WO2020032452A1 - 금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물 - Google Patents

금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물 Download PDF

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WO2020032452A1
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WO
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bone
osteoclast differentiation
inhibiting
oranopine
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PCT/KR2019/009327
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강건욱
김현영
김형식
이광열
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서울대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for inhibiting osteoclast differentiation comprising the inhibitory agent as an active ingredient.
  • Bones support the soft tissues and weight of the body, surround internal organs, protect internal organs from external shocks, and structurally support muscles and organs, as well as calcium and other essential minerals in the body such as phosphorus and magnesium. It is one of the important parts of the human body that stores substances. Therefore, the bones of grown adults do not stop, and until the day of their death, the old bones are removed and replaced with new bones. This is called bone remodeling. This bone remodeling is essential for repairing bone damage caused by growth and stress and maintaining proper bone function.
  • Osteoblasts Two types of cells are known to be involved in bone remodeling.
  • One of the two cells is an osteoblast that produces bone, and the other is an osteoblast that destroys bone.
  • Osteoblasts produce RANKL (receptor activator of NF- ⁇ B ligand) and osteoprotegerin (OPG), its decoy receptor.
  • RANKL receptor activator of NF- ⁇ B ligand
  • OPG osteoprotegerin
  • RANKL receptor activator of NF- ⁇ B
  • osteoclast progenitor cells differentiate into osteoclasts, resulting in bone resorption.
  • 'NFAT' nuclear factor of activated T cells
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • NF- ⁇ B NF- ⁇ B
  • p38 MAP kinase a key transcription factor that regulates osteoclast differentiation in osteoclast progenitor cells by intracellular calcium signaling by RANKL stimulation.
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • NF- ⁇ B NF- ⁇ B
  • p38 MAP kinase p38 MAP kinase
  • osteoclasts are fused to multinucleated cells during actual bone absorption, and their structure is changed to form wrinkled borders, and they are adsorbed on the surface of the bone matrix and cathepsin K or H + -ATPase in an acidified environment.
  • the action of enzymes absorbs bone.
  • Osteoblasts fill the pores with collagen and cover the deposits of calcium and phosphorus (hydroxyapatite) to form new bones that rebuild the skeleton.
  • Osteoporosis which has emerged as a major problem in the elderly society among metabolic bone diseases, is a disease that can easily cause fractures even with a slight impact due to a decrease in the amount of bone in the unit volume without a great change in the chemical composition of the bone.
  • the incidence of estrogens is high.
  • phytoestrogens derived from estrogens or plants present in nature and exhibiting weak estrogen activity are very useful for preventing postmenopausal osteoporosis.
  • this method has a limitation that it is used for a cause other than menopausal osteoporosis.
  • calcium adjuvant such as calcium salt, right bone meal, and vitamin D metabolite therapy are used for the treatment of non-menopausal osteoporosis, but they have problems in terms of solubility, absorption, and taste.
  • bisphosphonates or calcitonin preparations are used for drug administration and are known to be effective in the treatment of osteoporosis.
  • these drugs are specialized medicines and have side effects that can be constricted in the esophagus. It has also been reported to have side effects, such as loss of appetite.
  • oranopine which is a type of prophylactic agent, is used as a drug for treating rheumatoid arthritis, and its application to therapeutic drugs in various diseases including cancer is being studied. Drug repositioning research is drawing attention because it can reduce the risk of failure and reduce costs in the drug development process.
  • the present inventors confirmed that oranopine has an osteoclast differentiation inhibitory effect and a bone loss prevention effect in addition to the anti-inflammatory effect, thereby completing the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for improving, preventing, or treating metabolic bone diseases, including a forbidden agent as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for inhibiting bone loss, including a forbidden agent as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for inhibiting osteoclast differentiation comprising a gold (gold) agent as an active ingredient.
  • the braze agent is auranofin, sodium aurothiomalate, gold thioglucose, sodium aurothiosulfate, and gold thiomalate disodium aurothiomalate).
  • the composition may be to inhibit the differentiation of osteoclast precursors into osteoclasts
  • the osteoclast precursors may be dendritic cells or macrophages, preferably may be bone marrow-derived macrophages have.
  • the composition may be to inhibit osteoclast differentiation by inhibiting the expression of NFATc1 or by inhibiting phosphorylation of IKK and I ⁇ B ⁇ .
  • the composition may be to block IL-1 ⁇ secretion by inhibiting the cleavage of pro-IL1.
  • the composition may be used in the form of a pharmaceutical composition or a food composition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic bone diseases, including a forbidden agent as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving metabolic bone disease, including a forbidden agent as an active ingredient.
  • the braze agent is auranofin, sodium aurothiomalate, gold thioglucose, sodium aurothiosulfate, and gold thiomalate disodium aurothiomalate).
  • the metabolic bone disease may be a disease caused by menopause or osteoclast differentiation, and may be one or more selected from the group consisting of osteoporosis, periodontitis, osteocalcosis, and bone metastasis cancer.
  • the metabolic bone disease may be caused by menopause or osteoclast differentiation.
  • the bone metastases may be cancers that metastasize from breast cancer or prostate cancer.
  • the present invention can provide a food composition for inhibiting bone loss or improving bone density, including a forbidden agent as an active ingredient.
  • the bone loss may be induced by menopause or osteoclast hyperdifferentiation in women.
  • the food may be a health functional food.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating metabolic bone disease, comprising administering a contraindication to an individual.
  • the administration may be oral administration.
  • the present invention also provides a use for producing a medicament for inhibiting bone loss of a forbidden drug.
  • the present invention also provides a use for the production of a medicament for preventing or treating metabolic bone disease of the forbidden drug.
  • the present invention provides a use for producing a drug for inhibiting osteoclast differentiation of a forbidden drug.
  • the present invention also provides a method for inhibiting osteoclast differentiation, comprising administering a forbidden agent to a subject.
  • Inhibitors of the present invention have the effect of inhibiting the differentiation of osteoclasts induced by RANKL stimulation, and by inhibiting osteoclast differentiation, ultimately inhibiting bone resorption by osteoclasts It can be used for the prevention or treatment of metabolic bone disease caused by.
  • the present invention was confirmed that the bone density, mineral content of the bone is increased by administering oranopine which is a kind of forbidden agent in the mouse model artificially induced menopause by ovarian extraction procedure, the composition according to the present invention It is expected to be used to prevent, ameliorate, or treat metabolic bone diseases such as osteoporosis by inhibiting bone loss occurring later.
  • Figure 1a is a diagram confirming the osteoclast differentiation induced by RANKL in BMM cells and inhibition of osteoclast differentiation according to the treatment of oranopine through TRAP staining.
  • FIG. 1B is a graph quantifying FIG. 1A.
  • Figure 1c is a diagram confirming the CSTK mRNA expression level of osteoclast differentiation marker in BMM cells treated with RANKL and oranopine.
  • Figure 1d is a diagram confirming the expression level of TRAP mRNA, an osteoclast differentiation marker in BMM cells treated with RANKL and oranopine.
  • 1E is a diagram confirming the expression level of CSTK protein, which is an osteoclast differentiation marker and NFATc1 protein essential for osteoclast differentiation, in BMM cells treated with RANKL and oranopine.
  • Figure 1f is a diagram confirming the NFATc1 protein expression levels essential for osteoclast differentiation in Raw264.7 cells treated with RANKL and oranopine.
  • Figure 1g is a diagram confirming the cytotoxicity of oranopine through MTT assay.
  • Figure 2a is a diagram confirming the inhibition of NF- ⁇ B reporter activity by oranopine using the NF- ⁇ B reporter gene.
  • Figure 2b is a diagram confirming the c-Fos expression level in Raw264.7 cells treated with RANKL and oranopine.
  • Figure 2c is a diagram confirming that the expression of nuclear p65 is inhibited by oranopine treatment.
  • Figure 2d is a diagram confirming the distribution of p65 in BMM cells treated with RANKL and oranopine.
  • Figure 2e is a diagram confirming the phosphorylation level of IKK in Raw264.7 cells treated with RANKL and oranopine.
  • Figure 2f is a diagram confirming the phosphorylation level of I ⁇ B ⁇ subunit in Raw264.7 cells treated with RANKL and oranopine.
  • Figures 3a and 3b was confirmed that the inhibition of pro-IL1 ⁇ is inhibited by the treatment of Nivocasan to the BMM induced inflammatory control complex-dependent IL-1 ⁇ secretion with LPS and ATP, blocking the differentiation of BMM into TRAP positive and multinuclear cells Drawing.
  • FIG. 3C is a diagram illustrating the inhibition of NFATc1 and CSTK protein expression by Nivocasan by treating Nivocasan with BPS-induced inflammatory complex-dependent IL-1 ⁇ secretion with LPS and ATP.
  • 3D and 3E are graphs confirming that cleavage of pro-IL1 ⁇ is inhibited by inhibiting IL-1 ⁇ secretion when oranopine is treated in BMM and J774.A1 cells.
  • Figure 4a is a graph recording the weight change of the SHAM control group, OVX control group, and oranopine treatment group.
  • Figure 4b is confirmed that the bone loss is reduced by the administration of oranopine in OVX mice via H & E staining.
  • Figure 4c is a diagram confirming the increase in the weight of both femurs by the administration of oranopine in OVX mice.
  • 4D is a diagram showing that the BALP concentration of serum is increased by ovarian extraction, and the concentration of BALP is decreased by administration of oranopine.
  • 5A is a micro CT image of the SHAM control, OVX control, and oranopine treated groups.
  • 5B is a graph showing bone volume of the SHAM control, OVX control, and oranopine treated groups.
  • 5C is a graph showing the trabecular pattern factor of the SHAM control group, OVX control group, and oranopine treated group.
  • 5D is a graph showing the structural model indexes of the SHAM control group, OVX control group, and oranopine treated group.
  • Figure 5e is a graph showing the thickness of the spongy bone of the SHAM control group, OVX control group, and oranopine treatment group.
  • Figure 5f is a graph showing the number of spongy bone of the SHAM control, OVX control, and oranopine treatment group.
  • Figure 5g is a graph showing the degree of separation of the spongy bone of the SHAM control, OVX control, and oranopine treatment group.
  • Figure 6 is a result confirmed by performing ALP staining osteoblast differentiation induced by bone morphogenetic protein (BMP) in C2C12 cells.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the present inventors completed the present invention by confirming that the osteoclast differentiation by RANKL stimulation of oranopine, which is a kind of prophylactic agent, is effectively inhibited. More specifically, oranopine inhibits osteoclast differentiation by blocking NF- ⁇ B activation by inhibiting the expression of NFATc1 located higher in the signal transduction pathway associated with osteoclast differentiation and interfering with phosphorylation of IKK-I ⁇ B ⁇ . It was confirmed that the function can be inhibited osteoclast differentiation by blocking IL-1 ⁇ secretion mediated by inflammatory complex complex. In addition, by administering oranopine in a mouse artificially induced menopause to remove the ovary, the present invention was completed by confirming that oranopine has the effect of inhibiting bone loss and improving bone density.
  • the term " inhibitor" means a compound composed of a certain ratio of gold and other elements (components), that is, a gold compound, and includes both a gold (I) compound and a gold (III) compound. It may include.
  • Non-limiting examples of the forbidden agent include auranofin, sodium aurothiomalate, aurothioglucose, sodium aurothiosulfate, and sodium athiothiomalate.
  • the braze agent may preferably be oranopine, sodium goldthiomalate, or goldthioglucose, and more preferably oranopine.
  • Oranoffin refers to '2,3,4,6-tetra-o-acetyl-1-thio-beta-di-glucopyranosato-S- [triethylphosphine] gold ((2, 3 , 4, 6-tetra-O-acetyl-1-thio- ⁇ -D-glucopyranosato-S- [triethylphosphine] gold)) ', and has the structure of Formula 1.
  • Metabolic bone disease is caused by an imbalance between bone resorption by osteoclasts and bone formation by osteoblasts, which are caused by bone metastasis and primary disease.
  • Periodontal disease caused by bacteria that cause periodontal disease (e.g. multiple myeloma), rheumatoid or degenerative arthritis, periodontal disease, inflammatory alveolar bone resorption disease after implantation of dental implants, orthopedic area Inflammatory bone resorption diseases caused by implants implanted to fix bones in the body, and Paget's disease caused by various genetic predispositions, are caused by osteoclast hyperdifferentiation.
  • the metabolic bone disease herein may be a metabolic bone disease due to menopause or osteoclast differentiation, and is not limited as long as it is a disease that can be improved, prevented, or treated through inhibition of osteoclast differentiation.
  • Mature osteoclasts are cells in which the nucleus of each cell is changed into multinucleated cells by cell fusion and the cells fused in actin rings are bundled.
  • the osteoclast progenitors cells belong to the myeloid cell lineage.
  • Treatment of bone marrow cells with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) differentiates them into dendritic and macrophages, which are preosteoclasts, and is the master regulator of osteoclast differentiation.
  • Treatment of the receptor activator of NK-kB ligand (RANKL) binds to the receptor, RANK, to produce a variety of signaling.
  • a change in calcium oscillator (oscillator) not cell Ca 2+ - is dependent kinase (Ca 2 + -dependent kinase) is activated, to activate the transcription factor NFAT-c1 is expressed several proteins required for osteoclast differentiation.
  • cell-communication (coupling) factors that regulate the amount and rate of osteoclast differentiation by expression in osteoblasts or osteoclasts such as TGF- ⁇ , IGF, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , and SemaD It works like RANKL to regulate the differentiation and death of osteoclasts in homeostasis and morbidity.
  • “suppression of osteoclast differentiation” includes the meaning of inhibiting the differentiation of bone marrow cells into osteoclast progenitor cells (dendritic cells or macrophages), or inhibit the differentiation of osteoclast progenitor cells into osteoclasts, Preferably, it means inhibiting the differentiation of macrophages into osteoclasts, and more preferably, inhibiting osteoclast differentiation by RANKL stimulation of bone marrow-derived macrophages.
  • hypodifferentiation means that osteoclasts are differentiated in a large amount so that the balance between osteoclast bone resorption and osteoblast bone formation is broken, or osteoclast formation or activity is insufficient, resulting in less bone resorption. It means to include a greater degree.
  • Bone metastasis of cancer cells is induced by osteoclasts. Osteoclasts attract cancer cells to make bone metastasis, and osteoclasts and cancer cells may be more activated with each other through a signal transduction process such as hormones, thereby deteriorating bone metastasis.
  • the composition of the present invention inhibits the differentiation of such osteoclasts. It can effectively suppress bone metastasis of cancer cells.
  • breast cancer and prostate cancer cause bone metastasis in almost all cases, when the pharmaceutical composition of the present invention is used in such breast cancer and prostate cancer, better effects can be expected.
  • osteolysis occurs due to the bone resorption capacity of the multinuclear osteoclasts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention inhibits the differentiation of osteoclasts, inhibits the formation of multinuclear osteoclasts by the fusion of mononuclear osteoclasts, and can also reduce the bone resorption capacity of the multinuclear osteoclasts, thereby effectively inhibiting osteolysis. It can be suppressed.
  • periodontitis is an inflammatory disease caused by bacteria, and osteoclast formation increases under inflammatory conditions, thereby increasing bone destruction.
  • the composition of the present invention inhibits the differentiation of osteoclasts, inhibits the formation of multinuclear osteoclasts by fusion of mononuclear osteoclasts, and can also reduce the bone resorption capacity of multinuclear osteoclasts, thereby effectively preventing or treating periodontitis. Can be.
  • Menopause is generally defined as the final symptom of menstrual bleeding in women. However, the term is commonly used to refer to the period of female menopause, including the transition period between the genital tract and the final phenomena of menstrual bleeding. This period may also be referred to as near menopause or as menopause. During this period, various endocrine, somatic and physiological changes and loss of ovarian function progress gradually.
  • symptoms associated with declining estrogen levels near menopause include generalized fever and sweating, atrophy, headache, dizziness, joint pain, insomnia, numbness, boredom, muscle weakness, palpitations and mood changes, depression, memory and concentration problems
  • Psychological symptoms such as problems related to aberrant response and sexual function, include a rapid decrease in estrogen levels, which increases the activity of osteoclasts, resulting in increased bone resorption (bone loss), and eventually metabolic bone diseases such as osteoporosis. Will result.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise at least one known substance exhibiting the same or similar function as the inhibitory agent, in particular oranopine, and at least one kind that activates osteoblast production of osteoblasts or promotes osteoblast differentiation. It may further comprise a known substance, and may further comprise an anti-inflammatory agent.
  • prevention in the present invention means all actions to suppress or delay the onset of metabolic bone disease by the administration of the pharmaceutical composition according to the present invention
  • treatment is the administration of the pharmaceutical composition according to the present invention Means any action in which symptoms for metabolic bone disease are improved or beneficially altered
  • improvement means any action that at least reduces the degree of a parameter associated with the condition being treated, for example.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose , Polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • lubricants, wetting agents, sweetening agents, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like may be further included.
  • Inhibitors of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and acid salts formed by pharmaceutically acceptable free acid are useful as salts.
  • Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid and aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes. Obtained from non-toxic organic acids such as dioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids.
  • Such pharmaceutically nontoxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide and iodide.
  • the acid addition salts according to the invention are dissolved in conventional methods, for example, by dissolving the braze in an excess aqueous solution of water and precipitating the salts with water miscible organic solvents such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • water miscible organic solvents such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • the mixture may also be prepared by evaporation of a solvent or excess acid to evaporate, or by precipitation filtration of the precipitated salt.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt as the metal salt.
  • the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable negative salt (eg, silver nitrate).
  • compositions of the invention may be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage may be determined by the condition and weight of the patient, Depending on the degree, drug form, route of administration, and time, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to the type of disease, severity, activity of the drug, Sensitivity to drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical compositions according to the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, condition, weight of the patient, the absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate and excretion rate, the type of disease, the drug used in general 100 to 500 mg / kg body weight may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times daily.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the term "food” refers to the control of disease prevention, disease prevention and the like of food groups or food compositions which have added value to the food by using physical, biochemical, or biotechnological techniques to act and express the function of the food for a specific purpose. It means a food that is designed and processed to fully express the body control function on recovery, etc., which may further include a food-acceptable food supplement additive, and more suitable carriers, excipients and diluents commonly used It may include, it is meant to include functional foods and health functional food.
  • the food composition of the present invention may be used simultaneously or separately from a medicament for treatment before or after the onset of the disease for the prevention or improvement of metabolic bone disease.
  • the food composition of the present invention is a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and its Salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like, which may be used independently or in combination.
  • the active ingredient may be added to the food as it is, or may be used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention or improvement).
  • the compositions of the invention are added in amounts of up to 15% by weight, preferably up to 10% by weight relative to the raw materials. However, for long term intakes for health and hygiene purposes or for health control purposes, the amount may be below this range.
  • the health functional food composition of the present invention in addition to containing the active ingredient as an essential ingredient in the indicated ratio, there are no particular restrictions on other ingredients, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of the natural carbohydrate can be appropriately determined by the choice of those skilled in the art.
  • the health functional food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, Alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like.
  • these components can be used independently or in combination.
  • the proportion of such additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Functional foods also include beverages (including alcoholic beverages), fruits and processed foods (e.g. canned fruit, canned foods, jams, marmalade, etc.), fish, meat and processed foods (e.g. ham, sausages, corned beef) Etc.), breads and noodles (e.g. udon, soba noodles, ramen, spaghetti, macaroni, etc.), fruit juices, various drinks, cookies, syrups, dairy products (e.g. butter, cheese, etc.), edible vegetable oils, margarine, vegetable protein,
  • the retort food, frozen food, various seasonings may be prepared by adding the forbidden agent of the present invention or a food acceptable salt thereof.
  • the inhibiting agent of the present invention in the form of a food additive, it may be prepared and used in the form of powder or concentrate.
  • the amount of the composition may include 0.001% to 90% by weight of the total food weight, preferably 0.1% to 40% by weight, and may be below the above range for long-term intake, but the effectiveness It is not limited to the above range because the powder has no problem in terms of safety and can be used in an amount above the above range.
  • the invention provides a method of preventing or treating metabolic bone disease comprising administering the pharmaceutical / food composition to a subject.
  • the invention provides a method of inhibiting osteoclast differentiation comprising administering a forbidden agent to a subject.
  • administration in the present invention is meant to introduce the pharmaceutical composition of the present invention to the patient in any suitable way, the route of administration of the composition of the present invention via various oral or parenteral routes as long as the target tissue can be reached. May be administered.
  • ⁇ means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, a mammal, such as a primate, mouse, dog, cat, horse and cow, which is human or non-human. .
  • Oranopine was selected among the forbidden agents, oranopine (BML-EI206-0100) was purchased from Enzo Life Science (Lausen, Switzerland) and used for cathepsin K (E-7), NFATc1 (7A6), and p65.
  • the primary antibody was purchased from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA).
  • Lamin A / C, IKK, I ⁇ B ⁇ , and Phospho-I ⁇ B ⁇ (Ser32) specific antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA), and antibodies against IKK ⁇ were purchased from Abcam (Cambridge, MA, USA). Used.
  • Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining kit (386A-1KT) and MTT (3- (4,5-dimethylth-iazole-2-yl) -2,5-dipenyltetrazolium bromide) were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) and Murine M-CSF was supplied from Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA).
  • Mouse osteoclasts were obtained from C57BL / 6 mouse bone marrow. Specifically, the bone marrow cells were cultured for 3 days in the presence of 30ng / mL macrophage col ony stimulating factor (M-CSF), 10% fetal bovine serum (FBS), and ⁇ MEM ( ⁇ -minimum essential medium). The floating cells were removed from the culture dish, and the cells attached to the dish were used as osteoclast precursors (Bone Marrow-Derived Macrophage: BMM).
  • M-CSF macrophage col ony stimulating factor
  • FBS fetal bovine serum
  • ⁇ MEM ⁇ -minimum essential medium
  • the BMM was dispensed at 10 6 cell / well in a 6-well plate, incubated for 7 days with the addition of 30ng / mL M-CSF and 100ng / mL RNAKL, and the medium was changed every 3 days. Thereafter, the differentiated BMM was fixed with 4% paraformaldehyde and stained with TRAP, so that TRAP-positive multinucleate cells (TRAP + MNCs) having three or more nuclei were counted as osteoclasts.
  • TRAP + MNCs TRAP-positive multinucleate cells
  • Immunohistochemical methods were used to assess the effect of oranopine on the migration of p65 into the nucleus in the Raw264.7 macrophage line. Specifically, 3 ⁇ M of oranopine was treated in Raw264.7 cells and fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes, and then washed three times for 10 minutes with PBS containing 0.2% Triton X-100.
  • Oranopine group received 10 mg / kg of oranopine with saline solution for 43 days, and SHAM and OVX control group orally administered the same volume of saline solution. It was. The mice were then sacrificed and blood samples were obtained for serum biochemistry analysis, distal femurs were obtained and fixed in 75% ethanol overnight before bone mass was measured. This animal experiment was conducted according to the regulations of the Animal Ethics Committee of Sungkyunkwan University.
  • BALP Bone alkaline phosphatase activity was measured according to the manufacturer's instructions using a commercially available kit. BALP is a phosphorylase released during bone remodeling, and BALP activity is a representative biochemical parameter that reflects bone turnover conditions.
  • Micro CT Microcomputed tomograp hy micro CT: mCT
  • MCT images were acquired using a Skyscan 1172 micro-CT scanner (Ko ntich, Belgium), and the shape and structural characteristic parameters of the left femur were analyzed from the images.
  • Micro CT was scanned using a high resolution Skyscan 1172 system (Skyscan, Kontich, Belgium) at 50 kV and 201 ⁇ A with a 0.5 mm aluminum filter and a resolution of 11 ⁇ m pixel ⁇ 1 . Images were captured every 0.7 ° in the 180 ° range.
  • BMD bone mineral density
  • Tb.N trabecular number
  • BV / TV bone volume / total volume ratio
  • Quantitative data were generated in the Skyscan NRecon program using trabecular thickness (T), trabecular pattern factor (Tb.Pf), and structure model index (SMI), and the data were analyzed using Skyscan CTAN software.
  • the collected tibias were fixed with 4% paraformaldehyde and decalcified with 5.5% EDTA buffer for 2 weeks at 4 ° C.
  • the sample was gradually dehydrated, embedded with paraffin and longitudinal cut to 4 mm thick.
  • the cut block was deparaffinized with xylene, and stained with H & E (hematoxylin and eosin).
  • Proteins were isolated by sodium dodecyl sulfate-polyacryla mide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose paper to detect immune complexes using Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (CB1001, Merck Millipore, Billerica, Mass.) It was. Protein concentration was quantified by Multi Gauge, V3.0 (F UJIFILM, Tokyo, Japan).
  • MTT assay 1 mg / ml MTT (diluted in PBS at a concentration of 5 mg / mL) was loaded into each well of a 96-well plate and the cells were incubated for 2 hours. The culture was removed with a pipette and the remaining cells were lysed with 100 ⁇ M DMSO. Absorbance was measured at 490 nm using a Tirstar microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany).
  • the mRNA expression levels of the osteoclast differentiation markers TRAP and CSTK (cathepsin K) were measured using SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, Calif) and Bio-Rad CFX Manager TM Software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Quantification by real time qPCR used. 18 s rRNA protein mRNA was used as a reference gene to normalize mRNA levels. Primer information used is shown in Table 1 below.
  • Mouse IL-1 ⁇ (interleukin-1 ⁇ ) ELISA kit (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) was used to measure the concentration of IL-1 ⁇ in the culture medium.
  • Differentiated C2C12 cells were washed with phosphate buffer (PBS) and fixed for 10 minutes with 10% formaldehyde. After washing with PBS again, cells were stained with BCIP / NBT chromogenic substrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 30 minutes at RT to evaluate ALP activity. ALP-positive cells were stained purple or blue.
  • PBS phosphate buffer
  • BCIP / NBT chromogenic substrate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • Example One On the ban by RANKL Induction of osteoclast differentiation inhibition
  • BMM cells were treated with 100 ng / mL RANKL and 30 ng / mL M-CSF for 7 days, and the BMM cells were differentiated into osteoclast-like giant TRAP positive multinuclear cells (see FIG. 1A).
  • treatment with 1 or 3 ⁇ M of oranopine reduced differentiated BMM cells, in particular the number of multinucleated cells decreased concentration-dependently of oranopine (see FIG. 1B).
  • CSTK and TRAP are osteoclast specific marker genes and their expression is induced by RANKL.
  • oranopine (1 and 3 ⁇ M) completely inhibited the expression of osteoclast marker genes (see FIGS. 1C and 1D).
  • NFATc1 nuclear factor of activated T-cells 1
  • RANKL fibroblast growth factor 1
  • FIG. 1E As a result of repeating the same experiment in Raw264.7 cells, it was confirmed that the expression of NFATc1 was suppressed in a concentration-dependent manner of oranopine treated to the cells (see FIG. 1F).
  • MTT assay showed that 1 and 3 ⁇ M of oranopine were not toxic in BMM and Raw264.7 cells, suggesting that the reduction of osteoclast formation by oranopine was not due to the cytotoxicity of oranopine itself. (See FIG. 1G).
  • NF- ⁇ B regulates NFATc1 expression
  • the AP-1 group including c-Fos
  • C-Fos plays a pivotal role in osteoclast differentiation.
  • mice lacking c-Fos are known to have osteoclasts because osteoclast differentiation does not occur.
  • TNF receptor-associated factors activate various phosphorylation cascades, including IKK dependent I ⁇ B ⁇ phosphorylation, by RANK.
  • IKK dependent I ⁇ B ⁇ phosphorylation by RANK.
  • phosphorylation of IKK by TGF- ⁇ -activated kinase 1 plays a pivotal role in activating NF- ⁇ B signaling pathways by inflammatory cytokines and RANKL.
  • TAK1-dependent IKK complexes are activated with phosphorylation and degradation of the I ⁇ B ⁇ subunit.
  • IL-1 ⁇ is an inflammatory cytokine and is known to promote RANKL expression and directly induce osteoclast formation in bone marrow stromal cells.
  • IL-1 ⁇ is expressed as a 31kDa precursor (pro-IL-1) in hematopoietic cells by inflammatory stimulation, and must be converted to 17kDa in order to bind to the receptor.
  • the secretion of IL-1 ⁇ in BMDM is regulated by a two-step signal transduction pathway, and the first signal varies after activation of toll-like receptors (TLRs) that induce the synthesis of NF- ⁇ B-dependent NLRP3 and pro-IL-1.
  • TLRs toll-like receptors
  • the second signal is the caspase-1-catalyzed IL-1 ⁇ process activated by the inflammasome.
  • C2C12 cells were confirmed to differentiate into osteoblasts following the treatment of BMP (Bone Morphogenic Protein) irrespective of the treatment of oranopine.
  • oranopine has no effect on osteoblast differentiation and shows osteoclast-specific differentiation inhibitory effect, meaning that it can be used for the treatment of metabolic bone disease caused by osteoclast differentiation. .
  • Inhibitors of the present invention have the effect of inhibiting the differentiation of osteoclasts induced by RANKL stimulation, and by inhibiting osteoclast differentiation, ultimately inhibiting bone resorption by osteoclasts
  • the present invention was confirmed that the bone mineral density, bone mineral content is increased by administering oranopine which is a kind of forbidden drug in the mouse model artificially induced menopause by ovarian extraction procedure, the composition according to the present invention Since it can be used to prevent, improve, or treat metabolic bone diseases such as osteoporosis by inhibiting bone loss occurring afterwards, there is industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물 등에 관한 것으로서, 금제제는 파골세포 분화와 관련되는 신호 전달 경로에 있어서 보다 상위에 위치하는 NFATc1의 발현을 억제하고 IKK-IκBα의 인산화를 방해하여 NF-κB 활성화를 차단하고, 염증조절복합체 매개의 IL-1β 분비를 차단함으로써 파골세포 분화를 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 난소적출 동물모델에서 골 소실을 억제하고 골 밀도를 향상시키는 효과가 있는 바, 파골세포 분화 억제 및 파골세포 분화에 기인하는 대사성 골 질환의 개선, 예방, 또는 치료를 위한 의약용, 의약외용, 식품 첨가물용, 향장소재용 조성물 등 다양한 방면으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물
본 발명은 금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물 등에 관한 것이다.
본 출원은 2018년 8월 7일에 출원된 한국특허출원 제10-2018-0091968호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호하며, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 뼈의 재형성(bone remodeling)이라고 한다. 이러한 뼈의 재형성은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다.
뼈의 재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체 인 RANK(receptor activator of NF-κB)에 결합하면 파골 전구세포가 파골세포로 분화되어 골 흡수(resorption)가 일어난다. 자세하게는 RANKL 자극에 의한 세포내 칼슘 신호 전달로 파골 전구 세포에서 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자로 알려져 있는 NFAT(nuclear factor of activated T cells: 이하 간단하게 ‘NFAT'라 함)의 발현이 유도되고, 그 후 세포외 신호조절인산화효소(extracellular signal-regulated kinase: ERK), NF-κB, p38 MAP kinase 등의 활성화가 NFAT의 자가증폭(autoamplification)을 유발하여 활성이 지속되는 것이다.
따라서 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 상기와 같은 기작을 통해 파골세포에 의해 이루어지며, 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다. 파골세포는 실제적인 뼈의 흡수작용을 할 때는 다핵세포로 융합된 후 그 구조가 변하여 주름진 테두리를 형성하며, 골 기질 표면에 흡착하여 산성화 환경에서 카텝신(cathepsin) K 나 H +-ATPase 등 많은 효소의 작용으로 뼈를 흡수한다. 이에 반해, 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침적물 (hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건하게 된다.
성인의 경우 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 정상 성인에서는 골흡수 양과 골형성 양 사이에는 항상 균형이 유지되고 있다. 이와 같이 중요한 뼈에 균형이 깨질 경우 많은 질병이 야기될 수 있는데, 이러한 질환을 ‘대사성 골 질환’이라 한다.
대사성 골 질환 중 고령사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증은 골의 화학적 조성에는 큰 변화 없이 단위 용적내의 골량이 감소하여 경미한 충격에도 쉽게 골절을 일으킬 수 있는 질환이다. 노인 특히 폐경 후 여성들의 경우 에스트로겐의 분비 부족으로 인하여 그 발생빈도가 높게 나타난다. 현재 에스트로겐이나 천연에 존재하면서 약한 에스트로겐 활성을 나타내는 식물 유래의 피토에스트로겐이 폐경 후 골다공증 예방에 매우 유용하다는 연구가 보고되었다. 그러나 이러한 방법은 폐경성 골다공증 이외의 원인에는 제한적으로 사용된다는 한계점을 가진다. 이 밖에 칼슘염, 우골분 등의 칼슘 보강제, 비타민 D 대사산물 요법 등이 비 폐경성 골다공증 치료에 이용되고 있으나, 이들은 용해성이나 흡수성, 미각적 측면에서 문제점을 가지고 있다. 또한 약물 투여에는 비스포스포네이트(bisphosphonates)나 칼시토닌 제제 등이 사용되며 골다공증의 치료에 유효하다고 알려져 있으나, 이러한 약물은 전문의약품이고, 식도에 협착될 수 있는 부작용이 있어 복용에 주의를 요하며, 이명, 두통, 식욕 부진 등의 부작용도 나타낼 수 있다고 보고된 바 있다.
한편, 금제제의 일종인 오라노핀은 류마티스 관절염 치료제로 이용되는 약물로서, 암을 비롯한 여러 질병에서 치료 약물로의 적용 가능성이 연구되고 있다. drug repositioning 연구는 약물 개발 과정에서 실패 위험을 줄이고 비용을 줄일 수 있다는 점에서 주목받고 있다. 이에, 본 발명자들은 오라노핀이 항염증 효과 이외에 파골세포 분화 억제 효과와 이에 따른 골 손실 방지 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 금제제를 유효성분으로 포함하여 대사성 골 질환의 개선, 예방, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 금제제를 유효성분으로 포함하는, 골 손실 억제용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 금제제의 파골세포 분화 억제용 약제를 생산하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 금제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파골세포 분화를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 금제제의 대사성 골 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 금제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대사성 골 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금(gold)제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물 을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 금제제는 오라노핀(auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 및 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 파골세포 전구체의 파골세포로의 분화를 억제하는 것일 수 있으며, 상기 파골세포 전구체는 수지상 세포 또는 대식세포일 수 있으나, 바람직하게는 골수 유래 대식세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 NFATc1의 발현을 억제하거나, IKK 및 IκBα의 인산화를 억제하는 것에 의해 파골세포 분화를 억제하는 것 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 pro-IL1의 절단을 억제하여 IL-1β 분비를 차단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 형태로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 금제제를 유효성분으로 포함하는 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 금제제를 유효성분으로 포함하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 금제제는 오라노핀(auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 및 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 대사성 골 질환은 폐경 또는 파골세포 분화에 의해 야기되는 질환일 수 있으며, 골다공증, 치주염, 골석회증, 및 뼈 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 대사성 골 질환은 폐경 또는 파골세포 분화에 의해 야기되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 뼈 전이암은 유방암 또는 전립선 암으로부터 전이되는 암일 수 있다.
또한, 본 발명은 금제제를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제 또는 골 밀도 향상용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 골 손실은 여성의 폐경 또는 파골세포 과분화에 의해 유도되는 것 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 식품은 건강기능식품일 수 있다.
또한, 본 발명은 금제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대사성 골 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 투여는 경구 투여일 수 있다.
또한, 본 발명은 금제제의 골 손실 억제용 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 금제제의 대사성 골 질환 예방 또는 치료용 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 금제제의 파골세포 분화 억제용 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 금제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파골세포 분화를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 금제제, 특히 오라노핀은 RANKL 자극에 의해 유발되는 파골세포의 분화를 억제하는 효과가 있으며, 파골세포 분화를 억제함으로써 궁극적으로 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하여 파골세포의 분화에 의해 야기되는 대사성 골 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 난소적출시술에 의해 인위적으로 폐경을 유도한 마우스 모델에서 금제제의 일종인 오라노핀을 투여하여 골 밀도, 뼈의 미네랄 함량이 증가됨을 확인하였는바, 본 발명에 따른 조성물은 폐경기 이후 발생하는 골 소실을 억제하여 골다공증 등의 대사성 골 질환을 예방, 개선, 또는 치료하는데 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 BMM 세포에서 RANKL에 의한 파골세포 분화 유도와 오라노핀의 처리에 따른 파골세포 분화 억제를 TRAP 염색을 통해 확인한 도면이다.
도 1b는 도 1a를 정량화한 그래프이다.
도 1c는 RANKL과 오라노핀을 처리한 BMM 세포에서 파골세포 분화 마커인 CSTK mRNA 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 1d는 RANKL과 오라노핀을 처리한 BMM 세포에서 파골세포 분화 마커인 TRAP mRNA 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 1e는 RANKL과 오라노핀을 처리한 BMM 세포에서 파골세포 분화 마커인 CSTK 단백질과 파골세포 분화에 필수적인 NFATc1 단백질 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 1f는 RANKL과 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 파골세포 분화에 필수적인 NFATc1 단백질 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 1g는 오라노핀의 세포 독성을 MTT assay를 통해 확인한 도면이다.
도 2a는 NF-κB 리포터 유전자를 이용하여 오라노핀에 의한 NF-κB 리포터 활성 억제를 확인한 도면이다.
도 2b는 RANKL과 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 c-Fos 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 2c는 오라노핀 처리에 따라 nuclear p65의 발현이 저해됨을 확인한 도면이다.
도 2d는 RANKL과 오라노핀을 처리한 BMM 세포에서 p65의 분포를 확인한 도면이다.
도 2e는 RANKL과 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 IKK의 인산화 수준을 확인한 도면이다.
도 2f는 RANKL과 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 IκBα 서브유닛의 인산화 수준을 확인한 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 LPS와 ATP로 염증조절복합체 의존성 IL-1β 분비가 유도된 BMM에 Nivocasan을 처리하여 pro-IL1β의 절단이 억제되고, BMM의 TRAP 양성 및 다핵 세포로의 분화가 차단됨을 확인한 도면이다.
도 3c는 LPS와 ATP로 염증조절복합체 의존성 IL-1β 분비가 유도된 BMDM에 Nivocasan을 처리하여, Nivocasan에 의한 NFATc1 및 CSTK 단백질 발현 억제를 확인한 도면이다.
도 3d 및 도 3e는 BMM과 J774.A1 세포에서 오라노핀을 처리하는 경우 pro-IL1β의 절단이 차단되어 IL-1β 분비가 억제됨을 확인한 그래프이다.
도 4a는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 체중변화를 기록한 그래프이다.
도 4b는 H&E 염색을 통해 OVX 마우스에서 오라노핀의 투여로 골 소실이 감소됨을 확인한 도면이다.
도 4c는 OVX 마우스에서 오라노핀의 투여로 양 대퇴골의 중량이 증가됨을 확인한 도면이다.
도 4d는 난소적출에 의해 혈청의 BALP 농도가 높아지나, 오라노핀의 투여로 BALP의 농도가 감소됨을 확인한 도면이다.
도 5a는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 마이크로 CT 이미지이다.
도 5b는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 골 부피를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 섬유주 패턴 인자를 나타낸 그래프이다.
도 5d는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 구조 모델 지수를 나타낸 그래프이다.
도 5e는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 해면질골의 두께를 나타낸 그래프이다.
도 5f는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 해면질골의 수를 나타낸 그래프이다.
도 5g는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 해면질골의 분리 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 C2C12 세포에서 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)에 의해 유도된 조골 세포 분화능을 ALP 염색을 실시하여 확인한 결과이다.
본 발명자들은 금제제의 일종인 오라노핀의 RANKL 자극에 의한 파골세포 분화를 효과적으로 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 보다 구체적으로, 오라노핀이 파골세포 분화와 관련되는 신호 전달 경로에 있어서 보다 상위에 위치하는 NFATc1의 발현을 억제하고 IKK-IκBα의 인산화를 방해하여 NF-κB 활성화를 차단함으로써 파골세포 분화를 억제하는 기능을 수행하며, 또한 염증조절복합체 매개의 IL-1β 분비를 차단함으로써 파골세포 분화를 억제할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 난소를 적출하여 인위적으로 폐경을 유도한 마우스에서 오라노핀을 투여하여, 오라노핀이 골 소실을 억제하고 골 밀도를 향상시키는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 "금제제"란 금(gold)과 다른 원소(성분)가 일정 비율로 구성된 화합물 즉, 금의 화합물(gold compound)을 의미하고, 금(I) 화합물 및 금(Ⅲ) 화합물을 모두 포함할 수 있다. 상기 금제제의 비제한적인 예로 오라노핀(Auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate) 등이 있으며, 본 발명에서 금제제는 바람직하게는 오라노핀, 금티오말산 소듐, 또는 금티오글루코오스일 수 있고, 보다 바람직하게는 오라노핀일 수 있다.
본 명세서에서 “오라노핀”은 ‘2,3,4,6-테트라-오-아세틸-1-티오-베타-디-글루코피라노사토-에스-[트리에틸포스핀]금((2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-glucopyranosato-S-[triethylphosphine] gold))’으로, 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.
[화학식 1]
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한편, “대사성 골 질환”이란 파골세포(osteoclast)에 의한 골 흡수과 조골세포(osteoblast) 에 의한 골 형성의 불균형으로부터 야기되는 질병으로서, 뼈 전이암(bone metastasis), 원발성(Primary)으로 뼈에 생성된 종양(예, 다발성 골수종), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파제트 질병(Paget's disease) 등이 있으나, 파골세포 과분화에 의해 발생하는 질병으로는 골 경화증, 치주염 및 골다공증과 함께 유방암, 전립선 암 등의 종양이 뼈로 전이된 골 전이 병변(뼈 전이암) 등이 대표적이다.
따라서, 본 명세서에서 대사성 골 질환은 폐경 또는 파골세포 분화에 기인한 대사성 골 질환일 수 있으며, 파골세포 분화 억제를 통해 개선, 예방, 또는 치료 효과를 얻을 수 있는 질환이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 골 경화증, 치주염, 골다공증, 및 뼈 전이암일 수 있다.
성숙된 파골세포는 각 세포의 핵이 세포융합에 의해 다핵체 세포로 변화하고 엑틴고리(actin ring)로 융합된 세포들이 묶인 형태이다. 파골세포의 전구체(progenitors) 세포는 골수성 세포 계열(myeloid cell lineage)에 속한다. 골수 세포에 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)를 처리하면 전구세포(preosteoclast)인 수지상세포(dendritic cell) 및 대식세포(macrophages)로 분화하고, 파골세포 분화의 마스터 조절자(master regulator)인 RANKL(Receptor activator of NK-kB ligand)를 처리하면 수용체인 RANK에 결합하여 다양한 신호전 달을 만든다. 이에 따라 세포 안 칼슘 오실레이터(oscillator)의 변화로 Ca 2+-의존 키나아제(Ca 2 +-dependent kinase)가 활성화되고, 전사인자 NFAT-c1을 활성화하여 파골세포 분화에 필요한 여러 단백질을 발현하게 된다. 또한, TGF-β , IGF, IFN-γ, TNF-α 및 SemaD와 같이 조골세포 또는 파골세포에서 발현하여 파골세포 분화의 양과 속도를 조절하는 세포 커뮤니케이션 인자(cell-communication(coupling) factors)들도 RANKL과 같이 작용하여 항상성과 병적상태에서 파골세포의 분화와 사멸을 조절한다.
따라서, 본 명세서에서 “파골세포 분화 억제”는 골수 세포의 파골세포 전구세포(수지상 세포 또는 대식세포)로의 분화를 억제하거나, 파골세포 전구세포의 파골세포로의 분화를 억제의 의미를 포함하며, 바람직하게는 대식세포의 파골세포로의 분화 억제를 의미하며, 보다 바람직하게는 골수 유래 대식세포의 RANKL 자극에 의한 파골세포 분화를 억제하는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 “과분화”는 파골세포의 골 흡수와 조골세포의 골 형성의 균형이 깨지도록 파골세포가 다량 분화되거나, 조골세포의 형성 또는 활성이 부족하여 골 형성의 정도보다 골 흡수의 정도가 더 크게 된 것을 포함하는 의미이다.
암세포의 골전이는 파골세포에 의해 유도된다. 파골세포가 암세포를 끌어들여 골전이가 이루어지고 파골세포와 암세포가 호르몬 등의 신호전달 과정을 통해 서로 더욱 활성화되어 골전이가 악화될 수 있는데, 본 발명의 조성물은 이러한 파골세포의 분화를 억제함으로써 암세포의 골전이를 효과적으로 억제할 수 있다. 특히, 유방암과 전립선암은 거의 대부분의 경우에서 골전이가 발생하기 때문에, 본 발명의 약학적 조성물을 이러한 유방암과 전립선암에 사용하면 보다 우수한 효과를 기대할 수 있다.
또한, 다핵성 파골세포의 골흡수능으로 인해 골용해(osteolysis)가 발생한다. 본 발명의 약학적 조성물은 파골세포의 분화를 억제하고, 단핵 파골세포의 융합에 의해 다핵성 파골세포가 형성되는 것을 억제하며, 다핵성 파골세포의 골흡수능도 감소시킬 수 있으므로, 골용해를 효과적으로 억제할 수 있다.
한편, 치주염은 세균에 의해 발생하는 염증성 질환으로 염증 조건에서 파골세포의 형성이 증가하여 뼈의 파괴가 증가하게 된다. 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화를 억제하고, 단핵 파골세포의 융합에 의해 다핵성 파골세포가 형성되는 것을 억제하며, 다핵성 파골세포의 골흡수능도 감소시킬 수 있으므로, 치주염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
일반적으로 폐경기는 여성에게 있어 월경출혈의 최종 현상으로서 정의된다. 그러나 이 용어는 생식기까지와 월경출혈의 최종 현상을 경과하는 사이의 이행 기간을 포함하여 여성 갱년기의 시기로 언급되는데 통상 사용된다. 또한, 이 시기는 폐경기 근처 또는 갱년기로서도 언급되기도 한다. 이러한 시기 동안에는 각종 내분비, 체세포 및 생리적 변화 및 난소 기능의 손실이 점차적으로 진행된다. 또한, 폐경기 근처에서 쇠퇴하는 에스트로겐 수준과 관련된 증상으로는 전신열감 및 발한, 위축질염, 두통, 현기증, 관절통, 불면증, 무감정, 권태, 근육약화, 심계항진 및 분위기 변화, 울병, 기억 및 집중력 저하, 이상 감응 및 성적 기능과 관련된 문제와 같은 심리적 증상이 포함되며, 특히 에스트로겐 농도의 급속한 감소는 파골세포의 활성을 증가시켜 골 흡수(골 손실)가 증가하게 되며, 종국에는 골다공증과 같은 대사성 골 질환을 초래하게 된다.
본 발명의 약학적 조성물은 금제제, 특히 오라노핀과 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 1종 이상의 공지 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 조골세포의 골 생성을 활성화하거나 조골세포 분화를 촉진시키는 1종 이상의 공지 물질을 추가로 포함할 수 있고, 항염증제를 추가로 포함할 수도 있다.
한편, 본 발명에서 "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대사성 골 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료" 는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대사성 골 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함 하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 금제제는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸 벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 금제제를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 100 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에서 "식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 이는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있고, 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함하는 의미이다.
본 발명의 식품 조성물은 대사성 골 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능성식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지, 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 금제제 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 금제제를 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001 중량% 내지 90 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있고, 장기간 섭취 용도일 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으나, 유효성분이 안전성 면에서 아무런 문제가 없어 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있기 때문에 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적/식품 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 골 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 금제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파골세포 분화를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 금제제의 파골세포 분화 억제용 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 금제제의 대사성 골 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 실험 재료
금제제 중에서는 오라노핀을 선택하였으며, 오라노핀(BML-EI206-0100)은 Enzo Life Science (Lausen, Switzerland)에서 구입하여 사용하였으며, cathepsin K (E-7), NFATc1 (7A6), 및 p65에 대한 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하여 사용하였다. Lamin A/C, IKK, IκBα, 및 Phospho-IκBα (Ser32) 특이적 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며, IKKβ에 대한 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색 키트(386A-1KT)와 MTT(3-(4,5-dimethylth-iazole-2-yl)-2,5-dipenyltetrazolium bromide)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Murine M-CSF는 Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA)에서 공급받아 사용하였다.
2. in vitro 파골세포 분화 분석
마우스 파골세포(Murine osteoclasts)는 C57BL/6 마우스 골수로부터 획득하였다. 구체적으로, 상기 골수세포는 배양접시에서 30ng/mL M-CSF(macrophage col ony stimulating factor), 10% FBS(fetal bovine serum), 및 αMEM(α-minimum essential medium) 존재 하에 3일간 배양하였다. 상기 배양접시에서 부유하는 세포 를 제거하고, 접시에 부착된 세포를 파골세포 전구체(osteoclast precursor: Bone Marrow-Derived Macrophage: BMM)로 이용하였다. 파골세포 생성을 위하여, 상기 BMM을 6-well plate에 10 6 cell/well로 분주하고, 30ng/mL M-CSF 및 100ng/mL RNAKL 을 첨가하여 7일간 배양하였으며, 배지는 3일마다 교환하였다. 이후, 분화된 BMM은 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하고, TRAP를 염색하여, 3개 이상의 핵을 가진 TRAP 양성 다핵세포(TRAP-positive multinucleate cells: TRAP+ MNCs)를 파골세포로 계수하였다.
3. 면역조직화학적 방법 (Immunocytochemsitry method: ICC method)
Raw264.7 대식세포 주에서 p65가 핵으로 이동하는 것에 오라노핀이 미치는 영향을 평가하기 위하여 면역조직화학적 방법이 이용되었다. 구체적으로, Raw264.7 cell에 3μM의 오라노핀을 처리하고 4% 파라포름알데하이드로 15분 동안 고정시킨 후 0.2 % Triton X-100가 포함된 PBS로 10분 동안 3회 세척하였다. 이어서, 1% 말 혈청이 포함된 PBS로 차단한 후 항-p65 단일클론 항체와 Alexa-488 접합된 goat anti-mouse IgG antibody (A-21202, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 처리하고, prolong gold antifade mountant와 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, Thermo Scientific, Rochester, USA)로 세포를 대조 염색하였다. 대조군은 오라노핀 대신 vehicle을 처리하였다.
4. 동물 및 실험 설계
8주령 ICR 암컷 마우스는 오리엔트바이오(성남, 경기도)로부터 분양받아 2 주간 적응시킨 후 온도 21±2℃, 습도 50±5%, 12시간 광주기 조건하에서 사육하였다. tribromoethanol (Avertin)로 마취한 마우스에 난소 적출 수술을 시행하여 난소적출모델(OVX; n=12)을 제작하였으며, 대조군(sham-operated: SHAM; n=6)은 겉보 기 수술을 수행하여 제작하였다. 수술 4주 후 OVX 마우스는 OVX 대조군과 오라노핀군으로 구분하였으며, 오라노핀군은 43일 동안 10mg/kg의 오라노핀을 식염수와 함 께 투여하였고, SHAM과 OVX 대조군은 동일한 부피의 식염수를 경구 투여하였다. 이어서, 마우스를 희생시키고 혈정 생화학 분석(serum biochemistry analysis)을 위하여 혈액 샘플을 수득하고, 원위 대퇴골을 수득하여 75% 에탄올에 밤새 고정한 후 골 질량을 측정하였다. 본 동물실험은 성균관대학교 동물윤리위원회의 규정에 따라 수행하였다.
5. 혈청 생화학 분석
BALP(bone alkaline phosphatase) 활성은 시판 중인 키트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. BALP은 골 재형성 과정에서 방출되는 인산화 효소로서, BALP 활성도는 골 전환율(bone turnover) 상태를 반영하는 대표적인 생화학적 파라미터이다.
6. 마이크로 CT ( Microcomputed tomograp hy : micro CT: mCT ) 분석
Skyscan 1172 micro-CT scanner (Ko ntich, Belgium)를 사용하여 mCT 이미지를 획득하고, 상기 이미지로부터 좌측 대퇴골의 형태와 구조적 특성 파라미터를 분석하였다. 마이크로 CT는 0.5 mm 알루미늄 필터와 11μm pixel -1의 해상도로 50 kV 및 201 μA에서 고해상도 Skyscan 1172 시스템 (Skyscan, Kontich, Belgium)을 사용하여 스캔하였다. 이미지는 180° 범위에서 0.7°마다 캡쳐하였다. BMD(bone mineral density), Tb.N(trabecular number), BV/TV(bone volume/total volume ratio), Tb. Th(trabecular thickness), Tb.Pf(trabecular pattern factor), 및 SMI(structure model index)를 사용하여 Skyscan NRecon 프로그램에서 정량적 데이터를 생성하고, 상기 데이터는 Skyscan CTAN 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
7. 골 조직 형태학적 분석 (Bone histomorphometric analysis)
수집한 경골(tibias)을 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 4℃에서 2주동안 5.5% EDTA 완충액으로 석회질을 제거하였다. 상기 샘플을 점진적으로 탈수시키고, 파라핀으로 포매하여 4mm 두께로 종축 절단하였다. 절단한 블록을 크실렌(xylene) 으로 탈파라핀화하고, H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 수행하였다.
8. 웨스턴 블롯
SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacryla mide gel electrophoresis)로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 종이에 옮겨 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (CB1001, Merck Millipore, Billerica, MA)을 사용하여 면역 복합체를 검출하였다. 단백질 농도는 Multi Gauge, V3.0 (F UJIFILM, Tokyo, Japan)으로 정량화하였다.
9. MTT assa y
MTT assay를 통해 세포 생존력을 확인하였다. 1 mg/ml MTT (5 mg/mL의 농도로 PBS에 희석)를 96-well plate의 각 웰에 담지하고 2시간 동안 세포를 배양하였다. 상기 배양액을 파이펫으로 제거하고 남아 있는 세포를 100μM DMSO로 용해하였다. Tirstar microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
10. 리포터 유전자 분석( Reporter gene assay)
Raw264.7 세포를 48-well plate에 도말 하고, 70% 컨플루언시에서 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsb ad, CA)를 이용하여 리포터 플라스미드(1μg pNF-κB-luciferase 및 0.3 μg pRL-SV40)로 형질감염(transfection)시켰다. 형질감염된 세포는 1 또는 3 μM 오라노핀을 처리하고 24시간 후에 용해시켰다. 루시퍼라아제 활성은 dual-luciferase reporter assay kit (E1960, Promega, Madison, MI)을 이용하여 측정하였고, NF-κB 프로모터의 활성은 이와 대응되는 renilla 활성으로 정상화하였다.
11. qPCR (quantita tive real time polymerase chain reaction)
총 RNA는 Trizol® 시약 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 분리하고, 올리고(dT) 프라이머와 역전사효소(reverse transcriptas e)(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 파골세포 분화 마커인 TRAP와 CSTK(cathepsin K)의 mRNA 발현량은 SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, Calif)와 Bio-Rad CFX Manager™ Software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용한 실시간 qPCR에 의해 정량화하였다. 18s rRNA 단백질 mRNA는 mRNA 수준을 정상화하기 위한 기준 유전자로 사용되었다. 이용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2019009327-appb-img-000002
12. ELISA
배양 배지에서 IL-1β의 농도를 측정하기 위하여 마우스 IL-1β(interleukin-1β) ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN , USA)를 사용하였다.
13. ALP 염색(Alkaline Phosphatase Staining)
분화된 C2C12 세포를 인산염 완충액 (PBS)으로 세척하고 10% 포름 알데히드로 15분간 고정시켰다. 다시 PBS로 씻은 후, 세포를 RT에서 30분 동안 BCIP/NBT 발색 기질(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 염색하여 ALP 활성을 평가 하였다. ALP-양성 세포는 보라색 또는 청색으로 염색되었다.
14. 통계 분석
모든 실험은 최소 3회 반복하였으며, Student's t-test를 사용하여 통계적 유의성을 결정하였다( p<0.05).
[실험결과]
실시예 1. 금제제에 의한 RANKL 유도의 파골세포 분화 억제 확인
BMM에 100 ng/mL RANKL 및 30 ng/mL M-CSF을 처리하여 7일 동안 배양한 결과 BMM 세포는 파골세포 유사의 거대 TRAP 양성 다핵 세포로 분화되었다(도 1a 참조). 그러나, 1 또는 3 μM의 오라노핀을 처리한 경우 분화된 BMM 세포가 감소하였으며, 특히 다핵세포의 수는 오라노핀의 농도 의존적으로 감소하였다(도 1b 참조).
CSTK 및 TRAP는 파골세포 특이적 마커 유전자이며, RANKL에 의해 그 발현이 유도된다. qPCT 결과에서도 나타나는 바와 같이, 오라노핀(1 및 3 μM)의 처리는 파골세포 마커 유전자의 발현을 완벽하게 억제함을 알 수 있었다(도 1c 및 1d 참조).
또한, NFATc1(nuclear factor of activated T-cells 1)은 파골세포 분화에 필수적인 인자로서, RANKL에 의해 활성화된다. RANKL에 노출된 BMM에서 NFATc1과 CSTK 단백질의 발현 수준을 측정한 결과, 오라노핀의 처리는 상기 양 단백질의 발현을 억제함을 확인하였다(도 1e 참조). 아울러, Raw264.7 세포에서 동일한 실험을 반복한 결과, 세포에 처리한 오라노핀의 농도 의존적으로 NFATc1의 발현이 억제됨을 확인하였다(도 1f 참조).
또한, MTT assay 결과 1 및 3 μM의 오라노핀은 BMM과 Raw264.7 세포에서 독성을 나타내지 않았는바, 오라노핀에 의한 파골세포 형성 감소가 오라노핀 자체의 세포 독성에 기인한 것이 아님을 알 수 있다(도 1g 참조).
실시예 2. 금제제에 의한 IKK / IκBα 활성화 억제 확인
NF-κB는 NFATc1의 발현을 조절하며, c-Fos를 포함한 AP -1 그룹은 NFATc1을 생산하고 이와 협력하여 전사 조절 캐스케이드(cascade)을 촉발시키고, C-Fos는 파골세포 분화에 중추적인 역할을 수행하는 것으로서 c-Fos가 결핍된 마우스는 파골세포 분화가 발생하지 아니하여 골석회화증이 나타남이 알려져 있다.
오라노핀에 의한 NF-κB 활성 억제가 파골세포 분화를 차단하는지 확인하기 위하여, pNF-κB-luciferase reporter를 이용하여 리포터 유전자 분석을 수행하였다. 그 결과, NF-κB 결합 영역을 포함하는 리포터 구조물로 형질감염된 Raw264.7 세포에서 오라노핀은 RANKL 유도의 NF-κB 리포터 활성을 억제함을 확인하였다(도 2a 참조). 또한, 3μM의 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 RANKL에 의한 c-Fos 발현이 감소됨을 확인하였다(도 2b 참조).
이어서, 오라노핀의 낮은 농도범위에서도 파골세포 전구체의 NF-κB 발현과 그 활성을 효과적으로 저해함을 확인하였는바, 오라노핀의 RANKL 유도의 NF-κB 활성 억제 기작을 알아보고자 p65 단백질 발현 수준과 세포내 위치를 확인하였다. p65는 RANKL에 의한 NF-κB 활성화에 중요한 전사 인자로서, 100ng/mL의 RANKL을 처리한 결과 5 내지 15분 사이에 p65 단백질의 발현 증가하였으나, 3μM의 오라노핀 처리에 따라 RANKL의 p65 발현 촉진이 차단됨을 확인하였다(도 2c 참조). 또한, RANKL는 Raw264.7 세포에 p65의 핵으로의 이동을 유도하는 것으로 보이나, 3μM 오라노핀의 처리에 따라 그 이동이 차단됨을 확인할 수 있었다(도 2d 참조).
이어서, RANKL을 처리한 Raw 264.7 세포에서 오라노핀이 NF-κB 신호 전달 경로의 상단에서 기능하는지 확인하고자 하였다. TRAF(TNF receptor-associated factors) 는 RANK에 의해 IKK 의존성 IκBα 인산화를 포함한 다양한 인산화 캐스케이드(cascade)를 활성화시킨다. 또한, TAK1(TGF-β-activated kinase 1)에 의한 IKK의 인산화는 염증성 사이토카인과 RANKL에 의한 NF-κB 신호 전달 경로를 활성화 시키는데 중추적인 역할을 수행한다. 또한, IκBα 서브유닛의 인산화 및 분해와 함께 TAK1 의존적 IKK 복합체가 활성화된다. 웨스턴 블롯팅 결과, Raw264.7 세포에 오라노핀을 처리한 경우, RANKL만 처리한 경우보다 IKKβ 인산화가 감소되었으며(도 2e 참조), 오라노핀은 RANKL에 의한 IκBα 서브유닛의 인산화 및 분해를 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 2f 참조). 상기로부터, 오라노핀에 의한 NFATc1의 하향조절은 TAK1/IKK/IκBα 의존적 NF-κB 활성화를 억제에 의한 것임을 알 수 있다.
실시예 3. 금제제에 의한 IL- 1β 분비 억제 확인
IL-1β는 염증성 사이토카인으로서, 골수 스트로마 세포에서 RANKL 발현을 촉진시키고 파골세포 형성을 직접적으로 유도하는 것으로 알려져 있다. IL-1β는 염증성 자극에 의해 조혈 세포( hematopoietic cell)에서 31kDa 전구체(pro-IL-1)로 발현되며, 수용체와 결합하기 위해서는 17kDa의 형태로 전환되어야 한다. BMDM에서 IL-1β의 분비는 2 단계 신호 전달 경로에 의해 조절되며, 첫 번째 신호는 NF-κB 의존적 NLRP3 및 pro-IL-1의 합성을 유도하는 TLR(Toll-like receptor)의 활성화 이후의 다양한 PAMP에 의해 촉발되며, 두번째 신호는 염증조절복합체 (inflammasome)에 의해 활성화 되는 caspase-1-catalyzed IL-1β 프로세스이다.
이에, 염증조절복합체 의존성 IL-1β 분비가 BMM의 파골세포로의 분화에 관여하는지 확인하기 위하여, pan-caspase 억제제인 nivocasan (GS-9450)를 처리하여 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. Nivocasan은 caspase-1를 비가역적으 로 억제하고, IL-1β 분비에 중요한 역할을 하는 caspase-8 활성을 억제한다. BMM 에 Nivocasan 처리와 함께 LPS와 ATP를 노출시켜 NLRP3 염증조절복합체 의존성 IL-1β 분비를 유도한 결과, Nivocasan(10mM)가 pro-IL1β의 절단을 방해하고, BMDM의 TRAP 양성 및 다핵 세포로의 분화를 차단함을 알 수 있었다(도 3a 및 3b 참조). 아울러, Nivocasan은 NFATc1과 CSTK의 단백질 발현도 억제함을 확인할 수 있었는바 (도 3c 참조), 상기로부터 염증조절복합체 시그널링이 BMDM의 파골세포로의 분화에 적극적으로 관여함을 알 수 있다.
다음으로, 오라노핀이 염증조절복합체 매개의 IL1β 분비를 억제함으로써 BMM의 분화를 차단할 수 있는 것인지 확인하기 위해, Nivocasa n 대신 오라노핀 을 처리하여 상기 실험을 반복하였다. 그 결과, BMM과 J774.A1 세포 (ASC-positive mouse monocyte/macrophage cell line)에서 오라노핀의 처리는 염증조절복합체 매개의 IL-1β 분비를 억제함을 확인할 수 있었다(도 3d 및 3e 참조). 한편, 낮은 농도(0.3 및 1 μM)에서 오라노핀의 IL1β 분비 억제 효과로부터, 오라노핀의 IL-1β 분비 억제 활성은 염증조절복합체 활성 억제에 부분적으로 의존함을 알 수 있다.
실시예 4. 난소적출모델에서 금제제의 골 손실 방지 효과 확인
난소적출 마우스(OVX)에서 오라노핀의 골 손실 방지 효과를 확인하기 위하 여, OVX 마우스에 10mg/kg의 오라노핀을 43일 동안 경구투여하였고, 매일 마우스의 체중을 측정하였다. OVX 대조군은 동량의 vehicle을 투여하였다. SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 투여군의 체중은 초기에 거의 동일하였으나, 이후 오라노핀 투여군의 체중이 조금 감소하는 양상을 보였다(도 4a 참조). 상기로부터 오라노핀 이 위장관에 작용하여 부작용으로 설사를 동반하는 것을 알 수 있었다.
이어서, H&E 염색 결과, 오라노핀 투여는 OVX 마우스에서 골 소실을 억제함을 알 수 있었다(도 4b 참조). 43일 동안의 오라노핀 투여는 좌우 대퇴골의 중량 감소를 방지하였으며, SHAM 대조군보다 더 높은 골 중량을 가짐을 확인할 수 있었다(도 4c 참조). 다음으로, 혈청 생화학 분석 결과, OVX 대조군의 혈청에서 BALP 농도가 높았으나, 오라노핀의 투여가 난소 적출에 의해 증가된 BALP 농도를 감소시키는 것을 확인하였다(도 4d 참조).
상기 결과는, 생체 내에서 오라노핀의 파골세포 분화 억제를 통한 골 손실 억제 효과를 시사하는 것으로서, 미아크로 CT 이미지를 통해 보다 명확하게 알 수 있었다. OVX 대조군에서 보정된 골 미네랄 밀도 (BMD)의 유의한 감소는 확인되지 않았으나, 마이크로 CT의 단면 이미지로부터 오라노핀 투여에 따라 골 밀도가 개선됨을 확인할 수 있었다(도 5a 참조). 또한, 오라노핀은 난소적출에 따른 골 밀도, 골 중량, 해면질골(bone trabecular)의 두께 및 수의 변화를 억제하여, 난소적출 마우스에서 2-3 차원의 구조적 골 손실을 방지함을 알 수 있었다(도 5b 내지 5g 참조). 또한, 오라노핀 투여군에서 섬유주(trabecular) 패턴 인자와 구조 모델 지수에서 특별한 변화를 확인할 수 없었으나, 매우 낮은 섬유주 분리 수로부터 오라노핀이 생체 내에서 골 손실을 효과적으로 방지함을 알 수 있다.
실시예 5. 오라노핀이 조골세포에 미치는 영향 확인
오라노핀이 파골세포 특이적으로 효과를 나타냄을 확인하기 위하여, C2C12 세포를 이용하여 오라노핀이 조골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, C2C12세포는 오라노핀의 처리와 관계없이 BMP(Bone Morphogenic Protein)의 처리에 따라 조골세포로 분화함을 확인하였다.
상기 결과는 오라노핀이 조골세포 분화과정에 영향이 없으며, 파골세포 특이적으로 분화 억제 효과를 나타내는 것을 의미하는 바, 파골세포 분화에 의해 야기되는 대사성 골 질환의 치료에 이용될 수 있음을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 금제제, 특히 오라노핀은 RANKL 자극에 의해 유발되는 파골세포의 분화를 억제하는 효과가 있으며, 파골세포 분화를 억제함으로써 궁극적으로 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하여 파골세포의 분화에 의해 야기되는 대사성 골 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.
또한, 본 발명은 난소적출시술에 의해 인위적으로 폐경을 유도한 마우스 모델에서 금제제의 일종인 오라노핀을 투여하여 골 밀도, 뼈의 미네랄 함량이 증가됨을 확인하였는바, 본 발명에 따른 조성물은 폐경기 이후 발생하는 골 소실을 억제하여 골다공증 등의 대사성 골 질환을 예방, 개선, 또는 치료하는데 이용될 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (18)

  1. 금(gold)제제를 유효성분으로 포함하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금제제는 오라노핀(auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 및 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 골수유래 대식세포의 파골세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 NFATc1(nuclear factor of activated T-cells 1)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 IKK(IκB kinase) 및 IκBα(inhibitor of kappa B)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 IL-1β(interleukin-1β)분비를 차단하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
  7. 금(gold)제제를 유효성분으로 포함하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 대사성 골 질환은 폐경 또는 파골세포 분화에 의해 야기되는 질환인 것을 특징으로 하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 금제제는 오라노핀(auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 및 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 대사성 골 질환은 골다공증, 치주염, 및 뼈 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병인 것을 특징으로 하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 뼈 전이암은 유방암 또는 전립선암으로부터 전이되는 암인 것을 특징으로 하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 금제제를 유효성분으로 포함하는, 골 손실 억제용 식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 금제제는 오라노핀(auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 및 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골 손실 억제용 식품 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 골 손실은 폐경 또는 파골세포 과분화에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는, 골 손실 억제용 식품 조성물.
  15. 금제제의 파골세포 분화 억제용 약제를 생산하기 위한 용도.
  16. 금제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파골세포 분화를 억제하는 방법.
  17. 금제제의 대사성 골 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도.
  18. 금제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대사성 골 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
PCT/KR2019/009327 2018-08-07 2019-07-26 금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물 WO2020032452A1 (ko)

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