KR20190060676A - 나노입자 제조방법 - Google Patents

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정동기
지라 미타
박양호
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달톤비알엠 주식회사
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Abstract

본 발명은 나노입자의 제조방법과 이에 따라 제조되는 나노입자 및 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 어떠한 독성 물질 및 계면활성제도 첨가하지 않으면서 단순화시킨 공정으로 하나 이상의 식물 추출물을 함유하는 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이에 따라 제조된 나노입자, 및 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

나노입자 제조방법{METHOD FOR PREPARING NANOPARTICLES}
본 발명은 나노입자의 제조방법과 이에 따라 제조되는 나노입자 및 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 어떠한 독성 물질 및 계면활성제도 첨가하지 않으면서 단순화시킨 공정으로 하나 이상의 식물 추출물을 함유하는 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이에 따라 제조된 나노입자, 및 나노입자를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물에 관한 것이다.
종래의 항암 화학요법이 가져오는 부작용을 피하기 위하여, 하나 또는 둘 이상의 식물 추출물을 이용하는 항암 치료제들이 다수 보고되고 있다. 그러나, 식물 추출물은 인체에 무해하다는 측면에서 대체의학으로 각광받고 있을지라도 용해성이 극히 낮아 경구 투여가 제한되거나, 또는 약물 전달능이 떨어져 원하는 표적 부위을 타겟하는 것이 어렵거나, 원하는 효과를 얻기 위하여 고용량을 사용해야 하거나, 또는 저장 안정성이 보장되지 않는다는 등 다양한 문제점들을 갖고 있다.
이에, 당업계에서는 이러한 문제점들을 해결하기 위하여 다양한 노력이 행해지고 있으며, 그 중 하나는 나노입자화와 같은 나노 기술의 적용이다. 나노입자의 크기 및 표면 전하는 입자의 부착(adhesion) 및 세포와의 상호작용에 영향을 미치며, 이는 궁극적으로 나노입자의 세포 흡수 경로 및 효율이 달라지게 한다. 또한, 나노입자의 형태는 나노입자의 제조방법, 나노입자 제조시 사용되는 유도화제 및 안정화제 등과의 상호작용에 의존하는데, 이는 타겟 수용체에 대한 결합능, 마크로파지에 의한 포획 회피능 등에 영향을 미친다.
이와 같은 나노입자를 제조하는 방법에 관한 선행기술의 예는 공개특허공보 제10-2009-0112444호(2009.10.28)이며, 이는 브로콜리 나노입자를 함유하는 식용 가능 조성물을 제공하기 위한 발명이다. 그러나, 이러한 선행기술에는 식용 가능한 레시틴 유상을 CH2Cl2 또는 클로로포름에 소량 녹여 건조시킨 후, 상기 유상에 브로콜리 수용성 추출물을 교반한 후 초음파 분산기로 분산시키는 단계를 포함하는데, 식물 추출물 이외의 성분 또는 물 이외의 용매가 사용됨에 따라 입자 응집 현상이 일어나 나노입자가 생성되지 않거나 또는 나노입자가 균질하게 생성되지 않는다는 등의 한계점을 나타낸다.
따라서, 나노입자를 제조하는 방법에 있어서 공정 조건을 최적화시켜 우수한 성질을 갖는 나노입자를 수득하는 것은 당 업계에서 매우 중요한 관심사로 대두되고 있다.
공개특허공보 제10-2009-0112444호 (2009.10.28)
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결할 수 있는 나노입자의 신규 제조방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명의 제조방법은 다양한 식물 추출물에 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 단독의 식물 추출물 외에도 둘 이상의 복합 식물 추출물에 대해서도 적용할 수 있으므로, 종래 기술의 문제점을 해결하는 것에 그치는 것이 아니라 다양한 용도가 제공될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 나노입자 제조방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 식물 추출물을 물에 용해시켜 저장액(stock solution)을 제조하는 단계,
b) 상기 저장액을 70℃ 내지 100℃ 온도의 물에 적하 방식 또는 분무 방식으로 첨가하는 단계, 및
c) 초음파 분쇄를 적용하는 단계.
바람직하게는, 상기 a) 단계의 식물 추출물은 분무 건조 방법에 의해 제조된다.
바람직하게는, 상기 b) 단계의 적하 방식 또는 분무 방식은 저장액을 소정의 속도로 첨가한다. 상기 소정의 속도는 일정한 속도 또는 이미 결정된 속도로 첨가하는 것을 의미한다. 예를 들어 0.1 내지 1.0 ml/min의 속도일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 b) 단계에서 저장액이 첨가되는 물의 온도는 100℃이다.
바람직하게는, 상기 c) 단계에서 초음파 분쇄를 적용하여 생성된 용액을 동결건조한다. 이와 같이 동결건조된 나노입자는 저장안정성이 뛰어나며, 실제 사용할 때까지 보관하기에 용이하다. 선택적으로, 상기 동결 건조 전에 감압 농축을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 나노입자는 약학 조성물에 유효성분으로서 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 암을 예방 또는 치료할 수 있다. 다만, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 나노입자가 어떠한 추출물을 함유하는지에 따라 예방 또는 치료 대상인 질환이 달라질 수 있다는 것은 당업계의 통상의 기술자라면 용이하게 알 수 있을 것이며, 상기 질환은 암에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
상기 암은 고형암일 수 있으며, 바람직하게는 뇌종양, 위암, 간암, 폐암, 갑상선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 췌장암, 직장암, 대장직장암, 전립선암, 신장암, 흑색종, 골전이암, 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암의 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물 내의 식물 추출물 나노입자의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하다. 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 1 내지 80 중량%, 1 내지 70 중량%, 1 내지 60 중량%, 또는 1 내지 50 중량%로 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 효능 증진을 위해 식물 추출물 나노입자 이외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들면 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 바람직하게 경구 투여 제형일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 국소 투여를 위한 적합한 투여 제형으로 제형화될 수 있고, 국소 투여 제형의 경우 상기 제형은 외용제, 발포정, 좌제 등을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 상기 추출물을 당해 기술분야에서 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 기제(base)와 혼합하여 외용제로 제형화될 수 있다. 상기 외용제는 에멀젼, 겔, 연고, 크림, 패치, 리니먼트, 파우더, 에어로졸, 스프레이, 로숀, 세럼, 페이스트, 폼, 점적제, 현탁액, 및 팅크를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 환제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로 암 환자의 중증도에 따라 본 발명의 조성물을 0.1 내지 100 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한, 그 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이, 특히 환자가 갖는 중증도 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 나노입자는 식품 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 암을 개선 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 여기서, 본 발명의 식품 조성물에 포함되는 나노입자가 어떠한 추출물을 함유하는지에 따라, 본 발명의 식품 조성물이 개선 또는 예방하려는 대상 상태가 달라질 수 있다는 것은 당업계의 통상의 기술자라면 명확하게 알 수 있을 것이다. 따라서, 상기 식품 조성물이 개선 또는 예방하려는 대상 상태는 암에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 할 것이다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서 상기 식물 추출물 나노입자 및 암은 특별한 언급이 없는 한, 각각 상기 약학 조성물에서 언급한 바와 같다.
용어 "개선"은 암이 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키거나 증상의 진행 또는 악화를 지연시키거나 증상을 호전시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 식품은 건강기능성 식품일 수 있다. 용어 "건강기능성 식품"이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품 조성물은 골 질환 치료 효과를 증진 또는 개선시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 유효성분으로서 포함되는 식물 추출물 나노입자의 양은 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 식물 추출물 나노입자는 원료 조성물 중 0.001 내지 20 중량%, 0.001 내지 15 중량% 또는 0.001 내지 10 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 건강음료의 경우 100 mL를 기준으로 0.01 내지 2 g, 구체적으로 0.02 내지 2 g, 보다 구체적으로 0.3 내지 1 g을 가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품 조성물에 첨가되는 본 발명에 따른 식물 추출물 나노입자는 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 효능 증진을 위해 상기 식물 추출물 나노입자 이외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다.
상기 식품 조성물은 환제, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 액상의 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.
또한, 상기 식품의 종류는 특별한 제한되지 않는다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물이 음료 조성물일 경우 필수 성분으로서 상기 추출물을 지시된 비율로 함유하는 외에는 액체성분에 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 어떠한 독성화학 물질 및 계면활성제도 첨가하지 않으므로, 본 발명에 의해 제조된 나노입자는 인체에 무해하다. 또한, 본 발명에 의해 제조된 나노입자가 암 치료 또는 예방용 약학 조성물에 포함되거나, 또는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물에 포함된다고 하더라도, 제조공정에서 포함될 수 있는 불순물로 인한 부작용 또는 역효과를 억제 또는 차단하는 것이 가능하다.
메탄올, 아세톤, 디클로로메탄 등과 같은 유기용매를 사용할 경우에는 입자 응집 현상이 발생하여 특정 크기의 나노입자가 균질하게 생성되지 못하고, 구형을 나타내지 않으며, 특히 나노입자로서 분리할 수 없게 된다. 반면, 본 발명의 제조방법에 따라 유기용매를 사용하지 않고 생성된 나노입자는 입자 응집 현상이 전혀 나타나지 않으며 높은 수율로 나노입자를 수득할 수 있는 점에서 매우 유리하다.
더욱이, 본 발명에 따른 제조방법은 전 공정이 간단하고 비용이 저렴한 공정들로 이루어져 있으며, 또한 전 공정 시간이 짧아서 산업 적용에 매우 유리하다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 나노입자는 일반 크기의 입자에 비해 타겟 부위의 전달능, 세포내 균질한 분포, 및 생체이용률이 매우 우수하여 약리학적, 식품학적 및 화장품학적 측면에서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 나노입자는 안정적이며(stable), 제조 과정에서 유해 물질이 사용되지 않으므로 인체 유해성을 미리 배제할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 제조된 나노입자는 그 크기가 나노 범위에서 균일하며 그 형태가 원형으로 제공된다. 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 따라 제조되어 특정 크기 및 형태를 갖게 되는 나노입자는 세포내에 내재화되어 균질하게 분포되는 능력이 현저하게 높다. 따라서, 본 발명에 의해 제조된 나노입자는 약리효과 또는 식품효과에 있어서도 대상체에게 균질하게 제공될 수 있다. 일반입자는 마이크로미터 범위의 크기를 갖기 때문에, 세포내 내재화 및 균질한 분포가 어렵고 본 발명의 나노입자 사용시에 관찰되는 엔도사이토시스 과정이 진행되지 않으며, 그 형태가 불규칙하기 때문에 타겟 세포에 대한 접착도 어렵다. 이러한 이유로 인해, 일반입자는 원하는 효과를 얻기 위해서는 나노입자에 비해 더 높은 농도로 사용되어야 하며, 이는 세포독성 및 부작용을 야기한다.
특히, 단독의 식물 추출물 뿐만 아니라 둘 이상의 복합 식물 추출물에 대해서도 나노입자의 제조방법을 적용할 수 있으므로, 종래에 공지되어 있거나 시판되고 있는 제품에 대해서도 본 발명에 따른 제조방법의 범용적인 활용이 가능하다.
도 1은 실시예 1에서 수득된 나노입자의 UV-visible 분광분석 흡광 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 HR-TEM 이미지를 나타낸다. 도 2A는 미처리 대조군을 보여주며, 도 2B는 세포질 내에 분산된 수개의 나노입자들을 보여주며, 도 2C 및 2D는 핵 내에 분포된 나노입자를 보여주며, 도 2E 및 2F는 세포막상에 존재하는 나노입자를 보여주며, 도 2G 및 2H는 세포막 내부에 존재하는 나노입자를 보여준다.
도 3a는 HepG2 간암 세포와 HBM 정상세포에 대한 MTT 어세이 결과로서 농도에 따른 세포생존율을 각각 나타내는 그래프이다. 'BRM270'은 비교예 1에서 수득된 일반입자를 가리키며, 'BRM270 nanoparticle'은 실시예 1에서 수득된 나노입자를 가리킨다.
도 3b는 HeLa 자궁경부암 세포에 대한 MTT 어세이 결과로서 농도에 대한 세포생존율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 HepG2 간암 세포, A549 폐암 세포, HeLa 자궁경부암 세포, HBM 정상세포의 형태학적 분석을 위한 현미경 사진이다.
도 5는 HepG2 간암 세포에 대한 아폽토시스를 확인하기 위한 DAPI 어세이 결과를 나타낸다. 'BRM270 normal'은 비교예 1에서 수득된 일반입자를 가리키며, 'BRM270 NP'는 실시예 1에서 수득된 나노입자를 가리킨다.
도 6은 실시예 2에서 수득된 나노입자의 UV-visible 분광분석 흡광 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 비교예 2의 일반입자 및 실시예 2의 나노입자의 FE-SEM 현미경 사진을 나타낸다.
도 8은 HeLa 자궁경부암 세포에 대한 MTT 어세이 결과로서 농도에 대한 세포생존율을 나타내는 그래프이다.
도 9는 Cal72 골육종 세포 및 HeLa 자궁경부암 세포의 형태학적 분석을 위한 현미경 사진이다.
도 10은 비교예 3의 일반입자 및 실시예 3의 나노입자의 FE-SEM 현미경 사진을 나타낸다.
도 11은 비교예 4의 일반입자 및 실시예 4의 나노입자의 FE-SEM 현미경 사진을 나타낸다.
도 12는 비교예 5의 일반입자 및 실시예 5의 나노입자의 FE-SEM 현미경 사진을 나타낸다.
도 13은 비교예 6의 일반입자 및 실시예 6의 나노입자의 FE-SEM 현미경 사진을 나타낸다.
도 14는 HeLa 자궁경부암 세포에 대한 MTT 어세이 결과로서 농도에 대한 세포생존율을 나타내는 그래프이다.
도 15는 HeLa 자궁경부암 세포의 형태학적 분석을 위한 현미경 사진이다.
도 16은 비교예 7의 일반입자 및 실시예 7의 나노입자의 FE-SEM 현미경 사진을 나타낸다.
도 17의 좌측은 비교예 8의 일반입자의 FE-SEM 현미경 사진을 나타낸 것이며, 도 17의 우측은 실시예 8의 나노입자의 FE-SEM 현미경 사진을 나타낸다..
도 18은 HepG2 간암 세포에 대한 MTT 어세이 결과로서 농도에 대한 세포생존율을 나타내는 그래프이다.
도 19는 HepG2 간암 세포의 형태학적 분석을 위한 현미경 사진 및 DAPI 어세이 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
비교예 1
삼백초(Saururus chinensis), 황금, 하고초(Prunella vulgaris), 자근, 청피 및 쇠비름(Portulaca oleracea)을 각각 전체 조성물을 기준으로 21.13 중량%, 21.13 중량%, 18.3 중량%, 18.3 중량%, 14.09 중량%, 7.05 중량%의 배합비로 혼합하였다. 여기서, 황금은 속썩은풀(Scutellaria baicalensis)의 뿌리를 지칭하고, 자근은 지치(Lithospermum officinale)의 뿌리를 지칭하고, 청피는 청귤(Citrus nippokoreana)의 과피를 지칭한다.
상기 혼합된 물질을 광목천에 담아 추출기에 넣고 8배수의 추출수를 투입한 후 95℃ 내지 100 ℃의 온도로 10 내지 14시간 동안 추출하였다. 이에 따라 생성된 추출액을 필터로 여과하여 교반탱크로 이송한 후, 농축기를 이용하여 10브릭스(brix)의 당도가 되도록 농축하였다.
실시예 1
삼백초, 황금, 하고초, 자근, 청피 및 쇠비름을 각각 끓인 후 분무-건조하여 액상 추출물을 제조하였다.
이와 같이 제조된 각각의 액상 추출물을 동일한 비율로 배합하여 총 10 mg의 용액을 생성한 후, 20 ml의 물에 용해시켜 저장액(stock solution)을 수득하였다.
상기 수득된 저장액 1 ml를 끓는 물 50 ml에 적하(dropwise) 방식 또는 분무(spray) 방식으로 5분 동안 0.2 ml/min의 유속(flow rate)으로 첨가하였다. 나노입자의 형성 및 크기의 균질성 측면 모두를 고려할 때, 저장액은 유속을 일정하게 유지하면서, 즉 소정의 속도로 첨가하는 것이 바람직하다. 이와 달리 저장액을 한번에 첨가한 경우에는 입자 응집 현상이 발생하였으며, 이로 인해 나노입자를 유효하게 분리할 수 없었다. 또한, 유속의 변동성이 큰 경우에는 형성되는 나노입자의 크기가 균질하지 않으며, 이는 나노입자가 나타내는 효과의 일관성을 저해한다.
상온에서 30분 동안 200 - 800 rpm으로 지속적으로 교반한 후, 2시간 동안 초음파분쇄기(ultrasonicator)를 100.0 W 및 30.0 kHz 조건으로 적용하였다. 초음파처리 후에 맑은 옐로우오렌지 색의 용액이 획득되었으며, 이 용액을 회전증발기를 사용하여 40 ℃에서 감압하에 5 ml로 농축하였다.
상기 농축된 시료를 동결건조하여, 갈색의 나노입자 분말이 수득되었다.
실험예 1
본 실험예에서는 실시예 1에 따라 획득된 생성물의 입자 크기, 형태 및 나노입자에 해당하는지 여부를 여러 실험들을 통해 확인하였다.
(1) UV-visible 분광분석법
실시예 1에서 획득한 동결건조 분말 1 mg을 증류수 1 ml에 용해시켜 수용액으로 만든 후, Perkin Elmer LAMBDA 25 분광광도계를 이용하여 200-800 nm의 파장에서 분광분석을 수행하였다.
그 결과 획득된 UV-visible 스펙트럼을 도 1에 나타내었다. 도 1의 스펙트럼은 특히 파장 283.3 nm에서 뾰족한 피크를 보여준다. 이는 실시예 1에서 획득한 동결건조 분말이 매우 안정적이고, 증류수 내에 매우 잘 분산되어 있다는 것을 의미한다.
(2) FE-SEM (Field-Emission Scanning Electron Microscopy)
실시예 1에서 획득한 동결건조 분말의 표면 형태, 입자 크기 및 모양을 확인하기 위하여, JSM-6700F 기기를 이용하여 FE-SEM을 수행하였다.
이를 위해, 실시예 1의 생성물 1 mg 및 비교예 1의 생성물 1 mg을 각각 증류수 10 ml에 용해시킨 후, 카본 테이프 상에 확산시키고, 질소 스트림 하에 건조시켰다. 이어서, 진공 조건하에서 200 Å 두께의 백금 층으로 osmium plasma sputter coater OPC80 T에서 코팅시켰다.
이에 따라 획득된 현미경사진을 분석한 결과, 실시예 1에서 획득한 동결건조 분말은 완전 구형이었으며, 직경 23.0 내지 70.0 nm의 크기를 균질하게 나타낸다는 것이 확인되었다.
(3) 저장액이 첨가되는 용매의 유형에 따른 차이
상기 실시예 1의 과정에서 저장액을 물에 첨가하지 않고 메탄올, 아세톤, 디클로로메탄과 같은 유기용매에 첨가한 경우에는 입자 응집 현상 등으로 인해 구형의 균질한 크기의 나노입자를 수득할 수 없었다. 더욱이, 본 발명에 따른 제조방법은 인체에 무해한 나노입자를 생산하기 위하여 제조공정에서 임의의 독성화학 물질, 계면활성제, 불순물 등을 첨가하지 않는 것이다. 따라서, 나노입자의 제조방법에 있어서 식물 추출물로부터 만든 저장액을 유기용매에 첨가하는 것은 본 발명의 범위에 속하지 않는다.
(4) 저장액이 첨가되는 물의 온도에 따른 차이
상기 실시예 1의 과정에서 저장액을 끓는 물에 첨가하지 않고 다른 온도의 물에 첨가한 경우에는 다음과 같은 결과가 관찰되었다.
저장액이 첨가되는 물의 온도 생성된 입자의 크기 생성된 입자의 형태
1 40℃ 1.71-2.24 nm 불규칙 형태
2 50℃ 160-285 nm 다각형
3 60℃ 91-116 nm 육각형
4 70℃ 77-92 nm 구형
5 80℃ 64-81 nm 구형
6 100℃ 23-70 nm 구형
상기 표 1에서, 저장액이 첨가되는 물의 온도가 70℃ 이상인 경우부터 생성되는 입자의 형태가 구형을 나타내었다. 또한, 저장액이 첨가되는 물의 온도가 60℃ 이하에서는 입자가 나노 범위보다 작거나 큰 크기로 생성되었다.
입자의 형태가 구형이 아니거나 또는 나노 범위의 크기에서 벗어난 경우에는 본 발명에서 얻고자 하는 나노입자의 우수한 생체 및 표적 전달능을 보여주지 못한다. 예컨대, 나노입자의 크기가 너무 작다면 항암 치료시 종양 조직으로부터 모세혈관으로 누출되기가 쉽기 때문에 항암 치료제의 효과가 유효하게 나타나지 않으며, 나노입자의 크기가 너무 크다면 세망내피계(reticuloendothelial system)에서 마크로파지에 의한 포획을 피하지 못한다.
후술하는 실험예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 수득된 나노입자는 종양 조직으로부터 모세혈관으로 누출되는 현상이 없을 뿐만 아니라 마크로파지에 의한 포획 현상이 없으며 세포내 균질한 분포를 매우 잘 나타낼 수 있다.
실험예 2
본 실험예에서는 HR-TEM (High Resolution - Transmission Electron Microscope)을 이용하여 본 발명의 제조방법에 따라 획득된 나노입자의 크기 및 형태, 그리고 세포내 분포 및 내재화에 대해 분석하였다.
(1) 나노입자의 크기 및 형태
나노입자의 크기 및 형태를 확인하기 위하여, 실시예 1의 나노입자 및 비교예 1의 일반입자를 재증류수(double-distilled water)에 초음파 용해시킨 후 카본-코팅된 구리 그리드 위에 증착시키고 주위 조건하에 기화되도록 놔두었다.
HR-TEM 분석 결과, 비교예 1의 일반입자는 불규칙한 외형을 가진 다각형이었던 반면, 실시예 1의 나노입자는 완전한 구형이었으며 평균 직경이 약 40 내지 70 nm로 측정되었다. 나노입자가 구형일 때, 혈관내 장기간 순환하는 동안 세포막과의 상호작용을 강화시켜줄 수 있을 뿐만 아니라 마크로파지에 의한 흡수를 최소화시킬 수 있으며, 또한 타겟 수용체에 대한 결합능을 높여주고 타겟 부위에서의 균질한 생분포를 유도할 수 있다. 따라서, 구형이 아닌 나노입자에 비해 본 발명의 제조방법에 따라 수득되는 나노입자가 생체이용률 등의 측면에서 유의적으로 더 유리하다.
(2) 나노입자의 세포내 분포 및 내재화
다음으로, 나노입자의 세포내 분포 및 내재화를 분석하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
6.0x105개의 HepG2 간암 세포를 각 배양 디쉬에 파종하고, 1일 동안 부착 및 적응시켰다. 실시예 1의 나노입자를 각 배양 디쉬에 12시간 동안 노출시켰다. 이어서, 트립신처리에 의해 세포를 수집하고, 2.5% 글루타르알데히드에서 고정시켰으며, 사용하기 전까지 4℃에서 저장하였다.
HR-TEM 이미지 분석 결과, 실시예 1의 나노입자로 HepG2 간암 세포를 처리한 후 1시간 후에 나노입자는 세포의 핵 주변 영역에 도달하였으며, 세포는 나노입자를 계속하여 흡수하는 것이 관찰되었다. 이는 본 발명의 나노입자가 처리된 후에 매우 신속하게 세포내에 내재화된다는 것을 입증한다.
도 2A는 미처리 대조군을 보여준다. 도 2B는 세포질 내에 분산된 수개의 나노입자들을 보여준다. 특히, 도 2C 및 2D는 핵 내에 분포된 나노입자를 보여주며, 이는 세포내(subcellular) 수준에서의 나노입자의 위치를 최초로 규명한 것이다.
도 2E 및 2F는 나노입자가 세포내로 진입하는 동안 세포막상에 존재하는 나노입자를 보여준다. 특히, 도 2F에서 나노입자를 함유하는 엔도좀(endosome)-유사 구조가 세포막 근처에서 발견되었으며, 이러한 엔도좀-유사 구조는 세노 내부로 이동하였다. 도 2G 및 2H는 세포막 내부에 존재하는 나노입자를 보여준다.
본 발명에 따른 나노입자의 작은 크기로 인해 엔도사이토시스(endocytosis)가 용이하게 진행되며, 엔도사이토시스는 세포 내재화에 매우 유리한 과정이다. 이에 따라, 나노입자는 세포막 및 세포질 내에서 더 많은 양으로 축적되는 것이 관찰되었으며, 이는 나노입자를 구성하는 성분이 목적하는 세포에 효과적으로 작용할 수 있다는 것을 의미한다.
실험예 3
본 실험예에서는 본 발명의 제조방법에 따라 획득된 나노입자의 효과를 확인하였다.
(1) MTT 어세이
실시예 1의 나노입자, 비교예 1의 일반입자(BRM270), 및 독소루비신의 세포독성 효과를 비교 분석하기 위하여, HepG2 간암 세포, HeLa 자궁경부암 세포, HBM(human bone marrow) 정상세포를 이용하여 MTT 어세이를 통해 세포생존율 및 증식율을 확인하였다.
이를 위해, 각 세포를 96-웰 플레이트에 1x104 세포수/웰의 농도로 파종하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하고, 실시예 1의 나노입자, 비교예 1의 일반입자, 및 독소루비신을 2.0 내지 12.0 μg/mL 범위의 농도로 각각 처리하였다. 여기서, 독소루비신은 방선균 Streptomyces peucetius var. caesius가 생산하는 안트라사이클린계 항생물질의 일종으로서, 아드리아마이신이라고도 지칭되며, 악성림프종, 소화기암, 폐암, 유암에 뛰어난 항암효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 본 실시예에서, 독소루비신은 양성 대조군으로 사용되었다.
24시간 후에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 배양 배지에서 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드(MTT) 용액 5.0 mg/mL와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 100.0 μL의 DMSO로 용해시켰다. bio-assay reader(Bio-Rad, Berkeley, CA, USA)를 사용하여, 세포 용해물의 570.0 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3a는 HepG2 간암 세포와 HBM 정상세포에 대해 실시예 1의 나노입자, 비교예 1의 일반입자, 및 독소루비신을 각각 처리한 결과를 나타낸다. 도 3a에서 볼 수 있듯이, 실시예 1의 나노입자는 비교예 1의 일반입자 및 독소루비신에 비해 암세포 증식 억제 효과가 유의적으로 우수하다는 것을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 독소루비신은 정상세포 HBM의 성장 및 증식을 억제하는 부작용을 나타내는 반면, 실시예 1의 나노입자는 정상세포 HBM의 성장 및 증식에 거의 영향을 미치지 않으므로 타겟에 대해 특이적인 선택성이 매우 높다.
도 3b는 HeLa 자궁경부암 세포에 대해 실시예 1의 나노입자, 비교예 1의 일반입자, 및 독소루비신을 각각 처리한 결과를 나타낸다. 도 3b에서 볼 수 있듯이, 실시예 1의 나노입자는 비교예 1의 일반입자 및 독소루비신에 비해 암세포 증식 억제 효과가 유의적으로 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 실시예 1의 나노입자는 최소한의 세포독성을 나타내면서도 최대의 치료 효과를 나타낼 수 있다. 이는 실시예 1의 나노입자의 유효량을 낮춰줄 수 있게 해주며, 이에 따라 대상체가 섭취하거나 대상체에게 투여되는 유효량이 낮아지므로 본 발명에 따른 나노입자는 편의성 및 비용 측면에서 매우 유리하다.
(2) 세포 형태학적 분석
실시예 1의 나노입자와 비교예 1의 일반입자의 항암 효과를 세포 형태학적 측면에서 분석하였다.
HepG2 간암 세포, A549 폐암 세포, HeLa 자궁경부암 세포, HBM 정상세포를 각각 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 실시예 1의 나노입자와 비교예 1의 일반입자로 각각 처리하고 24시간이 경과한 후에 현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다.
도 4에서 볼 수 있듯이, 미처리 대조군에서는 세포 유형과 무관하게 깨끗한 세포골격(cytoskeleton)이 확인되었으며, 이는 세포가 건강한 형태를 유지한다는 것을 나타낸다. 마찬가지로, HBM 정상세포에 대해서는 실시예 1의 나노입자와 비교예 1의 일반입자로 처리하더라도 모두 깨끗한 세포골격이 확인되었다.
반면, HepG2 간암 세포, A549 폐암 세포, HeLa 자궁경부암 세포에 대해서는 실시예 1의 나노입자와 비교예 1의 일반입자로 처리된 경우 세포 수축을 나타내었으며 사멸 세포 및 세포 파편들이 증가하였다. 특히, 실시예 1의 나노입자로 처리한 군은 비교예 1의 일반입자로 처리한 군에 비해 사멸 세포 및 세포 파편들이 더 많이 관찰되었다.
(3) DAPI 어세이
실시예 1에서 제조된 나노입자와 비교예 1의 일반입자의 항암 효과를 비교하기 위하여 DAPI 어세이를 수행하여 HepG2 간암 세포의 아폽토시스를 확인하였다.
이를 위해, 1x106개의 HepG2 간암 세포를 6-웰 마이크로티터 플레이트에 파종하였다. 밤새 인큐베이션 후, 실시예 1의 나노입자와 비교예 1의 일반입자로 각각 세포를 처리하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, 10분 동안 4.0% 파라포름알데히드로 고정하였으며, 5분 동안 DAPI(4,6-디아미디노-2-페닐린돌) 처리하여 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 실시예 1의 나노입자를 최소 유효농도 12.0 μg/mL로 처리한 군은 HepG2 간암 세포의 44.4%에서 아폽토시스가 유도되었다. 반면, 비교예 1의 일반입자를 동일한 농도로 처리한 군은 HepG2 간암 세포의 12.5%에서만 아폽토시스가 유도되었다(도 5).
또한, 실시예 1의 나노입자는 아폽토시스가 진행되는 세포에서 크로마틴 응축과 함께 비-아폽토시스 세포에서는 핵 내 DNA 단편화(fragmentation)를 유발하였다.
실시예 2 및 비교예 2
삼백초(Saururus chinensis)를 끓인 후 분무-건조하여 액상 추출물을 제조하였다. 이와 같이 제조된 액상 추출물 10 mg을 20 ml의 물에 용해시켜 저장액을 수득하였다. 상기 저장액 1 ml를 끓는 물 50 ml에 적하 방식 또는 분무 방식으로 5분 동안 일정한 유속으로 첨가하였다. 이로부터 수득된 생성액을 상온에서 30분 동안 200-800 rpm으로 지속적으로 교반하였으며, 그 후 2시간 동안 초음파분쇄기를 100.0 W 및 30.0 kHz 조건으로 적용하였다. 초음파처리 후 회전증발기를 사용하여 40℃에서 감압하에 5 ml로 농축하고, 동결건조하였다. 이와 같이 수득된 동결건조 분말을 실시예 2의 시료로 사용하였다.
반면, 삼백초 추출물을 메탄올에 적하시키는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방식으로 수득한 동결건조 분말을 비교예 2의 시료로 사용하였다.
실험예 4
상기 실시예 2에 따라 획득된 생성물에 대해, 나노입자에 해당하는지 여부와 나노입자로서 나타내는 효과를 확인하였다.
(1) UV-visible 분광분석법
실험예 1과 동일한 방식으로 UV-visible 분광분석법을 수행하였으며, 이에 따라 획득된 스펙트럼을 도 6에 나타내었다.
도 6의 흡광 스펙트럼은 660 nm에서 뾰족한 피크를 보여준다. 이는 실시예 2에서 획득한 동결건조 분말이 증류수 내에 잘 분산되어 있고 매우 안정적이라는 것을 의미한다.
(2) FE-SEM
실험예 1과 동일한 방식으로 FE-SEM을 수행하였으며, 이에 따라 획득된 현미경사진을 도 7에 나타내었다.
도 7의 상단 사진에서, 비교예 2에서 획득한 동결건조 분말의 직경이 1.153 μm로 측정되었으며, 이는 나노입자에 해당하지 않는다. 이와 달리 도 7의 하단 사진에서, 실시예 2에서 획득한 동결건조 분말은 67.6 nm, 70.1 nm, 66.3 nm 및 72.4 nm의 직경이 균질하게 측정되었으며, 구형의 나노입자라는 것이 확인되었다. 이와 같은 나노입자 형태는 후술하는 항암 효과를 나타내는데 유리하게 작용한다.
(3) MTT 어세이
HeLa 자궁경부암 세포에 대해 실시예 2의 나노입자, 비교예 2의 일반입자, 및 독소루비신의 효과를 비교하기 위하여, 상기 실험예 3과 동일한 방식으로 MTT 어세이를 수행하여 세포생존율 및 증식율을 확인하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에서 볼 수 있듯이, 삼백초 단일 추출물의 나노입자는 삼백초 단일 추출물의 일반입자(마이크로 사이즈) 및 독소루비신 모두에 비해 자궁경부암 세포의 증식 억제 효과가 훨씬 더 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
(4) 세포 형태학적 분석
Cal72 골육종 세포 및 HeLa 자궁경부암 세포에 대해 실시예 2의 나노입자 및 비교예 2의 일반입자의 효과를 비교하기 위하여, 상기 실험예 3과 동일한 방식으로 세포 형태학적 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에서 볼 수 있듯이, 미처리 대조군에서는 골육종 세포와 자궁경부암 세포 모두에서 깨끗한 세포골격 및 건강한 형태를 유지하는 세포가 확인되었다. 반면, 실시예 2의 나노입자와 비교예 2의 일반입자로 처리한 경우에는 사멸 세포 및 세포 파편들이 관찰되었으며, 특히 실시예 2의 나노입자 처리 군에서 더욱 많은 수가 관찰되었다.
실시예 3 및 비교예 3
단일 재료로서 속썩은풀(Scutellaria baicalensis)의 뿌리를 이용한 것을 제외하고는 실시예 2 및 비교예 2와 동일한 방식을 각각 적용하여 동결건조 분말을 수득하였다. 이를 각각 실시예 3 및 비교예 3의 시료로 사용하였다.
실험예 5
실시예 3 및 비교예 3의 시료가 나노입자인지 여부를 확인하기 위하여 실험예 1과 동일한 방식으로 FE-SEM을 수행하였으며, 이에 따라 획득된 현미경사진을 도 10에 나타내었다.
도 10의 상단 사진에서, 비교예 3의 시료는 입자 직경이 4.476 μm로 측정되었으며, 이는 나노입자에 해당하지 않는다. 이와 달리 도 10의 하단 사진에서, 실시예 3의 시료는 79.7 nm, 75.3 nm, 80.0 nm, 84.4 nm, 및 80.3 nm의 직경이 균질하게 측정되었으며, 구형의 나노입자라는 것이 확인되었다. 이와 같은 나노입자 형태는 항암 효과를 나타내는데 유리하게 작용한다.
실시예 4 및 비교예 4
단일 재료로서 하고초(Prunella vulgaris) 잎을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2 및 비교예 2와 동일한 방식을 각각 적용하여 동결건조 분말을 수득하였다. 이를 각각 실시예 4 및 비교예 4의 시료로 사용하였다.
실험예 6
실시예 4 및 비교예 4의 시료가 나노입자인지 여부를 확인하기 위하여 실험예 1과 동일한 방식으로 FE-SEM을 수행하였으며, 이에 따라 획득된 현미경사진을 도 11에 나타내었다.
도 11의 상단 사진에서, 비교예 4의 시료는 입자 직경이 5.76 μm부터 8.75 μm까지 범위 내에서 측정되었으며, 이는 나노입자에 해당하지 않는다. 이와 달리 도 11의 하단 사진에서, 실시예 4의 시료는 66.3 nm부터 72.4 nm의 범위 내에서 직경이 균질하게 측정되었으며, 구형의 나노입자라는 것이 확인되었다. 이와 같은 나노입자 형태는 항암 효과를 나타내는데 유리하게 작용한다.
실시예 5 및 비교예 5
단일 재료로서 자초(Arnebia euchroma)를 이용한 것을 제외하고는 실시예 2 및 비교예 2와 동일한 방식을 각각 적용하여 동결건조 분말을 수득하였다. 이를 각각 실시예 5 및 비교예 5의 시료로 사용하였다.
실험예 7
실시예 5 및 비교예 5의 시료가 나노입자인지 여부를 확인하기 위하여 실험예 1과 동일한 방식으로 FE-SEM을 수행하였으며, 이에 따라 획득된 현미경사진을 도 12에 나타내었다.
도 12의 상단 사진에서, 비교예 5의 시료는 입자 직경이 0.794 μm로 측정되었으며, 이는 나노입자에 해당하지 않는다. 이와 달리 도 12의 하단 사진에서, 실시예 5의 시료는 75.1 nm부터 77.0 nm의 범위 내에서 직경이 균질하게 측정되었으며, 구형의 나노입자라는 것이 확인되었다. 이와 같은 나노입자 형태는 항암 효과를 나타내는데 유리하게 작용한다.
실시예 6 및 비교예 6
단일 재료로서 귤(Citrus unshiu markovich)의 진피를 이용한 것을 제외하고는 실시예 2 및 비교예 2와 동일한 방식을 각각 적용하여 동결건조 분말을 수득하였다. 이를 각각 실시예 6 및 비교예 6의 시료로 사용하였다.
실험예 8
상기 실시예 6에 따라 획득된 생성물에 대해, 나노입자에 해당하는지 여부와 나노입자로서 나타내는 효과를 확인하였다.
(1) FE-SEM
실험예 1과 동일한 방식으로 FE-SEM을 수행하였으며, 이에 따라 획득된 현미경사진을 도 13에 나타내었다.
도 13의 상단 사진에서, 비교예 6의 시료는 입자 직경이 0.105 μm부터 0.479 μm까지 범위에서 측정되었으며, 이는 나노입자에 해당하지 않는다. 이와 달리 도 11의 하단 사진에서, 실시예 4의 시료는 45.5 nm부터 64.5 nm의 범위 내에서 직경이 균질하게 측정되었으며, 구형의 나노입자라는 것이 확인되었다. 이와 같은 나노입자 형태는 후술하는 항암 효과를 나타내는데 유리하게 작용한다.
(2) MTT 어세이
HeLa 자궁경부암 세포에 대해 실시예 6의 나노입자, 비교예 6의 일반입자, 및 독소루비신의 효과를 비교하기 위하여, 상기 실험예 3과 동일한 방식으로 MTT 어세이를 수행하여 세포생존율 및 증식율을 확인하였다. 그 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에서 볼 수 있듯이, 귤 진피 단일 추출물의 나노입자는 귤 진피 단일 추출물의 일반입자(마이크로 사이즈) 및 독소루비신 모두에 비해 자궁경부암 세포의 증식 억제 효과가 훨씬 더 우수하다는 것을 확인할 수 있다. 귤 진피 단일 추출물의 나노입자는 정상세포에 대해 영향을 미치지 않으면서 암세포에서 대해서만 특이적으로 증식 억제 효과를 10 내지 100 μg/ml 농도에서 나타내었으며, IC50 값은 30 μg/ml였다.
(3) 세포 형태학적 분석
HeLa 자궁경부암 세포에 대해 실시예 6의 나노입자, 비교예 6의 일반입자, 및 독소루비신의 효과를 비교하기 위하여, 상기 실험예 3과 동일한 방식으로 세포 형태학적 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 15에 나타내었다.
실시예 6의 나노입자 처리 군에서 가장 많은 수의 사멸 세포 및 세포 파편들이 관찰되었다.
실시예 7 및 비교예 7
단일 재료로서 쇠비름(Portulaca oleracea)을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2 및 비교예 2와 동일한 방식을 각각 적용하여 동결건조 분말을 수득하였다. 이를 각각 실시예 7 및 비교예 7의 시료로 사용하였다.
실험예 9
실시예 7 및 비교예 7의 시료가 나노입자인지 여부를 확인하기 위하여 실험예 1과 동일한 방식으로 FE-SEM을 수행하였으며, 이에 따라 획득된 현미경사진을 도 16에 나타내었다.
도 16의 상단 사진에서, 비교예 7의 시료는 입자 직경이 0.137 μm 내지 0.331 μm의 범위로 측정되었으며, 이는 나노입자에 해당하지 않는다. 이와 달리 도 16의 하단 사진에서, 실시예 7의 시료는 직경 25.1 nm 내지 28.8 nm의 완전 구형을 균질하게 나타내는 것이 확인되었다. 이와 같은 나노입자 형태는 항암 효과를 나타내는데 유리하게 작용한다.
실시예 8
홍삼(red ginseng)의 뿌리에 대해 실시예 2와 동일한 방식을 적용하여 동결건조 분말을 수득하였다. 이 분말은 갈색이며, 실시예 8의 시료로 사용하였다.
실험예 10
상기 실시예 8의 시료에 대해, 나노입자에 해당하는지 여부와 나노입자로서 나타내는 효과를 확인하였다.
(1) FE-SEM
실험예 1과 동일한 방식으로 FE-SEM을 수행하였으며, 이에 따라 획득된 현미경사진을 도 17에 나타내었다.
도 17의 좌측 사진은 마이크로 크기의 홍삼 뿌리 일반입자(비교예 8)를 나타낸 것이며, 도 17의 우측 사진은 직경 50-65 nm의 완전 구형을 갖는 실시예 8의 홍삼 뿌리 나노입자를 나타낸 것이다.
(2) MTT 어세이
HepG2 간암 세포를 96-웰 플레이트에 1x104 세포수/웰의 농도로 파종하고, 48시간 동안 배양 배지에서 유지하였다. 그 후 MTT, 즉 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨-브로마이드)를 0.5 mg/mL의 농도로 웰마다 첨가하였다.
HepG2 간암 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후 상청액을 제거하였다. 이어서, 700 μL의 DMSO를 웰마다 추가하여, 포르마잔 생성물을 용해시켰다. microplate reader(BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 18에 나타내었다.
도 18에서 볼 수 있듯이, 홍삼 일반입자에 의해서도 HepG2 간암 세포의 생존율이 농도-의존적으로 낮아지는 것을 확인할 수 있으나, 홍삼 나노입자는 홍삼 일반입자에 비해 세포 생존율이 훨씬 더 낮다는 것을 확인할 수 있다.
(3) DAPI 어세이
실시예 8의 홍삼 나노입자와 홍삼 일반입자의 항암 효과를 비교하기 위하여 DAPI 어세이를 수행하여 HepG2 간암 세포의 아폽토시스를 확인하였다.
이를 위해, HepG2 간암 세포를 4챔버 슬라이트에 위치된 멸균 커버 글라스 위에 파종하였다. HepG2 간암 세포가 약 70% confluence까지 성장된 것이 확인된 후, 홍삼 일반입자, 홍삼 나노입자, 독소루비신을 각각 10 μg/ml의 농도로 처리하고 24시간 동안 인큐베이션하였다.
상기 인큐베이션이 완료된 후, PBS로 세척하고, HepG2 간암 세포를 실온에서 5분 동안 콜드 메탄올로 고정하였다. 이어서, PBS로 세척하고, PBS 중 2mg/ml 농도의 DAPI(4,6-디아미디노-2-페닐린돌) 용액을 처리하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 형광 현미경(Olympus)을 이용하여 핵을 촬영한 현미경사진을 도 19에 나타내었다.
그 결과, 도 19에서 확인할 수 있듯이, 홍삼 나노입자로 처리한 경우의 사진은 크로마틴 응축 현상을 더욱 뚜렷하게 나타내었으며, 이는 세포 아폽토시스가 활발하다는 것을 의미한다. 특히, 양성 대조군으로 사용된 독소루비신에 비해서도 홍삼 나노입자는 더욱 개선된 세포 아폽토시스 효과를 나타낸다는 것이 확인되었다.

Claims (9)

  1. 하기 단계를 포함하는 나노입자의 제조방법:
    a) 삼백초, 황금, 하고초, 자근, 청피 및 쇠비름 추출물을 물에 용해시켜 저장액(stock solution)을 제조하는 단계;
    b) 상기 저장액을 70℃ 내지 100℃ 온도의 물에 적하 방식 또는 분무 방식으로 첨가하는 단계; 및
    c) 초음파 분쇄를 적용하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계의 적하 방식 또는 분무 방식은 저장액을 소정의 속도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계에서 물의 온도는 100℃인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계에서 수득된 생성물을 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 생성물은 동결건조되기 전에 감압 농축되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    계면활성제 및 독성 물질이 첨가되지 않는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 나노입자.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 나노입자를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 나노입자를 포함하는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물.
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