WO2018080276A1 - 담즙산을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

담즙산을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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ischemia
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bile acid
reperfusion injury
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권현철
장형석
김경리
김정민
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention, treatment or amelioration of ischemic reperfusion injury comprising bile acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the lack of oxygen is called ischemia.
  • Ischemia irreversibly damages cells and leads to necrosis of tissues.
  • the brain or heart are the most sensitive body organs that are sensitive to a lack of blood supply.
  • ischemic cascades are triggered, resulting in a permanent tissue. Is damaged.
  • the reflow of blood flow after ischemia is called reperfusion.
  • the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is formed in the mitochondrial inner membrane, and when mPTP is opened, molecules of 1500 Da or less may enter the mitochondrial membrane.
  • the result of mPTP opening is the swelling and ultimate rupture of the outer mitochondrial membrane, with the post-combustion of oxidative phosphorylation, subsequent release of stored calcium and proapoptotic factors. Release of stored calcium can lead to mitochondrial permeability transition (MPT) in nearby mitochondria, leading to calcium overload, generation of reactive oxygen species (ROS), and chain reactions through cells. Then, depending on the energy state of the cell, apoptosis or necrosis occurs that leads to irreversible tissue and organ damage.
  • MTT mitochondrial permeability transition
  • ROS reactive oxygen species
  • mPTP mitochondrial-mediated apoptosis and necrosis in the pathogenesis of many diseases.
  • the present inventors have confirmed that ischemic reperfusion injury can be suppressed by deoxycholic acid, cholic acid, and lytocholic acid in bile acids while studying the relationship between mPTP and bile acids, thereby completing the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic reperfusion injury and a food composition for the prevention or improvement of ischemic reperfusion injury, including bile acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic reperfusion injury, including bile acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also provides a food composition for preventing or ameliorating ischemic reperfusion injury comprising bile acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • bile acids increase the level of intranuclear beta-catenin, interfere with the opening of mitochondrial permeability transition pores, and have an excellent effect of improving tissue damage and reducing infarct size in ischemic reperfusion injury animal models. It can be usefully used to prevent, treat or ameliorate reperfusion injury.
  • 1 is a diagram showing the results confirmed by the nuclear beta-catenin Luciferase assay whether the cholic acid, lithopholic acid, deoxycholic acid increases the beta-catenin level in the nucleus.
  • Figure 2 is a diagram showing the results confirmed by the western blot ( ⁇ -catenin nucleus movement by time after treatment of deoxycholic acid (DCA).
  • Figure 3 is a diagram showing the results confirmed by TMRM (Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate) staining whether cholic acid, litocholic acid, deoxycholic acid has an effect of protecting the mitochondria.
  • TMRM Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate
  • Figure 4 shows the results of the cell proliferation effect through the staining method using the cell counting method (FIG. 4A) and CCK-8 (FIG. 4B) in human umbrical vein endothelial cells (HUVEC) by treating TauroCA, cholic acid and lytocholic acid of bile acids. The figure shown.
  • FIG. 5 shows the results of cell migration effect through staining in human umbrical vein endothelial cells (HUVEC) by treating TauroCA, cholic acid and lytocholic acid of bile acids (FIG. 5A) and counting the number of cells that have passed through the membrane using the Boyden chamber.
  • Fig. 5B shows one result.
  • FIG. 6 is a diagram showing a tissue photograph of a mouse model confirming a mouse reperfusion injury inhibitory effect of bile acid (FIG. 6A), and a diagram showing a result of quantifying the area of infarct tissue in% relative to the total area in the tissue photograph (FIG. 6B). .
  • FIG. 7 is a diagram showing the staining results using Annexin-Vivo750 fluorescent dye to confirm the inhibitory effect of myocardial necrosis by reperfusion injury by deoxycholic acid in bile acids (Fig. 7A) and the effect of reducing the myocardial death by concentration of deoxycholic acid Fig. 7B shows the result of.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic reperfusion injury, including bile acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • bile acid has an excellent effect of increasing the intranuclear level of beta-catenin, preventing the opening of mitochondria permeable transition pore (mPTP) and improving tissue damage and reducing infarct size in ischemic reperfusion impaired animal models. It can be usefully used for preventing, treating or ameliorating damage.
  • mPTP mitochondria permeable transition pore
  • the bile acids in the present invention are ursodeoxycholic acid, glycochenDCA (glycochenodeoxycholic acid), TauroDCA (Taurodeoxycholic acid), Glycocholic acid, TauroCA (Taurocholic acid), ChenoDCA (Chenodeoxycholic acid).
  • Oxycholic acid), cholic acid (Cholic acid), dehydrocholic acid (Dehydrocholic acid), lithocholic acid (Lithocholic acid) and deoxycholic acid (Deoxycholic acid, DCA) may be one or more selected from the group consisting of , Butyric acid or deoxycholic acid, but is not limited thereto.
  • the cholic acid, lithocholic acid and deoxycholic acid of the present invention can effectively prevent and treat ischemic reperfusion injury even at low concentrations.
  • Pharmaceutically acceptable salts of bile acids include salts of acidic or basic groups that may be present in bile acids, unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, dihydrogen Phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts. It can be prepared through.
  • sodium glycolate, taurorate sodium salt but is not limited thereto.
  • ischemic injury refers to damage caused by reduced oxygen transfer while blocking blood circulation in organs that require blood flow, such as heart, brain, and kidney, and may cause fatal damage to tissue function and cell death. Includes damage.
  • Possible causes of ischemic injury include vascular disease, coronary thrombosis, cerebrovascular thrombosis, aneurysm rupture, systemic bleeding, crush injury, sepsis, severe skin burns, vascular occlusion surgery methods (e.g. spinal cord during thoracoabdominal aneurysm surgery) Ischemia), cardiopulmonary bypass methods, organ transplantation, cardiopulmonary collapse (acute cardiac death), and asphyxia.
  • ischemic injury includes ischemic reperfusion injury that may occur by organ transplantation, etc., in addition to ischemic injury that may normally occur.
  • ischemic reperfusion injury refers to myocardial ischemia, cerebrovascular ischemia, renal ischemia, liver ischemia, ischemia reperfusion cardiomyopathy, skin ischemia, intestinal ischemia, intestinal ischemia, gastric ischemia, pulmonary ischemia, pancreatic ischemia, skeletal muscle ischemia, abdominal muscle ischemia.
  • Limb ischemia, ischemia reperfusion colitis, mesenteric ischemia and asymptomatic ischemia may be caused by one or more ischemia selected from, but not limited to.
  • the ischemic reperfusion injury is repair of blood flow in a tissue or organ that has undergone a traumatic, eg, natural event, such as recovery of blood flow after an acute myocardial infarction, or a decrease in blood supply, or restores blood flow in a tissue or organ that has undergone reperfusion surgery, such as a decrease in blood supply. It may be caused by one or more surgical procedures, other therapeutic interventions or organ transplant procedures. Such surgical procedures include, for example, coronary artery bypass grafting, coronary artery formation, organ transplantation, and the like.
  • acute myocardial infarction is a phenomenon in which one of the heart's blood vessels closes, causing oxygen and nutrients to die, causing the heart muscle to die and become necrotic. Death rates can be lowered to within 10%.
  • cardiomyocytes are damaged due to the rapid supply of oxygen due to reperfusion of blocked blood vessels. This is called reperfusion injury, which causes patients to die within 30 days after the procedure. Percentages cause symptoms such as heart failure.
  • reperfusion surgery refers to an operation or procedure for removing blood clots generated in blood vessels and allowing blood flow to flow again, and includes reperfusion-induced manipulations through the use of surgical thrombectomy and stents, and the like.
  • Reperfusion surgery can be used to compensate for the shortcomings of reperfusion therapy (eg, plasminogen activators such as tPA).
  • Proximal thrombectomy is a method of removing thrombi by applying negative pressure by approaching from the proximal part of the thrombus, and mainly using an inhalation device, such as the Penumbra system.
  • Distal thrombectomy is a method of removing a thrombus by hanging a wire from the distal end past the thrombus, mainly using a coil device, such as the Merci system.
  • a stent retriever is a method of inducing reperfusion of blood vessels by placing a stent like a coronary artery.
  • the composition according to the present invention can be applied to various reperfusion surgery aimed at reperfusion in addition to the above-mentioned procedure.
  • Reperfusion surgery in the present invention means, but is not limited to, surgery or procedures performed to treat cerebrovascular disease, arteriosclerosis, cardiovascular disease, and the like.
  • the cerebrovascular disease includes, but is not limited to, stroke, cerebral infarction, thrombosis, cerebral embolism, and the like.
  • the cardiovascular disease includes, but is not limited to, myocardial infarction, angina pectoris and the like.
  • compositions of the present invention may be administered before, concurrently with or after the occurrence of ischemic reperfusion injury, for example for pretreatment for reperfusion surgery.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention are useful for preventing, treating or ameliorating tissues, such as myocardial damage, which are administered into a patient's blood vessels prior to vascular reperfusion surgery and subsequently after reperfusion.
  • the pathology resulting from ischemia, and damage caused by ischemia or ischemic reperfusion can lead to cell death in affected cells, tissues, or organs, leading to damage and dysfunction.
  • the invention provides a method of preventing or treating ischemic reperfusion injury comprising contacting or administering bile acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a cell, tissue, or organ in need thereof.
  • the bile acid of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered to a subject undergoing reperfusion surgery, for example, about 10 minutes prior to reperfusion surgery.
  • Minutes ago about 15 minutes ago, about 20 minutes ago, about 30 minutes ago, about 45 minutes ago, 1 hour ago, about 2 hours ago, about 3 hours ago, about 4 hours ago, about 5 hours ago, about 12 hours Before, about 24 hours, or about 48 hours, preferably about 2 hours.
  • the bile acids or pharmaceutically acceptable salts thereof of the present invention may be administered to a subject after or during reperfusion surgery.
  • bile acids or pharmaceutically acceptable salts thereof may be administered one or more times at regular intervals during the course of reperfusion surgery.
  • bile acids may be administered continuously throughout the duration of the reperfusion surgery.
  • bile acids of the present invention can be administered to a subject undergoing reperfusion surgery after reperfusion surgery.
  • the bile acid of the present invention is applied to a subject undergoing reperfusion surgery, for example, after about 5 minutes, about 10 minutes, about 15 minutes, about 20 minutes, about 30 minutes, about 45 minutes, about 1 hour after reperfusion surgery.
  • the bile acids or acceptable salts thereof of the present invention may also be used to inhibit ischemic or ischemic reperfusion injury to cells, tissues or organs ex vivo (e.g., tissues used in transplantation, organs used in organ transplantation) prior to reperfusion surgery. Can be.
  • the organ before transplanting an organ to a host individual (eg, during storage or transportation of the organ in a sterile environment), the organ is contacted with bile acid (eg, bathed in a composition comprising the bile acid of the present invention), or Ischemic reperfusion injury can be suppressed, and preferably, one intravenous injection prior to reperfusion procedure in individuals with acute myocardial infarction can inhibit heart damage due to reperfusion procedure.
  • bile acid eg, bathed in a composition comprising the bile acid of the present invention
  • composition of the present invention may further include a therapeutic agent for recanalization.
  • pharmaceutical compositions of the present invention can be used in combination with a reperfusion therapy.
  • Bile acids or pharmaceutically acceptable salts thereof of the invention are open inhibitors of mPTPs.
  • bile acids or pharmaceutically acceptable salts thereof of the present invention are agonists of beta-catenin.
  • Bile acids or pharmaceutically acceptable salts thereof of the present invention are for mitochondrial protection.
  • Bile acids or pharmaceutically acceptable salts thereof of the present invention inhibit infarction of tissues.
  • the bile acid or pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention is an agonist of beta-catenin, and the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is opened due to rapid oxygen inflow as the blocked blood vessel is reperfused. Muscle death or necrosis can be greatly reduced, reducing mortality by as much as 10% in 30 days after reperfusion and 30% of heart failure symptoms after the procedure. mPTP is formed in the inner membrane of the mitochondria. When mPTP is opened, mitochondrial depolarization is induced, resulting in mitochondrial dysfunction.
  • mPTP mitochondrial permeability transition pore
  • Bile acid acts as an agonist of beta-catenin to block the opening of mPTPs, thereby inhibiting mitochondrial depolarization, thereby protecting mitochondria and preventing oxidative damage, thereby preventing, treating or improving ischemic reperfusion injury. Effect.
  • compositions comprising the bile acids of the present invention or pharmaceutically acceptable salts thereof may be formulated in the form of injectable or oral formulations.
  • the preparation for injection comprising the pharmaceutical composition of the present invention may be administered via various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, but preferably via intravenous.
  • injectable formulations comprising a pharmaceutical composition of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a subject.
  • the injectable preparation is preferably administered subcutaneously, intramuscularly or intravenously, most preferably intravenously.
  • the oral preparation When administered intravenously, it can be administered by one intravenous injection before reperfusion procedure, and only one intravenous injection can effectively improve the damage to organs such as the heart due to reperfusion procedure.
  • the oral preparation may be selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups and lyophilized agents, but is not limited thereto.
  • the bile acid or pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention may be administered to a subject via intraperitoneal administration, intranasal administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intrathecal injection, inhalation administration, or oral administration.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the age, sex, weight, pathology and severity of the subject to be administered, the route of administration or the judgment of the prescriber. Appropriate dose determinations based on these factors are within the level of those skilled in the art, but can be used at concentrations comparable to FDA approved concentrations or at lower concentrations than FDA approved concentrations.
  • its daily dose may be for example 0.1 mg / kg / day to 10 mg / kg / day, specifically 0.5 mg / kg / day to 5 mg / kg / day, more specifically 0.8 mg / day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered once to three times a day, but is not limited thereto.
  • Formulations for parenteral administration of the pharmaceutical compositions of the invention may be, but are not limited to, injections, drops, lotions, ointments, gels, creams, suspensions, emulsions, suppositories, patches or sprays.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, buffers, dispersants, surfactants, colorants, flavoring or sweetening agents as necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by conventional methods in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or in combination with one or more other therapeutic agents, and may be administered before, after or simultaneously with the other therapeutic agents.
  • the bile acids of the invention and the other therapeutic agents described above may be co-administered simultaneously (eg, in conjunction) as separate formulations or as co-formulations.
  • the agents may be administered sequentially as separate compositions within an appropriate time frame determined by the skilled clinician (eg, sufficient time to allow for the overlap of the pharmaceutical effects of the therapy).
  • Bile acids and one or more other therapeutic agents of the invention are in a sequence suitable to achieve the desired therapeutic effect (eg, reducing and / or inhibiting ischemia, reducing and / or inhibiting ischemic injury; reducing and / or inhibiting ischemic reperfusion injury). As such, it may be administered in a single dose or in multiple doses. Appropriate dosages and dosing regimens can be determined by the clinician and depend on the agent (s) selected, the pharmaceutical formulation and route of administration, various patient factors and other considerations.
  • Suitable therapeutic agents include calcium channel blockers, beta blockers, nitroglycerin, aspirin, anti-inflammatory agents, natriuretic factors, vasodilators, thrombolytics and antithrombolic agents. Including but not limited to.
  • the present invention also provides a food composition for preventing or ameliorating ischemic reperfusion injury comprising bile acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the food composition may be used in health food, the health food in the present invention can be used as it is or add bile acid as it is, or in combination with other food or food ingredients, according to conventional methods.
  • the kind of food there is no particular limitation on the kind of food.
  • the foods include drinks, meat, sausages, breads, biscuits, rice cakes, chocolates, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, alcoholic beverages and vitamins. Combinations and the like, and include all of the health foods in the conventional sense.
  • the bile acids or pharmaceutically acceptable salts thereof of the present invention can be added as is to foods or used with other foods or food ingredients, and can be suitably used according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention or improvement).
  • the amount of bile acid in the health food may be added at 0.01 to 15 weight of the total food weight
  • the health beverage composition may be added in a ratio of 0.02 to 5 g, preferably 0.3 to 1 g based on 100 ml.
  • the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • the health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except bile acid as an essential ingredient in the indicated ratio, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. .
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and Salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the ursodeoxycholic acid and GlycochenDCA were analyzed by Nuclear beta-catenin Luciferase assay.
  • TCF / LEF reporter_HEK293 cell line (BPS bioscience) was used.
  • the TCF / LEF reporter_HEK293 cell line is a stable cell line in which the luciferase is cloned into the TCF / LEF promoter (beta-catenin binding promoter) in the nucleus. It is a cell line.
  • TCF / LEF reporter HEK293 cell line (BPS Bioscience) was dispensed into 24 wells (2 ⁇ 10 5 ) or 96 wells (2 ⁇ 10 4 ) and incubated until the cells adhered to the plate bottom. To make cells at rest, 10% FBS DMEM medium was replaced with 1% FBS medium and cultured for one day. Such bile acids were treated with 1 ⁇ M or 10 ⁇ M in cells and incubated for 24 hours, and then luciferase activity was measured using a luminometer. The measurement result is shown in FIG.
  • DCA Deoxycholic Acid
  • the increase in ⁇ -catenin was observed in the nucleus 30 minutes after DCA treatment, and after 2 hours, the amount of ⁇ -catenin in the nucleus of the cells reached the peak.
  • TauroCA, cholic acid, lithocholic acid, and deoxycholic acid have been shown to increase the level of beta-catenin that interferes with the opening of the mitochondrial permeability trasition pore (mPTP), thereby inhibiting reperfusion damage, thereby enhancing the beta-catenin anti-inflammatory effect.
  • mPTP mitochondrial permeability trasition pore
  • TMRM Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate
  • CCCP chlorophenylhydrazone, 50 ⁇ M
  • CCCP chlorophenylhydrazone, 50 ⁇ M
  • TMRM TMRM
  • Cyp suppressed mitochondrial damage by about 50%
  • lytocholic acid also inhibited mitochondrial damage to a level similar to that of the positive control group.
  • cholic acid and deoxycholic acid had an effect of suppressing mitochondrial damage by about 90%.
  • proliferation assay confirmed that cholic acid and lytocholic acid had a more significant cell proliferation effect than the control group.
  • CCK-8 assay confirmed a significant cell proliferation effect by the cholic acid. Therefore, it was confirmed that cholic acid and lytocholic acid proliferated and exhibited an inhibitory effect of ischemic reperfusion injury.
  • the number of cells was checked using a Boyden chamber to determine whether cell migration effects in human umbrical vein endothelial cells (HUVECs) were treated by 1 ⁇ M treatment of TauroCA, cholic acid, and lytocholic acid in bile acids. After the treatment of TauroCA, cholic acid and litocholic acid, the migration effect of the cells was confirmed, and the results of the above experiments are shown in FIGS.
  • the treatment of cholic acid, TauroCA, and litocholic acid confirmed that cell migration occurred more clearly than the control group.
  • the migration assay was confirmed that the treatment of cholic acid and lytocholic acid has a significant effect of increasing the movement of the cells than the control group, in particular, the cholic acid is about 2 times the cell migration than the control group It was confirmed that the effect has the best transfer effect.
  • mice 8 weeks old were anesthetized using ketamine. After the tube was inserted into the airway and connected to the respirator, the left side of the mouse was calibrated upward and the skin was incised. Open the heart between the ribs 3 and 4 to expose the heart and inject the deoxycholic acid or the cholic acid, which was the most effective in screening and in vitro assay, to the left ventricle by concentration (2, 10, 50 mg / kg) by vascular injection method. After tying up the left coronary artery, it was released and closed for 40 minutes. After 24 hours, the heart was collected, frozen at -20 ° C.
  • the positive control group Cyp (5 mg / kg) showed about 20% reduction in infarct area, whereas when 2 mg / kg of deoxycholic acid was treated, 50% or more, and 2 mg / kg.
  • kg of cholic acid it was confirmed that the reduction of about 50%, and 10mg / kg of cholic acid had an effect of reducing the infarct area by about 40%.
  • the individual died at a concentration of 10 mg / kg or more, and showed an effect at a concentration of 2 mg / kg or less, and in the case of cholic acid, an optimal effect was used at 2 mg / kg. When it was confirmed that the reperfusion damage inhibitory effect was excellent.
  • a mouse myocardial necrosis test was performed using Annexin-Vivo750 fluorescent dye.
  • Annexin-Vivo750 fluorescent dye was added to the mouse model prepared in Example 3 after 24 hours to observe the effect of deoxycholic acid (1, 2, 5 mg / kg (mpk)) for each concentration. 7A and 7B.
  • Annexin dyes are known to bind and fluoresce where cell death has occurred.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare tablets.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
  • Purified water was added to adjust the total volume to 1,000 ml. According to the conventional method for preparing a liquid, the above components are mixed, and then filled into a brown bottle and sterilized to prepare a liquid.
  • 0.1 to 10.0 parts by weight of the food composition of the present invention was added to the flour, and using the mixture, bread, cake, cookies, crackers and noodles were prepared in a conventional manner to prepare foods for health promotion.
  • 0.1-1.0 parts by weight of the food composition of the present invention was added to milk, and various dairy products such as butter and ice cream were prepared in a conventional manner using the milk.

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Abstract

본 발명은 담즙산을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 담즙산은 베타-카테닌의 핵내 수준을 증가시키고 mPTP(mitochondria permeable transition pore)의 개방을 방해하며 허혈성 재관류 손상 동물 모델에서 조직의 손상을 개선하고 경색 크기를 감소시키는 우수한 효과가 있으므로, 허혈성 재관류 손상의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

담즙산을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
혈액은 산소나 영양분을 몸의 각 조직이나 세포로 운반하는 역할을 하는데, 신체기관, 조직 또는 부위로 혈액을 공급하는 혈관이 협착 또는 수축하거나, 정상적인 혈관 생성이 충분히 이루어지지 않아 혈액 공급이 부족하여 산소가 결핍된 상태를 허혈(ischemia)이라고 한다. 허혈은 세포를 비가역적으로 손상시키고 조직의 괴사(necrosis)로 이어지게 된다. 특히, 뇌나 심장은 혈류 공급 부족에 가장 민감한 신체 기관으로서, 예를 들어, 뇌졸중 또는 두부 손상 등으로 조직에 허혈이 발생하면 허혈성 캐스캐이드(ischemic cascade)라고 불리우는 일련의 과정들이 촉발되어 조직이 영구적으로 손상된다. 이러한 조직 손상을 막기 위해 허혈이 생긴 후에 혈류가 다시 흐르는 것을 재관류(reperfusion)라고 한다.
허혈 및 이로 인한 저산소증에 대한 통상적인 치료는, 전신 산소공급을 증가시키거나 또는 혈관 막힘의 원인을 제거하여 혈류 및 산소 전달을 정상 수준으로 복구하는 것이다. 그렇지만, 혈류 및 산소 전달이 복구되면서 허혈 또는 저산소증에 의해 유발되는 손상과 무관하게 추가적으로 세포사 또는 기능 상실이 초래되는 문제가 있다. 혈류 및 산소 전달이 복구되면서 유발되는 추가적 손상은 재관류 손상으로 알려져 있다. 재관류 손상에 의해 유발되는 조직 손상은, 염증성 세포의 재관류된 조직에의 부착, 이들 염증성 세포의 활성화 및 후속되는 자유 라디칼의 형성으로부터 생기는 급성 염증 상태와 유사한 것으로 보인다. 재관류된 조직 내에 자유 라디칼 및 기타 세포독성 생체분자의 생성은 괴사 또는 아폽토시스 경로의 활성화에 의한 세포사를 유발할 수 있다.
한편, mPTP(mitochondrial permeability transition pore)는 미토콘드리아 내막에 형성되어 있으며, mPTP가 개방되면 1500 Da 이하의 분자가 미토콘드리아 막 내로 들어올 수 있다. mPTP 개방의 결과는 산화성 인산화의 탈공역, 저장된 칼슘 및 전아폽토시스 인자의 후속적 방출과 함께 외부 미토콘드리아 막의 종창 및 궁극적 파열 초래이다. 저장된 칼슘의 방출은 칼슘 과적, 활성 산소종(ROS)의 생성 및 세포를 통한 연쇄 반응을 초래하는 인근의 미토콘드리아에서의 MPT(mitochondrial permeability transition)를 야기할 수 있다. 이어서 세포의 에너지 상태에 따라, 비가역적 조직 및 기관 손상을 유도하는 아폽토시스 또는 괴사가 발생한다.
다수의 질환의 병인에서 미토콘드리아-매개된 아폽토시스 및 괴사의 역할은 잘 정립되어 있으며, mPTP가 급성 심근경색, 뇌졸중 및 신경학상 질환, 간염 등을 비롯한 몇몇 질환의 병인 및 진전에서 원인임이 알려져 있다.
특히, 심근경색의 경우, 허혈성 심장 질환에서, 순차적 허혈성 재관류가 괴사 및/또는 아폽토시스에 의해 심근 세포사를 초래하면서 발생한다. 치명적인 재관류 상해 (조직 재관류의 직접 결과로서의 심근세포사)는 최종 심근경색 크기의 50%까지를 차지하는 것으로 생각되고, RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase) 경로 및 mPTP 개방에 의존하는 것으로 알려져 있다.
현재까지 이러한 기능을 하는 mPTP와 담즙산과의 관련성에 대하여는 보고된 바가 없다. 상술한 바와 같이, 발생빈도가 높은 중요 질환인 허혈성 재관류 손상에 대한 효과적인 치료법이 충분하지 않은 실정이므로, 담즙산을 이용한 허혈성 재관류 손상의 효과적인 예방과 치료법이 나온다면 그 파급효과는 매우 클 것으로 보인다.
이에 본 발명자들은 mPTP와 담즙산과의 연관성을 연구하던 중 담즙산 중 데옥시콜산, 콜산 및 리토콜산에 의해 허혈성 재관류 손상을 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 담즙산(bile acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 담즙산(bile acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 담즙산은 베타-카테닌의 핵내 수준을 증가시키고 mPTP(mitochondrial permeability transition pore)의 개방을 방해하며 허혈성 재관류 손상 동물 모델에서 조직의 손상을 개선하고 경색 크기를 감소시키는 우수한 효과가 있으므로, 허혈성 재관류 손상의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 콜산, 리토콜산, 데옥시콜산이 핵 내 베타-카테닌 수준을 증가시키는지 여부를 nuclear beta-catenin Luciferase assay를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 데옥시콜산(DCA)의 처리 후 시간별 β-catenin 핵내 이동을 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 콜산, 리토콜산, 데옥시콜산이 미토콘드리아를 보호하는 효과가 있는지 여부를 TMRM(Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate) 염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 담즙산의 TauroCA, 콜산 및 리토콜산을 처리하여 HUVEC(human umbrical vein endothelial cell)에서 세포 counting 방법(도 4A) 및 CCK-8(도 4B)을 이용한 염색법을 통해 세포 증식 효과의 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 담즙산의 TauroCA, 콜산 및 리토콜산을 처리하여 HUVEC(human umbrical vein endothelial cell)에서 염색법을 통한 세포 이동 효과의 결과(도 5A) 및 Boyden chamber를 이용하여 막을 통과한 세포의 수를 카운팅한 결과를 나타낸 도(도 5B)이다.
도 6은 담즙산의 마우스 재관류 손상 억제 효과를 확인한 마우스 모델의 조직 사진을 나타낸 도(도 6A) 및 상기 조직 사진에서 전체 면적 대비 경색 조직의 면적을 %로 정량한 결과를 나타낸 도(도 6B)이다.
도 7은 담즙산 중 데옥시콜산에 의한 재관류 손상에 의한 심근 괴사의 억제효과를 확인하기 위하여 Annexin-Vivo750 형광 염료를 이용한 염색 결과를 나타낸 도(도 7A) 및 데옥시콜산의 농도별 심근 사멸 감소 효과의 결과를 나타낸 도(도 7B)이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 담즙산(bile acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 담즙산은 베타-카테닌의 핵내 수준을 증가시키고 mPTP(mitochondria permeable transition pore)의 개방을 방해하며 허혈성 재관류 손상 동물 모델에서 조직의 손상을 개선하고 경색 크기를 감소시키는 우수한 효과가 있으므로, 허혈성 재관류 손상의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 담즙산(bile acids) 은 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid), GlycochenDCA (glycochenodeoxycholic acid), TauroDCA(Taurodeoxycholic acid), 글리코콜산(Glycocholic acid), TauroCA(Taurocholic acid), ChenoDCA(Chenodeoxycholic acid, 케노데옥시콜산), 콜산(Cholic acid), 데하이드로콜산(Dehydrocholic acid), 리토콜산(Lithocholic acid) 및 데옥시콜산(Deoxycholic acid, DCA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 콜산, 리토콜산 또는 데옥시콜산이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 콜산, 리토콜산 및 데옥시콜산은 저농도에서도 효과적으로 허혈성 재관류 손상의 예방 및 치료가 가능하다.
담즙산의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 담즙산에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 글리코레이트나트륨염, 타우로레이트나트륨염이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "허혈성 손상"은 심장, 뇌, 신장 등 혈류공급을 필요로 하는 장기에서 혈액순환이 차단되면서 산소 전달이 감소되어 발생하는 손상을 의미하며, 조직의 기능 손상 및 세포사를 초래할 수 있는 치명적 손상을 포함한다. 허혈성 손상을 일으킬 수 있는 원인으로는 혈관 질병, 관상동맥 혈전증, 뇌혈관 혈전증, 동맥류 파열, 전신 출혈, 압궤 손상, 패혈증, 심각한 피부 화상, 혈관 폐색성 수술 방법(예, 흉복 동맥류 수술 과정에서의 척수 허혈), 심폐 우회로 방법, 장기 이식, 심폐 허탈(급성 심장사) 및 질식 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 "허혈성 손상"은 통상적으로 발생할 수 있는 허혈성 손상 외에 장기 이식 등으로 발생할 수 있는 허혈 재관류 손상을 포함한다.
본 발명에서 "허혈성 재관류 손상"은 심근 허혈, 뇌혈관 허혈, 신장 허혈, 간 허혈, 허혈 재관류 심근병증, 피부 허혈, 장관 허혈, 장 허혈, 위 허혈, 폐 허혈, 췌장 허혈, 골격근 허혈, 복근 허혈, 사지 허혈, 허혈 재관류 결장염, 장간막 허혈 및 무증후성 허혈로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 허혈에 의해 생길 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 허혈성 재관류 손상은 외상, 예컨대 급성 심근경색 후 혈류의 복구와 같은 자연적 사건 또는 혈액 공급 감소를 겪었던 조직 또는 기관에서 혈류의 복구, 또는 재관류 수술, 예컨대 혈액 공급 감소를 겪었던 조직 또는 기관에서 혈류를 복구시키는 하나 이상의 외과적 시술, 다른 치료적 개입(therapeutic intervention) 또는 장기 이식 수술과정에 의해 발생할 수 있다. 상기 외과적 시술에는 예를 들어 관상동맥 우회로 조성술, 관상 동맥 형성술, 기관 이식 수술 등이 포함된다.
예를 들어, 급성 심근경색은 심장의 혈관 중 하나가 폐쇄되면서 산소 및 영양공급이 이루어 지지 않아 심장 근육이 사멸, 괴사 되는 현상을 지칭하는데, 이 경우 보통 병원을 찾아와 1시간 이내에 혈관을 재관류 시켜주면 10% 이내로 사망률을 낮출 수가 있다. 하지만 10% 내외에 환자는 막혔던 혈관이 재관류 되면서 급격한 산소 공급으로 인해 심근세포가 손상을 받게 되는데 이를 재관류 손상이라 하고 이로 인하여 10% 내외에 환자가 시술 후 30일 내에 사망을 하고, 살아남은 환자 중에 30% 정도는 심부전 등의 증상을 얻게 된다.
본 발명에서 용어 "재관류 수술"은 혈관내에 생성된 혈전을 제거하고 혈류가 다시 흐르도록 위한 수술 또는 시술을 의미하며, 외과적 혈전제거술 및 스텐트(stent) 등의 사용을 통한 재관류 유발 조작법 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 재관류 수술은 재관류 치료제(예: tPA와 같은 플라스미노겐 활성화제)의 단점을 보완하기 위해 이용될 수 있다.
재관류 수술에는 음압을 걸어서 혈전을 흡입하는 방법(근위부 혈전제거술: proximal thrombectomy), 코일을 걸어 혈전을 빼내는 방법(원위부 혈전제거술: distal thrombectomy), 그리고 스텐트를 삽입하여 좁아진 혈관을 넓혀줌과 동시에 스텐트를 빼면서 혈전을 같이 제거하는 방법(스텐트 리트리버: Stent retriever) 등이 있다. 근위부 혈전제거술은 혈전의 근위부에서 접근하여 음압을 걸어줘서 혈전을 제거하는 방법으로, 주로 흡입 장치를 이용하며, 예컨대 Penumbra system이 있다. 원위부 혈전제거술은 혈전을 지나서 원위부에서부터 와이어를 걸어서 혈전을 제거하는 방법으로, 주로 코일 장치를 이용하며, 예컨대 Merci system이 있다. 스텐트 리트리버를 이용하는 방법은 관상동맥과 마찬가지로 스텐트를 넣어서 혈관의 재관류를 유도하는 방법이다. 본 발명에 따른 조성물은 상기 언급한 시술 이외에 재관류를 목적으로 하는 다양한 재관류 수술에 적용될 수 있다.
본 발명에서 재관류 수술은 뇌혈관 질환, 동맥경화증, 심혈관 질환 등을 치료하기 위해 실시되는 수술 또는 시술을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 뇌혈관 질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 뇌색전증 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 심혈관 질환은 심근경색, 협심증 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 허혈성 재관류 손상의 발생 전, 발생과 동시에, 또는 발생 후 투여가 가능하며, 예컨대 재관류 수술 전처리용일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 혈관 재관류 수술 이전에 환자의 혈관 내에 투여되어 재관류 이후에 오는 조직, 예컨대 심근 손상을 예방, 치료 또는 개선하는 데 유용하다.
또한, 본 발명에 기재된 바와 같이, 허혈에서 비롯된 병상, 및 허혈 또는 허혈성 재관류에 의해 야기되는 손상은 이환된 세포, 조직 또는 기관에서 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 이는 손상 및 기능장애로 이어지는데, 본 발명은 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 세포, 조직 또는 기관과 접촉시키거나, 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 허혈성 손상 또는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료를 위해서는, 예를 들어, 본 발명의 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 재관류 수술을 받을 개체에, 예를 들어 재관류 수술 약 약 5분 전, 약 10분 전, 약 15분 전, 약 20분 전, 약 30분 전, 약 45분 전, 1시간 전, 약 2시간 전, 약 3시간 전, 약 4시간 전, 약 5시간 전, 약 12시간 전, 약 24시간 전, 또는 약 48시간 전에 투여될 수 있고, 바람직하게는 약 2시간 전에 투여될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 재관류 수술 후에 또는 재관류 수술 도중 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 재관류 수술 과정 동안에 일정한 간격으로 1회 이상 투여될 수 있다. 대안적으로, 담즙산은 재관류 수술의 지속시간 내내 연속해서 투여될 수 있다. 또한, 예를 들어 본 발명의 담즙산은 재관류 수술을 받은 개체에게 재관류 수술 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 담즙산은 재관류 수술을 받은 개체에게, 예를 들어 재관류 수술 약 5분 후, 약 10분 후, 약 15분 후, 약 20분 후, 약 30분 후, 약 45분 후, 약 1시간 후, 약 2시간 후, 약 3시간 후, 약 4시간 후, 약 5시간 후, 약 12시간 후, 약 24시간 후, 또는 약 48시간 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 담즙산 또는 이의 허용가능한 염은 또한 재관류 수술 전에 생체외 세포, 조직 또는 기관(예컨대, 이식 시술에서 사용되는 조직, 기관 이식술에서 사용되는 기관)에 대한 허혈 또는 허혈성 재관류 손상을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 기관을 숙주 개체에 이식하기 전에 (예컨대, 멸균 환경 내에서 기관의 저장 또는 수송 동안), 기관을 담즙산과 접촉시켜 (예컨대, 본 발명의 담즙산을 포함하는 조성물 중에 입욕되어) 허혈 또는 허혈성 재관류 손상을 억제할 수 있으며, 바람직하게는 급성 심근경색을 가진 개체의 재관류 시술 전에 1회의 정맥 주사를 함으로써 재관류 시술로 인한 심장 손상을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 재관류 치료제(therapeutic agent for recanalization)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 재관류 치료제와 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 mPTP의 개방 억제제이다.
본 발명의 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 베타-카테닌(β-catenin)의 아고니스트(agonist)이다.
본 발명의 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 미토콘드리아 보호용이다.
본 발명의 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 조직의 경색을 억제한다.
본 발명의 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 베타-카테닌(β-catenin)의 아고니스트(agonist)로, 막혔던 혈관이 재관류 되면서 급격한 산소 유입으로 인해 mPTP(mitochondrial permeability transition pore)가 개방되어 심장근육이 사멸 혹은 괴사 되는 현상을 크게 감소 시켜 재관류 시술 이후 30일내 10% 에 달하는 사망률을 줄이고 시술 후 30% 정도의 환자가 겪는 심부전 증상을 줄일 수 있다. mPTP는 미토콘드리아 내막에 형성되어 있으며 mPTP가 개방되면 미토콘드리아의 탈분극이 유도되어 미토콘드리아 기능부전이 생긴다. 담즙산은 베타-카테닌의 아고니스트로 작용하여 mPTP의 개방을 방해하여 미토콘드리아의 탈분극을 억제함으로써 미토콘드리아를 보호하고 이의 산화적 손상을 방지하여 조직의 경색을 억제하므로 허혈성 재관류 손상을 예방, 치료 또는 개선하는 효과를 나타낸다.
본 발명의 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물은 주사용 제제 또는 경구용 제제의 형태로 제형화될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 주사용 제제는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으나, 바람직하게는 정맥을 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 주사용 제제는 개체에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 상기 주사용 제제는 피하, 근육 또는 정맥내 투여되는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 정맥 내 투여될 수 있다. 정맥 내 투여되는 경우, 재관류 시술 전 1회의 정맥 주사로 투여될 수 있으며, 1회의 정맥 주사만으로도 재관류 시술로 인한 심장 등 장기의 손상을 효과적으로 개선할 수 있다. 또한 상기 경구용 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 및 동결건조제제로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 담즙산(bile acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복강내 투여, 비강내 투여, 정맥 주사, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 또는 경구 투여를 통해 개체에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물의 유효 성분은 투여 받을 개체의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적정 용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으나, FDA 승인 농도와 유사한 농도 또는 FDA 승인 농도 대비 저농도로 사용할 수 있다. 보다 구체적으로 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 mg/㎏/일 내지 10 mg/㎏/일, 구체적으로는 0.5 mg/㎏/일 내지 5 ㎎/㎏/일, 더 구체적으로는 0.8 mg/㎏/일 내지 3 ㎎/㎏/일, 보다 더 구체적으로는 1 mg/㎏/일 내지 2 mg/㎏/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 치료제와 함께 투여될 수 있고, 다른 치료제의 이전, 이후 또는 이와 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 담즙산 및 상기의 다른 치료제는 분리된 제형으로서 또는 공동 제형으로서 동시에 (예컨대, 동반하여) 공동-투여될 수 있다. 대안적으로, 작용제는 숙련된 임상의가 결정한 적절한 시간틀 내에서 (예컨대, 요법의 약제학적 효과의 중첩을 허용하기에 충분한 시간) 분리된 조성물로서 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 담즙산 및 하나 이상의 다른 치료제는 요망되는 치료 효과 (예컨대, 허혈의 감소 및/또는 억제, 허혈성 손상의 감소 및/또는 억제; 허혈성 재관류 손상의 감소 및/또는 억제)를 달성하기에 적합한 순서대로 그러한 스케쥴에 따라 단일 용량 또는 다수의 용량으로 투여될 수 있다. 적합한 투여량 및 투여 요법은 임상의에 의해 결정될 수 있고 선택된 작용제(들), 약학적 제형 및 투여 경로, 다양한 환자 요인 및 그 밖의 고려사항에 의존적이다.
본 발명의 약학적 조성물과 함께 투여될 수 있는 적합한 다른 치료제는 칼슘 채널 차단제, 베타 차단제, 니트로글리세린, 아스피린, 항-염증제, 나트륨이뇨인자, 혈관확장제, 혈전용해제 및 항혈전제(antithrombolic agent)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 건강식품에 사용될 수 있고, 본 발명에서 건강식품은 담즙산을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 담즙산의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량으로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 담즙산을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 담즙산이 핵내 베타-카테닌(β-catenin) 수준에 미치는 영향 분석
1.1 베타-카테닌(β-catenin) 항진 약물 발굴을 위한 스크리닝
다양한 종류의 담즙산이 핵내의 베타-카테닌 수준에 미치는 영향을 분석하여 베타 카테닌 항진 효과가 있는 약물을 발굴하기 위해서, Nuclear beta-catenin Luciferase assay를 통해 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid), GlycochenDCA (glycochenodeoxycholic acid), TauroDCA(Taurodeoxycholic acid), 글리코콜산(Glycocholic acid), TauroCA(Taurocholic acid), ChenoDCA(Chenodeoxycholic acid, 케노데옥시콜산), 콜산(Cholic acid), 데하이드로콜산(Dehydrocholic acid), 리토콜산(Lithocholic acid) 및 데옥시콜산(Deoxycholic acid, DCA)의 처리가 핵내 베타-카테닌 수준 변화에 미치는 영향을 관찰하였다.
구체적으로, TCF/LEF reporter_HEK293 세포주(BPS bioscience)를 이용하였다. TCF/LEF reporter_HEK293 세포주는 핵 내 TCF/LEF 프로모터(베타-카테닌 결합 프로모터)에 루시퍼라제가 클로닝 되어 있는 안정된 세포주로 약물 처리 후 루시퍼라제의 수준을 측정하면 핵 내 베타-카테닌 수준을 관찰할 수 있는 세포주이다. TCF/LEF reporter_HEK293 세포주(BPS Bioscience)를 24 well(2×105개) 혹은 96 well(2×104개) 에 분주하고 플레이트 바닥에 세포가 붙을 때까지 배양하였다. 휴지기 상태의 세포를 만들기 위해 10% FBS DMEM 배지를 1% FBS 배지로 교체하고 하루 동안 배양하였다. 상기와 같은 담즙산들을 세포에 1μM 또는 10μM로 처리하고 24시간 동안 배양한 후 루미노미터(luminometer)를 이용하여 루시퍼라제의 활성도를 측정하였다. 측정 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 10종의 담즙산 중 TauroCA, 콜산, 리토콜산, 데옥시콜산이 핵 내 베타-카테닌 수준을 유의적으로 증가시킴을 확인하였다.
1.2 Deoxycholic acid (DCA)에 의한 β-catenin의 핵내 이동 증가의 확인
상기 실시예 1.1에서 확인한 데옥시콜산(DCA)에 의한 β-catenin 핵내 이동 관련 기작을 알아보기 위하여 western blot을 수행하였다. DCA 1μM을 세포에 처리하고 30분, 1, 2, 4, 8시간 후의 세포에 대하여 western blot을 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인한 바와 같이, DCA의 처리 후 30분부터 핵내로 β-catenin의 증가가 관찰되었으며, 2시간 후가 세포의 핵 내 β-catenin의 양이 가장 peak를 이루는 결과를 확인하였다.
따라서, TauroCA, 콜산, 리토콜산, 데옥시콜산이 mPTP(mitochondrial permeability trasition pore)의 개방을 방해하는 베타-카테닌의 수준을 증가시키고 이를 통해 재관류 손상을 억제하는 효과를 나타내어 베타-카테닌 항진 효과가 있는 약물의 후보군으로서의 가능성을 확인하였다.
실시예 2. 담즙산의 미토콘드리아 보호 효과 확인 - mPTP의 개방 억제
상기 실시예 1에서 베타-카테닌의 수준을 증가시키는 효과가 있음을 확인한 콜산, 리토콜산, 데옥시콜산이 미토콘드리아를 보호하는 효과가 있는지 확인하기 위해서 TMRM(Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate) 염색법을 수행하였다. TMRM은 정상적인 미토콘드리아에 염색이 되는 형광 마커이다.
구체적으로, 293T 세포에 콜산, 리토콜산, 데옥시콜산을 1μM 및 10μM 처리하고 1시간 후, 재관류와 유사한 자극을 미토콘드리아에 유도하여 mPTP를 열고 분극을 유도하는 물질인 CCCP (chlorophenylhydrazone, 50μM)를 처리하여 mPTP의 개방 유도 및 미토콘드리아의 탈분극을 유도하였다. 45분 후에 PBS로 씻어내고 TMRM으로 염색을 한 후 형광리더기를 이용하여 수치를 측정하였다. 측정 결과를 도 3에 나타내었다. 양성 대조군으로는 대표적인 mPTP의 개방을 억제하는 물질인 Cyp (cyclosporine A)를 사용하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 Cyp를 처리한 군에서 Cyp가 미토콘드리아 손상을 약 50% 정도 억제하였고, 리토콜산 역시 양성 대조군과 유사한 수준으로 미토콘드리아의 손상을 억제하였다. 특히 콜산 및 데옥시콜산의 경우 미토콘드리아 손상을 약 90% 억제할 수 있는 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 콜산, 데옥시콜산, 리토콜산을 처리하고 유도된 mPTP의 개방을 억제하여 미토콘드리아의 탈분극을 억제하여 미토콘드리아를 보호하는 우수한 효과가 있음을 확인하였는바, 재관류에 의한 미토콘드리아의 손상의 억제를 통한 비가역 조직 및 기관 손상을 유도하는 아폽토시스 또는 괴사를 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 담즙산의 in vitro 세포 증식 효과 및 세포 이동효과의 확인
3.1 담즙산의 in vitro 세포 증식 효과 확인
담즙산 중 TauroCA, 콜산 및 리토콜산을 1μM 처리하여 HUVEC(human umbrical vein endothelial cell)에서 세포 증식 효과가 나타나는지 확인하기 위하여 세포 counting 방법 및 CCK-8을 이용한 염색법으로 TauroCA, 콜산 및 리토콜산을 처리한 다음 24시간 후의 세포의 증식 효과를 확인하였으며, 상기 실험의 결과를 도 4A 및 4B에 나타내었다.
도 4A에 나타난 바와 같이, Proliferation assay에서는 콜산 및 리토콜산이 대조군보다 더 유의한 세포증식 효과가 있음을 확인하였다. 도 4B에서 나타난 바와 같이, CCK-8 assay에서는 콜산에 의한 유의한 세포증식 효과를 확인하였다. 따라서 콜산 및 리토콜산이 세포를 증식시키고 이를 통한 허혈성 재관류 손상의 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
3.2 담즙산의 in vitro 세포 이동 효과 확인
담즙산 중 TauroCA, 콜산 및 리토콜산을 1μM 처리하여 HUVEC(human umbrical vein endothelial cell)에서 세포 이동 효과가 나타나는지 확인하기 위하여 Boyden chamber를 이용하여 세포의 수를 확인하였다. TauroCA, 콜산 및 리토콜산의 처리한 다음 세포의 이동 효과를 확인하였으며, 상기 실험의 결과를 도 5A 및 5B에 나타내었다.
도 5A에 나타난 바와 같이, 콜산, TauroCA 및 리토콜산을 처리하면 대조군보다 확연하게 세포의 이동이 일어남을 확인하였다. 또한 도 5B에 나타난 바와 같이, migration assay에서는 콜산 및 리토콜산을 처리한 경우 세포의 이동이 대조군보다 유의한 수준으로 증가하는 효과가 있는 것을 확인하였으며, 특히 콜산은 대조군보다 약 2배 정도 세포이동 효과가 있어 가장 우수한 이동효과가 있음을 확인하였다.
따라서 콜산 및 리토콜산은 세포의 이동시키고, 이를 통한 허혈성 재관류 손상의 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 4. 재관류 손상 마우스 모델 제조 및 담즙산의 마우스 재관류 손상 억제 효과 확인
재관류 손상 마우스 모델을 제조하기 위하여, 케타민을 이용하여 Balb/C 마우스 (8 주령)를 마취하였다. 튜브를 기도 내로 삽관하고 호흡기에 연결한 후, 마우스 왼쪽 옆이 위로 오도록 보정하고 피부를 절개하였다. 3, 4번 갈비뼈 사이를 벌려 심장이 드러나게 고정하고 좌심실에 데옥시콜산 또는 스크리닝 및 in vitro assay에서 가장 효과가 우수했던 콜산을 혈관 주사 방식으로 농도별(2, 10, 50 mg/kg)로 주사한 후 좌관상 동맥을 묶었다가 40분후 풀어주고 봉합하였다. 24시간 후 심장을 채취하여 -20℃에 4시간 얼린 후 심장을 2mm 두께로 4등분하고 각각의 조직을 2% TTC (PBS 내) 용액에 넣어 40분간 배양하여 염색하였다. 이후 10% 포르말린 용액에 옮겨 하루 보관 후 사진을 찍었으며, 그 결과를 도 6A에 나타내었다. 또한, 조직 사진에서 전체 면적 대비 경색 조직의 면적을 %로 정량한 결과를 도 6B에 나타내었다. 양성 대조군으로는 mPTP의 개방을 억제하는 물질인 Cyp (cyclosporine A)를 사용하였다.
도 6A에 나타난 바와 같이, 살아있는 조직은 붉은색으로 염색이 되고 경색 조직은 하얀색으로 염색이 된 것을 확인하였으며, 대조군보다 2 mg/kg의 데옥시콜산을 처리한 조직 및 2, 10 mg/kg의 콜산을 처리한 조직은 하얀색으로 염색된 부분이 거의 없이 대부분이 붉은색으로 염색된 것을 확인하였다.
또한, 도 6B에 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 Cyp (5mg/kg)의 경우 20% 정도의 경색 면적 감소를 나타내는데 반해 2 mg/kg의 데옥시콜산을 처리한 경우는 50%이상, 2 mg/kg의 콜산의 경우는 약 50% 감소, 또한 10mg/kg의 콜산은 약 40% 정도 경색 면적을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다. 다만 데옥시콜산의 경우 10 mg/kg이상의 농도에서는 개체가 사망하였고, 2 mg/kg 이하의 농도에서 효과를 보였으며, 콜산의 경우에도 2 mg/kg에서 최적의 효능을 보이는 바, 저농도로 사용하는 경우에 재관류 손상 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
따라서, 저농도의 데옥시콜산과 콜산을 재관류 후의 심장 손상 억제제로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 재관류 손상 마우스 모델 제조에서 담즙산의 마우스 심근 괴사 억제 효과 확인
상기 재관류 손상에 의한 심근 괴사의 담즙산 중 데옥시콜산에 의한 억제효과를 확인하기 위하여 Annexin-Vivo750 형광 염료를 이용하여 마우스 심근 괴사 확인실험을 수행하였다. 상기 실시예 3에서 제조된 마우스 모델에 24시간 후 에 Annexin-Vivo750 형광 염료를 투입하여 농도별 데옥시콜산(1, 2, 5 mg/kg(mpk))의 효과를 관찰하였으며, 그 결과를 도 7A 및 7B에 나타내었다. Annexin 염료는 세포 사멸이 일어난 곳에서 결합하여 형광을 나타내는 것으로 알려져있다.
도 7A에 나타난 바와 같이, 재관류 시술을 하지 않은 대조군의 경우는 심장이 염색이 되지 않지만, 재관류 시술을 한 대조군은 강한 형광이 나타나는 것을 확인하였다. 또한 도 7B에서 나타난 바와 같이, 데옥시콜산의 경우 1mpk, 2mpk 농도의 경우 재관류 시술 대조군 대비 40% 이상 심근 사멸을 감소시키는 효과를 확인하였다. 따라서, 저농도의 데옥시콜산을 효과적인 허혈성 재관류 손상 억제로 인한 재관류 손상 억제제로 사용할 수 있음을 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
제제예 1: 의약품의 제조
1.1 캡슐제의 제조
담즙산 100ml
옥수수전분 100mg
유당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 정제를 제조한다.
1.2 주사제의 제조
담즙산 100ml
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1.3 액제의 제조
담즙산 100ml
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1,000ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2: 식품의 제조
2.1 밀가루 식품의 제조
본 발명의 식품 조성물 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
2.2 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 식품 조성물 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

Claims (19)

  1. 담즙산(bile acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 담즙산은 데옥시콜산(deoxycholic acid), 콜산(cholic acid) 및 리토콜산(lithocholic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 허혈성 재관류 손상은 심근 허혈, 뇌혈관 허혈, 신장 허혈, 간 허혈, 허혈 재관류 심근병증, 피부 허혈, 장관 허혈, 장 허혈, 위 허혈, 폐 허혈, 췌장 허혈, 골격근 허혈, 복근 허혈, 사지 허혈, 허혈 재관류 결장염, 장간막 허혈 및 무증후성 허혈로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 허혈에 의해 생기는 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 허혈성 재관류 손상은 외상 또는 재관류 수술에 의해 생기는 것인, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 재관류 수술은 뇌혈관 질환, 동맥경화증 또는 심혈관 질환을 치료하기 위한 것인, 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증 및 뇌색전증으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 심근경색 또는 협심증인, 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 재관류 수술 전처리용인, 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 mPTP(mitochondrial permeability transition pore)의 개방 억제제인, 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 베타-카테닌(β-catenin)의 아고니스트(agonist)인, 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 미토콘드리아 보호용인, 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 조직의 경색을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 경구용 제제 또는 주사용 제제의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 담즙산(bile acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 0.1 내지 10mg/kg/일로 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  15. 담즙산(bile acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 담즙산은 데옥시콜산(deoxycholic acid), 콜산(cholic acid) 및 리토콜산(lithocholic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 담즙산(bile acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 복강내 투여, 비강내 투여, 정맥 주사, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 또는 경구 투여를 통해 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는, 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 치료 방법.
  18. 담즙산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 허혈성 재관류 손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 담즙산은 데옥시콜산(deoxycholic acid), 콜산(cholic acid) 및 리토콜산(lithocholic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 식품 조성물.
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