KR101152479B1 - 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 또는 항암 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 또는 항암 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 탈지용 유기용매를 이용하여 탈지시킨 녹차씨를 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 또는 항암 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 탈지된 녹차씨 추출물은 항산화 활성이 우수하고, 염증생성 인자인 PEG2 및 TNF-a의 발현을 억제하는 효과가 우수하여 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있고, 동시에 암세포의 세포증식을 억제하고, 발암 물질의 대사에 관여하는 해독 효소들의 활성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 암 세포의 세포주기 이상을 초래하여 세포사멸을 유도함으로써 암을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있어 본 발명에 따른 조성물은 염증 질환 또는 암을 예방 및 치료할 수 있는 약제 및 건강기능식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 또는 항암 조성물 {Composition comprising defatted green tea seed extract for preventing and treating inflammatory or cancer disease}
본 발명은 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 또는 항암 조성물에 관한 것으로서, 탈지용 유기용매를 이용하여 탈지시킨 녹차씨의 물 또는 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 또는 항암 조성물에 관한 것이다.
염증(inflammation)은 외부 자극에 대한 생체조직의 방어반응 중 하나로서, 염증반응이 일어나면 여러 가지 염증 인자들(pro-inflammatory mediators)이 만들어지는데 이로 인하여 임상적으로는 발적, 발열, 종창, 동통, 기능장애 등의 증상이 나타난다. 특히, LPS(lipopolysaccharide), 염증유발인자 및 방사선조사 등의 유해한 자극은 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 및 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질을 과도하게 유도하여 염증질환과 조직이식거부반응, 자가면역질환, 당뇨병 등의 면역질환 및 신경세포의 사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다.
염증유발물질 중 하나인 NO는 정상상태에서는 내피세포나 대식세포에서 생산되며 세포살상과 살균작용 이외에도 다양한 생리활성을 나타내는데, 특히, 혈관 내피세포의 이완작용에 있어서 혈압의 항상성(homeostasis)을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LPS, 염증유발인자 및 방사선조사 등의 자극은 특히, 유도형 산화질소 합성효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthetase)의 발현을 유도하여 많은 양의 NO를 4 내지 6시간 동안 계속적으로 생성시키는데 이와 같이 생성된 과도한 양의 NO는 상기와 같은 질환들을 유발한다. 따라서 염증질환 치료제로서 iNOS 활성 억제제의 개발은 상기 질병의 치료제로서 개발 가능성이 높다고 할 수 있다.
다른 염증유발물질인 PGE2, PGF2a 및 PGI2와 같은 프로스타글란딘은 아라키돈산(arachidonic acid)에서 유래한 일종의 호르몬으로 다양한 생리활성에 관여하며 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase, COX)에 의해 발현이 조절된다. COX의 활성을 저해하여 프로스타글란딘의 합성을 저해하는 아스피린 인도메타신 같은 비스테로이드성 소염진통제는 관절염에 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
이 외에도 TNF-α는 BCG, LPS 및 염증유발인자에 의해 활성화된 대식세포와 섬유아세포 등에서 생산되어 세포사멸작용, 프로스타글란딘 및 IL-1, IL-6와 같은 사이토카인(cytokine)의 생산을 유도한다. 종양괴사인자로 발견된 TNF-α는 류마티스 관절염, 장기이식거부반응 등의 자가면역질환, 천식, 아토피성피부염 등의 알러지성 염증질환 및 패혈증, 급성간질환 등의 급성면역질환 등에 대한 관련성이 보고되면서 TNF-α의 합성을 억제하는 화합물에 대한 개발 연구가 활발하게 진행되고 있다. 또한, 최근의 보고에 의하면, TNF-α 수용체의 유전자가 손상된 쥐는 LPS에 의한 치사독성에 저항성이 있으며 TNF-α의 항체를 투여한 쥐는 관절염이나 LPS의 독성을 예방하는 효과가 있다는 사실이 알려진 바 있다(Beutler B., Science, 229:869, 1985; Pfeffer K et al., Cell, 73;457, 1993).
한편, 이러한 염증 질환을 치료할 수 있는 기존의 항염증제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증제로 구분되며, 이중 대부분의 합성 항염증제는 체내에 부작영을 수반하는 경우가 있어, 염증 치료의 효과가 탁월하며 부작용이 없는 천연추출물 유래의 새로운 항염증제의 개발이 필요한 실정이다.
종양은 자율적인 과잉 증식을 나타내는 세포의 집합으로서, 죽음에 이르게 할 가능성이 있는 악성종양과 그렇지 않은 양성종양으로 구별된다. 특히, 암은 발암유전자(oncogene) 및 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)와 같은 유전자에 변이(mutation)가 일어나서 발생하는 유전적 질환이며, 세포 차원에 원인이 있는 질환이다. 암 유전자 산물(oncogene product)들은 세포에서 서로 네트워크(network)를 이루어 세포의 분열이나 분화의 신호전달 체계를 조절하는 역할을 수행하고 있다. 즉, 이들의 조절이 비정상적이 되면 세포의 분화과정이 단절되고 무한정 분열을 계속하게 되는데, 이러한 잘못된 신호 전달 경로(signal transduction pathway)를 정상적으로 환원시켜 줄 수 있다면 부작용이 적은 탁월한 치료효과를 얻을 수 있을 것으로 기대되고 있다.
현재까지 암을 치료하는 주된 치료법으로는 외과적 치료법, 약물요법 및 방사선요법이 있는데, 현실적으로는 이들 단독으로 치료를 수행할 경우, 치료 효과가 미비한 문제점이 있어 최근에는 이들을 레이저요법 등과 조합한 집학적(集學的)요법이 널리 행해지고 있다. 그러나 이러한 치료법 역시 치료비용이 고가이며, 체내에 대한 부작용이 높다는 단점이 있다.
따라서 부작용이 없으며 저렴하게 약제 원료를 사용할 수 있는 새로운 항암제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 최근 건강에 대한 관심으로 녹차의 선호현상이 두드러져 소비가 증가함에 따라 녹차의 수요가 많아 녹차나무(Camellia sinensis L.)의 재배가 급속히 늘어나면서 녹차씨앗의 생산량도 증가하고 있다.
특히, 녹차씨앗은 천식과 뇌명, 만성 위장약, 산후회복, 수술 후의 빠른 상처 치유 등 문헌상에 민간요법이나 한방 치료에 대한 여러 약리학적 효과들이 나타나 있으며, 수량이 많고 기름이 풍부하여 중국 등지에서는 일부 식용으로 이용되고 있다(나효환, 백순옥, 한상빈, 복진영. 1992. 녹차 종자의 일반성분 J. Korean Agric Chem Soc, 35(4):272~275) 있다. 또한, 녹차씨앗에는 사포닌 및 페놀 등 각종 생리활성 성분들이 풍부하게 함유되어 있어 각종 의약 용도로 이용하려는 노력들이 대두되고 있다(Romos S. 2007. Effects of dietary flavonoids on apoptotic pathways related to cancer chemoprevention. J Nutr Biochem 18:427-442., Russo GL. 2007. Ins and outs of dietary phytochemicals in cancer chemoprevention. Biochem Pharm 74:533-544., Vissers MN, Zock PL, Katan MB. 2004. Bioavailability and antioxidant effects of olive oil phenols in humans: a review. Eur J Clin Nutr 58 955-965).
그러나 아직까지 녹차씨앗의 산업적 유용성을 보다 증대시키기 위해 녹차씨앗으로부터 추출물을 수득과정에서 항염 활성 및 항암 활성을 최대화할 수 이 있는 녹차씨앗의 분획추출물에 대한 내용은 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 녹차씨로부터 생리활성 성분이 함유된 추출물을 수득하는 과정에서 탈치 처리된 녹차씨로부터 수득한 용매분획 추출물이 우수한 항염활성 및 항암활성을 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 염증 질환 또는 암 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 또는 항암 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 또는 암질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 또는 항암 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탈지는 녹차씨 분말 100g을 기준으로 n-헥산을 1500~2500ml 첨가하여 22~26시간 동안 상온에서 탈지시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 탈지된 녹차씨 분말에 물 또는 유기용매를 첨가하여 가용 추출한 용매추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항염은 위염, 대장염, 관절염, 신장염 및 간염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암은 간암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 직장암 및 췌장암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 암 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 % 중량으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 또는 암질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 탈지된 녹차씨 추출물은 항산화 활성이 우수하고, 염증생성 인자인 PEG2 및 TNF-a의 발현을 억제하는 효과가 우수하여 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있고, 동시에 암세포의 세포증식을 억제하고, 발암 물질의 대사에 관여하는 해독 효소들의 활성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 암 세포의 세포주기 이상을 초래하여 세포사멸을 유도함으로써 암을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있어 본 발명에 따른 조성물은 염증 질환 또는 암을 예방 및 치료할 수 있는 약제 및 건강기능식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 각 용매별 분획추출물을 수득하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 각 용매별 분획추출물을 간암세포주인 HepG2 세포에 처리한 후 세포생존율을 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 각 용매별 분획추출물을 간암세포주인 HepG2 세포에 농도별로 처리한 후 QR(quinone reductase)활성을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 각 용매별 분획추출물을 간암세포주인 HepG2 세포에 농도별로 처리한 후 세포내에서 발현되는 CYP1A1 및 CYP1A2의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 수행한 결과 사진 및 그래프로 각각 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 석유에테르 추출분획물을 간암세포주인 HepG2 세포에 농도별로 처리한 후 세포내에서 발현되는 HO-1의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 수행한 결과 사진 및 그래프로 각각 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 에탄올 추출분획, 석유에테르 추출분획 및 에틸아세테이트 추출분획을 HepG2 세포에 농도별로 처리한 후 ARE의 활성 정도를 루시퍼라제 분석을 통해 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 탈지된 녹차씨의 에틸아세테이트 추출분획(7a) 및 열수추출물(7b)을 HepG2 세포에 농도별로 처리한 후 세포주기에 미치는 영향을 유세포분석기를 사용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 각 용매별 분획추출물을 간암세포주인 HepG2 세포에 농도별로 처리한 후 세포내에서 발현되는 염증전사인자인 TNF-a의 발현량을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과사진 및 그래프를 나타낸 것이다.
본 발명은 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 또는 항암 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
녹차는 천연기능성 물질 중 항산화능이 우수한 물질로 알려지면서 최근 관심의 대상이 되고 있는 식품 중의 하나이다. 녹차에는 폴리페놀성 화합물인 카테킨을 비롯한 다수의 성분이 함유되어 있으며, 여러 가지 약리작용이 뛰어나고 특히 항산화성이 우수하여 생체 내외의 스트레스에 의해 발생되는 유리기를 제거하는 기능이 있다고 알려져 있다(Kim MJ, et al, Nutrition Research, 22, pp733-744, 2002; Rhee SJ, et al, Kor. J. Gerontol., 8, pp49-55, 1998).
또한, 녹차의 항산화 작용에 대한 연구로는 나카야마(Nakayama)의 연구(Nakayama T., University of Shizuoka, Japan, 7, pp1991-1993, 1994)에서 카테킨의 폴리페놀 구조들이 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)에 의한 세포독성(cytotoxicity)을 억제하는 효과가 있다고 하였고, 지질 과산화 초기단계에서 단일종 산소(singlet oxygen)와 유리기 제거 역할로 플라보노이드가 효과적이라고 보고한 바 있으며, 그 외에도 성인병예방이나 후천성 면역결핍증 바이러스의 생육억제, 충치억제, 콜레스테롤 억제작용 등의 생리활성 효과가 뛰어난 것으로 알려진 바 있다.
한편, 이러한 녹차는 약리적 효능 및 기호성이 매우 우수함에도 불구하고 녹차잎을 직접 말려서 용기 또는 티백(Tea Bag)에 담아 파는 것 외에는 다양한 제품들은 개발되지 않고 있으며, 특히 녹차씨의 경우, 인체에 유익한 성분이 다량 함유되어 있음에도 상품화 되지 못하고 버려지는 실정이 대부분이며, 최근에야 녹차씨에 존재하는 기름성분인 녹차씨유가 생리활성 성분을 가지고 있다는 사실이 밝혀지면서 이를 식품에 응용하려는 시도들이 늘어나고 있다.
이에 본 발명에서는 녹차 식물의 구성 중에서 녹차씨 부분으로부터 항암 및 항염 활성이 매우 우수한 추출물을 수득하기 위해, 대부분 버려지는 탈지된 녹차씨를 다시 물 또는 용매로 처리하여 이로부터 항암 및 항염 활성을 갖는 추출분획을 수득하였다.
따라서 본 발명은 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 또는 항암 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 녹차씨는 시중에서 판매되고 있는 녹차씨라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 녹차씨의 외껍질과 속껍질을 제거하고, 세척한 다음, (45)~(55)℃의 온도에서 2일~4일간 건조시킨 후, 분쇄하여 분말화한 것을 사용할 수 있다.
또한, 상기 탈지는 당업계에 공지된 녹차씨로부터 지방을 제거하는 방법이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 탈지용 유기용매를 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 녹차씨 분말에 n-헥산 용매를 첨가하여 탈지시킬 수 있으며, 이때 상기 n-헥산 용매의 첨가량은 녹차씨 분말 100g을 기준으로 n-헥산을 1500~2500ml 첨가하여 22~26시간 동안 상온에서 탈지시킬 수 있다.
이후 상기 탈지된 녹차씨 분말은 물 또는 유기용매를 첨가하여 녹차씨 추출물을 수득할 수 있는데, 상기 물 또는 유기용매의 첨가는 녹차씨 분말 중량의 약 5 내지 15배, 바람직하게는 약 8 내지 12배의 양으로 첨가할 수 있다.
또한, 상기 물 또는 유기용매를 첨가하여 탈지된 녹차씨 분말로부터 추출물을 수득하는 방법은 당업계에 공지된 추출법인 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 75~105℃의 온도에서 2~6시간 동안 열수추출 또는 환류냉각 추출방법을 이용하여 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출한 후 감압농축하여 수득할 수 있다.
상기 유기용매로는 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 탈지된 녹차씨 분말에 10배의 증류수를 가해 100℃의 온도에서 4시간 동안 열수 추출하여 녹차씨 추출물을 수득하였으며, 또한, 탈지된 녹차씨 분말에 10배의 에탄올을 가해 80℃의 온도에서 4시간 동안 환류 추출한 다음 감압여과 하여 에탄올 추출물을 수득하였고, 이후 상기 에탄올 추출물에 증류수와 석유에테르를 가해 물층과 석유 에테르층을 각각 분획화 한 다음, 다시 상기 물층에 에틸아세테이트를 가해 물층과 에틸아세테이트층으로 분획화한 후, 다시 상기 물층에 부탄올을 가해 물층과 부탄올층으로 분확회하였다. 이때 각 단계별 용매처리에 의한 분획화는 2번씩 반복 수행하였고, 상기 일실시예에 따른 탈지된 녹차씨의 각 분획물 제조과정은 도 1에 나타내었다.
한편, 상기와 같이 본 발명에 따라 탈지 처리된 녹차씨 분말로부터 물 및 용매처리에 의해 수득한 녹차씨 추출물은 항산화 활성을 갖는 특징이 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 본 발명의 방법에 의해 수득한 녹차씨 추출물에 함유된 총 페놀의 함량 및 트롤록스(trolox)의 당량을 측정한 결과, 열수추출물, 에탄올 분획물, 석유에테르 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 모두 항산화능이 있는 것으로 나타났고, 특히 에탄올 분획물 및 열수추출물이 항산화능은 가장 우수한 것으로 나타났으며, 총 페놀 함량의 경우, 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 것으로 나타났다(표 3 및 표 4 참조).
따라서 상기 결과에 따라 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 분말의 추출물은 산화적 스트레스로 인한 질환, 예컨대, 노화, 고혈압, 동맥경화, 중풍, 지방간, 간경변, 당뇨병, 백내장 등의 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 분말의 추출물은 항염 활성이 우수한 특징이 있다.
염증은 앞서 기술한 바와 같이 LPS(lipopolysaccharide), 염증유발인자 및 방사선조사 등의 유해한 자극이 인체 면역체계를 과도하게 항진시킬 경우, 대식세포와 같은 면역세포에서 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 및 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질을 과도하게 유도하여 염증질환이 유발되는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명에서 제조한 탈지된 녹차씨 분말의 추출물이 항염 활성이 있는지를 조사하기 위해, 본 발명의 일실시예에서 탈지된 녹차씨 추출의 처리에 따른 염증 생성 사이토카인인 PGE2 및 염증전사인자인 TNF-α의 발현 양상을 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 그 결과, PGE2 및 TNF-α은 탈지된 녹차씨의 각 용매 추출물(열수추출물, 에탄올 분획물, 석유에테르 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물)의 처리에 따라 그 발현양이 감소되는 것으로 나타났고, 농도 의존적으로 발현양이 감소되는 것으로 나타났다(표 6 및 도 8 참조).
따라서 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출물은 염증유발 인자들의 발현을 억제하는 특징이 있으므로 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 염증 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 위염, 대장염, 관절염, 신장염 및 간염을 포함할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 분말의 추출물은 항암 활성이 우수한 특징이 있다.
일반적으로 암은 발암물질에 의해 DNA에 돌연변이가 유도되는 단계, 양성 종양(benign tumor)이 나타나는 단계, 양성종양이 악성종양(malignant tumor)으로 변환되는 단계 및 악성 정도의 증가와 전이로의 단계와 같이 다단계에 의해 진행되는 것으로 알려져 있으며, 이러한 암의 치료는 암세포의 세포증식을 억제하거나 또는 암세포의 세포사멸을 유도하는 방법들이 사용되고 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명에서 제조한 탈지된 녹차씨 분말의 추출물이 암세포의 세포증식을 억제하는 활성이 있는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 수득한 각 용매별 탈지된 녹차씨의 추출물을 간암 세포주에 처리한 다음, MTT 분석을 통해 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과, 각 분획물 모두 간암 세포의 세포증식을 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났으며, 특히, 부탄올 분획물이 가장 적은 농도에서 가장 높은 암 세포증식 억제활성이 있는 것으로 나타났다(표 5 및 도 2 참조).
한편, 체내에서 발암물질의 대사에 관여하는 효소계는 크게 제1상 효소계와 제2상 효소계로 나누어지며, 제1상 효소계로는 arylhydrocarbon hydroxylase와 사이토크롬 P450 부류가 있으며, 제2상 효소계에는 QR, HO-1, glutathione S-transferase (GST), UDP-glucuronyltransferase 등이 있다(Agrawal V, Huang N, Miller WL. 2008, Pharmacogenetics and Genomics. 18:569-576, Allanson M, Reeve VE. 2004. J Invest Dermatol 122:1030-1036, Androutsopoulos VP, Tsatsakis AM, Spandidos DA. BMC Cancer. 9: 187-204., Hart SN, Zhong XB. 2008, Expert Opin . drug Metab . Toxicol . 4:439-452). 이중, 제2상 효소계의 유도반응은 체외 이물질을 무독화시킴으로써 생체에 중요한 방어기전으로 작용하며, 제2상 효소계의 작용기작은 반응성이 강한 발암성분이 세포내 분자들과 반응하는 것을 억제하는 것인데, 이러한 세포 수준에서의 방어는 HO-1, QR 등의 제2상 해독효소(phase 2 detoxifying enzymes)와 항산화 효소의 활성화에 의해 가능하며, 특히 QR은 제2상 효소계의 지표효소로서 항종양 효소계 활성인자의 탐색에 널리 사용되고 있다(Farombi EO, Surh YJ. 2006, J. Biochem . Mol . Biol. 39:479-491., Fresco P, Borges F, Diniz C, Margues MPM. 2006, Med Res Rev 26:747-766., Greten FR, Eckmann L, Gereten TF et al. 2004, Cell 118:285-296., Moon JY. 2004, The Korean Journal of Meridian & Acupoint 21:139-145).
이에 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명에서 제조한 탈지된 녹차씨의 추출물이 해독 독소계, 즉, 제1상 효소계인 CYP1A1 및 CYP1A2와 제2상 효소계인 HO-1, ARE 및 QR의 활성에 미치는 영향을 조사하였는데, 그 결과, 탈지된 녹차씨의 추출물의 각 용매 추출분획물은 제1상 효소계 중 특히 CYP1A2의 발현을 증가시키는 것으로 나타났고(도 5 참조), HO-1, ARE 및 QR의 활성도 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다(도 3 및 도 6 참조).
상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 추출물이 암 세포의 세포증식을 억제함과 동시에 해독 독소계의 활성 촉진을 통해 항암 활성을 갖는 사실을 확인하였고, 나아가 상기 본 발명의 추출물이 암 세포의 세포주기에도 영향을 미치는지를 조사하였는데, 이는 일반적으로 세포증식과 관련된 세포주기의 조절은 각 주기별 관여하는 다양한 유전자들에 의해 조절되는 것으로 알려져 있으며, 세포주기 조절의 관점에서 암세포는 세포주기의 비정상화에 기인된 질병으로 정의될 수 있다.
따라서 특정시기의 세포주기 억제는 세포주기 조절 양성인자의 발현 저하 또는 음성조절인자의 과발현에 의해 유도될 수 있으며, 특히 암세포에서의 세포주기 억제는 암세포의 세포사멸 초래를 유발할 수 있다(Sherr CJ. 2000. The Pezcoller lecture: cancer cell cycles revisited. Cancer Res 60: 3689-3695)).
이에 본 발명의 일실시예에서는 간암 세포주를 대상으로 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 각 용매추출 분획물을 처리하고, 간암 세포의 세포주기 변화를 조사하였는데, 그 결과, 추출 분획물의 처리 농도가 증가할 수도록 세포주기에서 DNA의 복제시기를 결정하고 G2기의 세포분열 시기를 준비하는 G1 단계를 연장시켜 세포주기의 이상을 초래하는 것으로 나타났으며(도 7a 및 7b 참조), 특히 에틸아세트 추출분획과 열수추출물이 세포주기의 G1 단계를 매우 효과적으로 연장시킬 수 있는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 각 추출분획물이 암 세포의 세포주기 이상을 초래하여 세포사멸을 유발시키는 과정을 통해 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 또는 항암 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명의 조성물은 염증질환 또는 암의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 탈지된 녹차씨 추출물을 0.1 내지 50 % 중량으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 예방 또는 치료할 수 있는 상기 암의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 간암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 직장암 및 췌장암을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항염 또는 항암 조성물은 약학적으로 유효한 양의 탈지된 녹차씨 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 염증질환 또는 암 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 염증질환 또는 암 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 항염 또는 항암 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 항염 또는 항암 조성물은 염증질환 또는 암 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 염증질환 또는 암 증상의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 항염 또는 항암 조성물은 우수한 항산화 효과, 항염효과 및 항암 효과를 통해 염증질환 및 암 증상을 완화시키는 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 본 발명에서 사용한 추출물의 원료가 되는 녹차는 식품 등급으로 사용할 수 있는 천연식물이므로, 상기 본 발명의 조성물은 체내에 대해 매우 안정한 특징이 있다.
따라서 본 발명의 항염 또는 항암 조성물은 염증질환 또는 암 증상의 예방 및 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물은 염증질환 또는 암 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명의 조성물은 염증질환 또는 암 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 항염 또는 항암 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 염증질환 또는 암 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 항염 또는 항암 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 또는 암질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 참조예 1>
하기 본 발명의 실시예에서 사용한 세포배양 조건, 시약 및 통계처리 방법은 다음에 기재된 바와 같이 수행하였다.
세포배양 및 시약
HepG2 세포를 ATCC(American Type Culture Collection)사에서 구입하여 사용하였고, 10% FBS(Fetal bovine serum) 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle media) 배지에서 배양하였고, 계대 배양은 3 내지 4일에 한 번씩 수행하였으며,)배지에 배양하였으며, 세포배양은 CO2 배양기에서 37℃, 5% CO2의 조건하에서 수행하였다.
통계처리
본 발명의 실시예에서 수행한 실험들의 분석결과는 평균± 표준오차(S.E)로 표시하였고, 유의성은 SPSS/PC+ 패키지(pachage)의 원-웨이 아노바(one-way ANOVA)를 이용하여 던칸즈 멀티플 테스트(Duncan's multiple test)로 분석하였다.
< 실시예 1>
탈지된 녹차씨 추출물의 제조
<1-1> 탈지된 녹차씨 분말의 제조
녹차씨는 일송제다(Korea)로부터 구입하여 사용하였으며, 외껍질과 속껍질을 각각 제거한 다음, 깨끗하게 세척하고 50℃의 온도에서 3일간 열풍 건조하여 40 메쉬로 분말화한 후, 녹차씨 분말 100g에 2000mL의 n-헥산(n-hexane)을 가하여 24시간 동안 탈지시킨 다음, 감압여과기(Whatmann No. 1)를 이용하여 여과시키고, n-헥산으로 1회 세척하고 재여과시켰다. 이후, 48시간 동안 자연 건조시켜 회수율 86.49%의 탈지된 녹차씨 분말을 수득하였다.
<1-2> 탈지된 녹차씨의 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 제조
상기 <1-1>에서 제조된 탈지된 녹차씨 분말에 대해 상기 분말의 10배의 증류수를 각각 가해 100℃에서 4시간 동안 환류추출을 수행한 후, 원심분리(1,500 rpm, 15분)한 다음, 감압 여과하여 동결 건조하여 탈지된 녹차씨의 열수 추출물을 수득하였다. 또한, 에탄올 추출물은 탈지된 녹차씨 분말의 10배에 해당하는 에탄올을 각각 가해 80℃에서 4시간 동안 환류 추출하여 감압여과한 후 증발건조기를 사용하여 건조하여 수득하였다. 이때 상기 과정을 통해 탈지된 녹차씨의 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 회수율은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
탈지된 녹차씨의 에탄올추출물과 열수추출물의 회수율
DGTS
Hot water 35.84%
Ethanol 19.94%
DGTS; defatted green tea seed
<1-3> 탈지된 녹차씨의 분획추출물의 제조 탈지된 녹차씨의 분획추출물은 다음과 같은 방법으로 제조하였는데, 즉, 상기 <1-2>에서 제조한 에탄올 추출물(EtOH) 10g을 증류수 500 mL을 가해 용해시킨 후 석유에테르(PE) 500 mL을 가하여 혼합한 후 PE층인 상층액을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였고(PE 분획), 남은 물층에 에틸아세테이트(EtOAC) 500 mL을 가하여 혼합한 후 상층액인 에틸아세테이트 층을 회수하였으며 이와 같은 방법으로 2회 반복수행하여 에틸아세테이트 분획을 추출하였다. 이후, 다시 남은 물층에 부탄올(BuOH) 500 mL을 가하여 혼합한 후 상층액인 부탄올 층을 회수하였고, 이와 같은 방법으로 2회 반복 수행하여 부탄올 층을 추출하였다. 상기 과정과 같이 탈지된 녹차씨의 에탄올 추출물로부터 탈지된 녹차씨의 분획추출물을 제조하는 과정은 도 1에 나타내었다. 또한, 최종 물 분획은 동결 건조하였고, 나머지 모든 분획층은 증발기를 사용하여 건조시켜 이를 다음의 실험을 위한 시료로 사용하였으며, 각각 분획층의 수율은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
탈지된 녹차씨 추출물의 회수량
DGTS
Ethanol extract 10.0g
PE 0.115g
EtOAC 0.144g
BuOH 4.059g
H2O 4.952g
DGTS; defatted green tea seed
< 실시예 2>
탈지된 녹차씨 추출물의 항산화능 분석
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출물의 항산화 활성을 상기 추출물의 총 페놀 함량 및 트롤록스(trolox) 당량을 측정하여 확인하였는데, 즉, 실시예 <1-3>에서 분획화한 각 시료의 총 페놀 함량을 Folin-Dennis법(AOAC. 1985. Official method of analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 16th ed. Chemists, Washington D. C.)으로 측정하였으며, 이를 위해 각 추출물 200μL에 50% Folin-Ciocalteu 시약 1 mL과 7.5% Na2CO3 용액 800 μL을 가한 후 암소에서 45분간 방치하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 표준물질로는 갈릭산을 사용하였다.
또한, 총 항산화능의 측정은 상기 <1-2> 및 <1-3>의 추출물 및 분획물을 대상으로하여 trolox equivalent antioxidant capacity(TAEC)로 Erel의 방법(Erel C et al. 2004, A novel automated method to measure total antioxidant response against potent free radical reaction. Clinical Biochem 37, 112-119.)을 사용하여 2,2‘-azino-bis-(3-ethybenzthiazoline -6-sulfonic acid (ABTS, Sigma) radical cation decolorization 분석을 통해 조사하였다. 이후, 7mM ABTS 용액을 제조하고 TAEC는 2.45 mM potassium persulfate를 혼합한 후 암소에서 16 시간 방치하여 ABTS+ 스탁용액을 제조하였다. 이후, 상기 ABTS+ 스탁용액을 PBS 용액(5 mM, pH 7.4)으로 희석한 다음, 734 nm에서 흡광도가 0.70이 되도록 조정하여 50μL의 각 시료를 첨가한 후 혼합하여 30 ℃에서 정확히 1분과 6분 후에 흡광도를 측정하였으며 표준물질로는 trolox를 농도별로 조제하여 사용하였다. 각 시료의 총 항산화능은 trolox equivalent로 표시하였다. 또한, 통계분석은 SPSS 수프트웨어를 사용하였으며 모든 결과는 mean± SE로 표시하였고, ANOVA 와 Duncan's multiple range test로 군 간에 유의성을 p <0.05에서 검정하였다.
그 결과, 탈지된 녹차씨 추출물의 항산화능은 하기 표 3에 기재된 바와 같이, 각 추출분획은 항산화능을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 그 중에서도 열수추출물(HW)이 항산화능이 가장 높은 것으로 나타났고, 이어 에탄올 분획 및 부탄올 분획이 그 다음으로 높은 항산화능을 보였으며, 반면, 석유에테르층의 경우는 가장 낮은 항산화능을 나타내었다.
또한, 각 추출물 100 mg 당 총 페놀의 함량을 측정한 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 총 페놀 에틸아세테이트 분획이 3.197± 0.195 mg으로 가장 높은 것으로 나타났고, 반면, 석유에테르층에서 0.250± 0.043 mg으로 가장 낮은 수준을 보였다.
탈지된 녹차씨 추출물의 총항산화능 (Trolox equivalent(mM))
Extract DGTS
EtOH 4.74
PE 1.26
EtOAC 3.65
BuOH 4.53
H2O 3.68
HW(열수추출) 4.92
GTS; defatted green tea seed
총 페놀 함량(gallic acid)
DGTS
(mg/100 mg extracts)
EtOH 1.315±0.009d
PE 0.250±0.043e
EtOAC 3.197±0.195a
BuOH 2.132±0.011c
H2O 0.903±0.041d
HW(열수추출) 2.669±0.031b
GTS; defatted green tea seed
< 실시예 3>
탈지된 녹차씨 추출물의 항암 활성 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분획화한 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출분획물에 대해 항암 활성이 있는지를 조사하기 위해 HepG2 세포를 대상으로 암세포 증식 억제효과, 해독효소계 활성에 미치는 영향 및 세포 주기활성에 미치는 영향을 각각 분석하였다. 상기와 같은 분석을 위해 HepG2를 세포배양한 조건 및 시료의 처리는 다음과 같은 방법으로 처리하였다. 먼저 HepG2 세포는 DMEM(10% FBS)배지에 배양하였으며, 세포배양은 CO2 배양기에서 37℃, 5% CO2의 조건하에서 수행하였다. 탈지된 녹차씨 추출물의 시료처리는 에탄올 추출분획물의 경우, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/mL, 석유에테르 추출분획물의 경우, 50, 100, 150, 200 ㎍/mL, 에틸아세테이트 추출분획물의 경우, 10, 20, 30, 40, 50 ㎍/mL, 부탄올 추출분획물의 경우, 1, 2.5, 5, 7.5, 10 ㎍/mL, 물 분획물의 경우, 25, 50, 100 ㎍/mL, 열수 추출물의 경우, 20, 30, 40, 50 ㎍/mL 되도록 각각 세포에 처리한 다음, 48시간 배양하여 최종 농도를 세포독성으로 확인하였다. 최종 농도는 에탄올 추출물 2.5, 5, 10, 20 ㎍/mL, 석유에테르 추출물 50, 100, 150 ㎍/mL, 에틸아세테이트 추출물 10, 20, 30 ㎍/mL, 부탄올 추출물 1, 2.5, 5 ㎍/mL, 물 추출물 25, 50, 100 ㎍/mL, 열수추출물은 20, 30, 40, 50 ㎍/mL으로 결정하였다.
<3-1> 암세포 증식 억제 효과
본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출분획물의 항암 활성은 암세포 증식 억제 효과를 측정함으로써 분석하였는데, 즉, MTT 어세이를 통해 세포의 증식정도에 각 추출분획이 미치는 영향을 조사하였다. 상기 MTT 어세이는 HepG2 세포를 96 웰 플레이트에 5× 103 세포/웰(200 μL)로 분주한 다음, 24 시간 동안 전배양하고, 상기 기술된 바와 같이 탈지된 녹차씨 추출분획들을 각 농도별로 투여한 다음, 48시간 후, 세포의 생존율을 측정하였고, 그 결과는 하기 표 5 및 도 2에 나타낸 바와 같다.
HepG2 세포계에서 탈지된 녹차씨 추출물의 세포독성 IC50 값(μg)
EtOH PE EtOAC BuOH H2O HW
IC50 value 6.58 120.77 18.29 3.54 44.37 25.02
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 탈지된 녹차씨 추출분획이 간암세포인 HepG2 세포의 세포증식을 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났으며, 녹차씨 추출물의 간암세포 억제능의 IC50 값은 상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 부탄올 층이 3.54 μg으로 가장 낮은 값을 보였고, 그 다음이 에탄올층(6.58 μg), 에틸아세테이트층(18.29 μg), 열수추출물(25.02μg), 물분획층(44.37 μg) 및 석유에테르층(120.77 μg)의 순으로 나타났다.
<3-2> 해독독소계 활성 측정
본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출물의 열수추출물 및 각 용매추출분획에 대한 해독독소계 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해, NADPH(quinone reductase: QR) 활성 분석, 웨스턴 블럿 및 리포터 유전자 활성 분석을 수행하였다.
먼저, NADPH(quinone reductase: QR) 활성 분석은 Benson 등(Benson AM, Hunkeler MJ, Talalay P. 1980. Increase of NAD(P)H:quinone reductase by dietary antioxidants: possible role in protection against carcinogenesis and toxicity. Proc Natl Acad Sci USA 77: 5216-5220.)의 방법에 따라 수행하였는데, 즉, 1× 106개의 HepG2 세포를 세포배양 디쉬(φ100 mm)에 분주하여 24시간 전 배양한 후, α-MEM (10% FBS)을 제거하고 새로운 배지에 본 발명에 따른 녹차씨 추출분획을 첨가하여 48시간 배양하였다. 배지를 제거한 다음, 차가운 PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)로 2회 수세하고 0.25M 스크로스로 수집하였다. 수집한 세포들은 초음파 세포 분해기(50W, Kontes, Vineland, NJ, USA)로 균질화한 다음, 마이크로 원심분리기로 (VS-15000CFN11, Vision, Seoul, Korea)로 원심분리(10,500× g, 15분)하여 상등액을 얻었다. 세포 상등액 200 μL에 250 mM tris-HCl(pH 7.4), 70 mg bovine serum albumin, 0.1 % Tween 20, 500 uM FAD, 2 mM NADH를 첨가한 다음, 기질인 2,6-dichlorophenolindophenol(DCPIP)가 단백질 ㎎당 1분 동안 산화되는 정도를 600 nm에서 측정하였다. 단백질 정량은 브래드 포드 방법으로 수행하였다. 또한 본 발명에서 사용한 상기 QR 활성은 어떤 물질의 제2상효소계의 지표효소로서 항종양효소계 활성인자의 탐색에 널리 사용되고 있다.
또한, 상기 웨스턴 블럿은 앞서 기술한 바와 같이 다양한 농도의 추출분획을 처리한 HepG2 세포를 수집한 다음, Bredford 방법에 따라 단백질을 정량한 다음, 30 ㎍의 단백질을 SDS-PAGE로 전기영동 한 다음, PVDF 막(polyvinylidene fluoride; pore size 0.45 ㎛, Millipore)으로 단백질들을 이동시킨 후, 상기 PVDF 막을 5% non-fat dry milk를 함유한 TBS/T(Tris buffered saline-Tween; 200 mM Tris, 1.37 M NaCl, pH 7.6, 0.1 % Tween 20)으로 비특이적 단백질을 차단하기 위하여 하룻밤 반응시켰다. 이후, CYP1A1, CYP1A2, HO-1에 대한 항체와 3 시간 반응시킨 후, 각 항체에 대한 이차항체인 anti-rabbit IgG 또는 anti-goat IgG에 2시간 반응시켰다. 각 반응사이 TBS/T로 10분씩 3회 세척하였고, 마지막 세척이 끝나면 각 항체에 대한 대응 단백질 밴드를 Supersignal west pico chemiluminescent substrate(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 발현시켰으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
또한, 상기 리포터 유전자 활성 분석은, ARE-루시퍼라제 분석을 통해 수행하였는데, 이를 위해 먼저 플레이트(φ60mm)당 1× 105 HepG2 세포/60 mm 디쉬로 분주한 다음, 24시간 상기 세포들을 전 배양시키고, 본 발명에 따른 에탄올 추출분획물 2.5, 5, 10, 20 ㎍/mL, 석유에테르 추출분획물 50, 100, 150 ㎍/mL, 에틸아세테이트 추출분획물 10, 20, 30 ㎍/mL, 부탄올 추출분획물 1, 2.5, 5 ㎍/mL, 물 추출분획물 25, 50, 100 ㎍/mL 및 열수 추출물은 20, 30, 40, 50 ㎍/mL 되도록 각각 처리한 다음, 48시간 배양한 후 세포를 수집하여 루시퍼라제 활성을 프로메가 E4030방법에 따라 측정하였다. 즉, 수집한 시료를 루미노미터(Perkin Elmer Victor2 1420)를 이용하여 분석하였으며, 분석한 시료의 효소 활성은 Bredford 방법에 따라 단백질 함량을 정량하여 특이적 활성값으로 보정하였고, 결과는 도 5에 나타내었다.
상기와 같은 실험수행 결과, HepG2 세포에서의 탈지된 녹차씨 추출물의 QR 활성은 도 3에 나타낸 바와 같이, 에탄올 층의 경우, 20 μg 농도로 처리시 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 부탄올 층의 경우에는 2.5 μg 이상 처리시 대조군에 비해 유의적으로 증가한 것으로 나타난 반면 석유에테르층과 에틸아세테이트 증에서는 대조군에 비해 처리 농도 증가시 다소 증가하는 경향을 보였으나 현저한 차이는 보이지 않았다. 또한, 물추출 분획과 열수 추출물은 고농도에서는 오히려 감소하는 것으로 나타나 탈지된 녹차씨의 각 분획추출물 중에 에탄올 층과 부탄올 층의 경우, QR 활성이 가장 우수한 것으로 나타났다.
또한, 웨스턴 블럿을 통한 CYP1A1과 CYP1A2 단백질 발현 측정결과는 도 4에 나타낸 바와 같이, 탈지된 녹차씨의 각 추출분획물 중, 부탄올 층은 CYP1A1의 유전자 발현을 증가시키는 것으로 나타난 반면, 다른 분획에서는 감소시키는 것으로 나타났고, CYP1A2의 발현은 모든 분획 추출물에서 발현이 증가되는 것으로 나타났으며, 특히 에탄올 층과 부탄올 층에서는 농도 의존적으로 발현양이 증가되는 것으로 나타났다. 나아가 석유에테르 층은 HO-1의 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 5 참조).
또한, 리포터 분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 에탄올 추출분획층과 석유에테르층 및 에틸아세테이트층의 경우, ARE의 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다.
<3-3> 세포주기에 미치는 영향 분석
녹차씨 분획 추출물의 처리에 의한 HepG2 간암세포의 성장인자가 세포주기의 특정시기의 교란과 연관성은 가지는지의 여부를 조사하기 위해 세포주기 분포에 미치는 녹차씨 분획 추출물의 영향을 조사하였다. 세포주기 조사는 propidium iodide(PI) 염색법을 이용하여 수행했는데, 수집한 세포에 PBS 100μL와 에탄올 200μL를 첨가한 다음, 4℃, 1시간 동안 세포를 고정시켰다. 이후 PBS로 2회 세척한 다음, 50 ㎍/mL RNaseA (1.12% sodium citrate buffer) 250 μL를 첨가하여 37℃에서 30 분간 반응시키고, 50 ㎍/mL PI (1.12% sodium citrate buffer) 250μL를 첨가하여 다시 37℃에서 30분간 어두운 곳에서 반응시킨 다음, 유속세포 분석기(Becton Dickinson, FACS Calibur, NJ, USA)로 세포주기별 비율을 분석하였다.
그 결과, 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 탈지된 녹차씨 추출물의 에틸아세테이트 층과 열수 추출물은 처리 농도가 증가할수록 세포주기의 sub G1이 연장되는 것으로 나타났다. 일반적으로 세포주기 가운데 G1 phase는 주로 DNA 복제 시기를 결정하는 단계로 이후 G2기에서 세포분열을 준비하고 분열시작의 시간을 결정하며, 세포주기 내 G1 특히 sub G1은 세포가 생존하는데 결정적인 역할을 하며, 궁극적으로 세포주기의 이상을 초래하여 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨 추출분획물들은 간암세포의 세포주기 중 특히 sub G1의 시기를 연장시켜 암세포의 세포사멸을 유도하여 항암활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
탈지된 녹차씨 추출물의 항염증 활성 분석
상기 실시예 3을 통해 탈지된 녹차씨 추출물이 항암 활성이 있다는 사실을 규명하였고, 나아가 본 발명자들은 상기 탈지된 녹차씨 추출물이 항염증 효과가 있는지를 확인하기 위해 염증 관련 단백질인 PGE2(염증생성 사이토카인) 및 염증전사인자인 TNF-a의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 분석하였다.
이를 위해, 먼저, 상기 실시예 3에서 각 농도별 추출분획이 처리된 간암 세포주인 HepG2 세포로부터 총 단백질을 분리하였는데 이때 상기 분리 과정은 PROPREPTM Protein Extract Solution (iNtRON Biotechnology) 방법에 의해 수행하였다. 즉, 100 mm 디쉬(5× 106 cells/dish)의 세포 배양 플레이트로부터 배양액을 제거하고 미리 준비해 둔 차가운 PBS(pH 7.4)로 2번 세척한 후, 1 mL 차가운 PBS(pH 7.4)를 넣어 세포를 수집하였다. 이후, 이를 4℃에서 원심분리(12,000 rpm, 20초)하여 상층을 제거하고, 세포 용해를 위해 400 μL proprep을 넣고 -20℃에서 20분간 배양시킨 후 4℃에서 원심분리 (12,000 rpm, 5분) 하여 세포 추출 상등액(total protein)을 수득하였다. 상기 수득한 단백질은 정량하거나 또는 분석을 위해 -20℃에 보관하였다.
또한 웨스턴 블럿은 상기 수득한 세포 추출 상등액을 Bradford법 으로 정량 후 단백질 농도를 결정한 다음, 30 ㎍의 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 다음, nitrocellulose막으로 이동시켰다. 이후 상기 막은 TBST[10mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl, 0.05% Tween 20]으로 세척한 한, 2시간 동안 5% 블록킹 용액(5% BSA, 5% nonfat dried milk in TBST)으로 블록킹 한 후, 염증 관련 단백질의 발현을 결정하기 위한 일차 항체(rabbit anti-mouse iNOS antibody, polyclonal rabbit COX-2 antibody, Cell Signaling, Phospho-IκBα rabbit mAb, Cell Signaling, Phospho-p65 rabbit mAb, Cell Signaling, polyclonal Actin antibody, Santa Cruz Biotechnology)를 각각 1:1,000으로 밤새도록 반응시킨 후, TBST로 3번 헹군 후 alkaline phosphatase로 결합된 goat anti-mouse immunoglobulin G (IgG) 이차 항체를 1:2,000으로 희석하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium color development 기질(Promega)로 발색시키거나 X-ray 필름(Amersham HyperfilmTM ECL)에 20X LumiGLO (R) 시약 및 20X Peroxide (Cell Signaling)로 발광시켜 현상하였다. 또한, 통계분석은 SPSS software를 사용하였으며 모든 결과는 mean± SE로 표시하였고 one-way ANOVA test로 유의성을 p<0.05에서 검정하였으며, 결과는 하기 표 6 및 도 8에 나타내었다.
녹차씨 추출분획물이 처리된 HepG2 세포에서의 PGE2의 발현 수준 측정결과
μg/mL PGE2 (pg/mL)
EtOH
0 38.9±0.01) a2 )
2.5 -214.1±34.0bc
5 -154.6±13.5b
10 -248.6±29.5c
20 -180.6±23.5bc
PE
0 38.9±0.0a
50 -150.1±0.0b
100 -206.1±58.0b
150 -212.1±55.0b
EtOAC
0 38.9±0.0a
10 -152.6±49.5b
20 -131.1±0.0b
30 -128.1±48.0b
BuOH
0 38.9±0.0a
1 -165.1±0.0b
2.5 -196.1±10.0b
5 -203.6±31.5b
H2O
0 38.9±0.0a
25 -185.1±28.0bc
50 -256.6±63.5c
100 -51.1±33.0ab
HW
0 38.9±0.0a
20 -220.1±47.0b
30 -212.1±15.0b
40 -351.1±0.0c
1)mean±SE 2) p<0.05 수준에서 ANOVA와 Duncan's multiple test
그 결과, 상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 간암세포인 HepG2 세포에서 본 발명에 따른 탈지된 녹차씨의 각 추출분획물과 열수추출물은 세포내에서 PGE2의 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, 염증전사 인자인 TNF-α의 발현 또한 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 8 참조).
나아가 본 발명의 추출물을 포함하는 약학 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 하는 것이다.
< 제제예 1> 산제의 제조
탈지된 녹차씨 추출물 300 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
< 제제예 2> 정제의 제조
탈지된 녹차씨 추출물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
< 제제예 3> 캅셀제의 제조
탈지된 녹차씨 추출물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
< 제제예 4> 주사제의 제조
탈지된 녹차씨 추출물 50 mg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
< 제제예 5> 액제의 제조
탈지된 녹차씨 추출물 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
< 제제예 6> 건강식품의 제조
탈지된 녹차씨 추출물 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산 제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
< 제제예 7> 건강음료의 제조
탈지된 녹차씨 추출물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 탈지된 녹차씨 추출물은
    녹차씨 분말에 n-헥산을 첨가하여 녹차씨 분말을 탈지하고,
    상기 탈지된 녹차씨 분말에 에탄올을 가하여 에탄올 추출물을 수득한 다음, 상기 에탄올 추출물에 증류수를 가해 용해시킨 후 석유에테르(PE), 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 가하여 추출시킨 분획물 중 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항암은 간암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 직장암 및 췌장암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 암 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는항암 조성물.
  7. 삭제
  8. 탈지된 녹차씨 추출물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 탈지된 녹차씨 추출물은
    녹차씨 분말에 n-헥산을 첨가하여 녹차씨 분말을 탈지하고,
    상기 탈지된 녹차씨 분말에 에탄올을 가하여 에탄올 추출물을 수득한 다음, 상기 에탄올 추출물에 증류수를 가해 용해시킨 후 석유에테르(PE), 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 가하여 추출시킨 분획물 중 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 암질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 것을 특징으로 하는 암질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
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KR102185006B1 (ko) 엉겅퀴, 도라지 및 더덕이 포함된 혼합물을 함유하는 천식 및 혈관질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
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