KR101265872B1 - 프래럽토린 a 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis, comprising praeruptorin A or pharmaceutical salt thereof as an active ingredient}

본 발명은 프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

인체의 골조직은 조골세포에 의한 골 재형성(Bone formation)과 파골세포에 의한 골 재흡수(Bone resorption) 과정과 같은 골의 리모델링(Bone remodeling)이 평생동안 끊임없이 반복되어 이루어진 역동적인 기관이다. 골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이와 같은 기능을 하는 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포, 파골세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 이들 중 파골세포는 조혈모세포로부터 유래한 세포로서 노화된 골의 흡수를 담당하며, 조골세포는 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 세포로서 골 형성에 주된 역할을 담당한다.

이 중 파골세포는 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포가 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand)에 의해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다. 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수하는 역할을 한다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MAPK, 또는 NF-κB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다(Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30, 305, 211-4). 따라서 RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.

골 질환의 대표적인 예인 골다공증은 골의 재흡수와 재형성 사이의 균형이 깨어져서 골 재흡수 속도가 빨라짐에 따라 골의 칼슘이 빠져 일어나게 되는 골소실로 인한 골절에 의해 급격히 초래되는 질병이다. 선행 연구보고에 의하면 65세 이상에서 잘 오는 노인성 골다공증과 성 호르몬 부족에서 오는 폐경 후 골다공증 뿐만 아니라 요즘은 젊은 학생에게도 편식 등으로 칼슘 섭취가 부족하게 되어 골다공증이 초래되는 것으로 알려져 있다. 그리고 고혈압, 고지혈증, 당뇨병, 간질환, 신부전증, 갑상선 질환, 암, 성기능 감퇴, 스테로이드나 위장약을 장기 복용하는자, 술, 담배, 커피가 심한 자, 고기 많이 먹는 사람, 운동 잘 안하는 사람, 왜소한 사람, 앉아 일하는 사람,위 수술 받은 사람, 요통, 관절염, 근육통이 있는 사람, 오래 누워 있는 사람, 피로를 잘 느끼는 사람 등은 골다공증 발생의 위험이 높아진다. 그러나 그 작용기전은 아직 명확하지 않은 상황이다. 골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절은 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다.

골다공증 치료제를 개발하기 위한 통상적인 실험방법은 일차적으로 파골세포의 활성을 억제시키거나, 조골세포의 활성을 증가시키는 물질을 선택한 후, 인간에서 나타나는 골다공증과 유사한 증상을 보이는 동물을 사용하여 골량이 얼마만큼 회복되고, 골강도가 얼마만큼 회복되었는지 정도로 약효를 평가한다.

골다공증의 원인은 다양하게 생각할 수 있지만, 가장 많은 것이 나이가 드는 것(노화) 또는 여성의 폐경 후의 호르몬 불균형이기 때문에, 현재의 치료는 주로 에스트로겐, 비타민 D나 칼시토닌의 투여가 행해지고 있다. 그러나, 호르몬의 투여는 암(특히, 유방암, 자궁암 등)을 유발할 위험이 있어 안전한 치료 방법이라고는 할 수 없다. 또한, 제2 세대 치료제로서, 비스포스포네이트의 투여도 행해지고 있지만, 투여를 중단하면 리바운드가 발생하는 문제점을 가지고 있다. 또한, 어느 쪽의 방법도 골다공증의 진행을 지연시킬 수는 있어도 일단 감소한 골을 재생시키기는 어려운 단점을 가지고 있다.

또한, 골 질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요하기 때문에, 이에 대한 치료제로 크게 골흡수 억제제와 골형성 자극제가 있다. 이들 중 골 형성 자극제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 골 형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않으므로 임상적으로 널리 사용되기 위해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다. 뿐만 아니라, 골 형성을 자극하기 위한 제제로서 조골세포를 활성화시키기 위한 촉진제 및 파골세포의 골 흡수를 억제하기 위한 억제제는 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 천연물로부터 유래하여 독성이 적고, 파골세포의 분화를 억제할 수 있는 화합물을 찾고자 예의 노력한 결과, 프래럽토린 A(praeruptorinA)가 파골세포의 분화를 현저하게 억제함으로써 골다공증의 예방 및 치료제로 사용될 수 있는 것을 확인하고 발명을 완성하였다.

본 발명은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어, "프래럽토린 A(praeruptorin A)"은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미한다:

[화학식 1]

상기 프래럽토린 A는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 직접 합성하거나 또는 천연물 등으로부터 분리된 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 상기 프래럽토린 A는 전호에서 분리된 화합물일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 프래럽토린 A는 골다공증의 예방 또는 치료용으로 사용된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨,칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "골다공증"이란 뼈에 구조상 아무런 이상이 없으면서 뼈를 구성하는 무기질과 기질의 양이 과도하게 감소하여 뼈에 스펀지처럼 작은 구멍이 많이 나서 무르고 쉽게 부러지는 상태를 말하며, 다른 용어로 골조소증 또는 골소공증이라고도 한다. 상기 골다공증은 일반적으로 골량의 저하, 즉 골밀도의 저하나 골조직이 열화되는 증상을 수반한다.

상기 골다공증은 예컨대, 여성에서의 폐경에 따른 골다공증, 노인성 골다공증 및 난소 적출술에 따른 골다공증 등의 원발성 골다공증; 글루티코르티코이드 유발성 골다공증, 갑상선 기능 항진성 골다공증 고정 유발성 골다공증, 헤파린 유발성 골다공증, 면역 억제 유발성 골다공증, 신부전에 따른 골다공증, 염증성 골다공증, 쿠싱 증후군에 따른 골다공증 및 류마티스성 골다공증 등의 이차성 골다공증; 등과 같은 골 질환 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 표지 마커로 알려져 있는 c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar 및 TRAP의 발현을 효과적으로 억제하므로 골다공증의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골다공증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골다공증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

구체적인 일 실시예에서, 프래럽토린 A는 파골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는 지 확인하고자, 5주령의 수컷 마우스 넙다리뼈와 정강뼈 속의 골수세포를 분리하여, 배양한 후, 프래럽토린 A를 처리하고 파골세포의 형성양상를 확인하였다. 그 결과, 프래럽토린 A의 처리 농도 증가에 따라 파골세포 형성이 감소하였으며, 특히 10 μM 이상의 농도에서는 파골세포의 분화를 현저하게 감소시켜 파골세포 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 내지 3).

또한, 구체적인 다른 실시예에서, 프패럽토린 A가 어떠한 파골세포 분화에서 핵심적인 역할을 담당하는 NFATc1의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 루시퍼레이즈 시험을 수행하였다. 그 결과, 프패럽토린 A 10ng/㎖의 이상의 농도에서 RANKL로 증가된 NFATc1의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

상기와 같이 본 발명의 프래럽토린 A를 포함하는 조성물은 증가된 파골세포의 분화인자들의 발현을 억제함으로써, 파골세포의 형성 및 분화를 억제하여, 궁극적으로 파골세포에 의한 골 재흡수를 제어하고, 골다공증 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 상기 프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "데커신(decursin)"은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 의미한다:

[화학식 2]

상기 데커신은 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 직접 합성하거나 또는 천연물 등으로부터 분리된 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 상기 데커신은 전호에서 분리된 화합물일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 데커신은 골다공증의 예방 또는 치료용으로 사용된다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 앞서 설명한 바와 같다.

구체적인 일 실시예에 있어서, 데커신이 파골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는 지 확인하고자, 5주령의 수컷 마우스 넙다리뼈와 정강뼈 속의 골수세포를 분리하여, 배양한 후, 데커신을 처리하고 파골세포의 형성양상를 확인하였다. 그 결과, 데커신의 처리 농도 증가에 따라 파골세포 형성이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4 및 5).

또한, 본 발명은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 인간을 포함하는 개체에게 투여하여 골다공증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란 골다공증이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 조성물은 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 프래럽토린 A, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 골다공증은 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 사용된 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

바람직하게 상기 건강기능식품은 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함할 수 있다. 상기 데커신은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.

상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

본 발명에 따른 프래럽토린 A은 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함으로써, 과도한 골 재흡수를 억제하여 궁극적으로 골다공증의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은, 프래럽토린 A의 TRAP 염색 결과를 나타낸 그래프이다(NC; negative control, 음성 대조군, PC: positive control, 양성 대조군).
도 2는, 프래럽토린 A 처리에 따른 TRAP 염색에 양성을 나타낸 세포수 카운팅 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 프래럽토린 A 처리에 따른 TRAP 활성도를 흡광도로 나타낸 그래프이다.
도 4는, 데커신의 TRAP 염색 결과를 나타낸 그래프이다(NC; negative control, 음성 대조군, PC: positive control, 양성 대조군).
도 5는, 데커신 처리에 따른 TRAP 염색에 양성을 나타낸 세포수 카운팅 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 프래럽토린 A의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은, 데커신의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은, 파골세포 분화 표지 마커들의 mRNA 발현수준을 RT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 9는, 프래럽토린 A 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 10은, 데커신 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 11은, 프래럽토린 A 처리에 따른 세포 신호전달 경로와 관련된 단백질들의 발현 양상을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 12는, 프래럽토린 A 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 루시퍼라아제 시험으로 확인한 결과이다.
도 13은, 데커신 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 루시퍼라아제 시험으로 확인한 결과이다.
도 14는, 프래럽토린 A 처리에 따른 NFATc1 단백질 과발현에 대한 영향을 레트로바이러스 감염에 따른 형광 활성으로 분석한 결과이다.
도 15는, 데커신 처리에 따른 NFATc1 단백질 과발현에 대한 영향을 레트로바이러스 감염에 따른 형광 활성으로 분석한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험재료

프래럽토린 A(Praeruptorin A)는 STANFORD CHEMICALS에서 구입하였다. 데커신은 shanghai Tauto Biotech에서 구입하였다. 마우스 RANKL과 마우스 M-CSF는 R&D System에서 구입하였다. CCK assay kit는 Dojindo Molecular Technologies에서 구입하였다. phospho (p)-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다. c-Fos와 NFATc1 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사에서 구입하였다. 세포배양에 사용된 최소 기본 알파 변형 배지(Minimal Essential Medium alpha Modification, α-MEM), 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 페니실린, 스트렙토마이신 및 트립신-EDTA는 모두 Gibco-BRL사(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 파골세포의 시험에 사용된 염색키트, 및 기타 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 세포는 습식 조건, 37℃로 5% CO₂의 배양조건하의 배양기에서 배양하였다. 5주령의 ICR 수컷 마우스는 다물사이언스에서 구입하였다.

실시예 2: 파골세포의 배양 및 분화

5주령 생쥐의 넙다리뼈와 정강뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/㎖)가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 포식세포는 M-CSF (30 ng/㎖)와 RANKL (10 ng/㎖)을 첨가하여 배양하고 프래럽토린(Praeruptorin A) 또는 데커신(decursin)을 농도별로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) 용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포는 파골세포로 간주하였다.

실시예 3: TRAP ( tartarate resistance acid phosphatase ) 염색 및 활성도 분석

다핵 파골세포는 10분(프래럽토린) 또는 5분(데커신) 동안 3.7% 포르말린으로 고정하고 10분간 0.1% Triton X-100으로 세포막의 투과성이 높아지면 TRAP 용액의 처리에 의해 붉게 염색된다. 붉게 염색된 파골세포는 3개 이상의 핵을 갖는 것만 파골세포로 인정하였다. TRAP 활성도는 TRAP이 염색된 파골세포에 3mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich)가 함유된 TRAP 완충용액(100mM sodium citrate pH 5.0, 50mM sodium tartrate)을 처리하여 37℃에서 5분간 반응시키고 반응된 상층액을 새로운 플레이트에 옮긴 후 0.1 N NaOH를 동량으로 첨가해 405 nm에서 흡광도를 확인하였다.

그 결과, 도 1 내지 3에 나타나듯이 음성 대조군(NC)에 비하여 RANKL에 의하여 유도된 양성 대조군(PC)은 확연하게 많은 수의 붉게 염색된 파골세포가 형성된 것을 관찰할 수 있었다. 또한 이 때, 프래럽토린 A를 처리하면 농도 의존적으로 TRAP 활성도를 억제하면서 붉게 염색된 파골세포 수를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.

또한, 도 4 및 5에 나타나듯이, 데커신 또한 프래럽토린 A와 마찬가지로 농도의존적으로 TRAP 활성을 감소시켜 파골세포의 수를 현저하게 감소시켰다.

상기와 같이, 프래럽토린 A와 데커신이 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로 골다공증과 ?은 골 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 세포독성 분석

포식세포는 1×10⁴/well의 밀도로 96-well plate에서 프래럽토린 A(Praeruptorin A)와 M-CSF (30 ng/㎖), 또는 데커신(decursin)과 M-CSF (30 ng/㎖)를 첨가하여 3일간 배양하였다. 3일 후, CCK 용액 50 ㎕를 각각의 well에 첨가하고 4시간 배양 후 ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.

그 결과, 도 6 및 7에 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 대조군의 생존률 100%에 대하여, 프래럽토린 A 또는 데커신을 농도 별로 처리하여도 세포 생존률이 크게 감소하지 않아 세포독성이 거의 없는 것을 확인하였다.

실시예 5: RT-PCR 분석

파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커들의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였고, 구체적으로 c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar 및 TRAP의 양상을 확인하였다. 실험방법은 RNA는 상기 실시예 2에서 배양한 세포들에서 TRIzol (Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1 ㎍은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR green을 이용한 real-time PCR 증폭으로 결과를 얻었다.

그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이 아무것도 처리하지 않은 세포 중 마커의 발현 수준을 0으로 두었을 때, 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL 처리시 모든 마커들의 발현 양상이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명에 따른 프래럽토린 A를 처리한 경우, 증가한 파골세포 분화 마커들의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다

실시예 6: 웨스턴 블롯 분석

파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커 중 NFATc1의 단백질 발현 양상을 확인하고, 프래럽토린 A 및 데커신이 어느 경로를 경유하여 파골세포의 분화에 작용하는 것인지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

구체적으로 실시예 2에서 배양한 세포는 용해 버퍼(50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease inhibitors)를 이용하여 용해하였고, 원심분리 (14,000 rpm)를 수행하여 순수한 단백질을 얻었다. 단백질은 DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10% SDS-polyacrilamide gel에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막 (Amersham Biosciences)으로 옮기고 항체를 이용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 9 및 10에 나타나듯이, NFATc1의 단백질 발현은 RANKL의 처리로 증가하였으며, 프래럽토린 A 또는 데커신의 처리로 현저하게 감소하여 아무것도 처리하지 않은 세포의 발현과 유사한 수준으로 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 11에 나타나듯이, 여러 단백질 중에서 특히 P38의 인산화가 현저하게 억제되었는 바, 본 발명에 따른 프래럽토린 A는 P38의 인산화 정도를 조절하는 것으로 파골세포 분화에 관여하는 것을 알 수 있었다.

실시예 7: 루시퍼레이즈 분석

본 발명에 따른 프래럽토린 A 또는 데커신이 파골세포 분화 표지 마커인 NFATc1의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 루시퍼레이즈 시험을 수행하였다.

구체적으로, 루시퍼레이즈가 붙어있는 NFATc1, PGL-Rel, RANK 벡터와 Lipofectamine 2000을 섞어서 HEK293T 세포에 첨가해 6시간 동안 감염시켜 각 형질들을 도입시켰다. 형질이 도입된 HEK293T 세포는 RANKL(50 ng/㎖)과 프래럽토린 A(Praeruptorin A) 또는 데커신(decursin)을 처리하여 2일간 배양하였다. 배양한 HEK293T 세포는 용해 버퍼를 이용해 세포를 용해시킨 후, 원심분리를 통해 상층액을 얻었다. 상층액은 white plate (96 well)에 10 ㎕씩 분주한 후 LARII 용액을 50 ㎕/well씩 첨가해 READER 측정(FL_luminometer)하였다. 측정한 후 Stop & Gloreagent를 20 ㎕/well씩 첨가해서 다시 READER 측정(RL_luminometer)하였다.

그 결과, 도 12에 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군을 1이라 하고, 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL을 처리하면 NFATc1의 형광발현이 증가하고, 프래럽토린 A를 처리하면, 증가된 발현을 현저하게 낮추고, 특히 10 μM 이상의 농도에서는 음성 대조군보다 더 낮은 발현 정도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 13에 나타나듯이 RANKL을 처리한 양성 대조군을 100%로 두었을 때, 데커신의 처리에 따라 농도의존적으로 NFATc1의 형광발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 레트로바이러스 준비와 감염

레트로바이러스는 pMX-IRES-GFP (retrovirus vector, GFP) 또는 pMX (CA)-NFATc1(구조적으로 활성을 갖는)과 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 함께 첨가한 Plat-E세포(platinum-E retrovirus packaging cell line)로부터 얻었다. 48시간동안 Plat-E세포로부터 만들어진 바이러스 상층액은 polybrene (10 ㎍/㎖)을 첨가하여 BMM에 8시간 동안 처리함으로써 감염시켰다. 감염된 BMM은 M-CSF (30 ng/㎖), RANKL (10 ng/㎖)과 프래럽토린 A 또는 데커신을 처리하여 4일간 배양하였다.

그 결과, 도 14 및 15에 나타나듯이 파골세포 분화에서 프래럽토린 A 또는 데커신에 의해 분화가 억제되었고 NFATc1의 과발현에 의해 분화가 rescue됨을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 통계분석

실험의 정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다.

<110> Industry-Academy Cooperation Corps of Sunchon National University <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis, comprising praeruptorin A or pharmaceutical salt thereof as an active ingredient <130> PA120922KR <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mOSCAR <400> 1 agggaaacct catccgtttg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mOSCAR <400> 2 gagccggaaa taaggcacag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c-src <400> 3 ccaggctgag gagtggtact 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c-src <400> 4 cagcttgcgg atcttgtagt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TRAP <400> 5 gatgactttg ccagtcagca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TRAP <400> 6 acatagccca caccgttctc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for DC-STAMP <400> 7 ccaaggagtc gtccatgatt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for DC-STAMP <400> 8 ggctgctttg atcgtttctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for c-Fos <400> 9 ccagtcaaga gcatcagcaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for c-Fos <400> 10 aagtagtgca gcccggagta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NFATc1 <400> 11 gggtcagtgt gaccgaagat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NFATc1 <400> 12 ggaagtcaga agtgggtgga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Cathepsin K <400> 13 ggccaactca agaagaaaac 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Cathepsin K <400> 14 gtgcttgctt cccttctgg 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 15 aactttggca ttgtggaagg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 16 acacattggg ggtaggaaca 20

Claims (8)

1. 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 골다공증의 예방 또는 치료는 파골세포의 분화를 억제하는 것에 의한 것인 약학적 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
   
5. 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 골다공증의 예방 또는 치료는 파골세포의 분화를 억제하는 것에 의한 것인 건강기능식품.
   
7. 삭제
8. 제5항에 있어서, 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함하는 것인 건강기능식품.
   
   

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