mL 순으로 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 및 0.00%로, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다. 수적이상을 가진 중기상의 빈도는 음성대조군 및 모든 시험물질 처리군에서 모두 0.00%로, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다.
양성대조군에서는 구조적 이상을 가진 중기상의 빈도(31.33%)에서 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다(P<0.01).
대사활성계 비적용 6시간 처리
S9 농도
(g/mL)		 세포수 RICC(%) 이상중기상
(%)		 PP+ER(%)
+ 0 8022±23 100 0.00 0.00
200 6254±33 70 0.00 0.00
250 5386±50 56 0.00 0.00
300 5054±13 50 0.67 0.00
330 4717±7 45 0.00 0.00
350 4947±124 49 0.00 0.00
400 4400±81 39 0.00 0.00
4-Nitroquinoline-1-oxide 0.4 5942±170 65 14.67 0.00
위 표 8에 나타낸 바와 같이, 구조적 이상중기상의 빈도는 음성대조군, 시험물질 200, 250, 300, 330, 350 및 400 μg/mL 순으로 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 0.67, 0.00 및 0.00% 로서, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다. 수적이상을 가진 중기상의 빈도는 음성대조군 및 모든 시험물질 처리군에서 모두 0.00%로서, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다.
양성대조군에서는 구조적 이상을 가진 중기상의 빈도(14.67%)에서 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다(P<0.01).
대사활성계 비적용 24시간 처리
S9 농도
(g/mL)		 세포수 RICC(%) 이상중기상
(%)		 PP+ER(%)
- 0 7105±8 100 0.67 0.00
50 5847±6 75 0.67 0.00
80 5282±70 64 0.00 0.00
100 4844±66 55 0.00 0.00
120 4494±94 48 0.00 0.00
130 4370±109 46 0.00 0.00
150 3999±8 39 0.00 0.00
4-Nitroquinoline-1-oxide 0.4 5829±30 75 12.00 0.00
위 표 9에 나타낸 바와 같이, 구조적 이상중기상의 빈도는 음성대조군, 시험물질 50, 80, 100, 120, 130 및 150 μg/mL 순으로 0.67, 0.67, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00 및 0.00% 로서, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다. 수적이상을 가진 중기상의 빈도는 음성대조군 및 모든 시험물질 처리군에서 모두 0.00%로서, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다.
양성대조군에서는 구조적 이상을 가진 중기상의 빈도(12.00%)에서 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다(P<0.01).
염색체이상을 계수한 결과, 처리 방법에 상관없이 모든 시험물질 처리군에서 염색체의 이상을 가진 중기상의 출현빈도가 음성대조군에 비해 증가하지 않았으며, 이 결과는 양성판정 기준을 만족시키지 못하였다.
따라서, 시험물질인 조다당 분획물(PLE-O)는 본 시험 조건 하에서 CHL 세포에 염색체이상을 유발하지 않는 것을 확인하였다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1에서 얻은 감잎 유래 조다당 분획물 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1에서 얻은 감잎 유래 조다당 분획물 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1에서 얻은 감잎 유래 조다당 분획물 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1에서 얻은 감잎 유래 조다당 분획물 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1에서 얻은 감잎 유래 조다당 분획물 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 감잎 유래 조다당 분획물 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 감잎 유래 조다당 분획물 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (13)

  1. 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 감잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid) 18 내지 39 중량%, DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid)를 포함하는 KDO 유사 물질 0.5 내지 10 중량%를 포함하고,
    상기 골 관련 질환은 골다공증, 골관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성관절염 및 치조골 파괴에 의한 치주질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 감잎 유래 다당 분획물은 단백질 0.5 내지 20 중량%를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 중성 다당은 아라비노오스, 람노오스, 갈락토오스, 푸코스, 글루코오스 및 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II 지표 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 다당 분획물은 (a) 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및
    (b) 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물로서,
    상기 감잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid) 18 내지 39 중량%, DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid)를 포함하는 KDO 유사 물질 0.5 내지 10 중량%를 포함하고,
    상기 골 관련 질환은 골다공증, 골관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성관절염 및 치조골 파괴에 의한 치주질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 감잎 유래 다당 분획물은 단백질 0.5 내지 20 중량%를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 중성 다당은 아라비노오스, 람노오스, 갈락토오스, 퓨코오스, 글루코오스 및 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II 지표 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  13. 삭제
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