KR101576887B1 - 황칠 추출물을 포함하는 중금속 중독으로 인한 질환의 치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 중금속 중독으로 인한 질환의 치료 및 예방을 위한 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 추출물은 카드뮴, 납, 수은 등의 중금속에 의해 유래된 활성산소종의 제거 효능을 MDA(malondialdhyde) 수준, Cu,Zn-수퍼옥시드 디스무타제(superoxide dismutase), 카탈라제 활성(catalase activity)을 실험한 결과, 이들의 활성을 강력하게 저해함을 확인하고 비소계, 납계, 카드늄계 착화물에 의해 독성이 유발된 cell 에서 GSTP1, 메탈로티오네인(metallothioneins) 등의 중금속 해독관련 유전자와 세포의 산화적 스트레스 및 생존에 관련된 인터류킨 시토킨(interleukin cytokine) 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase)s 등의 유전자 발현을 현저하게 감소시킴을 확인하고 중금속을 투여한 수컷 Sprague-Dawley 랫트를 대상으로 혈중 중금속의 배출정도를 확인한 결과, 중금속 배설효과가 탁월함을 확인하여 황칠나무 추출물의 중금속 배출효과가 탁월함을 확인하여 중금속 중독으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하다.

Description

황칠 추출물을 포함하는 중금속 중독으로 인한 질환의 치료 및 예방용 조성물{Composition comprising extract of Dendropanax morbifera Lev. for the treatment and prevention of diseases caused by heavy metal poisoning}

본 발명은 황칠 추출물을 포함하는 중금속 중독으로 인한 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.

[문헌 1] Satoh, M., et al., Tohoku J. Exp. Med., 196, pp23-32, 2002

[문헌 2] Klaassen, C.D., Casarett and Doull's Toxociology, McGraw-Hill Medical Publishing Division, New York, pp822-826, 2001

[문헌 3] Falck, F.Y.Jr., et al., Am. J. Ind. Med., 4, pp541-549, 1983

[문헌 4] Sauer, J.M., et al., Toxicology, 121, pp155-164, 1997

[문헌 5] Raffray, M., et al., Pharmacol. Ther., 75, 153-177, 1997

[문헌 6] Nomura, M., et al., J. Biol. Chem., 278, pp2058-2065, 2003

[문헌 7] 한국 특허공개 제 2000-0004499

[문헌 8] 한국 특허공개 제 2003-0079205

[문헌 9] 한국 특허공개 제 2004-01077853

[문헌 10] 한국 특허공개 제 2004-0107852

[문헌 11] 한국 특허공개 제 2005-0036093

[문헌 12] SL Stvolinskii et al., Protective effect of carnosine on Cu, Zn-superoxide dismutase during impaired oxidative metabolism in the brain in vivo, 135(2), 130-132, 2003., WS EUM et al., HIV-1 Tat-mediated protein transduction of Cu,Zn-superoxide dismutase into pancreatic β cells in vitro and in vivo, 37(3), 339-349, 2004

[문헌 13]Kim. I.S et al., Protective effect of Chrysanthemum indicum Linne against 1-methyl-4-phenylpridinium ion and lipopolysaccharide-induced cytotoxicity in cellular model of Parkinson's disease, 49(4), 963-973, 2011

[문헌 14]R.J. Porra et al., Biochemica et Biophysica Acta., 975., 384-394., 1989.

본 발명은 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 중금속 중독으로 인한 질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

카드뮴(Cd)은 중금속 중에서 가장 독성이 높은 물질 중의 하나이며 환경 중금속으로, 인체에 암을 유발하는 발암물질로 분류된다(Satoh, M., et al., Tohoku J. Exp. Med., 196, pp23-32, 2002). 역학 조사에 따르면 소량의 카드뮴일지라도 장기간 섭취되면 카드뮴이 표적 장기에 축적되어 결과적으로 건강에 악영향을 끼치게 된다. 인간이 평생동안 섭취하는 총 카드뮴의 양은 대략 2000 mg(Klaassen, C.D., Casarett and Doull's Toxociology, McGraw-Hill Medical Publishing Division, New York, pp822-826, 2001)정도이며, 음식이나 작업실 공기 중에 존재하는 카드뮴을 만성적으로 섭취할 경우, 카드뮴이 축적된 조직의 세포를 사멸시켜 기관(organ)이상을 야기할 수 있다(Falck, F.Y.Jr., et al., Am. J. Ind. Med., 4, pp541-549, 1983). 카드뮴은 주로 간과 신장에 축적되고, 낮은 용량일지라도 만성적으로 축적된 카드뮴은 폐, 간, 신세뇨관 질환을 야기한다. 카드뮴 노출에 의해 유도된 세포의 형태적인 변형은 세포퇴화, 염증성 반응, 섬유화를 포함한다. 카드뮴에 의해 유도된 조직손상의 병리적 기전은 세포 괴사 및 높은 세포교체율과 관련된다(Sauer, J.M., et al., Toxicology, 121, pp155-164, 1997).

일반적으로, 저용량의 독성물질은 세포자멸사(apoptosis)를 야기하는 경향이 있지만, 높은 수준의 독성물질노출은 나중에 세포괴사를 일으킨다(Raffray, M., et al., Pharmacol. Ther., 75, 153-177, 1997). 세포사멸자극에 의한 단백질의 분해는 단백질에 결합되어 있는 배드(Bad)를 방출하고, 배드의 미토콘드리아로의 전위를 촉진하며 배드는 미토콘드리아내의 BclXL와 상호작용하여 세포사를 증가시킨다(Nomura, M., et al., J. Biol. Chem., 278, pp2058-2065, 2003).

2000년대 초반에 들어 웰빙의 붐이 일어나면서 질 좋은 삶을 위한 운동, 식품, 의류, 환경 등의 시장이 급격히 확대되었다. 그로 인한 경제적인 효과가 지금까지도 꾸준히 늘어가고 있으며, 웰빙의 여러 분야에서도 새로운 소재로 만들어진 식품관련 제품은 속속들이 출시되고 있다. 특히 큰 규모를 이루고 있는 다이어트 시장과 접목하여 디톡스 제품은 레몬을 이용한 제품을 필두로 하여 많은 종류의 소재를 다루고 있다. 레몬의 경우 디톡스의 관심으로 2012년 상반기 보다 2013년 레몬 판매량은 11.4%나 늘었으며, 해독주 관련 토마토, 양배추등의 수요도 늘어났다. 이것은 디톡스에 대한 관심은 계속하여 늘어나고 있으며, 그에 따른 소재에 대한 시장도 같이 늘어난다는 것으로 파악된다.

또한 중금속에 의한 세포 독성은 산화적 손상에 기인한 것으로 알려져 있어, 항산화 또한 디톡스와 같은 맥락을 이룬다고 할 수 있다. 항산화에 뛰어난 효과가 있는 대표적인 물질로 안토시아닌, 플라보노이등이 있으며, 최근 아사이베리 열매에 풍부한 안토시아닌은 사람의 건강한 세포에 영향을 주지 않고 암세포만을 선별적으로 죽인다는 연구가 미국 피츠버그 대학 연구팀에 의해 밝혀졌고, 게리 스토너 박사가 이끈 미국 5개 대학 공동연구팀은 쥐 실험을 통해 아사이베리가 종양을 억제하는 사실을 발견하였다.

이와 같이 지속적인 디톡스, 항산화에 대한 소재개발 및 연구가 이뤄지고 있으며, 최근에는 다이어트 등과 같은 한 가지 목적에 국한된 식품에서 나아가 건강을 되찾기 위한 방식으로도 그 영역이 넓어지고 있다.

황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 두릅나무과에 속하는 식물로써 세계에서 오직 한국의 해남, 완도와 같은 남부 해안 지역과 제주도에서만 자생하는 상록 활엽교목으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것으로 황칠(黃漆)이라고 한다. 본초 강목에서는 황칠나무가 번열을 제거하고, 안질 및 화상치료에 효과가 있다고 알려졌으며, 최근 들어서는 황칠나무의 잎이 항암 작용에 효능이 있으며 또한 항산화 작용 및 신경 안정작용이 있는 것으로 보고되어 지고 있으며 아울러 황칠나무 추출물이 피부의 멜라닌 색소를 생성하는 타이로시나아제를 불활성화 시켜 피부 미백에 도움을 준다고 알려져 있다. 황칠나무는 비휘발 성분 66.7%, 방향성분 10.8%, 수분 8.1% 및 고형분이 14.4% 로 구성되어져 있으며 특히 방향성분은 주로 β-쿠베벤(cubebene), γ-셀리넨(selinene), δ-카디넨(cadiene)으로 이루어져 있다고 보고되고 있다.

종래의 황칠나무에 관한 관련 기술로는 한국 특허공개 제 2000-0004499에 항암활성을 가지는 황칠나무 추출물이 기재되어 있고, 한국 특허공개 제 2003-0079205에 간세포 보호효과를 갖는 황칠 추출물, 황칠 분획물 및 이들을 함유한 약학 조성물이 기재되어 있고, 한국 특허공개 제 2004-01077853에 에탄올 유발 간손상을 억제하는 황칠추출물이 기재되어 있고, 한국 특허공개 제 2004-0107852에 피부 미백 효과가 있는 황칠추출물과 황칠 분획물이 기재되어 있으며 한국 특허공개 제 2005-0036093에 황칠나무 수액을 유효성분으로 하는 자외선 차단 화장품 조성물, 한국 특허공개 제 2006-0131360에 생리활성이 뛰어난 황칠나무의 종실추출물이 기재되어 있다.

그러나, 상기 종래기술 문헌의 어디에도 황칠나무 추출물에 대한 중금속 중독으로 인한 질환에 치료효능에 대하여 개시되거나 교시된 바는 없다

본 발명자들은 카드뮴, 납, 수은 등의 중금속에 의해 유래된 활성산소종의 제거 효능을 MDA(malondialdhyde) 수준, Cu,Zn-수퍼옥시드 디스무타제(superoxide dismutase), 카탈라제 활성(catalase activity)을 실험한 결과, 이들의 활성을 강력하게 저해함을 확인하고(실험예 1) 비소계, 납계, 카드뮴계 착화물에 의해 독성이 유발된 cell 에서 GSTP1, 메탈로티오네인(metallothioneins) 등의 중금속 해독관련 유전자와 세포의 산화적 스트레스 및 생존에 관련된 인터류킨 시토킨(interleukin cytokine) 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase)s 등의 유전자 발현을 현저하게 감소시킴을 확인하고(실험예 2) 중금속을 투여한 수컷 Sprague-Dawley 랫트를 대상으로 혈중 중금속의 배출정도를 확인한 결과, 중금속 배설효과가 탁월함을 확인하여 황칠나무 추출물의 중금속 배출효과가 탁월함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 카드뮴(Cd), 수은(Hg), 또는 납(Pb)으로부터 선택된 중금속 중독으로 인한 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 상기 중금속 중독으로 인한 질환은 중금속 인체 축적으로 인한 빈혈, 헤모글로빈뇨증, 혈뇨, 황달, 오심, 구토, 복통 등의 위장관 장애, 호흡곤란, 불안감, 권태감, 신경손상, 기억력 감소의 증상, 소화기 증상, 기관지염, 폐기종, 빈혈, 신장결석증, 당뇨, 단백뇨, 아미노산뇨. 이따이이따이병, 고혈압, 기형유발, 돌연변이, 암, 신경퇴행성 질환를 포함하며, 바람직하게는 신장결석증, 이따이이따이병, 암, 신경퇴행성 질환을 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 황칠나무 추출물은 Dendropanax morbifera Lev. , Dendropanax morbiferus 의 잎, 가지, 또는 수피, 바람직하게는, 잎 또는 가지부위를 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 황칠나무 추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 또는 10~100%(v/v) 에탄올, 보다 더 바람직하게는 물 또는 20~50%(v/v) 에탄올에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 황칠 나무 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 황칠 나무 추출물은 건조된 황칠 나무의 잎, 가지, 또는 수피, 바람직하게는, 잎 또는 가지부위를 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 10~100% 에탄올을 수회 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1시간 내지 12시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 초음파 추출법 또는 환류 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 황칠 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 중금속 중독으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 황칠 나무 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 치료 및 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 중금속 중독으로 인한 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물은, 상기 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.02 ~ 90 중량 %로 포함한다.

또한, 상기 본 발명의 황칠 나무 추출물을 포함하는 중금속 중독으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용하는 부형제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 황칠 나무 추출물을 포함하는 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 이와 함께 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해, 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제, 예를 들면 액제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액상제제 에어로졸 등의 경구형 제형, 피복용 연고제 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 황칠 나무 추출물을 일정량 함유한 조성물은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 0.001 % ～ 30 %의 유효성분을 함유하는 내용제제로 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있고, 환자의 성별, 나이 및 질병의 정도에 따라서 그 사용량을 증감할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 카드뮴(Cd), 수은(Hg), 또는 납(Pb)으로부터 선택된 중금속 중독으로 인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능 식품을 제공한다.

본 발명의 추출물은 목적 질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 및 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제 및 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 목적 질환의 예방 및 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리 사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량 부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 추출물은 카드뮴, 납, 수은 등의 중금속에 의해 유래된 활성산소종의 제거 효능을 MDA(malondialdhyde) 수준, Cu,Zn-수퍼옥시드 디스무타제(superoxide dismutase), 카탈라제 활성(catalase activity)을 실험한 결과, 이들의 활성을 강력하게 저해함을 확인하고(실험예 1) 비소계, 납계, 카드뮴계 착화물에 의해 독성이 유발된 cell에서 GSTP1, 메탈로티오네인(metallothioneins) 등의 중금속 해독관련 유전자와 세포의 산화적 스트레스 및 생존에 관련된 인터류킨 시토킨(interleukin cytokine) 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase)s 등의 유전자 발현을 현저하게 감소시킴을 확인하고(실험예 2) 중금속을 투여한 수컷 Sprague-Dawley 랫트를 대상으로 혈중 중금속의 배출정도를 확인한 결과, 중금속 배설효과가 탁월함을 확인하여 황칠나무 추출물의 중금속 배출효과가 탁월함을 확인하여 중금속 중독으로 인한 질환의 새로운 치료 및 예방제로서 사용될 수 있다.

도 1 및 2는 황칠나무 잎 추출물에 대한 HPLC 분석 결과에 관한 도이고,
도 3은 카드뮴 및/또는 시료 투여 4주후 해마에서의 MDA, SOD 활성, 및 카탈라제(catalase) 활성을 나타낸 도이며;
도 4는 납 및/또는 시료 투여 4주후 해마에서의 MDA, SOD 활성, 및 카탈라제(catalase) 활성을 나타낸 도이며;
도 5는 수은 및/또는 시료 투여 4주후 해마에서의 MDA, SOD 활성, 및 카탈라제(catalase) 활성을 나타낸 도이며;
도 6은 황칠나무 잎 추출물이 LPS로 자극된 산화적 스트레스 및 생존에 관련된 interleukin cytokine에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 7은 황칠나무 잎 추출물이 LPS로 자극된 산화적 스트레스 및 생존에 관련된 MAPKs에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 8은 CTL, Pb, Pb+LE, Pb+DME (leaf) 및 Pb+DME (stem) 군들의 혈청중 납 함량 수준을 분석한 도이며 (n = 10 per group; ^aP < 0.05 versus CTL group; ^bP < 0.05 versus Pb-treated group이며 데이터는 평균(mean) ± SD을 나타냄):
도 9는 CTL, Pb, Pb+LE, Pb+DME (leaf) 및 Pb+DME (stem) 군들의 혈청중 카드뮴 함량수준을 분석한 도이며 (n = 10 per group; ^aP < 0.05 versus CTL group; ^bP < 0.05 versus Pb-treated group이며 데이터는 평균(mean) ± SD을 나타냄):
도 10은 CTL, Pb, Pb+LE, Pb+DME (leaf) 및 Pb+DME (stem) 군들의 혈청중 수은 함량수준을 분석한 도이다 (n = 10 per group; ^aP < 0.05 versus CTL group; ^bP < 0.05 versus Pb-treated group이며 데이터는 평균(mean) ± SD을 나타냄).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 황칠 추출물의 제조

본 연구에 사용된 황칠은 농업회사법인 (주)황칠코리아에서 공급받았으며, 대조용을 사용한 레몬은 제주레몬 업체에서 공급받았으며, 황칠의 경우 잎과 가지를 분리하여 사용하였다.

1.1. 열수 추출

레몬 및 황칠나무 가지, 잎 부위의 이물질을 제거한 뒤 환류(refluxing) 추출장치(광명화학, EAM-9204-06)를 사용하여 가열은 항온수조(동진과학, KSW-6001) 100°C에서 4시간을 조건으로 추출하였다. 추출된 시료를 원심분리기(FLETA5, 한일)로 원심분리하여 상등액(supernatant)만을 취하여 동결건조기(DRC-100+FDU-2100, 렙코퍼레이션)로 동결 건조를 하여 분말을 제조하여 사용하였다. (이하, ‘DMW라 함), 수율은 하기 표 1에 기재하였다.

열수추출 수율

구분	황칠나무 가지	황칠나무 잎	레몬
수율	3.4%	2.8%	2.4%

1.2. 에탄올 추출

레몬 및 황칠나무 가지, 잎 부위를 정제수로 이물질을 제거한 뒤에 80°C의 열풍건조기(SC-OV72, 성찬화학) 내에 48시간동안 방치하여 수분을 제거하였다. 그 후 파쇄 한 뒤 각 원료를 칭량하고 질량의 7배의 70%의 주정에탄올을 추출용매로 하여 초음파추출장치(SM30-CEP, 애니택코리아)로 초음파처리를 한 후 7일간 침지시켜 추출하였고, 여과지로 여과한 후, 여과액을 회전식 진공 증발기(N-1200BSW, 렙코퍼레이션)로 감압 농축하여 건조시켜 분말화 하여 사용하였다.(이하, ‘DME라 함), 수율은 하기 표 2에 기재하였다.

에탄올 추출 수율

구분	황칠나무 가지	황칠나무 잎	레몬
수율	3.6%	3.0%	2.6%

실시예 2. 지표성분 분석

분말화된 레몬과 황칠나무 잎, 가지 부위의 지표성분 분석을 위한 지표성분에 대하여 레몬은 Limonene으로 설정이 되었다. 황칠의 경우 베타-아미린(β-amyrin)을 지표물질로 설정하여 실험을 진행하였다.

레몬과 황칠나무 잎, 가지 부위를 표 3과 같은 조건으로 HPLC 분석을 하여 그 결과들은 도 1 및 2에 나타내었다.

HPLC 분석결과 조건

흡광도	용매	Column	유속
245nm	3DW : ACN(Merck, 1.14291.4004) (60:40)	C18	0.9/min

실험예 1. 중금속에 의해 유래된 활성산소종의 레몬추출물 및 황칠나무 추출물의 제거 효능 평가

상기 실시예의 시료들의 중금속에 의해 유래된 활성산소종에 대한 제거 효능을 확인하기 위하여 종래문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.(SL Stvolinskii et al., Protective effect of carnosine on Cu, Zn-superoxide dismutase during impaired oxidative metabolism in the brain in vivo, 135(2), 130-132, 2003., WS EUM et al., HIV-1 Tat-mediated protein transduction of Cu,Zn-superoxide dismutase into pancreatic β cells in vitro and in vivo, 37(3), 339-349, 2004)

카드뮴, 납, 수은 등에 투여로 인하여 생체 내에서 산소가 발생되며, 이로 인해 세포막의 지질산화를 유도하기 때문에 체내에서 지질의 비율이 가장 높은 뇌를 대상으로 실험을 계획하였으며, 특히 외부의 변화에 민감한 해마(hippocampus)를 대상으로 실험을 수행하였다.

1.1.실험 동물의 준비

암컷과 수컷 Sprague-Dawley 랫드를 중앙실험동물로부터 구입하였다. 구입한 랫드의 안정화를 위하여 SPF(specific pathogen free)-room 에서 일주일간 사육관리를 통하여 실험을 진행 할 수 있는 상태로 준비하였다.

1.2. 실험 과정

상기 랫트를 대조군, 중금속(납, 카드뮴, 수은) 투여군, 중금속+레몬추출물, 중금속+황칠나무 잎 추출물, 중금속+황칠나무가지추출물 투여군으로 나누어 각 군당 5마리씩을 대상으로 하였으며, 양쪽 해마를 별도로 채취하여 10개의 샘플을 가지고 지질산화의 지표물질로 알려진 malondialdhyde (MDA) level을 ELISA법를 이용하여 확인하였으며, Cu,Zn-superoxide dismutase(STA-340)과 catalase(STA-341)의 활성(activity)은 Cell BioLabs에서 구입하여 ELISA로 측정하였다.

1.3. 실험 결과

상기 실험 결과, 카드뮴을 투여한 군의 경우 MDA level이 급격하게 증가하였으며, 레몬추출물 및 황칠나무 추출물 모든 군에서 카드뮴의 농도를 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 3) . 또한 SOD activity도 카드뮴 투여군에서 유의적으로 감소하였으며, 레몬추출물 및 황칠나무 추출물 모든 군에서 SOD activity가 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 대조군과 유사한 정도의 SOD activity를 나타내었으며 Catalase activity 또한 카드뮴 투여에 의해서 현저하게 감소하는 경향을 확인할 수 있었으나, 레몬추출물 및 황칠나무 추출물 투여군의 경우 catalase activity가 약간만 증가하는 것을 확인한 바, 레몬 추출물 및 황칠나무 추출물의 모든 군들이 SOD에 특히 강한 자극을 나타내었음을 확인하였다 (도 3).

납을 투여한 군의 경우 MDA level이 해마에서 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 레몬추출물 및 황칠나무 추출물 모두에서 납의 농도를 감소시키는 것을 확인할 수 있었으나, 레몬추출물 투여군의 경우 통계적인 유의성을 확인할 수 없었으나, 황칠나무 추출물을 투여한 경우에는 유의성을 확인할 수 있었음. 한편 SOD activity는 납을 투여한 경우에 오히려 상승하는 패턴을 확인할 수 있었으며, 레몬추출물 및 황칠나무 추출물을 투여한 경우에 SOD 활성(activity)이 감소함을 확인할 수 있었다 (도 4).

수은을 투여한 군에서 수은에 의해 MDA level이 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었음. 그러나 레몬추출물 및 황칠나무잎 추출물을 투여한 군에서 MDA level은 수은을 단독으로 투여한 군과 유사하게 관찰되었으며 한편 황칠나무 가지 추출물을 투여한 군에서는 MDA level이 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었으며 SOD 활성(activity)은 수은을 투여한 군에서 유의적으로 감소가 되었으며, 레몬추출물, 황칠나무 잎, 황칠나무 가지 추출물을 투여한 경우에 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

실험예 2. 중금속 해독관련 유전자 발현에 대한 효과

상기 실시예의 시료들의 중금속 해독관련 유전자 발현에 대한 효능을 확인하기 위하여 각각의 실험을 하기와 같이 수행하였다.(Kim. I.S et al., Protective effect of Chrysanthemum indicum Linne against 1-methyl-4-phenylpridinium ion and lipopolysaccharide-induced cytotoxicity in cellular model of Parkinson's disease, 49(4), 963-973, 2011)

LPS(Lipopolysccharide)로 자극받은 세포에서 황칠나무 잎 주정 추출물의 처리가 세포의 산화적 스트레스 및 생존에 관련된 interleukin cytokine 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase)s 등의 유전자에서 어떠한 발현 변화를 발생하는지와 더불어 중금속에 의한 세포사멸의 기전 및 후보 원료의 detoxification작용 기전을 확인하고 있다. Interleukin은 RT-PCR을 이용하여 확인을 하며, MAPKs 의 확인은 western blotting으로 확인을 한다.

2.1. RT - PCR 법

시료를 호모게나이저(X120, CAT)로 homogenization한 후에 chloroform으로 상분리(phase seperation)을 시킨 후에 이소프로판올(isopropanol)을 이용하여 RNA precipitation을 행하고 75% EtOH로 RNA를 세척(washing)한 후에 DEPC(Diethyl pyrocarbonate) water에 RNA를 넣어 녹였다. 그후 cDNA를 합성하여 RT-PCR을 이용하여 분석하였다.

2.2. western blot 분석법

MAPKs의 확인은 polyacrylamide(161-0156, Bio-Rad)를 이용하여 만든 10~15%의 gel을 사용하여 전기영동법(electrophoresis)으로 protein을 검사하였다. protein은 알려진 방법 (Towbin et al, 1979; H Schagger, 2006, Nature protocols)에 따라 acrylamide로부터 PVDF membrane(161-0177, Bio-Rad)으로 transfer를 하였으며, skim milk(170-6404, Bio-Rad)로 만든 blocking buffer 에 상온으로 1시간 반응시켰다. 그런 후에 0.1% Tween 20을 함유한 TBS-T 용액으로 15 분간 3 회 세척하고 MAPKs antibody를 함유한 blocking buffer에 담궈 4℃에서 overnight시켜 protein 에 붙였으며, horse radish peroxidase와 link된 2차 항체를 함유한 blocking buffer에서 상온으로 1시간 배양하고 0.1% Tween 20을 함유한 TBS-T 용액으로 15 분간 3 회 세척한다. 세척이 끝난 membrane은 ECL kit로 LAS-3000 (FUJI, Japan)을 이용하여 측정하였다

2.3 실험 결과

LPS로 자극된 세포에 황칠나무 잎 추출물을 농도별로 처리를 하였다. 그 결과 LPS에 의해 유도된 IL-1β cytokine은 황칠 나무 잎 추출물에 의하여 농도 의존적으로 감소하였으며 앞서 수행된 세포독성이 없는 50ug/mL의 최고 농도에서 가장 큰 저해능을 보였다. 또한 IL-6 cytokine도 마찬가지로 황칠나무 잎 추출물의 농도 의존적으로 감소함을 나타내었으며 50ug/mL의 농도에서 가장큰 저해효과를 보였다 (도 6).

LPS로 자극된 세포에 황칠나무 잎 추출물을 농도별로 처리를 하였다. 그 결과 LPS에 의해 유도된 p38은 황칠 나무 잎 추출물에 의하여 농도 의존적으로 감소하였으며 앞서 수행된 세포독성이 없는 50ug/mL의 최고 농도에서 가장 큰 저해능을 보였다. JNK 또한 황칠나무 잎 추출물의 농도 의존적으로 감소함을 나타내었으며 50ug/mL의 농도에서 가장 큰 저해효과를 보였다 (도 7).

실험예 3. 동물실험을 통한 중금속 배출효능 평가

3.1. 실험군의 구성

레몬추출물 및 황칠나무추출물이 카드뮴, 납, 수은 등의 중금속을 효과적으로 배출하는지를 확인하기 위해 수컷 Sprague-Dawley 랫드(6주령, 암컷, 수컷, 약 250g)를 중앙실험동물로부터 구입하여 사용하였으며, 각 군당 10마리를 배정하여 총 130마리의 동물을 본 실험에 사용하였다. 대조군에는 아무런 물질을 투여하지 않았으며, 중금속, 레몬추출물 및 황칠나무 추출물은 하기 표 4와 같은 농도로 매일 투여하였으며, 투여 4주 후에 동물을 희생하여 혈액을 채취하여 중금속의 배출정도를 확인하였다.

실험군의 구성

실험군의 구성
대조군	CTL
카드뮴 투여군	Cd (cadmium chloride) - 3 mg/kg, SC)
카드뮴+레몬추출물 투여군	Cd+LE (100 mg/kg, PO)
카드뮴+황칠나무잎추출물 투여군	Cd+DME (leaf) (100 mg/kg, PO)
카드뮴+황칠나무가지추출물 투여군	Cd+DME (stem) (100 mg/kg, PO)
납투여군	Pb (lead acetate) - 25 mg/kg, IP
납+레몬추출물 투여군	Pb+LE
납+황칠나무잎추출물 투여군	Pb+DME (leaf)
납+황칠나무가지추출물 투여군	Pb+DME (stem)
수은투여군	Hg (dimethylmercury) - 5 ug/kg, IP
수은+레몬추출물 투여군	Hg+LE
수은+황칠나무잎추출물 투여군	Hg+DME (leaf)
수은+황칠나무가지추출물 투여군	Hg+DME (stem)

3.2. 혈액 중 중금속 농도 측정

중금속 및 추출물을 4주간 투여한 다음, 마지막 투여 2시간 후에 동물을 zoletil(zoletil 50, Virbac) 을 이용하여 과마취를 시킨 후에 혈액 중 납, 수은, 카드뮴의 검출을 위해서 혈청을 채취하고 또한 뇌조직, 간에서 산화적 손상 및 항산화효소의 조직내 분포를 확인하기 위하여 조직을 채취하였다.

납은 원자흡수분광광도법-흑연로법(R.J. Porra et al., Biochemica et Biophysica Acta., 975., 384-394., 1989) 을 사용하여, 원자에 높은 열을 가해 원자를 들뜬 상태로 만든 후 Pb 원자가 217.0 nm에서 광흡수가 이루어지는 것을 이용하여 정량 평가하고, 수은은 cold vapor generation 법(Varian Instruments at work, ; AA-32, 1983; AA60, 1986; AA-65, 1986.)을 이용하여 원자에 열을 가하지 않고 Tin(II) chloride dihydrate (SnCl₂)로 수은을 기체상태 환원시킨 후 광흡수를 보이는 253.7 nm에서 정량 평가하였다. 또한 카드뮴은 원자흡광광도-흑연로법 검사원리 원자에 높은 열을 가해 원자를 들뜬 상태로 만든 후 Pb 원자가 228.8 nm에서 광흡수가 이루어지는 것을 이용하여 정량 평가하였다.

본 실험 결과 납은 대조군에서는 혈액 중에 평균 0.472 ug/L를 관찰할 수 있었으며, 납을 투여한 동물에서는 급격하게 증가하여 납의 농도가 14.03 ug/L를 나타내었다. 한편 레몬추출물을 투여한 군의 경우 납의 농도가 급격하게 감소하여 7.54 ug/L를 나타내었으며, 황칠나무 잎 추출물의 경우 6.547 ug/L, 황칠나무가지 추출물의 경우 7.487 ug/L을 나타내어 황칠나무 잎 추출물의 배설효과가 가장 높게 관찰되었으나, 레몬추출물 및 황칠나무 추출물 사이의 유의성을 관찰되지 않았다 (도 8).

한편 카드뮴은 대조군의 혈액에서는 0.033 ug/L가 관찰되었음. 한편 카드뮴을 투여한 군의 경우 카드뮴 농도가 급격하게 증가하여, 평균 6.086 ug/L를 관찰할 수 있었음. 레몬추출물의 경우에는 카드뮴 농도가 감소하여 평균 3.832 ug/L를 나타내었으며, 황칠나무잎 추출물의 경우 2.865 ug/L, 황칠나무가지 추출물의 경우 2.014 ug/L의 카드뮴 농도를 나타내어, 카드뮴의 제거에 황칠나무 가지 추출물의 효능이 월등히 좋은 것을 확인할 수 있었으며, 통계학적으로도 유의성을 관찰할 수 있었다 (도 9).

수은은 대조군의 혈액에서 평균 0.006 ppm을 관찰할 수 있어, 매우 적은 양이 관찰되었음. 수은을 투여한 군의 경우 평균 1.394 ppm이 관찰되어 농도가 높게 관찰되었으며, 레몬추출물을 투여한 군의 경우 1.136 ppm이 관찰되어 감소를 하였다. 한편 황칠나무 잎 추출물을 투여한 군의 경우 1.172 ppm이 관찰되어 레몬추출물과 유사한 양상으로 관찰되었고 황칠나무가지 추출물을 투여한 경우 0.889 ppm의 수은이 검출되어 수은을 투여한 군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으나, 레몬 추출물 및 황칠나무 잎 추출물과는 통계적인 유의성을 확인할 수 없었다 (도 10).

하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 정제의 제조

DMW 추출물 ------------------------------------------ 25 mg

유당 ------------------------------------------------ 50 mg

전분 ------------------------------------------------ 10 mg

스테아린산 마그네슘 ---------------------------------- 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 2. 캅셀제의 제조

DMW 추출물 ------------------------------------------ 25 mg

유당 ------------------------------------------------ 30 mg

전분 ------------------------------------------------ 28 mg

탈크 ------------------------------------------------- 2 mg

스테아린산 마그네슘 ---------------------------------- 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

제제예 3. 현탁제의 제조

DME 추출물 ----------------------------------------- 500 mg

이성화당 --------------------------------------------- 10 g

설탕 ------------------------------------------------ 30 mg

나트륨 CMC ----------------------------------------- 100 mg

레몬향 ----------------------------------------------- 적량

정제수 적량 가하여 전체 ---------------------------- 100 ㎖

상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조방법에 따라 현탁제를 제조하고 100 ㎖ 용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.

제제예 4. 산제의 제조

DMW 추출물 ----------------------------------------- 250 mg

유당 ------------------------------------------------ 30 mg

전분 ------------------------------------------------ 20 mg

스테아린산 마그네슘 ---------------------------------- 적량

상기의 성분을 긴밀히 혼합하고 폴리에틸린이 코팅된 포에 충진하고 씰링하여 산제를 제조하였다.

제제예 5. 연질캅셀의 제조

연질캅셀제 1정 중 함량

DME 추출물 ------------------------------------------ 500 mg

폴리에틸렌글리콜 400 -------------------------------- 400 mg

농글리세린 ------------------------------------------- 55 mg

정제수 ----------------------------------------------- 35 mg

폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 다음 정제수를 투입하고 이 혼합물을 약 60 ℃로 유지한 상태에서 플라본을 넣고 교반기로 약 1,500 rpm으로 교반하면서 균일하게 혼합한 후 서서히 교반하면서 실온으로 냉각하고 진공펌프를 사용하여 기포를 제거하고 연질캅셀의 내용물로 한다.

연질캅셀의 피막은 일반적으로 널리 알려진 젤라틴, 가소제의 소프트 처방으로 하여 1 캅셀당 젤라틴 132 mg, 농글리세린 52 mg, 디솔비톨액 70 % 6 mg 및 착향제로 에틸바닐린 적량, 코팅기제로 카르나우바납을 사용하여 통상의 조제방법으로 제조한다.

제제예 6. 건강기능식품의 제조

DMW 추출물 ---------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 ---------------------------------------- 20 g

비타민 A 아세테이트 --------------------------------- 70 ㎍

비타민 E ------------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B₁ ------------------------------------------ 0.13 ㎎

비타민 B₂ ------------------------------------------ 0.15 ㎎

비타민 B₆ ------------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ ------------------------------------------ 0.2 ㎍

비타민 C -------------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ---------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ------------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ------------------------------------------------ 50 ㎍

판토텐산 칼슘 -------------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 --------------------------------------- 적 량

황산제1철 ----------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 ------------------------------------------ 0.82 ㎎

탄산마그네슘 -------------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ----------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 ----------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ------------------------------------------ 90 ㎎

탄산칼슘 ------------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 -------------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

DME 추출물 ----------------------------------------- 1000 ㎎

구연산 --------------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 --------------------------------------------- 100 g

매실농축액 --------------------------------------------- 2 g

타우린 ------------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 전체 -------------------------------- 900 ㎖

통상의 건강기능음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강기능음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1. 황칠 나무(Dendropanax morbifera Lev.)의 잎 또는 가지부위를 세척 및 세절 후 70%(v/v) 주정 에탄올을 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안 초음파 추출법 또는 환류 추출법을 1 내지 20회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 얻은 황칠나무의 70%(v/v) 주정 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 카드뮴(Cd), 수은(Hg), 또는 납(Pb)으로부터 선택된 중금속 인체 축적으로 인한 빈혈, 헤모글로빈뇨증, 혈뇨, 황달, 오심, 구토, 복통, 호흡곤란, 불안감, 권태감, 신경손상, 기억력 감소의 증상, 기관지염, 폐기종, 빈혈, 신장결석증, 당뇨, 단백뇨, 아미노산뇨. 이따이이따이병, 고혈압, 또는 기형유발의 치료 및 예방을 위한 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 황칠 나무(Dendropanax morbifera Lev.)의 잎 또는 가지부위를 세척 및 세절 후 70%(v/v) 주정 에탄올을 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안 초음파 추출법 또는 환류 추출법을 1 내지 20회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 얻은 황칠나무의 70%(v/v) 주정 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 카드뮴(Cd), 수은(Hg), 또는 납(Pb)으로부터 선택된 중금속 인체 축적으로 인한 빈혈, 헤모글로빈뇨증, 혈뇨, 황달, 오심, 구토, 복통, 호흡곤란, 불안감, 권태감, 신경손상, 기억력 감소의 증상, 기관지염, 폐기종, 빈혈, 신장결석증, 당뇨, 단백뇨, 아미노산뇨. 이따이이따이병, 고혈압, 또는 기형유발의 예방 및 개선용 건강기능식품.
6. 삭제

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