WO2014084669A1 - 프래럽토린 a 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

프래럽토린 a 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2014084669A1
WO2014084669A1 PCT/KR2013/011018 KR2013011018W WO2014084669A1 WO 2014084669 A1 WO2014084669 A1 WO 2014084669A1 KR 2013011018 W KR2013011018 W KR 2013011018W WO 2014084669 A1 WO2014084669 A1 WO 2014084669A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
osteoporosis
pharmaceutically acceptable
acceptable salt
praeruptorin
treatment
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/011018
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
손영진
김광진
Original Assignee
순천대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 순천대학교 산학협력단 filed Critical 순천대학교 산학협력단
Publication of WO2014084669A1 publication Critical patent/WO2014084669A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis, including a fructorin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a dietary supplement for preventing or improving osteoporosis, and a fructorin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It relates to a method for preventing or treating osteoporosis comprising the step of administering.
  • Bone tissue of the human body is a dynamic organ in which bone remodeling, such as bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts, is repeated continuously throughout life.
  • Bone tissue is composed of cartilage and skeletal system, mechanical functions of supporting and muscle attachment, protecting the organs and bone marrow, and preserving them to maintain the homeostasis of calcium and phosphorus ions.
  • Bone tissue that functions like this is composed of cell substrates such as collagen and glycoprotein, and various kinds of cells such as osteoblasts, osteoclasts and osteocytes. Of these, osteoclasts are derived from hematopoietic stem cells and are responsible for uptake of aged bone.
  • Osteoblasts are cells derived from bone marrow stromal cells and play a major role in bone formation.
  • RAW264.7 monocyte cells of the mouse are differentiated into multinucleated osteoclasts by RANKL (receptor activator of nuclear factor ⁇ B (RANK) ligand).
  • RANKL receptor activator of nuclear factor ⁇ B (RANK) ligand.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • RANKL binding to RANK
  • NF- ⁇ B transcription factor NF- ⁇ B
  • RANKL when RANKL binds to RANK, it promotes the activity of TRAF6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6), thereby promoting the activity of transcription factors such as MAPK or NF- ⁇ B, AP-1, NFATc1 (Lee ZH, Kim). HH.Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts.Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30, 305, 211-4). Therefore, blocking of signaling pathways activated by RANKL has been recognized as one of the therapeutic approaches for the treatment of bone diseases including osteoporosis.
  • TRAF6 tumor necrosis factor receptor-associated factor 6
  • Osteoporosis a representative example of bone disease, is a disease caused by a fracture due to bone loss caused by calcium loss of bone as the balance between bone resorption and remodeling is broken and the bone resorption rate is increased. According to a previous study, it is known that osteoporosis is caused by lack of calcium intake due to unbalanced diet among young students as well as postmenopausal osteoporosis which is well-being from 65 and older and postmenopausal osteoporosis.
  • osteoporosis is known to cause a variety of fractures, especially femoral fractures, which are easily caused by bone weakness, rather than the symptoms themselves, to limit the long-term activity and lead a healthy life, resulting in 15% of the elderly deaths. have.
  • Conventional test methods for developing osteoporosis treatments include selecting animals that primarily inhibit osteoclast activity or increase osteoblast activity, and then determine how much bone mass is used in animals with symptoms similar to osteoporosis in humans. Recovery, and how much bone strength has been recovered to evaluate the efficacy.
  • the causes of osteoporosis can be thought of in various ways, but since most of them are aging (aging) or hormonal imbalances after menopause in women, current treatment is mainly administered estrogen, vitamin D or calcitonin. However, the administration of hormones is not a safe treatment method because of the risk of cancer (especially breast cancer, uterine cancer, etc.). Moreover, although bisphosphonate is also administered as a 2nd generation therapeutic agent, it has a problem that rebound generate
  • bone resorption inhibitors and bone formation stimulants as a treatment for this.
  • studies on bone formation stimulants have been actively conducted, but since bone mineralization by bone formation stimulants does not necessarily mean reduction of fractures, more research is needed to be widely used clinically.
  • accelerators for activating osteoblasts and inhibitors for inhibiting bone resorption of osteoclasts, as agents for stimulating bone formation generally require long-term administration to patients, so it is desirable to have low toxicity and oral administration. There is a great need for research.
  • fruptorin A significantly inhibits osteoclast differentiation, thereby preventing and treating osteoporosis. It was confirmed that it could be used to complete the invention.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoporosis, which comprises praeruptorin A (praeruptorin A) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a dietary supplement for the prevention or improvement of osteoporosis comprising praparuptor A (praeruptorin A) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Yet another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating osteoporosis, which comprises administering praeruptorin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • the fructorin A according to the present invention can suppress the excessive bone resorption and ultimately can be usefully used as a composition for the prevention and treatment of osteoporosis.
  • Figure 1 is a graph showing the TRAP staining results of the prapartorin A (NC; negative control, negative control, PC: positive control, positive control).
  • Figure 2 is a graph showing the cell number counting results positive for TRAP staining according to the treatment with fracturin A.
  • Figure 3 is a graph showing the absorbance of the TRAP activity according to the treatment with fracturin A.
  • NC negative control, negative control
  • PC positive control, positive control
  • 5 is a graph showing the cell number counting result positive for TRAP staining according to the Deckerin treatment.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of the cytotoxicity test of Fraptorin A.
  • Figure 9 shows the results confirmed by Western blot experiments NFATc1 protein expression according to the treatment with fracturin A.
  • Figure 11 shows the results confirmed by Western blot experiments, the expression of proteins related to the cell signaling pathway following the treatment with fracturin A.
  • Figure 13 shows the results of confirming the NFATc1 protein expression according to the decusin treatment by luciferase test.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoporosis comprising praparuptor A (praeruptorin A) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • ransruptorin A refers to a compound represented by the following formula (1):
  • the fracturin A may be purchased commercially, synthesized directly, or used to be separated from natural products, but is not limited thereto.
  • the fractorin A may be a compound separated from the previous issue.
  • the fructurin A is used for the prevention or treatment of osteoporosis.
  • the term “pharmaceutically acceptable salts” refers to formulations of compounds that do not cause serious irritation to the organism to which the compound is administered and do not impair the biological activity and properties of the compound.
  • the pharmaceutically acceptable salts are acids that form non-toxic acid addition salts containing pharmaceutically acceptable anions, such as inorganic acids, such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, and tartaric acid.
  • Organic carbonic acid such as formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trichloroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicylic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfate Acid addition salts formed by sulfonic acids and the like such as phonic acid and the like.
  • carboxylic acid salts include metal salts or alkaline earth metal salts formed by lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, amino acid salts such as lysine, arginine, guanidine, dicyclohexylamine, N Organic salts such as -methyl-D-glucamine, tris (hydroxymethyl) methylamine, diethanolamine, choline and triethylamine and the like.
  • osteoporosis refers to a state in which the bones are free of fragile and easily broken due to excessive decrease in the amount of minerals and substrates constituting the bones without any structural abnormalities in the bones, and other Also known as osteoporosis or osteoporosis.
  • the osteoporosis is usually accompanied by a decrease in bone mass, that is, a decrease in bone density or deterioration of bone tissue.
  • the osteoporosis may include, for example, primary osteoporosis such as osteoporosis following menopause in women, senile osteoporosis and osteoporosis following ovarian extraction; Secondary osteoporosis such as glutocorticoid-induced osteoporosis, hyperthyroidism, osteoporosis, fixed-induced osteoporosis, heparin-induced osteoporosis, immunosuppression-induced osteoporosis, osteoporosis following renal failure, inflammatory osteoporosis, osteoporosis due to Cushing's syndrome, and rheumatoid osteoporosis; It may be any one or more of bone diseases such as, but not limited to.
  • the composition of the present invention effectively inhibits the expression of c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar and TRAP, which are known as markers for differentiation of osteoclasts, and thus are useful as prophylactic or therapeutic agents for osteoporosis.
  • c-Fos NFATc1
  • DC-STAMP DC-STAMP
  • c-src cathepsin K
  • oscar TRAP
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of osteoporosis by administration of the composition of the present invention
  • treatment refers to the composition of the composition of the present invention.
  • administration it means any action that improves or beneficially changes the symptoms caused by osteoporosis.
  • luciferase tests were performed to determine whether frapporin A inhibits the expression of NFATc1, which plays a key role in osteoclast differentiation. As a result, it was confirmed that the expression of NFATc1 increased to RANKL markedly reduced at a concentration of at least 10 ng / ml of fruptorin A (FIG. 8).
  • the composition comprising the fructorin A of the present invention inhibits the expression of increased osteoclast differentiation factors, thereby inhibiting the formation and differentiation of osteoclasts, ultimately controlling bone resorption by osteoclasts, In addition, it was confirmed that the osteoporosis disease can be effectively treated.
  • composition comprising the fructurin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention as an active ingredient may further include decursin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the decusin may be purchased commercially, synthesized directly, or used separated from natural products, but is not limited thereto. Preferably, the decusin may be a compound separated from the previous issue. For the purposes of the present invention, the decusin is used for the prevention or treatment of osteoporosis.
  • the pharmaceutically acceptable salts are as described above.
  • composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the active ingredient.
  • the carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition of the present invention can be used in the form of powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to conventional methods. .
  • it may be prepared by using diluents or excipients such as fillers, weighting agents, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants which are commonly used.
  • Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like.
  • Such solid preparations may be prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used.
  • It may be prepared by adding various excipients such as humectants, sweeteners, fragrances, preservatives and the like in addition to liquid oral liquids or liquid paraffin for oral use.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository utopsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally (e.g., intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is based on the condition and weight of the patient, and the degree of disease. Depending on the drug form, route of administration, and time, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the present invention provides a method for preventing or treating osteoporosis comprising administering praeruptorin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • the fructurin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered in a pharmaceutical composition.
  • the method may further comprise administering decursin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the term "individual" means all animals including humans who have already developed or may have osteoporosis, and the composition of the present invention has an effect of effectively preventing and treating the disease by administering to the individual. have.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment in a medical treatment, the effective dose level being the type of subject and its severity, age , Sex, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the present invention provides a dietary supplement for the prevention or improvement of osteoporosis, which comprises praeruptorin A (praeruptorin A) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • praeruptorin A praeruptorin A
  • the fructorin A, its pharmaceutically acceptable salts and osteoporosis are as described above.
  • improvement means any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, such as the extent of symptoms.
  • the dietary supplement may further comprise decursin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the decusin is as described above.
  • the health functional food includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, Organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like. Others may contain pulp for the production of natural fruit juices and fruit juice drinks and vegetable drinks. These components can be used independently or in combination.
  • the health functional food is any one of meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, gum, ice cream, soup, beverage, tea, functional water, drink, alcoholic beverage and vitamin complex Can be.
  • the health functional food may further include food additives, and the suitability as a "food additive" is related to the relevant items according to the General Regulations and General Test Act of the Food Additives Code approved by the Food and Drug Administration unless otherwise specified. Judging by the standards and standards.
  • Items listed in the "Food Additives Code” include, for example, chemical synthetic products such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, cinnamon acid, natural additives such as navy, licorice extract, crystalline cellulose, guar gum, L- Mixed preparations, such as a glutamate sodium preparation, a noodles addition alkali preparation, a preservative preparation, and a tar pigment preparation, are mentioned.
  • chemical synthetic products such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, cinnamon acid, natural additives such as navy, licorice extract, crystalline cellulose, guar gum, L- Mixed preparations, such as a glutamate sodium preparation, a noodles addition alkali preparation, a preservative preparation, and a tar pigment preparation, are mentioned.
  • Extracts according to the present invention added to foods, including beverages in the process of producing the health functional food can be appropriately added or reduced its content as needed.
  • Praparruptorin A was purchased from STANFORD CHEMICALS. Deckerin was purchased from shanghai Tauto Biotech. Mouse RANKL and mouse M-CSF were purchased from the R & D System. The CCK assay kit was purchased from Dojindo Molecular Technologies. Phospho (p) -JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I- ⁇ B antibody was used as a product of Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). c-Fos and NFATc1 antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).
  • ⁇ -MEM Minimal Essential Medium alpha Modification
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • Penicillin Streptomycin
  • Trypsin-EDTA used for cell culture are all from Gibco-BRL (Grand Island). , NY, USA).
  • Staining kits and other reagents used for testing osteoclasts were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Cells were incubated in wet conditions at 37 ° C. under incubation conditions of 5% CO 2 . Five-week-old ICR male mice were purchased from Multiscience.
  • the femur and tibia of five-week-old mice were separated and bone marrow cells were washed with a 1cc syringe to obtain bone marrow cells.
  • the isolated myeloid cells were cultured in ⁇ -minimum essential medium ( ⁇ -MEM) medium containing 10% FBS, antibiotics, M-CSF (30 ng / ml) for 3 days. After 3 days, the attached cells were used as bone marrow macrophage (BMM). Phagocytes were incubated with M-CSF (30 ng / ml) and RANKL (10 ng / ml) and treated with Praparruptorin A or decursin at different concentrations. After 4 days, the cultured cells were stained with tartarate resistance acid phosphatase (TRAP) solution (Sigma Aldrich, USA) and the cells stained in red were considered osteoclasts.
  • TRAP tartarate resistance acid phosphatase
  • Example 3 tartarate resistance acid phosphatase staining and activity analysis
  • the multinucleated osteoclasts are stained red by treatment with TRAP solution after 10 minutes (fraptorin) or 5 minutes (deckerin) fixation with 3.7% formalin and 10% 0.1% Triton X-100 for increased cell membrane permeability.
  • the red stained osteoclasts were recognized as osteoclasts only with three or more nuclei.
  • TRAP activity was treated by TRAP stained osteoclasts treated with TRAP buffer containing 3 mM p -nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich) (100 mM sodium citrate pH 5.0, 50 mM sodium tartrate) for 5 minutes at 37 °C and reacted The solution was transferred to a new plate and 0.1 N NaOH was added in the same amount to confirm absorbance at 405 nm.
  • decosin also reduced TRAP activity in a concentration-dependent manner, similar to the fructorin A significantly reduced the number of osteoclasts.
  • osteoporosis and B can be usefully used for bone diseases because the fructorin A and decusin effectively inhibit osteoclast differentiation.
  • Phagocytic cells were treated with Praparruptorin A and M-CSF (30 ng / ml) or decursin and M-CSF (30 ng /) in 96-well plates at a density of 1 ⁇ 10 4 / well. Ml) was added and incubated for 3 days. After 3 days, 50 ⁇ l of CCK solution was added to each well, and after 4 hours of incubation, the absorbance was confirmed at 450 nm using an ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA).
  • the cells cultured in Example 2 were lysis buffer (50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease Inhibitors were used to dissolve and centrifuged (14,000 rpm) to obtain pure protein. Proteins were quantified using a DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and the same amount of protein was isolated from 10% SDS-polyacrilamide gel. The separated protein was transferred to PVDF membrane (Amersham Biosciences) and the degree of protein expression was confirmed using the antibody.
  • lysis buffer 50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease Inhibitors
  • Luciferase test was performed to determine whether the fructorin A or decusin according to the present invention inhibits the expression of the osteoclast differentiation marker NFATc1.
  • NFATc1, PGL-Rel, RANK vector, and luciferase-coated Lipofectamine 2000 were mixed and added to HEK293T cells for 6 hours to infect each trait.
  • Transduced HEK293T cells were incubated for 2 days with RANKL (50 ng / ml) and Praparruptorin A or decursin.
  • Cultured HEK293T cells were lysed using a lysis buffer, and then the supernatant was obtained by centrifugation. The supernatant was dispensed into 10 ⁇ l of white plate (96 wells), and then 50 ⁇ l / well of LARII solution was added for READER measurement (FL_luminometer). After the measurement, the Stop & Gloreagent was added to 20 ⁇ l / well, and then READER measurement (RL_luminometer) was performed.
  • the negative control without any treatment was 1, and when RANKL induced osteoclast differentiation was increased, fluorescence expression of NFATc1 was increased. Significantly lower, especially at concentrations of 10 ⁇ M or more was confirmed to show a lower expression than the negative control.
  • Retrovirus is a Plat-um-E retrovirus packaging cell line containing pMX-IRES-GFP (retrovirus vector (GFP) or pMX (CA) -NFATc1 (structurally active) and Lipofectamine 2000 (Invitrogen) )
  • Virus supernatants made from Plat-E cells for 48 hours were infected by addition of polybrene (10 ⁇ g / ml) to BMM for 8 hours. Infected BMM was incubated for 4 days with M-CSF (30 ng / ml), RANKL (10 ng / ml) and Fraptorin A or Decusin.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품, 및 프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프래럽토린 A은 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함으로써, 과도한 골 재흡수를 억제하여 궁극적으로 골다공증의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품, 및 프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
인체의 골조직은 조골세포에 의한 골 재형성(Bone formation)과 파골세포에 의한 골 재흡수(Bone resorption) 과정과 같은 골의 리모델링(Bone remodeling)이 평생동안 끊임없이 반복되어 이루어진 역동적인 기관이다. 골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이와 같은 기능을 하는 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포, 파골세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 이들 중 파골세포는 조혈모세포로부터 유래한 세포로서 노화된 골의 흡수를 담당하며, 조골세포는 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 세포로서 골 형성에 주된 역할을 담당한다.
이 중 파골세포는 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포가 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand)에 의해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다. 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수하는 역할을 한다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MAPK, 또는 NF-κB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다(Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30, 305, 211-4). 따라서 RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.
골 질환의 대표적인 예인 골다공증은 골의 재흡수와 재형성 사이의 균형이 깨어져서 골 재흡수 속도가 빨라짐에 따라 골의 칼슘이 빠져 일어나게 되는 골소실로 인한 골절에 의해 급격히 초래되는 질병이다. 선행 연구보고에 의하면 65세 이상에서 잘 오는 노인성 골다공증과 성 호르몬 부족에서 오는 폐경 후 골다공증 뿐만 아니라 요즘은 젊은 학생에게도 편식 등으로 칼슘 섭취가 부족하게 되어 골다공증이 초래되는 것으로 알려져 있다. 그리고 고혈압, 고지혈증, 당뇨병, 간질환, 신부전증, 갑상선 질환, 암, 성기능 감퇴, 스테로이드나 위장약을 장기 복용하는자, 술, 담배, 커피가 심한 자, 고기 많이 먹는 사람, 운동 잘 안하는 사람, 왜소한 사람, 앉아 일하는 사람,위 수술 받은 사람, 요통, 관절염, 근육통이 있는 사람, 오래 누워 있는 사람, 피로를 잘 느끼는 사람 등은 골다공증 발생의 위험이 높아진다. 그러나 그 작용기전은 아직 명확하지 않은 상황이다. 골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절은 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다.
골다공증 치료제를 개발하기 위한 통상적인 실험방법은 일차적으로 파골세포의 활성을 억제시키거나, 조골세포의 활성을 증가시키는 물질을 선택한 후, 인간에서 나타나는 골다공증과 유사한 증상을 보이는 동물을 사용하여 골량이 얼마만큼 회복되고, 골강도가 얼마만큼 회복되었는지 정도로 약효를 평가한다.
골다공증의 원인은 다양하게 생각할 수 있지만, 가장 많은 것이 나이가 드는 것(노화) 또는 여성의 폐경 후의 호르몬 불균형이기 때문에, 현재의 치료는 주로 에스트로겐, 비타민 D나 칼시토닌의 투여가 행해지고 있다. 그러나, 호르몬의 투여는 암(특히, 유방암, 자궁암 등)을 유발할 위험이 있어 안전한 치료 방법이라고는 할 수 없다. 또한, 제2 세대 치료제로서, 비스포스포네이트의 투여도 행해지고 있지만, 투여를 중단하면 리바운드가 발생하는 문제점을 가지고 있다. 또한, 어느 쪽의 방법도 골다공증의 진행을 지연시킬 수는 있어도 일단 감소한 골을 재생시키기는 어려운 단점을 가지고 있다.
또한, 골 질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요하기 때문에, 이에 대한 치료제로 크게 골흡수 억제제와 골형성 자극제가 있다. 이들 중 골 형성 자극제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 골 형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않으므로 임상적으로 널리 사용되기 위해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다. 뿐만 아니라, 골 형성을 자극하기 위한 제제로서 조골세포를 활성화시키기 위한 촉진제 및 파골세포의 골 흡수를 억제하기 위한 억제제는 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다.
본 발명자들은 천연물로부터 유래하여 독성이 적고, 파골세포의 분화를 억제할 수 있는 화합물을 찾고자 예의 노력한 결과, 프래럽토린 A(praeruptorinA)가 파골세포의 분화를 현저하게 억제함으로써 골다공증의 예방 및 치료제로 사용될 수 있는 것을 확인하고 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 프래럽토린 A은 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함으로써, 과도한 골 재흡수를 억제하여 궁극적으로 골다공증의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, 프래럽토린 A의 TRAP 염색 결과를 나타낸 그래프이다(NC; negative control, 음성 대조군, PC: positive control, 양성 대조군).
도 2는, 프래럽토린 A 처리에 따른 TRAP 염색에 양성을 나타낸 세포수 카운팅 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 프래럽토린 A 처리에 따른 TRAP 활성도를 흡광도로 나타낸 그래프이다.
도 4는, 데커신의 TRAP 염색 결과를 나타낸 그래프이다(NC; negative control, 음성 대조군, PC: positive control, 양성 대조군).
도 5는, 데커신 처리에 따른 TRAP 염색에 양성을 나타낸 세포수 카운팅 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 프래럽토린 A의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은, 데커신의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은, 파골세포 분화 표지 마커들의 mRNA 발현수준을 RT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 9는, 프래럽토린 A 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 10은, 데커신 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 11은, 프래럽토린 A 처리에 따른 세포 신호전달 경로와 관련된 단백질들의 발현 양상을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과이다.
도 12는, 프래럽토린 A 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 루시퍼라아제 시험으로 확인한 결과이다.
도 13은, 데커신 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 루시퍼라아제 시험으로 확인한 결과이다.
도 14는, 프래럽토린 A 처리에 따른 NFATc1 단백질 과발현에 대한 영향을 레트로바이러스 감염에 따른 형광 활성으로 분석한 결과이다.
도 15는, 데커신 처리에 따른 NFATc1 단백질 과발현에 대한 영향을 레트로바이러스 감염에 따른 형광 활성으로 분석한 결과이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, "프래럽토린 A(praeruptorin A)"은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2013011018-appb-I000001
상기 프래럽토린 A는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 직접 합성하거나 또는 천연물 등으로부터 분리된 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 상기 프래럽토린 A는 전호에서 분리된 화합물일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 프래럽토린 A는 골다공증의 예방 또는 치료용으로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨,칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "골다공증"이란 뼈에 구조상 아무런 이상이 없으면서 뼈를 구성하는 무기질과 기질의 양이 과도하게 감소하여 뼈에 스펀지처럼 작은 구멍이 많이 나서 무르고 쉽게 부러지는 상태를 말하며, 다른 용어로 골조소증 또는 골소공증이라고도 한다. 상기 골다공증은 일반적으로 골량의 저하, 즉 골밀도의 저하나 골조직이 열화되는 증상을 수반한다.
상기 골다공증은 예컨대, 여성에서의 폐경에 따른 골다공증, 노인성 골다공증 및 난소 적출술에 따른 골다공증 등의 원발성 골다공증; 글루티코르티코이드 유발성 골다공증, 갑상선 기능 항진성 골다공증 고정 유발성 골다공증, 헤파린 유발성 골다공증, 면역 억제 유발성 골다공증, 신부전에 따른 골다공증, 염증성 골다공증, 쿠싱 증후군에 따른 골다공증 및 류마티스성 골다공증 등의 이차성 골다공증; 등과 같은 골 질환 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 표지 마커로 알려져 있는 c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar 및 TRAP의 발현을 효과적으로 억제하므로 골다공증의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골다공증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골다공증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
구체적인 일 실시예에서, 프래럽토린 A는 파골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는 지 확인하고자, 5주령의 수컷 마우스 넙다리뼈와 정강뼈 속의 골수세포를 분리하여, 배양한 후, 프래럽토린 A를 처리하고 파골세포의 형성양상를 확인하였다. 그 결과, 프래럽토린 A의 처리 농도 증가에 따라 파골세포 형성이 감소하였으며, 특히 10 μM 이상의 농도에서는 파골세포의 분화를 현저하게 감소시켜 파골세포 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 내지 3).
또한, 구체적인 다른 실시예에서, 프패럽토린 A가 어떠한 파골세포 분화에서 핵심적인 역할을 담당하는 NFATc1의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 루시퍼레이즈 시험을 수행하였다. 그 결과, 프패럽토린 A 10ng/㎖의 이상의 농도에서 RANKL로 증가된 NFATc1의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 8).
상기와 같이 본 발명의 프래럽토린 A를 포함하는 조성물은 증가된 파골세포의 분화인자들의 발현을 억제함으로써, 파골세포의 형성 및 분화를 억제하여, 궁극적으로 파골세포에 의한 골 재흡수를 제어하고, 골다공증 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 상기 프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "데커신(decursin)"은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 의미한다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2013011018-appb-I000002
상기 데커신은 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 직접 합성하거나 또는 천연물 등으로부터 분리된 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 상기 데커신은 전호에서 분리된 화합물일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 데커신은 골다공증의 예방 또는 치료용으로 사용된다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 앞서 설명한 바와 같다.
구체적인 일 실시예에 있어서, 데커신이 파골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는 지 확인하고자, 5주령의 수컷 마우스 넙다리뼈와 정강뼈 속의 골수세포를 분리하여, 배양한 후, 데커신을 처리하고 파골세포의 형성양상를 확인하였다. 그 결과, 데커신의 처리 농도 증가에 따라 파골세포 형성이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4 및 5).
본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 프래럽토린 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 약학적 조성물에 포함되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 방법은 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란 골다공증이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 조성물은 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 프래럽토린 A, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 골다공증은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
바람직하게 상기 건강기능식품은 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함할 수 있다. 상기 데커신은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험재료
프래럽토린 A(Praeruptorin A)는 STANFORD CHEMICALS에서 구입하였다. 데커신은 shanghai Tauto Biotech에서 구입하였다. 마우스 RANKL과 마우스 M-CSF는 R&D System에서 구입하였다. CCK assay kit는 Dojindo Molecular Technologies에서 구입하였다. phospho (p)-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다. c-Fos와 NFATc1 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사에서 구입하였다. 세포배양에 사용된 최소 기본 알파 변형 배지(Minimal Essential Medium alpha Modification, α-MEM), 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 페니실린, 스트렙토마이신 및 트립신-EDTA는 모두 Gibco-BRL사(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 파골세포의 시험에 사용된 염색키트, 및 기타 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 세포는 습식 조건, 37℃로 5% CO2의 배양조건하의 배양기에서 배양하였다. 5주령의 ICR 수컷 마우스는 다물사이언스에서 구입하였다.
실시예 2: 파골세포의 배양 및 분화
5주령 생쥐의 넙다리뼈와 정강뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/㎖)가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 포식세포는 M-CSF (30 ng/㎖)와 RANKL (10 ng/㎖)을 첨가하여 배양하고 프래럽토린(Praeruptorin A) 또는 데커신(decursin)을 농도별로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) 용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포는 파골세포로 간주하였다.
실시예 3: TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) 염색 및 활성도 분석
다핵 파골세포는 10분(프래럽토린) 또는 5분(데커신) 동안 3.7% 포르말린으로 고정하고 10분간 0.1% Triton X-100으로 세포막의 투과성이 높아지면 TRAP 용액의 처리에 의해 붉게 염색된다. 붉게 염색된 파골세포는 3개 이상의 핵을 갖는 것만 파골세포로 인정하였다. TRAP 활성도는 TRAP이 염색된 파골세포에 3mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich)가 함유된 TRAP 완충용액(100mM sodium citrate pH 5.0, 50mM sodium tartrate)을 처리하여 37℃에서 5분간 반응시키고 반응된 상층액을 새로운 플레이트에 옮긴 후 0.1 N NaOH를 동량으로 첨가해 405 nm에서 흡광도를 확인하였다.
그 결과, 도 1 내지 3에 나타나듯이 음성 대조군(NC)에 비하여 RANKL에 의하여 유도된 양성 대조군(PC)은 확연하게 많은 수의 붉게 염색된 파골세포가 형성된 것을 관찰할 수 있었다. 또한 이 때, 프래럽토린 A를 처리하면 농도 의존적으로 TRAP 활성도를 억제하면서 붉게 염색된 파골세포 수를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.
또한, 도 4 및 5에 나타나듯이, 데커신 또한 프래럽토린 A와 마찬가지로 농도의존적으로 TRAP 활성을 감소시켜 파골세포의 수를 현저하게 감소시켰다.
상기와 같이, 프래럽토린 A와 데커신이 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로 골다공증과 B은 골 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 세포독성 분석
포식세포는 1×104/well의 밀도로 96-well plate에서 프래럽토린 A(Praeruptorin A)와 M-CSF (30 ng/㎖), 또는 데커신(decursin)과 M-CSF (30 ng/㎖)를 첨가하여 3일간 배양하였다. 3일 후, CCK 용액 50 ㎕를 각각의 well에 첨가하고 4시간 배양 후 ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.
그 결과, 도 6 및 7에 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 대조군의 생존률 100%에 대하여, 프래럽토린 A 또는 데커신을 농도 별로 처리하여도 세포 생존률이 크게 감소하지 않아 세포독성이 거의 없는 것을 확인하였다.
실시예 5: RT-PCR 분석
파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커들의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였고, 구체적으로 c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar 및 TRAP의 양상을 확인하였다. 실험방법은 RNA는 상기 실시예 2에서 배양한 세포들에서 TRIzol (Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1 ㎍은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR green을 이용한 real-time PCR 증폭으로 결과를 얻었다.
그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이 아무것도 처리하지 않은 세포 중 마커의 발현 수준을 0으로 두었을 때, 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL 처리시 모든 마커들의 발현 양상이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명에 따른 프래럽토린 A를 처리한 경우, 증가한 파골세포 분화 마커들의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 웨스턴 블롯 분석
파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커 중 NFATc1의 단백질 발현 양상을 확인하고, 프래럽토린 A 및 데커신이 어느 경로를 경유하여 파골세포의 분화에 작용하는 것인지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
구체적으로 실시예 2에서 배양한 세포는 용해 버퍼(50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease inhibitors)를 이용하여 용해하였고, 원심분리 (14,000 rpm)를 수행하여 순수한 단백질을 얻었다. 단백질은 DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10% SDS-polyacrilamide gel에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막 (Amersham Biosciences)으로 옮기고 항체를 이용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 9 및 10에 나타나듯이, NFATc1의 단백질 발현은 RANKL의 처리로 증가하였으며, 프래럽토린 A 또는 데커신의 처리로 현저하게 감소하여 아무것도 처리하지 않은 세포의 발현과 유사한 수준으로 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 11에 나타나듯이, 여러 단백질 중에서 특히 P38의 인산화가 현저하게 억제되었는 바, 본 발명에 따른 프래럽토린 A는 P38의 인산화 정도를 조절하는 것으로 파골세포 분화에 관여하는 것을 알 수 있었다.
실시예 7: 루시퍼레이즈 분석
본 발명에 따른 프래럽토린 A 또는 데커신이 파골세포 분화 표지 마커인 NFATc1의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 루시퍼레이즈 시험을 수행하였다.
구체적으로, 루시퍼레이즈가 붙어있는 NFATc1, PGL-Rel, RANK 벡터와 Lipofectamine 2000을 섞어서 HEK293T 세포에 첨가해 6시간 동안 감염시켜 각 형질들을 도입시켰다. 형질이 도입된 HEK293T 세포는 RANKL(50 ng/㎖)과 프래럽토린 A(Praeruptorin A) 또는 데커신(decursin)을 처리하여 2일간 배양하였다. 배양한 HEK293T 세포는 용해 버퍼를 이용해 세포를 용해시킨 후, 원심분리를 통해 상층액을 얻었다. 상층액은 white plate (96 well)에 10 ㎕씩 분주한 후 LARII 용액을 50 ㎕/well씩 첨가해 READER 측정(FL_luminometer)하였다. 측정한 후 Stop & Gloreagent를 20 ㎕/well씩 첨가해서 다시 READER 측정(RL_luminometer)하였다.
그 결과, 도 12에 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군을 1이라 하고, 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL을 처리하면 NFATc1의 형광발현이 증가하고, 프래럽토린 A를 처리하면, 증가된 발현을 현저하게 낮추고, 특히 10 μM 이상의 농도에서는 음성 대조군보다 더 낮은 발현 정도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 13에 나타나듯이 RANKL을 처리한 양성 대조군을 100%로 두었을 때, 데커신의 처리에 따라 농도의존적으로 NFATc1의 형광발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 레트로바이러스 준비와 감염
레트로바이러스는 pMX-IRES-GFP (retrovirus vector, GFP) 또는 pMX (CA)-NFATc1(구조적으로 활성을 갖는)과 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 함께 첨가한 Plat-E세포(platinum-E retrovirus packaging cell line)로부터 얻었다. 48시간동안 Plat-E세포로부터 만들어진 바이러스 상층액은 polybrene (10 ㎍/㎖)을 첨가하여 BMM에 8시간 동안 처리함으로써 감염시켰다. 감염된 BMM은 M-CSF (30 ng/㎖), RANKL (10 ng/㎖)과 프래럽토린 A 또는 데커신을 처리하여 4일간 배양하였다.
그 결과, 도 14 및 15에 나타나듯이 파골세포 분화에서 프래럽토린 A 또는 데커신에 의해 분화가 억제되었고 NFATc1의 과발현에 의해 분화가 rescue됨을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 통계분석
실험의 정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다.

Claims (8)

  1. 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 골다공증의 예방 또는 치료는 파골세포의 분화를 억제하는 것에 의한 것인 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  4. 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  5. 제5항에 있어서, 상기 골다공증의 예방 또는 치료는 파골세포의 분화를 억제하는 것에 의한 것인 건강기능식품.
  6. 제5항에 있어서, 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함하는 것인 건강기능식품.
  7. 프래럽토린 A(praeruptorin A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료 방법.
  8. 제7항에 있어서, 데커신(decursin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
PCT/KR2013/011018 2012-11-30 2013-11-29 프래럽토린 a 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2014084669A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120138539A KR101265872B1 (ko) 2012-11-30 2012-11-30 프래럽토린 a 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR10-2012-0138539 2012-11-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014084669A1 true WO2014084669A1 (ko) 2014-06-05

Family

ID=48666516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/011018 WO2014084669A1 (ko) 2012-11-30 2013-11-29 프래럽토린 a 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101265872B1 (ko)
WO (1) WO2014084669A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107753480A (zh) * 2017-12-05 2018-03-06 云南中医学院 白花前胡丁素在制备药物性肝损伤保护药物中的应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101799533B1 (ko) 2016-03-16 2017-11-20 경희대학교 산학협력단 텍토리게닌을 포함하는 골 형성 촉진용 조성물
CN108042527B (zh) * 2017-12-05 2020-02-07 云南中医学院 白花前胡乙素在制备药物性肝损伤保护药物中的用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR950007844A (ko) * 1993-09-07 1995-04-15 서정욱 항암제로서의 데커신
WO2000023074A1 (en) * 1998-10-22 2000-04-27 Binex Co., Ltd. Pharmaceutical composition containing decursin
US20040162337A1 (en) * 2003-01-30 2004-08-19 Fong Wang Fun Chemical compounds having therapeutic activities in treating cancer
KR100715887B1 (ko) * 2006-11-27 2007-05-09 우석대학교 산학협력단 부정맥의 예방용 기능성 식품
WO2012090205A2 (en) * 2010-12-28 2012-07-05 Kamedis Ltd. Plant extracts for the treatment and prevention of infections

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR950007844A (ko) * 1993-09-07 1995-04-15 서정욱 항암제로서의 데커신
WO2000023074A1 (en) * 1998-10-22 2000-04-27 Binex Co., Ltd. Pharmaceutical composition containing decursin
US20040162337A1 (en) * 2003-01-30 2004-08-19 Fong Wang Fun Chemical compounds having therapeutic activities in treating cancer
KR100715887B1 (ko) * 2006-11-27 2007-05-09 우석대학교 산학협력단 부정맥의 예방용 기능성 식품
WO2012090205A2 (en) * 2010-12-28 2012-07-05 Kamedis Ltd. Plant extracts for the treatment and prevention of infections

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107753480A (zh) * 2017-12-05 2018-03-06 云南中医学院 白花前胡丁素在制备药物性肝损伤保护药物中的应用
CN107753480B (zh) * 2017-12-05 2020-02-07 云南中医学院 白花前胡丁素在制备药物性肝损伤保护药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR101265872B1 (ko) 2013-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014189328A1 (ko) 구기자잎 추출 분말과 베타인을 유효성분으로 함유하는 항비만 조성물
WO2014084669A1 (ko) 프래럽토린 a 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US8822705B2 (en) Pharmaceutical composition for preventing and/or treating bone disease, functional food or health food and pharmaceutical preparation comprising thereof as active ingredient
KR20200079203A (ko) 블루베리 추출물을 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물
US20070232703A1 (en) Composition for preventing and/or treating bone disease, physiologically functional or health food containing thereof, and pharmaceutical containing thereof as active ingredients
WO2011008052A2 (ko) 콜포신 다로페이트를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2017026641A1 (ko) Gypenoside lxxv를 포함하는 자궁경부암의 예방 또는 치료용 조성물
KR100910622B1 (ko) 연근 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품
WO2020235828A1 (ko) 곽향 추출물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 억제용 조성물 및 이의 용도
KR101308144B1 (ko) 아젤라신 ｄ를 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2023085741A1 (ko) 3'-시알릴락토오스, 6'-시알릴락토오스 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 감염에 의한 다발성 장기부전의 예방 또는 치료용 조성물
WO2015068940A1 (ko) 아르테미시닌을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물
WO2017082478A1 (ko) 콩 발아배아 추출물을 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2018080276A1 (ko) 담즙산을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2018043989A1 (ko) 아피제닌, 커큐민 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021010762A1 (ko) 벤토나이트를 유효성분으로 포함하는 대사성 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101457117B1 (ko) 관중 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품
KR101502465B1 (ko) 고량강 추출물을 포함하는 골 관련 질환 또는 혈관 석회화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102157421B1 (ko) 진토닌을 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2020122373A1 (ko) 자감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR102142112B1 (ko) 골 질환 예방 또는 치료용 화합물 및 이의 용도
KR100718490B1 (ko) 파골세포 분화억제 효과를 갖는 대추 추출물 및 이를 포함하는 건강기능식품 조성물
WO2018066954A1 (ko) 올레아놀린산 아세테이트를 유효성분으로 포함하는 약제에 의해 유발되는 신장독성의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR102206831B1 (ko) 메로터페노이드계 화합물 및 그의 용도
WO2018147517A1 (ko) 꼬막단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13857874

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13857874

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1