WO2011059294A2 - 모르피난 알칼로이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물 - Google Patents

모르피난 알칼로이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물 Download PDF

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이민재
박대훈
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강원대학교산학협력단
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer or immune enhancing composition containing a morphinane alkaloids compound as an active ingredient. More specifically, the present invention provides an anticancer or immune enhancing composition containing a morphinan alkaloid compound isolated from Stephania delavayi Diels as an active ingredient, a pharmaceutical for preventing or treating cancer, and a functional health food for enhancing immunity. It is about.
  • Cancer is one of the incurable diseases to be solved by humankind, and huge capital is being invested in the development to cure it all over the world.In Korea, it is the number one disease cause of death among Koreans since the 1990s. More than 100,000 people have been diagnosed with cancer, and more than 60,000 have died.
  • the cancer causing factors include smoking, ultraviolet rays, chemicals, food, stress, and other environmental factors, but the causes of the various causes are difficult to develop the treatment, and the effects of the treatment vary depending on the site of occurrence.
  • Surgical treatment is effective for eliminating the initial state of cancer, but in some cases, it is necessary to remove organs.
  • metastasis cannot be prevented, and radiation treatment has a high therapeutic effect in treating cancer of a specific site, while radiation therapy cannot prevent new carcinogenesis and metastasis. The problem is that it involves pain.
  • anticancer agent which is a chemotherapeutic agent used for the treatment of malignant tumors
  • anticancer agents are agents that exhibit anticancer activity by inhibiting various metabolic pathways of cancer cells, especially synthesis of nucleic acids.
  • anticancer drugs currently used in cancer treatment are classified into six categories of alkylating agents, metabolic antagonists, antibiotics, mitosis inhibitors, hormonal agents, and other agents according to biochemical mechanisms of action. It does not work but damages normal cells, especially tissue cells with active cell division, which has been accompanied by various side effects such as bone marrow dysfunction, gastrointestinal disorders, and alopecia. Therefore, it is very important to develop an anticancer agent that can enhance the anticancer effect without any side effects of the human body.
  • the research is to extract or process anticancer ingredients from natural materials such as plants to develop them into cancer treatments, preventive medicines or health supplements. Is actively being done.
  • the anticancer activity of the anticancer agent for the treatment of cancer can be divided in several ways from the cancer development mechanism, firstly the mechanisms that induce direct action on cancer cells, ie cytotoxicity, cell cycle regulation and apoptosis (apoptosis) The second is due to the mechanism of inhibiting the angiogenesis of cancer cells, the third is due to the mechanism of inhibiting the invasion of cancer cells, and the fourth is to increase the immunity to inhibit the metastasis of cancer cells. It can be divided into mechanism and the like.
  • each anticancer agent may be active at each of these stages, but it is common to show anticancer activity by showing a major activity at a specific stage.
  • the present inventors while developing a new anti-cancer agent, the natural product, that is, the morphinan alkaloid compound isolated and purified from the Qunjeon not only has excellent anti-cancer activity, but also does not have toxicity and side effects, which is excellent in stability and immune regulation.
  • the present invention was completed by confirming that it has an immune enhancing effect.
  • an object of the present invention is to provide an anticancer or immune enhancing composition containing a morphinan alkaloid compound having excellent anticancer activity and an excellent immune enhancing effect or a salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a medicament for the prevention or treatment of cancer comprising the anticancer or immune enhancing composition.
  • Another object of the present invention is to provide a functional health food having an anticancer or immune enhancing effect comprising the anticancer or immune enhancing composition.
  • the present invention is an anticancer or immune enhancing composition containing a morphinane alkaloids (morphinane alkaloids) compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • R 1 or R 2 is independently hydrogen ; Alkyl groups of 1 to 18 ; A cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms having a substituent ; C1-C4 lower alkyl group containing the phenyl group which has 1-3 substituents ; Lower alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms having hydroxy and alkoxy and acyloxy groups having 1 to 5 carbon atoms ; Lower acyl groups having 1 to 7 carbon atoms having hydroxy and alkoxy and acyloxy groups having 1 to 5 carbon atoms ; A cycloalkylcarbonyl group having 5 to 7 carbon atoms having 1 to 3 substituents ; And it may be selected from the group consisting of acyl groups having 1 to 4 carbon atoms including a phenyl group having 1 to 3 substituents.
  • R 1 or R 2 may be independently selected from the group consisting of hydrogen, methyl and acetyl.
  • the compound may be 6,7-di-O-acetylsinococuline (6,7-di-O-acetylsinococuline: FK-3000).
  • the morphinan alkaloid-based compound may be extracted and separated from the stephania delavayi Diels.
  • the extraction may be carried out by a solvent extraction method using water or an organic solvent.
  • the organic solvent may be selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane.
  • the separation may be performed in parallel with Sephadex LH-20 chromatography, silica gel chromatography, C18 HPLC chromatography.
  • the morphinan alkaloid-based compound may have the activity of inhibiting cell proliferation, induction of cell death, cell cycle arrest or cell growth of cancer cells.
  • the morphinan alkaloid-based compound may induce cell proliferation inhibition and apoptosis of cancer cells through inhibiting the expression of NF-kB or COX-2.
  • the cell cycle detention may be to arrest the G2 / M stage during the cell cycle progression.
  • the morphinan alkaloid-based compound may be to enhance the activity of the immune system of B cells by activating CD19.
  • the cancer is breast cancer, laryngeal cancer, lung cancer, epithelial cancer, prostate cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, colon cancer, liver cancer, gastric cancer, tongue cancer, skin cancer, brain tumor, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, kidney cancer , Gallbladder cancer, oral cancer, colon cancer, liver cancer and bladder cancer.
  • the present invention also provides a medicament for the prevention or treatment of cancer, comprising the anticancer or immune enhancing composition of the present invention.
  • the present invention provides a functional health food having an anticancer or immune enhancing effect comprising the anticancer or immune enhancing composition of the present invention.
  • the morphinan alkaloid compounds according to the present invention inhibit the expression of NF-kB and COX-2, which are important factors for cancer development, inhibit the cell proliferation of cancer cells and induce cell death, and progress the cell cycle. Depresses the progression of G2 to M and inhibits the growth of tumors, which not only has excellent anti-cancer activity, but also has an immunomodulatory effect through immunomodulatory action and has no toxicity and side effects in the body, preventing or treating cancer. There is an effect that can be used as a material of the functional health foods for the drug and immune enhancement.
  • Figure 1 shows a chromatogram separated from the FK-3000 compound according to the present invention using an HPLC chromatograph from one sentence.
  • Figure 2 is a graph showing the cell survival rate of MDA-MB-231 cells according to the concentration and time after treatment with FK-3000 compound by concentration to breast cancer cell line MDA-MB-231 cell line.
  • Figure 3 is a graph showing the results obtained by fluid cell measurement of cell death of MDA-MB-231 cells after treatment with FK-3000 compound by concentration and time of breast cancer cell line MDA-MB-231 cell line.
  • Figure 4 shows a photograph comparing the migration of the NF-kB to the nucleus in the MDA-MB-231 cell line not treated with 0.5 ug / ml FK-3000 compound and FK-3000 compound by immunofluorescence analysis.
  • Figure 5 shows that after treatment with the FK-3000 compound MDA-MB-231 cell line NF-kB activity and COX-2 expression by the FK-3000 compound over time confirmed by Western blot.
  • FIG. 6 is a graph showing the detention of cell cycle progression when the FK-3000 compound is treated in the MDA-MB-231 cell line through cell cycle distribution analysis for each treatment concentration and treatment time of FK-3000.
  • FIG. 7 shows Western blots of cyclin B and p-cdc2 that promote the change of phosphorylation of p38 MAPK by FK-3000 compounds and cell cycle progression to M stages at different concentrations and treatment times of FK-3000. It shows what was confirmed.
  • FIG. 8A is a 5uM SB239063, 5uM SB239063 and 0.5ug / ml FK-3000, and 0.5ug / ml FK to confirm whether the inhibition of apoptosis of FK-3000 was inhibited by SB239063, an inhibitor of p38 MAPK.
  • -3000 is treated with MDA-MB-231 cell lines, respectively, and is a graph comparing cell viability after 24 and 48 hours of incubation.
  • FIG. 8B shows that 5 uM of SB239063, 5 uM of SB239063 and 0.5 ug / ml of FK-3000 and 0.5 ug / ml of FK-3000 were treated with MDA-MB-231 cell line, respectively, and cultured for 90 minutes, followed by p-p38 MAPK and The expression level of p-cdc25B was confirmed by Western blot.
  • FIG. 8C shows that 0.5 ug / ml of FK-3000 and 5 uM of SB239063 and 0.5 ug / ml of FK-3000 were treated in MDA-MB-231 cell lines, respectively, and cultured for 90 minutes, followed by pB MAPK nuclei by SB239063.
  • the photograph shows the movement inhibition phenomenon through the microscope.
  • Figure 9a shows 5uM SB239063, 0.5ug / ml FK-3000 and 5uM SB239063 and 0.5ug / in MDA-MB-231 cell line to determine whether SB239063 influences the inhibition of expression of COX-2 by FK-3000.
  • Each of ml of FK-3000 was treated and the photo shows the expression level of COX-2 in each cell by immunochemistry using the antibody of COX-2.
  • Figure 9b shows the results of Western blot using the antibody of COX-2 to confirm whether SB239063 affects the inhibition of expression of COX-2 by FK-3000.
  • Figure 10 shows the tumor growth inhibitory effect of FK-3000 MDA-MB-231 cell line injected into mice to form a tumor, 10mg / kg Taxol, 1mg / kg FK-3000 and 10mg / kg Taxol and 1mg / kg of FK-3000 were injected intraperitoneally in each mouse, and then reared for 24 days and then compared to the tumor size of the mouse.
  • Figure 11 is injected into the mouse MDA-MB-231 cell line to form a tumor, 10mg / kg Taxol, 1mg / kg FK-3000 and 10mg / kg Taxol and 1mg / kg FK-3000, respectively After injection into the abdominal cavity of the mouse, it is a graph comparing the measurement of the tumor volume for each time.
  • FIG. 12 shows LPS treatment of splenic lymphocytes obtained from mice administered with 10 ⁇ g / ml of FK-3000 and non-administered mice to confirm that FK-3000 regulates B cell proliferation. It is a graph comparing the results obtained by measuring the degree of inhibition of proliferation of stimulated B cells.
  • Figure 13 after treatment with ConA and PWM for each concentration of spleen lymphocytes obtained from mice administered with 10ug / ml of FK-3000 and non-administered to determine whether FK-3000 affects T cell proliferation It is a graph which compared the result of having measured the inhibition of the proliferation of T cells.
  • the present invention is characterized by providing an anticancer or immune enhancing composition containing a morphinane alkaloids compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the morphinan alkaloid-based compound may be a compound having the formula
  • R 1 or R 2 is independently hydrogen ; Alkyl groups of 1 to 18 ; A cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms having a substituent ; C1-C4 lower alkyl group containing the phenyl group which has 1-3 substituents ; Lower alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms having hydroxy and alkoxy and acyloxy groups having 1 to 5 carbon atoms ; Lower acyl groups having 1 to 7 carbon atoms having hydroxy and alkoxy and acyloxy groups having 1 to 5 carbon atoms ; A cycloalkylcarbonyl group having 5 to 7 carbon atoms having 1 to 3 substituents ; And it may be selected from the group consisting of acyl groups having 1 to 4 carbon atoms including a phenyl group having 1 to 3 substituents.
  • the R 1 or R 2 may be independently selected from the group consisting of hydrogen, methyl and acetyl, more preferably the morphinan alkaloid compound according to the present invention is 6,7-di-o-acetylsinoko Culin (6,7-di-O-acetylsinococuline (FK-3000)).
  • the morphinan alkaloid compound having the above structural formula according to the present invention may be used in the form of a salt, preferably a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salt is preferably an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid, and an organic acid and an inorganic acid may be used as the free acid.
  • the organic acid is not limited thereto, citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, Glutamic acid and aspartic acid.
  • the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.
  • the morphinan alkaloid compounds according to the invention can be isolated from nature or prepared by chemical synthesis methods known in the art.
  • the morphinan alkaloid compounds of the present invention can be isolated and purified from natural plants. That is, it can be obtained from a plant or part of a plant using a method of extracting and separating conventional materials. Stems, roots or leaves are appropriately dried and macerated or only dried to obtain the desired extracts and extracted with a suitable organic solvent, and the desired extracts may be purified using methods known to those skilled in the art to which the present invention pertains. It can be purified. Most preferably, the FK-3000 compound of the present invention can be isolated and purified from Stephania delavayi Diels.
  • Stephania delavayi Diels is a dicotyledonous plant of the Menispermaceae, which has been known as a Chinese herbal medicine since ancient times as a therapeutic agent for clearing detoxification, diarrhea, aches and pains and acute gastroenteritis, and belongs to the same genus S. cepharantha Hayata. Is a Japanese native species that has been known to inhibit DNA damage by eliminating radicals that induce lipid peroxidation. However, there are no known ingredients that are effective ingredients of pharmacologic efficacy. Accordingly, in the present invention, the bioactive component was isolated and purified from Stephania delavayi Diels, and it was confirmed that the purified component was very excellent in anticancer and immune enhancing effects.
  • a suitable solvent for the extraction may be water or an organic solvent, preferably purified water, methanol (methanol), ethanol (propanol), isopropanol (isopropanol), butanol (butanol), Various solvents such as acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane Can be used or mixed. More preferably, methanol can be used.
  • the extract obtained from the above method can be used to obtain the active ingredient from the extract using a separation and purification method known in the art
  • the separation and purification of the FK-3000 compound of the present invention is a silica gel (silica gel)
  • Column chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC) filled with various synthetic resins, such as activated alumina, or the like, may be used alone or in combination.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Sephadex LH-20 chromatography and C18 HPLC chromatography can be performed in parallel.
  • the extraction and purification of the active ingredient is not necessarily limited to the above-described method.
  • FK-3000 6,7-di-O-acetylsinococuline (hereinafter referred to as FK-3000) compound belonging to the morphinan alkaloid family is HSV-1 (herpes simplex virus type-1). ) And HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) have been shown to have antiviral effects to inhibit infection by these viruses (Nawawi A et al ., Phytother Res . 15, 6, 497 -500, 2001; Ma CM. Et al ., Chem Pharm Bull ,, 50, 6, 877-80, 2002; Ma CM. Et al ., Phytother Res ., 16, 2, 186-189, 2002), There is no report on the fact that the FK-3000 compound and the morphinan alkaloid compound have anticancer activity and immune enhancing activity through an immunomodulatory function.
  • the morphinan alkaloid compound has excellent anticancer activity and immune enhancing activity.
  • FK-3000 which is a morphinan alkaloid compound
  • FK-3000 is treated to breast cancer cells After counting the number of surviving cells, staining cells with Annexin V, a marker of apoptosis, and measuring apoptosis due to apoptosis, breast cancer cells treated with FK-3000 were FK-3000. It was shown that cell proliferation was suppressed and cell death was increased compared to the control group without treatment, and cell death by FK-3000 was proportional to concentration and culture time (see FIGS. 2 and 3).
  • the morphinan alkaloid compound of the present invention has anticancer activity by inhibiting the proliferation of cancer cells and inducing apoptosis to promote cell death.
  • NF-B Nuclear Factor kappa B
  • p50 subunit family p50, p52
  • p65 subunit family p65, c-Rel, RelB
  • IB proteins IBa, IB, IB, IBe, Bcl3
  • the IB kinase complex when activated by various stimuli such as various cytokines such as TNF-a and IL-1, bacteria, viral infections, stress or oxidants, the IB protein is phosphorylated and degraded by the ubiquitin mechanism.
  • the active NF-B released from IB migrates from the cytoplasm to the nucleus and binds to the NF-B binding site of the target gene to induce the expression of various genes encoding proteins involved in immune or inflammatory reactions. (Barnes PJ et al. N. Engl. J. Med. 336, 1066-1071, 1997).
  • proteins regulated by the transcription factor NF-B play an important role in normal physiological functions such as development and immune responses, but abnormal activation of NF-B is associated with arthritis, asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, and systemic Lupus erythematosus, psoriasis, ulcerative colitis, systemic inflammatory syndrome, pneumonia, multiple myositis, Alzheimer's disease (Keith T. Akama et al, Proc. Natl. Acad. Sci .
  • NF-B NF-B-like protein
  • phosphorylated active NF-B is a cyclooxygenase-2.
  • NF-B and IB are present in phosphorylated and activated forms in cancer cells, and expression of COX-2 is also increased (Jand BC., J. BioL . Chem ., 275, 39 507-39515, 2000; Monks NR et al ., J. Cell Biochem , 92, 646-650, 2004).
  • controlling the activation of abnormal NF-B can suppress the onset or progression of various inflammatory diseases including degenerative diseases, and can control the activation of NF-B because it can treat cancer diseases caused by abnormal cell proliferation. Research on higher regulatory factors continues.
  • NF-B NF-B kinase A
  • JNK Jun-N-terminal kinase
  • GSK-3 glycogen synthase kinase-3
  • PKA protein kinase A
  • JNK Jun-N-terminal kinase
  • GSK-3 glycogen synthase kinase-3
  • PKA protein kinase A
  • p38 MAPK Has been shown to inhibit the activation of NF-B and reduce phosphorylation of NF-B by JNK (Ivanov VN, J. BioL. Chem ., 274, 14079-14089, 1999; Park MK, Mol. Cell , 17, 45-50, 2004).
  • the present inventors investigated whether the morphinan alkaloid compound according to the present invention can inhibit the activity of NF-B and COX-2, that is, according to an embodiment of the present invention, FK is a morphinan alkaloid compound
  • FK is a morphinan alkaloid compound
  • Treatment of -3000 compounds with breast cancer cell lines followed by Western blot expression of NF-B and COX-2, and when treated with FK-3000 compounds, NF-B and COX-2 compared to untreated controls Has been shown to be reduced, and the translocation of NF-B to the nucleus was also blocked (see FIGS. 4 and 5).
  • the morphinan alkaloid compounds of the present invention have anticancer activity by down-regulating NF-B and COX-2, inhibiting proliferation of cancer cells and inducing apoptosis.
  • the morphinan alkaloid compound according to the present invention is characterized by being able to suppress the development and progression of cancer by arresting the progress of the cell cycle in cancer cells.
  • the cell cycle refers to a series of processes in which chromosomal DNA and cell components are replicated, distributed evenly, and divided into two daughter cells.
  • many proteins are interacted in a series of various orders, and the cells proliferate while the G1, S, G2, and M phases are repeated periodically. Looking at these steps in mammalian cells in detail:
  • G1 phase with a checkpoint is a preparatory step for making new cells.
  • the cell cycle stops and enters the growth phase, G0. But with sufficient nutrition and a variety of growth factors, the cell cycle progresses to S phase.
  • the cell replicates its genome to make two copies of the chromosome, as well as several factors in the cytoplasm to divide into two cells.
  • the cell enters the G2 stage, known as the second checkpoint.
  • the major mechanism of action during the G2 period regulates DNA replication and completion and prepares for entry into the cleavage phase.
  • the various factors necessary for cell construction are produced at the G2 stage.
  • M stage is the dividing stage where the actual division of the cell occurs.
  • M phase the genome that is replicated in the shortest and most dramatic stage in time is separated into the cell's anode and two daughter cells Because it is the stage that is created.
  • This series of processes is a very important process for maintaining the life of cells because all cells go through in order for one cell to grow and divide into two cells. Therefore, the study of cell cycles and the substances regulating them are essential for the study of cell growth mechanisms and the development of preventive and therapeutic drugs for cancers occurring in the cell cycle.
  • a complex of cyclin and cyclindependent kinase acts as a regulator, and cyclin D at stage G1.
  • CDK cyclin and cyclindependent kinase
  • / CDK4 cyclin D / CDK6 and cyclin E / CDK2 act in sequence
  • cyclin A / CDK2 G2 and M are involved in cyclin A / CDK1 and cyclin B / CDK1 in phase S.
  • the present inventors treated FK-3000 in a breast cancer cell line, and then promoted the progression from G2 to M stage.
  • cyclin B and cdc2 which are known to be factors
  • both expression was reduced, and in particular, the expression of phosphorylated cdc2 was markedly decreased, which promoted cell cycle progression from G2 to M phase.
  • cdc25B which is known to play an important role in the proliferation and metastasis of cells, was also found to reduce the expression of phosphorylated cdc25B (see FIG. 7).
  • the present inventors investigated whether the activation of p38 MAPK is inhibited when the p38 MAPK inhibitor is treated in the activation mechanism of p38 MAPK by the morphinan alkaloid compound of the present invention.
  • the survival rate of the cells treated with FK-3000 alone and incubated for 48 hours was about 52%, whereas the group treated with FK-3000 compound and SB23906 showed a survival rate of about 72%, and the group treated with SB23906 only Almost all cells were shown to survive (see FIG. 8A).
  • Phosphorylation of p38 MAPK plays an important role in cell death, differentiation and cell cycle progression. Phosphorylated p38 MAPK is known to migrate from the cytoplasm to the nucleus and cause DNA damage.
  • the morphinan alkaloid compound of the present invention induces apoptosis by activating p38 MAPK.
  • FK-3000 was not completely inhibited by FK-3000 despite the treatment of SB23906.
  • the mechanism of apoptosis was found to be involved in a mechanism other than the inhibition mechanism of NF-kB through p38 MAPK.
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • COX-2 is a main enzyme involved in the biosynthesis of prostaglandin, and there are two kinds of isomers in vivo.
  • COX-1 is expressed in the normal state and is involved in gastrointestinal protection and renal function control.
  • COX-2 is transient and rapid in the cell by mitogen or cytokines during inflammation or other immune reactions. Expressed.
  • substances that inhibit COX-1 or COX-2 may play an important role not only in the treatment of inflammation but also in inhibiting cancer production.
  • the present inventors treated only FK-3000 with breast cancer cell line in one embodiment of the present invention to investigate whether the anticancer activity mechanism by the morphinan alkaloid compound of the present invention is through the inhibition of expression of COX-2.
  • the expression of COX-2 was measured in the group treated with only SB23906 and the group treated with FK-3000 and SB23906 together.
  • the morphinan alkaloid compound according to the present invention is characterized by the activity of inhibiting tumor growth.
  • a tumor is formed by subcutaneously injecting a breast cancer cell line into a mouse, followed by intraperitoneal injection of FK-3000 into the tumor-forming mouse, and the mouse is not treated with the FK-3000 compound.
  • Tumor size was significantly reduced compared to that of the tumor growth inhibitory effect, which was almost similar to or better than that of taxol, which was previously known as an anticancer agent.
  • FK-3000 compound was treated with Taxol.
  • the tumor growth inhibitory effect was found to be very good (see FIGS. 10 and 11).
  • the morphinan alkaloid compound according to the present invention not only has excellent activity of inhibiting tumor growth by reducing the size of the tumor, but also when administered in combination with an existing anticancer agent, the conventional anticancer or morphinan alkaloid compound is administered alone. It can be seen that the anticancer effect is significantly improved than when. Therefore, when the morphinan alkaloid compound according to the present invention is used for anticancer treatment, it may be used alone or in combination with an existing anticancer agent.
  • the inventors performed a stability test on mouse animal models to determine whether the morphinan alkaloid compound isolated and purified in the present invention is stable as a clinical anticancer agent.
  • the present invention after administering 10 mg of FK-3000 compound once a day for 5 days in male and female mice, collecting the tissue and blood of the mice, and then the pathological state of each tissue and The amount of leukocyte related components in the blood was investigated. As a result, the levels of serum biochemical markers in the tissues and blood of the mice to which the FK-3000 compound was administered were not significantly different from those of the normal group to which the FK-3000 compound was not administered (see Example 5).
  • the results indicate that the morphinan alkaloid compound according to the present invention does not cause side effects and toxicity in vivo and has excellent stability.
  • the morphinan alkaloid compound of the present invention is characterized by having immunomodulatory activity, and in particular, activates CD19 to enhance the activity of the immune system of B cells.
  • splenocytes from mice to which FK-3000 has been administered to determine whether the proliferation of lymphocytes and the expression of cell surface molecules are changed by FK-3000, a morphinan alkaloid compound.
  • B cells were treated with LPS and T cell stimulators ConA and PWM, respectively, and then lymphocyte proliferation was examined.
  • harmful stimuli such as LPS (lipopolysaccharide), inflammation-inducing factors, and irradiation can excessively stimulate the human immune system, leading to tumor necrosis factor-a (TNF-a) and interleukin-IL-1 in immune cells such as macrophages.
  • TNF-a tumor necrosis factor-a
  • interleukin-IL-1 interleukin-IL-1 in immune cells such as macrophages.
  • Inflammatory diseases such as arthritis, sepsis and tissue transplant rejection by excessively inducing inflammatory substances such as IL-6, prostagladin, luecotriene and nitric oxide (NO) It is known to cause autoimmune diseases, immune diseases such as diabetes and neuronal cell death, and is also known to be involved in the development of various cancers.
  • the morphinan alkaloid compound of the present invention regulates and enhances the immune response by activating B lymphocytes by inhibiting excessive immune response of B cells by LPS and enhancing expression of CD19, a B cell-related factor. In contrast, it was found that it is not involved in T cell proliferation.
  • the present invention provides an anticancer or immune enhancing composition containing a morphinan alkaloid compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing and treating the symptoms of diseases caused by cancer or immune disorders.
  • the type of the cancer which can be prevented or treated using the morphinan alkaloid-based compound is not limited thereto, but breast cancer, laryngeal cancer, lung cancer, epithelial cancer, prostate cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, colon cancer, liver cancer, stomach cancer, Tongue cancer, skin cancer, brain tumor, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, kidney cancer, gallbladder cancer, oral cancer, colon cancer, liver cancer and bladder cancer.
  • the anticancer or immune enhancing composition according to the present invention may include a pharmaceutically effective amount of a morphinan alkaloid compound alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat cancer or immune abnormalities.
  • the pharmaceutically effective amount of the morphinan alkaloid compound according to the present invention is 0.5-100 mg / day / kg body weight, preferably 0.5-5 mg / day / kg body weight.
  • the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed according to the degree of disease symptoms, the age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment of the patient.
  • the pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness or the like when administered to humans.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • the anticancer or immune enhancing composition according to the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the active ingredient is determined by the route of administration, age, sex, weight and It may be appropriately selected depending on various factors such as severity.
  • the anticancer or immune enhancing composition of the present invention can be administered in parallel with a known compound having the effect of preventing, improving or treating the symptoms of cancer.
  • the present invention can provide a medicament for preventing or treating cancer, including a composition containing a morphinan alkaloid compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the morphinan alkaloid compound according to the present invention has no toxicity and side effects in vivo and can be used safely even when taken for a long time.
  • the morphinan alkaloid compound of the present invention is isolated and purified from a natural plant, Ilmunjeon
  • the composition of the present invention comprising the same has a very stable characteristic for the body.
  • the anticancer or immune enhancing composition of the present invention can be added to a food for the purpose of preventing or improving cancer and immune enhancing effect, the composition of the present invention as a functional health food composition having an anticancer or immune enhancing effect Can be used.
  • the composition for functional health foods having an anticancer or immune enhancing effect of the present invention is effective in preventing and improving cancer symptoms, and foods having an immune enhancing effect, such as a main ingredient, an auxiliary ingredient, a food additive, a functional food or a beverage. It can be easily utilized.
  • the food means a natural product or processed product containing one or more nutrients, and preferably means a state in which it can be directly eaten through a certain processing process, and as a general meaning, food It includes all food additives, functional foods and drinks.
  • Foods to which the composition for functional health foods having anticancer or immune enhancing effects according to the present invention can be added include, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, functional foods, and the like.
  • food includes special nutritional products (e.g., formulated milk, young, infant food, etc.), processed meat products, fish products, tofu, jelly, noodles (e.g. ramen, noodles, etc.), bread, health supplements, seasonings.
  • Foods e.g. soy sauce, miso, red pepper paste, mixed soy sauce
  • sauces confectionery (e.g. snacks), candy, chocolates, gums, ice creams, dairy products (e.g.
  • fermented milk, cheese, etc. other processed foods
  • kimchi, Pickled foods various kimchi, pickles, etc.
  • beverages e.g., fruit drinks, vegetable drinks, soy milk, fermented beverages, etc.
  • natural seasonings e.g. ramen soup, etc.
  • the food, beverage or food additives may be prepared by a conventional manufacturing method.
  • the functional food is a biological defense rhythm control, disease prevention and recovery of a food group or a food composition that has added value to the food by using physical, biochemical, biotechnological techniques, etc. to function and express the function of the food for a specific purpose. It means a food that is designed and processed to fully express the body regulatory function related to the living body, specifically, it may be a health functional food.
  • the functional food may include food acceptable food additives, and may further include appropriate carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of functional foods.
  • the drink refers to a generic term for drinking to quench thirst or enjoy a taste and includes a functional drink.
  • the beverage contains, as essential ingredients, a composition for the prevention and amelioration of the menopausal symptoms as an essential ingredient, and there are no special limitations on the other ingredients, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks. Can be.
  • the food containing the functional health food composition having the anticancer or immune enhancing effect of the present invention in addition to the above-described flavors, coloring agents such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors And fillers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the components may be used independently or in combination.
  • the amount of the composition according to the present invention may comprise 0.001% to 90% by weight of the total food weight, preferably 0.1 wt% to 40 wt%, and in the case of a beverage, it may be included in a ratio of 0.01g to 20g, preferably 0.3g to 10g based on 100ml, but for health and hygiene purposes or health control
  • the active ingredient can be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety is not limited to the above range.
  • methanol was added before the above sentence, and a methanol fraction was obtained by a solvent extraction method. Thereafter, the obtained methanol fraction (1 g) was loaded on a Cetadex LH-20 (40 id ⁇ 860 mm, 25-100 m) column, and fractions were separated using methanol as an eluting solvent. The third fraction (700 mg) was again loaded onto a C18 HPLC (YMC-Pack Pro, S-5m, 20i.d. ⁇ 250mm) column, using 10-30% aqueous MeCN (0.05% TFA) as eluent.
  • C18 HPLC YMC-Pack Pro, S-5m, 20i.d. ⁇ 250mm
  • the compound isolated and purified according to the present invention is a morphinan alkaloid compound represented by the following formula (1), and the experiments performed thereafter are morphinan alkaloid compounds purified by the method of the present invention.
  • 6,7-di-o-acetylsinococuline represented by the following Chemical Formula 2 (6,7-di-O-acetylsinococuline; hereinafter referred to as FK-3000).
  • R 1 or R 2 is independently hydrogen; Alkyl groups of 1 to 18; A cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms having a substituent; Lower alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms including a phenyl group having 1 to 3 substituents; Lower alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms having hydroxy and alkoxy and acyloxy groups having 1 to 5 carbon atoms; Lower acyl groups having 1 to 7 carbon atoms having hydroxy and alkoxy and acyloxy groups having 1 to 5 carbon atoms; A cycloalkylcarbonyl group having 5 to 7 carbon atoms having 1 to 3 substituents; And an acyl group having 1 to 4 carbon atoms including a phenyl group having 1 to 3 substituents.
  • FK-3000 was treated at each concentration from 0 to 4 / for each cell, and then for 24 and 48 hours. After incubation, the degree of proliferation of the cells was measured using a CCK-8 (Dojindo Laboratories, Japan) cell counting kit.
  • the FK-3000 of the present invention was confirmed that the activity of killing MDA-MB-231 cells, which is a breast cancer cell line, that is, cell proliferation inhibitory activity, the concentration of FK-3000 and As the incubation time increased, apoptosis also increased.
  • the results indicate that the morphinan alkaloid compound of the present invention has an activity of inducing apoptosis and inhibiting cell proliferation of cancer cells, and found that the apoptosis effect is increased in a concentration-dependent manner.
  • Apoptosis of cancer cells of FK-3000 compounds was investigated by flow cytometric assay to analyze the cell proliferation inhibition mechanism of morphinan alkaloid compounds.
  • MDA-MB-231 cells cultured in the same manner as in Example 1 were treated with FK-3000 at concentrations of 0, 0.5 and 5.0 ug / ml, respectively, and cultured for 24 and 48 hours, followed by trypsin treatment. Were obtained respectively.
  • the cells were then washed with cold PBS solution and then lysed with 0.01 M Hepes / NaOH, pH7.4 solution containing 0.14 M NaCl and 2.5 mM CaCl 2 , followed by 5 Annexin V-FITC and 5 Propidium iodide (PI) was added and slowly mixed, followed by reaction for 15 minutes in the dark at room temperature. Then, 0.01 M Hepes / NaOH, pH7.4 solution was further added, and the cells stained with Annexin V were analyzed by BD Model FACScan (Becton Dickinson Inc., New Jersey, USA) to analyze the degree of apoptosis of each cell.
  • BD Model FACScan Becton Dickinson Inc., New Jersey, USA
  • apoptosis-induced cells As a result, as shown in Figure 3, the higher the concentration of FK-3000 treated to breast cancer cells, the number of apoptosis-induced cells was increased, in particular 0.5 and 5ug / ml of FK-3000 to the cells After 24 hours of incubation, apoptosis was increased to 8.01% and 12.97%, respectively, with apoptosis of 7.0% for the untreated controls. In addition, apoptosis was increased to 37.69% when FK-3000 was treated at 5.0 ug / ml and incubated for 48 hours.
  • the present inventors have found that the morphinan alkaloid compound of the present invention has anticancer activity by inducing apoptosis in cancer cells and promoting apoptosis, and anticancer activity through apoptosis of FK-3000 is concentrated. It can be seen that the proportion is dependent.
  • NF-kB and COX- are known to play an important role in the cancer development mechanism by confirming that the morphinan alkaloid compound has anticancer activity by inducing apoptosis of cancer cells through the experiment of ⁇ 2-2>. It was also investigated whether the morphinan alkaloid compound affected the activity of 2. For this investigation, the migration of NF-kB into the nucleus via immunofluorescence was measured along with phosphorylation of NF-kB and measurement of expression of COX-2 by treatment with FK-3000.
  • phosphorylation of NF-kB and the expression level of COX-2 were determined by extracting total protein from the cultured MDA-MB-231 cells using PRO-PREP (Intron Biotechnology, Korea) and nuclear extraction kit (Panomics). , California, USA) were used to isolate proteins in the cytoplasm and nucleus, respectively.
  • the amount of each protein was quantified by using the BioRad D c Protein Assay Kit (BioRad, California, USA) after electrophoretic protein an equal amount of the SDS-PAGE of 10%, p -NFB monoclonal antibodies ( Cell Signaling, Cat # 3036), COX-2 Polyclonal Antibody (Cayman, Cat # CAY-160106), ⁇ -Actin Monoclonal Antibody (Sigma-Aldrich, Inc., Cat # A-5316), and PARP Monoclonal Antibody ( After reaction with the primary antibody of BIOMOL International, Cat # SA-250), secondary antibodies of HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (Cayman, Cat # 10004301) and anti-mouse IgG (Cell Signaling, Cat # 7076) Each reaction was performed by Western blot known in the art.
  • NF-kB which acts as a survival factor of cancer cells, generally moves to the nucleus when activated by phosphorylation.
  • FK-3000 according to the present invention is treated to breast cancer cells, untreated controls In comparison, the migration of NF-kB to the nucleus was suppressed (see FIG. 4).
  • FIG. 5 the expression of phosphorylated NF-kB was decreased when FK-3000 was treated as compared to the untreated control group.
  • the expression of COX-2 was also reduced, and this result was found to be proportional to the increase in incubation time after treatment with FK-3000.
  • the present inventors found that the morphinan alkaloid compounds of the present invention inhibit phosphorylation of NF-kB, which acts as a survival factor of cancer cells, thereby inhibiting NF-kB activity and at the same time blocking migration to the nucleus. It was found that the action, and the inhibition of phosphorylation of NF-kB by FK-3000 also reduced the expression of COX-2.
  • morphinan alkaloid compounds have anticancer activity by inhibiting the activity of NF-kB and COX-2, that is, by down-regulation, inhibiting the proliferation of cancer cells and inducing apoptosis.
  • NF-kB and COX-2 that is, by down-regulation, inhibiting the proliferation of cancer cells and inducing apoptosis.
  • the present inventors analyzed whether the morphinan alkaloid compound has an effect of inhibiting cell proliferation not only for MDA-MB-231 cells, which are breast cancer cell lines, but also for cell lines of other cancer types.
  • MDA-MB-231 cells which are breast cancer cell lines, but also for cell lines of other cancer types.
  • cancer cell lines breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7, prostate cancer cell line PC-3, epithelial cell line A-431, colon cancer cell line HT-29 and CT-26 cell lines were used.
  • the cell lines were treated with FK-3000 and the extent of proliferation of the cells was measured.
  • a control group a group treated with a sinococuline compound and an extract of an extract known to have an anticancer effect were used, and cell proliferation was measured in the same manner as in Example ⁇ 2-1>. Is shown in Table 1 below.
  • the FK-3000 compound of the present invention was found to be significantly superior to the cell proliferation inhibitory activity of cancer cells compared to sinococuline and Qijun extract, the inhibition of cancer cell proliferation of FK-3000 is breast cancer In addition, it was found that the proliferation of cells of prostate cancer, epithelial cancer and colon cancer can be suppressed.
  • MDA cultured in the culture medium of Example ⁇ 2-1> to investigate whether the morphinan alkaloid compounds of the present invention can inhibit the growth and progression of cancer through the cell cycle control of cancer cells -MB-231 cells were dispensed into 6 well plates to 3.0 10 5 cell counts / well, treated with 0.5, 5 ug / FK-3000 for each cell, and then incubated for 24 and 48 hours. Each cell was then treated and fixed with 70% ethanol at a temperature of 4.
  • the fixed cells were centrifuged at 1200 rpm for 6 minutes, then the supernatant was removed and the pellet was removed with 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaCl 2 , 5 mL PI and 80 mL / mL Ribonuclease A (Sigma Chemical Co.). It was dissolved in a 0.01 M HEPES / NaOH, pH7.4 solution, and then reacted for 20 minutes in the dark at room temperature, the concentration of the DNA of the cells was measured using BD Model FACScan (Becton Dickinson Inc.).
  • Each FK-3000 compound was treated, and then cultured for a predetermined time period from 30 minutes to 48 hours, followed by Western blot in the same manner as described in Example ⁇ 2-3>, wherein the antibody was anti-p -p38 monoclonal antibody (Cell Signaling, Cat # 9215), anti-p-cdc25B antibody (ABGENT, AP3053a), anti-cyclinB antibody (SantaCruz, SC-245), anti-p-cdc-2 antibody (Cell Signaling, Cat # 9112), anti-COX-2 polyclonal antibody (Cayman, Cat # CAY-160106) and anti-actin monoclonal antibody (Sigma-Aldrich, Inc., Cat # A-5316) were used as primary antibodies , HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (Cayman, Cat # 10004301) was carried out in the same manner except for using as a secondary antibody.
  • the antibody was anti-p -p38 monoclonal antibody
  • the present inventors have found that the morphinan alkaloid compound of the present invention has an effect of arresting the G2 / M phase in the cell cycle process. It was found that cyclinB and cdc-2, which promote cell cycle progression, were inhibited by FK-3000. In addition, FK-3000 inhibited the phosphorylation of cdc25B while the phosphorylation of p38 MAPK was increased. It was confirmed that to induce.
  • the morphinan alkaloid compound in the present invention not only inhibits cell proliferation and induces cell death of cancer cells, but also has an effect of arresting the G2 / M stage in the cell cycle process.
  • Counting kit CCK-8 was used to measure proliferation of cells, ie cell viability, for 24 and 48 hours. At this time, the control was used as a vehicle (vechicle) treated with 0.1% DMSO alone.
  • the measurement of phosphorylation which is the activity standard of p38 MAPK and cdc25B by treatment of the compounds, was the same as the method described in the above ⁇ 3-2>, anti-p-p38 monoclonal antibody (Cell Signaling, Cat # 9215) and anti Western blot using -p-cdc25B antibody (ABGENT, AP3053a).
  • cell proliferation by measuring apoptosis as shown in Figure 8a, treated with only SB239063 inhibitor of p38 MAPK (when incubated for 48 hours), showed a cell survival rate similar to the control, while 0.5 ug / FK
  • the group treated with -3000 only showed cell survival rate of about 52%, indicating that cell proliferation was suppressed, and the group treated with SB239063 and FK-3000 showed about 72% cell survival rate.
  • the present inventors have not completely inhibited the induction of apoptosis by FK-3000 despite the treatment of SB239063 when SB239063 was treated with FK-3000. This is probably because the phosphorylated p38 MAPK treated SB239063. It was expected that a small amount of expression in the group, and this prediction was confirmed by the expression of a small amount of p-p38 MAPK in the group treated with SB239063 with FK-3000 as shown in Figure 8b. In addition, when only SB239063 was treated alone, the expressed p-p38 MAPK was hardly confirmed. Therefore, SB239063 inhibits the phosphorylation of p38 MAPK.
  • phosphorylation of p38 MAPK is known to play an important role in apoptosis, differentiation and cell cycle progression, and phosphorylated p38 MAPK is known to migrate from the cytoplasm to the nucleus and cause DNA damage. . Therefore, the present inventors observed the migration of p-p38 MAPK to the nucleus by SB239063 treatment. As shown in FIG. On the other hand, in the group treated with SB239063 and FK-3000, the amount of phosphorylated p38 MAPK accumulated in the nucleus was reduced compared to the group treated with FK-3000 alone.
  • SB239063 an inhibitor of p-p38 MAPK, inhibits the migration of p-p38 MAPK to the nucleus and inhibits apoptosis promotion by FK-3000.
  • the present inventors found that SB239063 does not completely inhibit the induction of apoptosis by FK-3000, indicating that another mechanism is involved in inducing apoptosis by FK-3000.
  • SB239063 an inhibitor of p-p38 MAPK, did not inhibit the inhibition of COX-2 expression by FK-3000. Furthermore, the induction of apoptosis by FK-3000 (inhibition of cell proliferation). Mechanism) inhibits G2 / M cell cycle progression and inhibits COX-2 expression through down-regulation of cyclin B and p-cdc2 by induction of p38 MAPK and dephosphorylation of cdc25B. It was found through the.
  • cancer cells were injected into mice to investigate the tumor growth inhibitory activity of the morphinan alkaloid compound in a mouse model in which tumors were formed.
  • 40 8-week-old male Crl: NU / NU-nu mice were purchased from OrientBio (Seongnam, Korea) and bred for 7 days at a temperature of 22 ⁇ 3 °C for 12 hours of light / dark. Purina diet (Purina Korea, Korea) was ingested freely with water.
  • Intra-injection group, FK-3000 1mg / kg daily intraperitoneally and paclitaxel (10mg / kg once intraperitoneally) and FK-3000 (1mg / kg daily intraperitoneal) As a group they were bred for 24 days.
  • the volume of the tumor is a ⁇ b 2/2 (wherein a is the width (width) of the largest tumors, b is represented by the length of the vertical to a).
  • the size of the tumor was shown to be reduced compared to the control group
  • the FK-3000 group was also shown to reduce the size of the tumor
  • tumor size was significantly reduced.
  • the group treated with a small amount of FK-3000 (1 mg / kg) showed a similar reduction in tumor size to the group treated with 10 mg / kg paclitaxel.
  • the volume of the tumor gradually increased over time in the control group, whereas in the group treated with paclitaxel or FK-3000, the volume of the tumor compared to the control group. was decreased, and the tumor volume was significantly reduced in the group treated with paclitaxel and FK-3000.
  • the above results showed that the morphinan alkaloid compound of the present invention has an excellent effect of inhibiting tumor growth, and the size of the tumor treated with 1 mg / kg of FK-3000 treated 10 mg / kg of Taxol. Almost similar to the size of one tumor, it was found that the morphinan alkaloid compound of the present invention had better anticancer activity than Taxol used as an anticancer agent. In addition, when the morphinan alkaloid compound is treated with Taxol, it was found that the tumor suppression effect is very excellent compared to the morphinan alkaloid compound or Taxol alone treatment.
  • mice were purchased from OrientBio, and mice were bred under the conditions described in Example 4. Thereafter, 5 male and 5 female mice were injected with 10 / FK-3000 once a day for 5 days. They were then weighed daily, and after 1 day after the last injection, the weight and appearance of the mice were observed. The mice were anesthetized with isopran and blood was obtained via intracardic. In addition, each tissue such as liver, kidney and spleen were obtained from the mice for histopathological examination. In particular, three spleen samples out of 10 mouse samples were used to obtain splenocytes. In this case, a mouse group administered with PBS solution instead of 10 / FK-3000 was used as a control group.
  • CBC leukocyte related component
  • Hemavet 950 Hemavet 950 (Drew Scientific Group, USA) of the blood samples prepared in ⁇ 5-1>, and obtained in ⁇ 5-1>.
  • the pathological form of each tissue was visually observed and the heart, lung, liver, kidney, spleen, bladder, testes and ovaries were fixed with 10% neutral formalin.
  • the fixed samples were Tissue-Tek VIP (Sakura, Japan). After embedding with paraffin using a cut to a thickness of 3. Then all the slices (slices) were stained with H & E reagents and then subjected to histopathology examination using an optical microscope, the results are shown in Table 2 and Table 3 below.
  • WBC White blood cell
  • NE Neutrophil
  • LY Lymphocyte
  • MO Monocyte
  • EO Eosinophil
  • BA Basophil
  • RBC Red blood cell
  • Hb Hemoglobin
  • HCT Hematocrit
  • MCV Mean Corpuscular Volume
  • MCH Mean Corpuscular Hemoglobin
  • MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration
  • RDW Red cell Distribution Width
  • PLT Platelet
  • MPV Mean Platelet Volume.
  • NS showed insignificant values at p ⁇ 0.05 by Tukey's multiple range test
  • GOT glutamic oxaloacetic transaminase
  • GPT glutamic pyruvic transaminase
  • BUN blood urea nitrogen
  • TBIL directbilirubin
  • ALB albumin
  • the treatment of the FK-3000 compound of the present invention tended to slightly upregulate the spleen-related components in vivo, but the improved numerical range also showed no significant difference from the normal value.
  • the serum biochemical indicators including GOT, GPT, BUN, TBIL, and ALB were compared with the control group to confirm stability in the liver and kidney. There was no significant difference.
  • the results show that the morphinan alkaloid compound of the present invention does not cause other side effects in vivo and has excellent stability.
  • the present inventors further examined the proliferation of lymphocytes and the expression of cell surface molecules to investigate whether the morphinan alkaloid compounds of the present invention have an immunomodulatory effect.
  • the degree of lymphocyte proliferation according to a method known by Ahemed et al. In mice administered FK-3000 by the method of Example ⁇ 5-1> to investigate the effect on the proliferation of lymphocytes by FK-3000. was analyzed.
  • the splenocytes obtained from the mouse were dispensed into 5 10 5 cells / well / 100 ul in 96-well plates using RPMI medium containing streptomycin and 10% fetal bovine serum, followed by LPS, ConA and PWM were added to the cells by 0, 2.5 and 5 /, respectively, then medium was added so that the total volume was 200 / well. It was then incubated for 24 and 48 hours at 5% CO 2 and 37 temperature conditions, respectively. Then, Alamar Blue (Alamar, Sacramento, CA) analysis was performed, and the values were measured using a Multi-Detection Microplate Reader (Bio-red TM , USA). At this time, the control group was subjected to the same process as the method of the mouse group not treated with FK-3000.
  • the results indicate that the morphinan alkaloid compound of the present invention has an effect of reducing the proliferation of B cells by LPS, and was not involved in the proliferation of T cells.
  • the expression patterns of immune-related factors expressed on the surface of splenocytes by morphinan alkaloid compounds were investigated by FACS analysis. To this end, after culturing splenocytes obtained in a mouse administered with FK-3000 by the method of Example ⁇ 5-1> to 1 ⁇ 10 8 , the cells were obtained in a tube, and then T-cell related.
  • Molecules such as FITC anti-mouse CD3, PE rat anti-mouse CD4, PerCP rat anti-mouse CD8a, PE rat anti-mouse CD11B (monocyte / macrophage related molecule) and PE labeled anti-mouse NK 1.1 (NK cell related molecule) PE anti-mouse CD19 antibody, a B cell-related molecule, was mixed and reacted at 4 for 2 hours, and the cells were washed with PBS solution of 1 and analyzed using BD Model FACscan (Becton Dickinson Inc., USA). The results are shown in Table 4 below. At this time, as a control, the antibody reaction was performed in the same manner as the above method on splenocytes obtained from mice not treated with FK-3000.
  • NS represents an insignificant value at p ⁇ 0.05 through Tukey's multiple range test.
  • the expression level of the T cell-related molecules CD3, CD4 and CD8a and the monocyte / macrophage-related molecule CD11B and the NK cell-related molecule NK 1.1 were almost similar to those of the control group, that is, the control group.
  • CD19 a B cell-related molecule, was significantly increased from 38.62% to 43.57% (p ⁇ 0.05) in the FK-3000-treated group compared to the control group.
  • the results indicate that the morphinan alkaloid compound inhibits the proliferation of B cells by LPS and activates CD19, a molecule related to B cells, and thus can regulate B cell mediated immune responses. And it was found. However, when treated with T cell stimulants ConA and PWN showed similar results to the control group, it can be seen that the morphinan alkaloid compounds of the present invention do not affect the immune function by T cells.

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Abstract

본 발명은 모르피난 알칼로이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 일문전(Stephania delavayi Diels)으로부터 분리된 하기 화학식의 구조를 가지는 모르피난 알칼로이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 분리 및 정제된 모르피난 알칼로이드계 화합물은 암 세포의 세포증식 억제, 세포사멸 유도, 세포주기 진행의 억류 및 종양의 성장을 억제하여 우수한 항암 활성을 가지며 면역조절을 통한 면역증진 효과가 있고 독성 및 부작용이 없기 때문에 암의 예방 또는 치료용 약제 및 면역증진을 위한 기능성 건강식품의 소재로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

모르피난 알칼로이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물
본 발명은 모르피난 알칼로이드계(morphinane alkaloids) 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 일문전(Stephania delavayi Diels)으로부터 분리된 모르피난 알칼로이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물, 암의 예방 또는 치료용 약제 및 면역 증진용 기능성 건강식품에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 1990년대 이후로 한국인의 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 암 환자로 진단되고 있고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다. 이러한 암의 유발 인자로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 스트레스 및 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다.
한편, 암을 치료하는 방법으로는 현재 외과적 치료, 방사선 치료 및 화학적 치료가 사용되고 있는데, 외과적 치료는 암의 초기상태의 제거에는 효과적이나, 경우에 따라서는 장기를 제거해야 하는 등의 부작용과 전이를 방지할 수 없다는 문제가 있으며, 방사선 치료의 경우도 특정부위의 암 치료에는 치료효과가 높은 장점이 있는 반면 방사선의 조사로 인해 새로운 발암위험성과 전이를 방지할 수 없다는 점과 함께 치료시 환자의 고통을 수반한다는 문제가 있다.
또한, 화학적 치료는 악성종양의 치료를 위해 사용되는 화학요법제인 항암제를 사용하는 방법으로서, 대부분의 항암제는 암 세포의 각종 대사경로, 특히 핵산의 합성을 억제하여 항암활성을 나타내는 약제들이다. 또한, 현재 암 치료에 사용되고 있는 항암제는 생화학적인 작용 기전에 따라 크게 알킬화제, 대사길항제, 항생물질, 유사분열억제제, 호르몬제 및 기타 제제의 6개의 범주로 분류되며, 이들 항암제는 암 세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직세포에도 손상을 입히기 때문에 골수기능저하, 위장장애, 탈모증 등의 여러 가지 부작용을 수반하는 문제점이 있어 왔다. 따라서 인체의 부작용이 없으면서도 항암효과를 높일 수 있는 항암제를 개발하는 것이 매우 중요하다.
따라서 최근에는 인체에 부작용을 유발하지 않으면서도 항암 효과가 우수한 항암제를 천연재료로부터 수득하기 위해 식물 등 천연재료에서 항암성분을 추출하거나 또는 가공하여 암치료제나 예방용 약제 또는 건강보조식품으로 개발하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다.
이러한 노력들로 인해 천연재료로부터 항암 활성을 가지는 물질들이 발굴되었는데, 이러한 예로 인삼의 사포닌 성분이 항암 활성이 있다고 밝혀졌으며, 동충하초 또는 상황버섯을 비롯한 버섯류 및 버섯류로부터 분리된 베타-글루칸 성분도 항암 활성이 있음이 밝혀졌고, 부추의 추출물도 항암 활성이 있음이 밝혀진 바 있다. 이 외에도 암 치료에 효과가 있다고 알려진 각종 천연재료로부터 유효성분을 추출하여 약학조성물 또는 가공식품 등의 형태로 사용하려는 연구가 계속되고 있다.
한편, 암 치료를 위한 항암제의 항암 활성 작용은 암의 발전 메카니즘으로부터 몇 가지로 나눌 수 있는데, 첫째는 암 세포에 대한 직접적인 작용, 즉 세포독성, 세포주기조절 및 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 기작에 의한 것이고, 두 번째는 암 세포의 혈관신생(angiogenesis)을 저지하는 기작에 의한 것이며, 세 번째는 암 세포의 침윤을 저지하는 기작에 의한 것이고, 네 번째는 면역력을 높여 암 세포의 전이를 저지하는 기작 등으로 크게 나눌 수 있다. 또한, 각 항암제는 이러한 각 단계에서 모두 활성을 나타낼 수도 있지만 특정 단계에서 주요한 활성을 보여 항암 작용을 하는 것이 일반적이다.
따라서 지금까지도 많은 천연재료로부터 암의 발전 메카니즘을 억제함을 통해 항암 활성을 가지는 약제들이 개발되고 있으나, 종래 발굴된 항암제의 경우 인체에 부작용을 유발시키고 항암 효과도 미비하다는 문제점이 있다.
그러므로 부작용 및 독성이 없고 우수한 항암 활성을 가지는 효과적인 암 치료를 위한 새로운 항암제의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 새로운 항암제를 개발하기 위한 연구를 진행하던 중, 천연물, 즉 일문전으로부터 분리 및 정제한 모르피난 알칼로이드계 화합물이 우수한 항암 활성을 가질 뿐만 아니라 독성 및 부작용이 없어 안정성이 우수하고 면역 조절을 통한 면역 증진효과를 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 항암 활성이 우수하고 면역 증강 효과가 우수한 모르피난 알칼로이드계 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항암 또는 면역 증강용 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항암 또는 면역 증강용 조성물을 포함하는 항암 또는 면역 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 모르피난 알칼로이드계(morphinane alkaloids) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물을 제공하며,
화학식 1
Figure PCTKR2010008096-appb-C000001
상기 식에서, R1 또는 R2는 독립적으로 수소; 1 내지 18의 알킬 그룹; 치환기를 가지는 탄소수 5 내지 7의 시클로 알킬 그룹; 1 내지 3개의 치환기를 가지는 페닐 그룹을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 저급알킬 그룹; 히드록시와 탄소수 1 내지 5개의 알콕시 및 아실옥시 그룹을 가지는 탄소수 1 내지 6의 저급알킬 그룹; 히드록시와 탄소수 1 내지 5개의 알콕시 및 아실옥시 그룹을 가지는 탄소수 1 내지 7의 저급아실 그룹; 1 내지 3의 치환기를 가지는 탄소수 5 내지 7의 시클로알킬카르보닐 그룹; 및 1 내지 3의 치환기를 가지는 페닐 그룹을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 아실 그룹으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 메틸 및 아세틸로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 6,7-디-오-아세틸시노코쿨린(6,7-di-O-acetylsinococuline:FK-3000)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모르피난 알칼로이드계 화합물은 일문전(Stephania delavayi Diels)으로부터 추출 및 분리될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출은 물 또는 유기용매를 이용한 용매추출 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분리는 세파덱스 LH-20 크로마토그래피 및 실리카겔 크로마토그래피, C18 HPLC 크로마토그래피를 병행하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모르피난 알칼로이드계 화합물은 암 세포의 세포증식 억제, 세포사멸 유도, 세포주기 억류 또는 세포성장을 억제하는 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모르피난 알칼로이드계 화합물은 NF-kB 또는 COX-2의 발현 억제를 통해 암 세포의 세포증식 억제 및 세포사멸을 유도할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포주기 억류는 세포주기 진행 과정에서 G2/M 단계를 억류(arrest)하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모르피난 알칼로이드계 화합물은 CD19를 활성화시켜 B 세포의 면역계의 활성을 증진시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 유방암, 후두암, 폐암, 상피암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 대장암, 간암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 담낭암, 구강암, 결장암, 간암 및 방광암으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 항암 또는 면역 증강용 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 항암 또는 면역 증강용 조성물을 포함하는 항암 또는 면역 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품을 제공한다.
본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물은 암 발생의 중요 인자로 작용하는 NF-kB 및 COX-2의 발현을 억제하여 암 세포의 세포증식을 억제하고 세포사멸을 유도하는 활성이 있고, 세포주기 진행에서 G2에서 M으로의 진행을 억류하며, 종양의 성장을 억제하는 효과가 있어 우수한 항암 활성을 가질 뿐만 아니라 면역조절 작용을 통한 면역증진 효과가 있으며 체내에서 독성 및 부작용이 없기 때문에 암의 예방 또는 치료용 약제 및 면역증진을 위한 기능성 건강식품의 소재로 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일문전으로부터 본 발명에 따른 FK-3000 화합물을 HPLC 크로마토그래프를 이용하여 분리한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 FK-3000 화합물을 농도별로 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주에 처리한 후, 처리 농도 및 시간에 따른 MDA-MB-231 세포의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 FK-3000 화합물을 농도별 및 시간별로 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주에 처리한 후, MDA-MB-231 세포의 세포 사멸을 유체 세포 측정을 통해 얻은 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 0.5ug/ml의 FK-3000 화합물과 FK-3000 화합물을 처리하지 않은 MDA-MB-231 세포주에서 NF-kB의 핵으로의 이동을 면역형광 분석을 통해 비교한 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 MDA-MB-231 세포주에 FK-3000 화합물을 처리한 후 시간별로 FK-3000 화합물에 의한 NF-kB의 활성 및 COX-2의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 6은 MDA-MB-231 세포주에서 FK-3000 화합물을 처리할 경우 세포주기 진행 과정에서의 억류 현상을 FK-3000의 처리 농도 및 처리 시간별로 세포 주기 분포 분석을 통해 확인한 것을 나타낸 그래프이다.
도 7은 FK-3000 화합물에 의한 p38 MAPK의 인산화 변화 및 M 단계로의 세포주기 진행을 촉진하는 사이클린 B 와 p-cdc2의 발현 정도를 FK-3000의 처리 농도 및 처리 시간별로 웨스턴 블럿을 수행하여 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 8a는 p38 MAPK의 억제제인 SB239063에 의해 FK-3000의 세포사멸 촉진이 억제되는지를 확인하기 위해, 5uM의 SB239063, 5uM의 SB239063와 0.5ug/ml의 FK-3000, 및 0.5ug/ml의 FK-3000을 MDA-MB-231 세포주에 각각 처리하고 24시간 및 48시간 배양 후 세포 생존율을 비교한 그래프이다.
도 8b는 5uM의 SB239063, 5uM의 SB239063와 0.5ug/ml의 FK-3000 및 0.5ug/ml의 FK-3000을 MDA-MB-231 세포주에 각각 처리하고 90분 동안 배양 후, p-p38 MAPK 및 p-cdc25B의 발현정도를 웨스턴 블럿을 수행하여 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 8c는 0.5ug/ml의 FK-3000 및 5uM의 SB239063와 0.5ug/ml의 FK-3000을 MDA-MB-231 세포주에 각각 처리하고 90분 동안 배양 후, SB239063에 의한 p38 MAPK의 핵으로의 이동 억제 현상을 현미경으로 통해 확인한 사진을 나타낸 것이다.
도 9a는 FK-3000에 의한 COX-2의 발현 억제에 SB239063이 영향을 미치는지 확인하기 위해 MDA-MB-231 세포주에 5uM의 SB239063, 0.5ug/ml의 FK-3000 및 5uM의 SB239063와 0.5ug/ml의 FK-3000을 각각 처리하고 COX-2의 항체를 이용한 면역화학법을 통해 각 세포에서 COX-2의 발현 정도를 확인한 사진을 나타낸 것이다.
도 9b는 FK-3000에 의한 COX-2의 발현 억제에 SB239063이 영향을 미치는지 확인하기 위해 COX-2의 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 FK-3000의 종양 성장 억제효과를 확인하기 위해 MDA-MB-231 세포주를 마우스에 주입시켜 종양을 형성하게 한 후, 10mg/kg의 탁솔, 1mg/kg의 FK-3000 및 10mg/kg의 탁솔과 1mg/kg의 FK-3000을 각 마우스의 복강내로 주사한 다음, 24일간 사육한 후 마우스의 종양 크기를 비교하여 나타낸 사진이다.
도 11은 MDA-MB-231 세포주를 마우스에 주입시켜 종양을 형성하게 한 후, 10mg/kg의 탁솔, 1mg/kg의 FK-3000 및 10mg/kg의 탁솔과 1mg/kg의 FK-3000을 각각 마우스의 복강내로 주사한 다음, 각 시간별로 종양의 부피를 측정하여 비교한 그래프이다.
도 12는 FK-3000이 B 세포 증식을 조절하는지를 확인하기 위해 10ug/ml의 FK-3000을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스로부터 수득한 비장 림프구에 대해 LPS를 각 농도별로 처리한 후 LPS에 의해 자극된 B 세포의 증식 억제 정도를 측정한 결과를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 FK-3000이 T 세포 증식에 영향을 미치는지 확인하기 위해 10ug/ml의 FK-3000을 투여한 마우스 및 투여하지 않은 마우스로부터 수득한 비장 림프구에 대해 ConA 및 PWM을 각 농도별로 처리한 후 T 세포의 증식 억제 정도를 측정한 결과를 비교하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 모르피난 알칼로이드계(morphinane alkaloids) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 상기 모르피난 알칼로이드계 화합물은 하기 화학식 1 을 가지는 화합물일 수 있으며,
<화학식 1>
Figure PCTKR2010008096-appb-I000001
상기 식에서, R1 또는 R2는 독립적으로 수소; 1 내지 18의 알킬 그룹; 치환기를 가지는 탄소수 5 내지 7의 시클로 알킬 그룹; 1 내지 3개의 치환기를 가지는 페닐 그룹을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 저급알킬 그룹; 히드록시와 탄소수 1 내지 5개의 알콕시 및 아실옥시 그룹을 가지는 탄소수 1 내지 6의 저급알킬 그룹; 히드록시와 탄소수 1 내지 5개의 알콕시 및 아실옥시 그룹을 가지는 탄소수 1 내지 7의 저급아실 그룹; 1 내지 3의 치환기를 가지는 탄소수 5 내지 7의 시클로알킬카르보닐 그룹; 및 1 내지 3의 치환기를 가지는 페닐 그룹을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 아실 그룹으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
바람직하게 상기 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 메틸 및 아세틸로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게 상기 본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물은 6,7-디-오-아세틸시노코쿨린(6,7-di-O-acetylsinococuline: FK-3000)일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 구조식을 가지는 모르피난 알칼로이드계 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 천연 식물로부터 분리 및 정제할 수 있다. 즉, 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 식물 또는 식물의 일부로부터 수득될 수 있다. 줄기, 뿌리 또는 잎은 목적하는 추출물을 획득하기 위하여 적절히 건조하여 침연(macerated)하거나 단지 건조시켜 적절한 유기용매로 추출하고, 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는 본 발명의 FK-3000 화합물은, 일문전(Stephania delavayi Diels)으로부터 분리 및 정제할 수 있다.
한편, 일문전(Stephania delavayi Diels)은 방기과(Menispermaceae)의 쌍자엽 식물로, 예로부터 중국에서 청열해독, 이습, 지통 및 급성 위장염 등의 치료제로 활용된 한약재로 알려져 있으며, 같은 속에 속하는 S. cepharantha Hayata는 일본 자생종으로 지질과산화를 유도하는 라디칼을 소거하여 DNA의 손상을 억제하는 작용이 있음이 알려진 바 있다. 그러나 아직까지 일문전이 가지는 약학적 효능의 유효물질이 되는 성분들에 대해서는 알려진 바 없다. 이에 본 발명에서는 일문전(Stephania delavayi Diels)으로부터 생리활성 성분을 분리 및 정제하였으며, 정제한 성분이 항암 및 면역 증진 효과가 매우 우수하다는 것을 확인하였다. 본 발명에서 상기 추출을 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.
또한, 상기 방법으로부터 수득한 추출물은 이후 당업계에 공지된 분리 및 정제 방법을 사용하여 상기 추출물로부터 활성 성분을 수득할 수 있는데, 본 발명의 FK-3000 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세파덱스 LH-20 크로마토그래피 및 C18 HPLC 크로마토그래피를 병행하여 수행할 수 있다. 그러나 활성성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.
한편, 모르피난 알칼로이드계에 속하는 6,7-디-오-아세틸시노코쿨린(6,7-di-O-acetylsinococuline: 이하 FK-3000이라고 함) 화합물은 HSV-1(herpes simplex virus type-1) 및 HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)에 대하여 항 바이러스 효과를 가짐으로써 이들 바이러스에 의한 감염을 억제할 수 있다는 내용이 밝혀진 바 있으나(Nawawi A et al., Phytother Res. 15, 6, 497-500, 2001; Ma CM. et al., Chem Pharm Bull, ,50,,6, 877-80, 2002; Ma CM. et al., Phytother Res., 16, 2, 186-189, 2002), 상기 FK-3000 화합물 및 모르피난 알칼로이드계 화합물이 항암 활성을 가지며 면역 조절 기능을 통한 면역 증진 활성이 있다는 내용에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다.
본 발명에서는 모르피난 알칼로이드계 화합물이 우수한 항암 활성 및 면역 증진 활성을 가지고 있다는 사실을 최초로 규명하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 일문전으로부터 분리 및 정제한 모르피난 알칼로이드계 화합물의 암 세포 증식 억제 및 세포사멸 촉진 활성을 확인하기 위하여, 모르피난 알칼로이드계 화합물인 FK-3000을 유방암 세포에 처리한 후, 생존하는 세포들의 수를 카운팅하고, 아폽토시스(apoptosis)의 표지 물질인 아넥신 V로 세포를 염색하여 아폽토시스에 의한 세포사멸을 측정한 결과, FK-3000을 처리한 유방암 세포들은 FK-3000을 처리하지 않은 대조군에 비해 세포증식이 억제되어 세포사멸이 증가하는 것으로 나타났으며, FK-3000에 의한 세포사멸은 농도 및 배양 시간에 비례하는 것으로 나타났다(도 2 및 도 3 참조).
따라서 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 암 세포의 증식을 억제하고 아폽토시스(apoptosis)를 유발하여 세포사멸을 촉진시킴으로써 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.
한편, NF-B(Nuclear Factor kappa B)는 p50 서브유니트 훼밀리(subunit family, p50, p52)와 p65 서브유니트 훼밀리(p65, c-Rel, RelB)의 5종류의 단백질의 동종-이량체(homodimer) 또는 이종-이량체(heterodimer)로 구성된 전사인자로서, 정상상태에서는 그 저해제인 IB 단백질(IBa, IB , IB, IBe, Bcl3)들과 결합한 불활성화된 상태로 세포질에 존재한다(Ghosh, S., et al. Annu Rev. Immunol. 16, 225~260, 1998). 그러나 TNF-a 및 IL-1과 같은 다양한 사이토카인, 박테리아, 바이러스 감염, 스트레스 또는 산화제 등 각종 자극들에 의해 IB 키나제 복합체가 활성화되면 IB 단백질은 인산화되어 유비퀴틴 메카니즘에 의해 분해되어지고, 인산화에 의해 IB에서 유리된 활성 NF-B는 세포질(cytoplasm)에서 핵(nucleus)으로 이동하여 목적 유전자의 NF-B 결합부위에 결합하여 면역 또는 염증반응 등에 관련된 단백질들을 코딩하는 다양한 유전자의 발현을 유도하게 된다(Barnes P.J. et al. N. Engl. J. Med. 336, 1066~1071, 1997).
또한, 전사인자인 NF-B에 의해 발현이 조절되는 단백질들은 발생 및 면역반응 등 정상적인 생리기능에도 중요한 역할을 하지만, 비정상적인 NF-B의 활성화는 관절염, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 전신 홍반성 루푸스, 건선, 궤양성 대장염, 전신성 염증반응증후군, 폐혈증, 다발성근염, 알츠하이머병(Alzheimer's disease) (Keith T. Akama et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5795~5800, 1998) 등의 염증질환 뿐만 아니라 피부암, 고형암, 혈액암 등의 다양한 암에서도 항시적인 NF-B의 활성화, IB 단백질의 변이 및 비정상적인 IKK 효소의 활성화 등이 밀접하게 관련되어 있는 것으로 알려져 있다(Mercurio, F., et al., Oncogene, 18, 6163~6171, 1999; Rayet, B. et al., Oncogene, 18, 6938~6947, 1999 ).
특히, 종양의 발생 및 진행과정은 NF-B에 의한 신호 전달 과정과 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있는데, 예컨대, NF-B의 활성화는 암 세포의 세포사멸을 억제하는 작용을 하며, 세포주기의 진행을 촉진시켜 세포의 증식을 활성화하는 것으로 밝혀졌으며(Monks NR et al., J. Cell Biochem, 92, 646~650, 2004), 인산화된 활성형의 NF-B는 COX-2(cyclooxygenase-2) 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로 밝혀진 바 있다. 또한, 최근 연구에 의하면 암 세포에서 NF-B 및 IB는 인산화되어 활성화된 형태로 존재하며, COX-2의 발현도 증가되어 있는 것으로 보고된 바 있다(Jand BC., J. BioL. Chem., 275, 39 507~39515, 2000; Monks NR et al., J. Cell Biochem, 92, 646~650, 2004).
따라서 비정상적인 NF-B의 활성화를 조절하는 것은 퇴행성 질환을 포함한 각종 염증질환의 발병이나 진행을 억제할 수 있고, 비정상적인 세포증식에 기인한 암 질환을 치료할 수 있기 때문에 NF-B의 활성화를 조절할 수 있는 상위 조절 인자들에 대한 연구가 계속되고 있다.
지금까지 알려진 NF-B의 상위 조절인자들로는 p38 MAPK, JNK(Jun-N-terminal kinase), GSK-3 (glycogen synthase kinase-3) 및 PKA(protein kinase A)들이 밝혀졌으며, 이 중에서 특히 p38 MAPK는 NF-B의 활성화를 억제하고 JNK에 의한 NF-B의 인산화를 감소시킨다는 사실이 밝혀진 바 있다(Ivanov VN, J. BioL. Chem., 274, 14079~14089, 1999; Park MK, Mol. Cell., 17, 45~50, 2004).
이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물이 NF-B 및 COX-2의 활성을 억제할 수 있는지를 조사하였는데, 즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 모르피난 알칼로이드계 화합물인 FK-3000 화합물을 유방암 세포주에 처리한 다음, 웨스턴 블럿을 통해 NF-B 및 COX-2의 발현을 확인한 결과, FK-3000 화합물을 처리한 경우, 처리하지 않은 대조군에 비해 NF-B 및 COX-2의 발현이 감소된 것으로 나타났으며, NF-B의 핵으로의 이동(translocation)도 차단되는 것으로 나타났다(도 4 및 도 5 참조).
그러므로 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 NF-B 및 COX-2를 하향조절(down regulation)하여 암 세포의 증식을 억제하고 세포사멸을 유도함으로써 항암 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물은 암 세포에서 세포주기의 진행을 억류(arrest)함으로써 암의 발생 및 진행을 억제할 수 있는 특징이 있다.
일반적으로 세포주기(cell cycle)는 염색체 DNA 및 세포구성 성분이 복제되어 균등하게 배분되고 2개의 딸세포로 분열하는 일련의 과정을 말한다. 이러한 세포주기 진행에는 많은 단백질들이 일련의 순서로 다양하게 상호작용하여 이루어지며, G1, S, G2, M기의 순서가 주기적으로 반복하면서 세포는 증식하게 된다. 포유세포에서의 이들 단계를 자세히 살펴보면 다음과 같다.
먼저, 체크포인트가 존재하는 G1기는 새로운 세포를 만들기 위한 준비단계로서, 이때 성장인자와 영양이 충분히 공급되지 못하면 세포주기는 멈추게 되고 성장 휴지기인 G0 상태로 접어들게 된다. 그러나 충분한 영양이 공급되고 다양한 성장 인자들이 준비되면 세포주기는 S단계로 진행되게 된다. 이때, 세포는 자신의 게놈 (genome)을 복제하여 2 카피 (copy)의 염색체를 만들 뿐만 아니라 2개의 세포로 분열되기 위해 세포질 내의 여러 인자들이 복제된다. S기가 끝나면 세포는 제2의 체크포인트로 알려진 G2 단계로 진입한다. G2 기간 동안의 주요 작용기작은 DNA 복제와 완성을 조절하며 분열기로의 진입을 준비한다. 따라서 세포의 구성에 필요한 다양한 인자들이 G2 단계에서 생산된다. 2개의 세포로 분열되는데 필요한 인자들이 충분히 만들어진 후에는 세포의 실질적 분열이 일어나는 분열기인 M기로 진행되며, M기는 시간적으로 가장 짧고 가장 드라마틱한 단계로 복제된 게놈이 세포의 양극으로 분리되어 2개의 딸세포가 만들어지는 단계이기 때문이다. 이러한 일련의 과정은 한 세포가 성장하여 2개의 세포로 분열되기 위해서 모든 세포가 거치는 과정이므로 세포의 생명유지에 매우 중요한 과정이다. 그러므로 세포주기의 연구와 이들을 조절하는 물질은 세포성장 기작의 연구 및 세포주기 이상에서 발생하는 암의 예방 및 치료제 개발에 필수적이라 할 수 있다.
또한, 세포주기의 각 주기 및 다음 단계로의 진행에는 특정 조절인자들이 관여하는데, 특히 사이클린(cyclin)과 사이클린 의존성 인산화효소(CDK: cyclindependent kinase)의 복합체가 조절제로서 작용하며, G1기에는 사이클린 D/CDK4, 사이클린 D/CDK6 및 사이클린 E/CDK2가 순차적으로 작용하고, S기에는 사이클린 A/CDK2, G2 및 M기에는 사이클린 A/CDK1과 사이클린 B/CDK1가 관여하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물이 암 세포의 세포주기 진행을 억류하는 활성이 있는지를 조사하기 위해, 유방암 세포주에 FK-3000을 처리한 후, G2에서 M단계로의 진행을 촉진하는 인자로 알려진 사이클린 B 및 cdc2의 발현을 확인한 결과, 발현이 모두 감소되는 것으로 나타났고, 특히 인산화된 cdc2의 발현은 현저히 감소되는 것으로 나타났으며, G2에서 M단계로의 세포주기 진행을 촉진함과 동시에 세포의 증식 및 전이 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 cdc25B도 인산화된 cdc25B의 발현이 감소되는 것으로 나타났다(도 7 참조).
반면, NF-B의 활성화를 억제하는 것으로 알려진 p38 MAPK의 경우, 유방암 세포주에 FK-3000 화합물을 처리한 결과, 세포 내에서 인산화된 p38 MAPK, 즉 활성화된 p38 MAPK의 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 7 참조).
또한, 본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물에 의한 p38 MAPK의 활성화 기작에 있어서, p38 MAPK의 억제제를 처리할 경우, p38 MAPK의 활성화가 억제되는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 유방암 세포주를 대상으로 FK-3000만을 처리한 군, p38 MAPK의 억제제인 SB23906만을 처리한 군 및 FK-3000 화합물과 SB23906을 함께 처리한 군에서 세포의 생존율 및 p-p38 MAPK의 발현과 핵으로의 이동을 측정하였다.
그 결과, FK-3000만을 처리하고 48시간 배양한 세포의 생존율은 약 52%로 나타난 반면, FK-3000 화합물과 SB23906을 함께 처리한 군은 약 72%의 생존율을 보였고, SB23906만을 처리한 군은 거의 모든 세포들이 다 생존하는 것으로 나타났다(도 8a 참조).
따라서 본 발명자들은 SB23906의 처리에도 불구하고 FK-3000에 의한 세포사멸이 완벽히 저해되지 못한 결과는 아마도 SB23906이 처리된 세포에서 인산화된 활성형의 p38 MAPK이 미량 존재하기 때문이라고 예측하였으며, 이러한 예측은 웨스턴 블럿 수행을 통해 확인할 수 있었다(도 8b 참조).
한편, p38 MAPK의 인산화는 세포사멸, 분화 및 세포주기 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 인산화된 p38 MAPK은 세포질에서 핵으로 이동하여 DNA의 손상 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 p38 MAPK의 억제제인 SB23906을 유방암 세포주에 처리한 결과, FK-3000에 의한 활성형 p-p38 MAPK의 핵으로의 이동이 억제되는 것으로 나타났으며, FK-3000만을 처리한 경우에는 p-p38 MAPK가 핵으로 이동되어 축적되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 8c 참조).
그러므로 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 p38 MAPK를 활성화시켜 세포사멸을 유도한다는 것을 알 수 있었으며, 특히 SB23906의 처리에도 불구하고 FK-3000에 의한 세포사멸이 완벽히 저해되지 않았다는 결과를 통해 FK-3000에 의한 세포사멸 기작은 p38 MAPK를 통한 NF-kB의 억제기작 이외에도 다른 기작이 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다.
한편, 염증반응에 관여하는 효소로 알려진 COX-2(cyclooxygenase-2: 시클로옥시게나제-2)는 종양발생 과정의 각 단계가 진행할수록 발현양이 증가하는 것으로 보고되어 있다(Kitayama W., et al., Carcinogenesis, 20:2305-2310, 1999; Takahashi M., et al., Cancer Res., 57:1233-1237, 1997). 이러한 COX는 프로스타그란딘(prostaglandin)의 생합성에 관련되는 주효소로서 생체 내에 두 종류의 이성효소가 존재한다. COX-1은 정상상태에서 발현하여 위장관 보호나 신장기능 조절 등에 관여하며, COX-2는 염증이나 기타 면역 반응시 세포분열인자(mitogen)나 사이토카인(cytokines)들에 의해 세포내에서 일시적이고 빠르게 발현된다. 따라서 COX-1또는 COX-2를 억제하는 물질은 염증의 치료뿐만 아니라 암 생성 억제의 측면에서도 중요한 역할을 할 수 있다.
따라서 본 발명자들은 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물에 의한 항암 활성 기작이 COX-2의 발현 억제를 통해 이루어지는지를 조사하기 위해, 본 발명의 일실시예에서 유방암 세포주를 대상으로 FK-3000만을 처리한 군, SB23906만을 처리한 군 및 FK-3000와 SB23906을 함께 처리한 군에서 COX-2의 발현을 측정하였다.
그 결과, FK-3000만을 처리한 경우에는 COX-2의 발현이 감소되는 것으로 나타났으며, FK-3000와 SB23906을 함께 처리한 경우에서도 COX-2의 발현이 감소되는 것으로 나타난 반면, SB23906만을 처리한 경우에는 COX-2의 발현이 아무처리도 하지 않은 대조군과 거의 유사한 것으로 나타났다(도 9a 및 9b 참조).
이러한 결과는 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물이 p38 MAPK의 활성화를 통한 NF-kB의 발현 억제 및 COX-2의 발현 억제를 통해 암 세포의 세포사멸을 유도한다는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물은 종양의 성장을 억제하는 활성이 있는 특징이 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 유방암 세포주를 마우스에 피하 주입시켜 종양이 형성되게 한 다음, 종양이 형성된 마우스를 대상으로 FK-3000을 복강내 주사한 결과, FK-3000 화합물을 처리하지 않은 마우스에 비해 종양의 크기가 현저하게 감소되는 것으로 나타났으며, 이러한 종양 성장 억제 효과는 기존에 항암제로 알려진 탁솔의 효과와 거의 유사 또는 더 우수한 효과를 보였으며, 특히 탁솔과 함께 FK-3000 화합물을 처리한 군의 경우에는 종양 성장 억제 효과가 매우 우수한 것으로 나타났다(도 10 및 도 11 참조).
그러므로 본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물은 종양의 크기를 감소시켜 종양의 성장을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라 기존의 항암제와 병용 투여할 경우에는 기존의 항암제 또는 모르피난 알칼로이드계 화합물을 단독 투여할 때 보다 항암 효과가 현저하게 향상됨을 알 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물을 항암 치료에 사용할 경우, 단독으로 사용할 수도 있거나 또는 기존의 항암제와 병용하여 사용할 수도 있다.
한편, 종래 사용되고 있는 대부분의 항암제들은 인체에 부작용을 초래하거나 또는 독성이 강하여 암 세포 이외에도 정상세포에 이상을 초래하는 문제점들이 있었다. 이에 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 정제된 모르피난 알칼로이드계 화합물이 임상용의 항암제로서 안정한지를 확인하기 위해 마우스 동물 모델을 대상으로 안정성 테스트를 수행하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 암수의 마우스들을 대상으로 10mg의 FK-3000 화합물을 하루에 한번씩 5일간 투여한 후, 상기 마우스들의 각 조직 및 혈액을 수집한 다음, 각 조직들의 병리학적인 상태 및 혈액 내의 백혈구 관련 성분들의 양을 조사하였다. 그 결과, FK-3000 화합물을 투여한 마우스의 각 조직 및 혈액내 혈청 생화학적 지표들의 수치는 FK-3000 화합물을 투여하지 않은 정상군과 유의한 차이를 보이지 않았다(실시예 5 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물은 생체 내에서 부작용 및 독성을 유발하지 않으며 안정성이 우수하다는 것을 알 수 있었다.
나아가 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 면역 조절 활성을 갖는 특징이 있으며, 특히 CD19를 활성화시켜 B 세포의 면역계의 활성을 증진시키는 특징이 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 모르피난 알칼로이드계 화합물인 FK-3000에 의해 림프구의 증식 및 세포 표면 분자들의 발현이 변화되는지를 확인하기 위해 FK-3000을 투여한 마우스로부터 비장세포(splenocyte)를 분리한 후, B 세포 자극인자인 LPS 및 T 세포 자극인자인 ConA와 PWM을 각각 처리한 다음, 림프구의 증식을 조사하였다.
그 결과, FK-3000이 투여된 마우스에 B 세포 자극인자인 LPS를 처리한 경우, 대조군인 FK-3000이 투여되지 않은 마우스에 비해 림프구의 증식이 감소된 것으로 나타났으며, 반면, T 세포 자극인자인 ConA와 PWM을 각각 처리한 군은 대조군과 유사한 림프구의 증식 양상을 나타내었다(도 12 및 13 참조).
또한, 세포 표면 분자들의 발현을 조사한 결과, FK-3000을 투여한 군의 경우 대조군에 비해 B 세포 관련 인자인 CD19의 분자의 발현이 증가된 것으로 나타난 반면, T 세포 관련 인자들의 발현은 대조군과 유의한 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다(표 4 참조).
일반적으로 LPS(lipopolysaccharide), 염증유발인자 및 방사선조사 등의 유해한 자극은 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 TNF-a(tumor necrosis factor-a), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 및 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발 물질을 과도하게 유도하여 관절염, 패혈증 등의 염증질환과 조직이식거부반응, 자가면역질환, 당뇨병 등의 면역질환 및 신경세포의 사멸을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 나아가 각종 암의 발생에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 LPS에 의한 B 세포의 과도한 면역 반응은 억제함과 동시에 B 세포 관련 인자인 CD19의 발현을 증진시켜 B 림프구를 활성화시킴으로써 면역 반응을 조절 및 증진시킬 수 있으며, 반면, T 세포 증식에는 관여하는 않는다는 것을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 모르피난 알칼로이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 본 발명의 조성물은 암 또는 면역 이상으로 유발되는 질환의 증상을 예방 및 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 모르피난 알칼로이드계 화합물을 이용하여 예방 또는 치료할 수 있는 상기 암의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 유방암, 후두암, 폐암, 상피암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 대장암, 간암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 담낭암, 구강암, 결장암, 간암 및 방광암일 수 있다.
본 발명에 따른 항암 또는 면역 증강용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 모르피난 알칼로이드계 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암 또는 면역 이상 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 항암 또는 면역 증강용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 항암 또는 면역 증강용 조성물은 암의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 모르피난 알칼로이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 모르피난 알칼로이드계 화합물은 생체 내에서 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 천연식물인 일문전으로부터 분리 및 정제한 것이므로 이를 포함하는 본 발명의 조성물은 체내에 대해 매우 안정한 특징이 있다.
따라서 본 발명의 항암 또는 면역 증강용 조성물은 암의 예방 또는 개선 및 면역 증진 효과를 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물을 항암 또는 면역 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물로 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명의 항암 또는 면역 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물은 암 증상의 예방 및 개선에 효과가 있고, 면역 증진 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 항암 또는 면역 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 갱년기 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 항암 또는 면역 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 항암 또는 면역 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.01g 내지 20g, 바람직하게는 0.3g 내지 10g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
모르피난 알칼로이드계 화합물의 분리 및 정제
일문전(Stephania delavayi Diels)으로부터 모르피난 알칼로이드계 화합물을 수득하기 위해 상기 일문전에 메탄올을 첨가한 후, 용매추출 방법을 통해 메탄올 분획을 수득하였다. 이후, 수득한 메탄올 분획(1g)을 세타덱스 LH-20(40 id × 860 mm, 25-100 m) 컬럼에 로딩한 후, 용출용매로 메탄올을 사용하여 분리된 분획들을 얻었으며, 분획들 중에서 3번째 분획(700mg)을 다시 C18 HPLC(YMC-Pack Pro, S-5m, 20i.d.×250mm) 컬럼에 로딩하고, 용출용매로 10-30%의 수성 MeCN(0.05% TFA)을 사용하여 7 mL/min의 속력으로 90분간 용출시켰고, 82.14분의 머무름 시간(retention time)에서 용출된 모르피난 알칼로이드계 화합물을 획득하였다. 이후, 용출된 상기 화합물을 당업계에 공지된 1H, 13C 및 2D NMR 스텍트럼 분석을 통해 모르피난 알칼로이드계 화합물인지를 분석하였다.
분석 결과, NMR 스텍트럼 분석을 통해 본 발명에 따라 분리 및 정제된 화합물이 하기 화학식 1로 표시되는 모르피난 알칼로이드계 화합물임을 확인하였으며, 이후 수행되는 실험들은 본 발명의 방법으로 정제된 모르피난 알칼로이드계 화합물 중에서 하기 화학식 2로 표시되는 6,7-디-오-아세틸시노코쿨린(6,7-di-O-acetylsinococuline; 이하 FK-3000이라고 함)을 사용하여 수행하였다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2010008096-appb-I000002
상기 화학식에서, R1 또는 R2는 독립적으로 수소; 1 내지 18의 알킬 그룹; 치환기를 가지는 탄소수 5 내지 7의 시클로 알킬 그룹; 1 내지 3개의 치환기를 가지는 페닐 그룹을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 저급알킬 그룹; 히드록시와 탄소수 1 내지 5개의 알콕시 및 아실옥시 그룹을 가지는 탄소수 1 내지 6의 저급알킬 그룹; 히드록시와 탄소수 1 내지 5 의 알콕시 및 아실옥시 그룹을 가지는 탄소수 1 내지 7의 저급아실 그룹; 1 내지 3 의 치환기를 가지는 탄소수 5 내지 7 의 시클로알킬카르보닐 그룹; 및 1 내지 3의 치환기를 가지는 페닐 그룹을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 아실 그룹이다.
화학식 2
Figure PCTKR2010008096-appb-C000002
<실시예 2>
모르피난 알칼로이드계 화합물의 세포사멸 활성 분석
<2-1> FK-3000에 의한 유방암 세포의 세포증식 억제 활성 측정
실시예 1의 방법으로 분리 및 정제된 모르피난 알칼로이드계 화합물이 항암 활성을 가지고 있는지를 확인하기 위해 한국세포주 은행으로부터 수득한 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포를 대상으로 본 발명에서 정제한 모르피난 알칼로이드계 화합물 중에서 FK-3000을 이용하여 암세호의 세포증식 억제 활성을 조사하였다. 상기 조사는 10% 소태아 혈청, 2mg/ml의 소듐 카보네이트, 100 U/mL 페니실린 및 100 /mL의 스트렙토마이신이 함유된 RPMI-1640(Gibco/BRL, Grand Island, NY) 배지에서 배양한 MDA-MB-231 세포를 96 웰 플레이트에 1.5×104 세포수/웰이 되도록 분주한 후, 각 세포에 대하여 0 에서부터 4/의 농도까지 각 농도별로 FK-3000을 처리한 후, 24 및 48시간 동안 각각 배양한 다음, CCK-8(Dojindo Laboratories, Japan) 세포 카운팅 키트를 사용하여 세포의 증식정도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 FK-3000은 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포를 사멸시키는 활성, 즉 세포증식 억제활성이 있는 것을 확인할 수 있었으며, FK-3000의 처리 농도 및 배양 시간이 증가할수록 세포사멸도 증가하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 암 세포의 세포사멸을 유도하고 세포증식을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었으며, 농도 의존적으로 세포사멸 효과가 증가한다는 것을 알 수 있었다.
<2-2> FK-3000의 세포사멸 활성 측정
모르피난 알칼로이드계 화합물의 세포증식 억제 메카니즘을 분석하기 위해 FK-3000 화합물의 암세포에 대한 아폽토시스를 유체 세포측정 방법(flow cytometric assay)을 통해 조사하였다. 먼저 상기 실시예 1과 같은 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에 0, 0.5 및 5.0ug/ml 농도의 FK-3000를 각각 처리하고 24시간 및 48시간 동안 배양한 다음, 트립신 처리에 의해 세포들을 각각 수득하였다. 이후 차가운 PBS 용액으로 세포들을 세척한 다음, 0.14 M NaCl 및 2.5 mM CaCl2을 함유한 0.01 M Hepes/NaOH, pH7.4 용액으로 세포를 용해시킨 다음, 5 아넥신(Annexin) V-FITC 및 5 propidium iodide(PI)를 첨가하고 천천히 혼합한 후, 상온의 어두운 상태에서 15분간 반응시켰다. 이후 0.01 M Hepes/NaOH, pH7.4 용액을 더 첨가한 다음, Annexin V로 염색된 세포들을 BD Model FACScan(Becton Dickinson Inc., New Jersey, USA)으로 분석하여 각 세포들의 아폽토시스 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 유방암 세포에 처리한 FK-3000의 농도가 높을수록 아폽토시스가 유발된 세포들의 수는 증가한 것으로 나타났고, 특히 0.5 및 5ug/ml의 FK-3000를 세포에 처리하고 24시간 배양하였을 경우, 아폽토시스는 각각 8.01% 및 12.97%까지 증가하는 것으로 나타났으며, 이때 화합물을 처리하지 않은 대조군의 경우에는 아폽토시스가 7.0%인 것으로 나타났다. 또한, FK-3000를 5.0ug/ml으로 처리하고 48시간 배양하였을 경우에는 아폽토시스가 37.69%로 증가되는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물이 암 세포에서 아폽토시스를 유발하여 세포사멸을 촉진시킴으로써 항암활성이 있음을 알 수 있었고, FK-3000의 세포사멸을 통한 항암활성은 농도 의존적으로 비례한다는 사실을 알 수 있었다.
<2-3> FK-3000의 NF-kB 및 COX-2에 미치는 영향 분석
상기 <2-2>의 실험을 통해 모르피난 알칼로이드계 화합물이 암 세포의 세포사멸을 유도함으로써 항암활성을 가진다는 사실을 확인함에 따라 암 발생 기작에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NF-kB 및 COX-2의 활성에 대해서도 모르피난 알칼로이드계 화합물이 영향을 미치는지를 조사하였다. 상기 조사를 위해, FK-3000의 처리에 의한 NF-kB의 인산화 및 COX-2의 발현 측정과 함께 면역형광분석을 통한 NF-kB의 핵내로의 이동을 측정하였다. 먼저 NF-kB의 핵으로의 이동 측정을 위해 상기 실시예에서 배양한 MDA-MB-231 세포에 5ug/ml의 FK-3000을 처리하고 48시간 배양한 후, 상기 세포들을 4%의 포름알데히드로 고정시키고 PBS로 세척한 후, 5% Triton X-100을 처리하였다. 이후 세포들을 블록킹 용액으로 블록킹 시키고 일차 항체인 anti-NF-B 토끼 항체(Cell Signaling, Cat #4764)를 1:500의 비율로 희석하여 4에서 밤새도록 반응시킨 후 세포들을 세척하고 다시 1시간 동안 anti-토끼 IgG FITC(Cayman, Cat #CAY-10006588)와 반응시킨 다음, DAPI로 염색하고 IX51 Research Microscope (Olympus, Japan)를 이용하여 이미지화된 사진을 수득하였다.
또한, NF-kB의 인산화 및 COX-2의 발현 정도 측정은 상기 배양된 MDA-MB-231 세포들로부터 PRO-PREP(인트론 바이오테크놀러지, 한국)을 이용하여 총 단백질을 추출하였고 핵 추출 키트(Panomics, California, USA)를 사용하여 세포질 및 핵내의 단백질을 각각 분리하였다. 이후, 각 단백질의 양을 BioRad Dc 단백질 어세이 키트(BioRad, California, USA)를 사용하여 정량화 하였으며 동일한 양의 단백질을 10%의 SDS-PAGE에 전기영동 한 후, p-NFB 단일클론 항체(Cell Signaling, Cat #3036), COX-2 다클론 항체(Cayman, Cat #CAY-160106), β-액틴 단일클론 항체(Sigma-Aldrich, Inc., Cat #A-5316) 및 PARP 단일클론 항체(BIOMOL International, Cat #SA-250)의 일차 항체로 반응시킨 다음, 다시 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG(Cayman, Cat #10004301)와 anti-mouse IgG (Cell Signaling, Cat #7076)의 이차 항체를 각각 반응시켜 당업계에 공지된 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 암 세포의 생존 인자로 작용하는 NF-kB의 경우, 일반적으로 인산화에 의해 활성화가 되면 핵으로 이동하게 되는데, 본 발명에 따른 FK-3000을 유방암 세포에 처리하였을 경우, 처리하지 않은 대조군에 비해 NF-kB의 핵으로의 이동이 억제되는 것으로 나타났다(도 4 참조). 또한, 웨스턴 블럿으로 NF-kB 및 COX-2의 발현을 측정한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, FK-3000을 처리한 경우 처리하지 않은 대조군에 비해 인산화된 NF-kB의 발현은 감소된 것으로 나타났고, 이와 함께 COX-2의 발현도 감소되는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 FK-3000의 처리 후 배양 시간이 증가할수록 비례하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물이 암 세포의 생존 인자로 작용하는 NF-kB의 인산화를 억제함으로서 NF-kB의 활성을 억제함과 동시에 핵으로의 이동도 차단하는 작용을 한다는 것을 알 수 있었고, 또한 FK-3000에 의한 NF-kB의 인산화 억제는 COX-2의 발현도 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명자들은 모르피난 알칼로이드계 화합물이 NF-kB 및 COX-2의 활성을 억제, 즉, 하향조절(dowm regulation)함으로써 암 세포의 증식을 억제하고 세포사멸을 유도함으로써 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.
<2-3> 암 세포주들에서 FK-3000의 세포증식 억제 효과 측정
본 발명자들은 모르피난 알칼로이드계 화합물이 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포 뿐만 아니라 다른 암 종류의 세포주들에 대해서도 세포증식을 억제하는 효과가 있는지를 분석하였다. 이를 위해 암 세포주들로서, 유방암 세포주인 MDA-MB-231 및 MCF-7, 전립선암 세포주인 PC-3, 상피암 세포주인 A-431, 대장암 세포주인 HT-29 및 CT-26 세포주를 사용하였으며, 상기 세포주들에 대해 FK-3000을 처리한 후 세포들의 증식 정도를 측정하였다. 이때 대조군으로는 항암 효과가 있다고 알려진 시노코쿨린(sinococuline) 화합물 및 일문전 추출물을 각각 처리한 군을 사용하였고, 세포 증식 측정은 상기 실시예 <2-1>의 방법과 동일하게 수행하였으며, 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
표 1 다양한 암 세포주들에 대한 FK-3000, sinococuline 및 일문전 추출물의 세포증식 억제 효과 결과(단위 :/mL)
Cell-line FK-3000 sinococuline S. delavayi Diels.
MDA-MB-231 0.52 4.49 2.31
MCF-7 0.77 14.45 2.05
PC-3 0.22 6.81 1.20
A-431 2.70 6.83 5.32
HT-29 0.40 15.88 4.57
CT-26 1.90 11.21 3.37
Average 1.198 9.945 3.137
그 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 FK-3000 화합물은 sinococuline 및 일문전 추출물에 비해 암 세포의 세포 증식 억제 활성이 월등히 우수한 것으로 나타났으며, FK-3000의 암 세포 증식 억제는 유방암 뿐만 아니라 전립선암, 상피암 및 대장암의 세포 증식도 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
모르피난 알칼로이드계 화합물의 세포주기 억제 활성 분석
<3-1> FK-3000의 G2/M으로의 세포주기 억류 활성 측정
나아가 본 발명자들은 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물이 암 세포의 세포주기 조절을 통해 암의 성장 및 진행을 억제할 수 있는지를 조사하기 위해 상기 실시예 <2-1>의 배양 배지로 배양된 MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트에 3.0 105 세포수/웰이 되도록 분주한 후, 각 세포에 대하여 0.5, 5ug/의 FK-3000을 처리한 다음, 24 및 48시간 동안 배양하였다. 이후, 4의 온도에서 70%의 에탄올을 이용하여 각 세포들을 처리 및 고정시켰다. 24시간 후 고정된 세포들을 1200rpm의 속력으로 6분 동안 원심분리한 다음, 상층액은 제거하고 펠렛을 0.14M NaCl, 2.5mM CaCl2, 5mL PI 및 80mL/mL Ribonuclease A(Sigma Chemical Co.)을 함유한 0.01 M HEPES/NaOH, pH7.4 용액으로 용해시킨 다음, 상온의 어두운 상태에서 20분 동안 반응시켰고, 세포들의 DNA의 농도를 BD Model FACScan(Becton Dickinson Inc.)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, FK-3000을 처리하지 않은 대조군에 비해 FK-3000을 처리한 경우, G2에서 M 단계로의 세포주기 진행이 억류(arrest)되어 G2/M 단계(도 6에서 M4에 해당함)의 DNA의 농도가 증가된 것을 확인할 수 있었으며, G2/M 세포주기의 억류 효과는 0.5ug/ FK-3000를 처리한 것에 비해 5ug/을 처리하였을 때 더 증가하는 것으로 나타났다.
<3-2> FK-3000에 의한 p38 MAPK 및 cdc2의 활성 변화 측정
상기 <3-1>의 결과를 통해 모르피난 알칼로이드계 화합물이 세포주기 과정에서 G2/M 단계를 억류(arrest)한다는 사실을 확인함에 따라 세포주기 과정 중 G2/M 단계의 조절인자로 알려진 cdc25 및 p38 MAPK의 활성이 모르피난 알칼로이드계 화합물에 의해 조절되어지는지를 조사하였다. 이를 위해 상기 실시예 <2-1>의 조건으로 배양한 MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트에 3.0 105 세포수/웰이 되도록 분주한 후, 각 배양된 세포에 대하여 0.5 및 5ug/의 FK-3000 화합물을 각각 처리한 다음, 30분에서 48시간까지 정해진 시간 동안 배양한 다음, 상기 실시예 <2-3>에 기재된 방법과 동일하게 웨스턴 블럿을 수행하였는데, 이때 항체로는 anti-p-p38 단일클론 항체(Cell Signaling, Cat #9215), anti-p-cdc25B 항체(ABGENT, AP3053a), anti-cyclinB 항체(SantaCruz, SC-245), anti-p-cdc-2 항체(Cell Signaling, Cat #9112), anti-COX-2 다클론 항체(Cayman, Cat #CAY-160106) 및 anti- -actin 단일클론 항체(Sigma-Aldrich, Inc., Cat #A-5316)를 일차 항체로 사용하였고, HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG(Cayman, Cat #10004301)를 이차 항체로 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 유방암 세포주에 FK-3000 화합물을 처리한 경우, 화합물을 처리하지 않은 대조군에 비해 인산화된 p38 MAPK의 발현은 증가하는 것으로 나타났으며, FK-3000의 처리농도 및 처리 후 배양 시간에 비례하여 인산화된 p38 MAPK의 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 반면, 세포 증식 및 전이(metastasis) 단계에서 중요한 역할을 하는 cdc25B의 경우, FK-3000의 처리에 의해 발현 정도가 감소되는 것으로 나타났으며, 특히 M 단계로 세포주기 진행을 촉진하는 인자로 알려진 cyclinB 및 cdc-2 의 경우에서도 FK-3000 화합물을 처리하였을 경우, 대조군에 비해 발현이 억제되는 나타났고, 발현억제는 FK-3000의 처리 농도 및 배양 시간과 비례하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물이 세포주기 과정에서 G2/M 단계를 억류(arrest)하는 효과가 있음을 알 수 있었으며, 이러한 세포주기 억류는 G2에서 M 단계로의 세포주기 진행을 촉진하는 인자인 cyclinB 및 cdc-2이 FK-3000에 의해 억제됨을 통해 일어난다는 것을 알 수 있었고, 또한, FK-3000은 cdc25B의 인산화를 억제하는 반면 p38 MAPK의 인산화는 증가시키는 결과를 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
그러므로 본 발명에 모르피난 알칼로이드계 화합물은 암 세포의 세포증식을 억제하고 세포사멸을 유도할 뿐만 아니라 세포주기 과정에서 G2/M 단계를 억류(arrest)하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
<3-3> FK-3000의 억제제 처리에 의한 암 세포의 세포사멸 및 p38 MAPK의 핵으로의 이동 분석
본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물이 p38 MAPK의 인산화를 증가시켜 p38 MAPK의 활성화를 통해 세포주기를 억류한다는 사실을 확인함에 따라 p38 MAPK의 억제제인 SB239063를 처리하였을 경우, 상기와 같은 모르피난 알칼로이드계 화합물의 작용에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 이를 위해 상기 실시예 <2-1>의 조건으로 배양한 MDA-MB-231 세포를 96웰 플레이트에 1.5×104 세포수/웰이 되도록 분주한 후, 각 세포에 대하여 0.5ug/의 FK-3000 화합물만을 처리한 군, 5.0uM의 SB239063(시그마 알드리치사, Cat. no. #S0569)만을 처리한 군 및 0.5ug/의 FK-3000 화합물과 5.0uM의 SB239063을 함께 처리한 군을 대상으로 세포 카운팅 키트 CCK-8을 이용하여 24시간 및 48시간 동안의 세포의 증식, 즉 세포 생존율을 측정하였다. 이때 대조군으로는 베히클(vechicle)로서 0.1% DMSO를 단독 처리한 것을 사용하였다. 또한, 상기 화합물들의 처리에 의한 p38 MAPK 및 cdc25B의 활성기준인 인산화의 측정은 상기 <3-2>에 기재된 방법과 동일하게 anti-p-p38 단일클론 항체(Cell Signaling, Cat #9215) 및 anti-p-cdc25B 항체(ABGENT, AP3053a)를 이용한 웨스턴 블럿으로 수행하였다.
또한, p38 MAPK이 활성화된 p38 MAPK의 인산화 형태인 p-p38 MAPK의 핵으로의 이동을 측정하기 위해, 상기 기술된 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에 0.5ug/의 FK-3000 화합물만을 처리한 군 및 0.5ug/의 FK-3000 화합물과 5.0uM의 SB239063을 함께 처리한 군을 Lab-Tek II 챔버 슬라이드 시스템(Nalge Nunc International)에서 90분 동안 배양하였다. 이후 배양한 세포들을 원심분리한 후, 차가운 PBS로 3번 세척한 다음, 4%의 파라포름알데히드(시그마 알드리치, SO57504)를 이용하여 상온에서 세포들을 고정시키고, 0.5% Triton X-100을 처리한 다음 Animal-Free BlockerTM(Vector, SP-5030)으로 1시간 동안 블록킹 한 후 4 C에서 anti-p-p38 단일클론 항체를 사용하여 밤새도록 반응시켰다. 이후 goat anti-rabbit IgG FITC(Cayman, Cat #CAY-10006588) 항체로 1시간 동안 추가 반응시키고, 7/mL BisBenzimide H33342 트리하이드로클로라이드(trihydrochloride)(Sigma-Aldrich, Inc., B2261)로 핵을 염색한 후 LSM510 META Fluorescent Microscope(Carl-Zeiss, 독일)를 사용하여 이미지를 수득하였다.
그 결과, 세포사멸 측정을 통한 세포증식은 도 8a에 나타낸 바와 같이, p38 MAPK의 억제제인 SB239063 만을 처리한 경우(48시간 배양 시), 대조군과 거의 비슷한 세포 생존율을 보인 반면, 0.5ug/의 FK-3000만을 처리한 군은 약 52%의 세포 생존율을 보여 세포증식이 억제된 것으로 나타났고, SB239063 및 FK-3000을 함께 처리한 군의 경우는 약 72%의 세포 생존율을 보였다.
따라서 본 발명자들은 SB239063를 FK-3000와 함께 처리하였을 경우, SB239063의 처리에도 불구하고 FK-3000에 의한 세포사멸 유도를 완벽히 저해하지 못한 결과를 통해 이러한 이유는 아마도 인산화된 p38 MAPK이 SB239063를 처리한 군에서도 소량으로 발현되기 때문이라고 예상하였으며, 이러한 예상은 도 8b에 나타낸 바와 같이 SB239063을 FK-3000와 함께 처리한 군의 경우, p-p38 MAPK이 소량으로 발현되는 것을 통해 확인할 수 있었다. 또한, SB239063만을 단독 처리한 경우에서는 발현된 p-p38 MAPK이 거의 확인되지 않았으므로 SB239063은 p38 MAPK의 인산화를 억제함을 알 수 있었다.
또한, p38 MAPK의 인산화는 세포사멸, 분화 및 세포주기 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 인산화된 p38 MAPK은 세포질(cytoplasm)에서 핵(nucleus)으로 이동하여 DNA의 손상을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 SB239063 처리에 의한 p-p38 MAPK의 핵으로의 이동을 관찰한 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이, 0.5ug/의 FK-3000만을 처리한 군의 경우에는 인산화된 p38 MAPK이 핵에 축적되어 있는 것을 확인할 수 있는 반면, SB239063 및 FK-3000을 함께 처리한 군의 경우에는 FK-3000만을 처리한 군에 비해 핵에 축적된 인산화된 p38 MAPK의 양이 감소된 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 p-p38 MAPK의 억제제인 SB239063은 p-p38 MAPK의 핵으로의 이동을 억제하여 FK-3000에 의한 세포사멸 촉진을 저해한다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 본 발명자들은 SB239063이 FK-3000에 의한 세포사멸 유도를 완벽히 저해하지 못한다는 상기 결과를 통해 FK-3000에 의한 세포사멸 유도는 또 다른 메카니즘이 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다.
<3-4> FK-3000에 의한 COX-2 발현 억제에서 SB239063에 의한 영향 분석
SB239063이 FK-3000에 의한 세포사멸 유도를 완벽히 저해하지 못한다는 사실을 통해 본 발명자들은 SB239063이 FK-3000에 의한 COX-2의 발현에도 영향을 주는지를 조사하였다. 상기 조사는 실시예 <2-1>의 조건으로 배양된 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포에 0.5ug/의 FK-3000 화합물을 처리한 군 및 0.5ug/의 FK-3000 화합물과 5.0uM의 SB239063을 함께 처리한 군을 Lab-Tek II 챔버 슬라이드 시스템(Nalge Nunc International)에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양한 세포들을 원심분리하고 차가운 PBS로 세척한 다음, 4%의 파라포름알데히드(시그마 알드리치, SO57504)를 이용하여 상온에서 세포들을 고정시키고, 다시 PBS로 세척한 후 anti-COX-2 항체(Biocare; CRM 306C)를 이용하여 밤새 반응시켰다. 이후 세포들을 EnVision+TM(DAKO; Cat #K4001)으로 반응시킨 다음 Liquid DAB Substrate Chromogen System(DAKO)을 이용하여 현상화 한 후, BX51 Research Microscope (Olympus, Japan)로 세포들을 관찰하였다.
그 결과, 도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같이, SB239063을 단독으로 처리한 군의 경우, COX-2의 발현은 대조군과 거의 유사하게 나타난 반면, FK-3000을 단독으로 처리한 군의 경우에는 COX-2의 발현이 현저하게 억제된 것으로 나타났고, SB239063및 FK-3000을 함께 처리한 군에서도 COX-2의 발현이 억제되는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 p-p38 MAPK의 억제제인 SB239063은 FK-3000에 의한 COX-2의 발현 억제는 저해하지 못한다는 사실을 알 수 있었으며, 나아가 FK-3000에 의한 세포사멸 유도기작(세포증식 억제기작)은 p38 MAPK의 인산화 및 cdc25B의 탈인산화의 유도에 의해 사이클린 B 및 p-cdc2가 하향조절(down-regulation)됨을 통해 G2/M의 세포주기 진행이 억류됨과 동시에 COX-2의 발현이 억제됨을 통해 이루어짐을 알 수 있었다.
<실시예 4>
모르피난 알칼로이드계 화합물의 종양 성장 억제 활성 분석
본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물의 항암 활성을 직접적으로 확인하기 위하여 암 세포를 마우스에 주입시켜 종양이 형성된 마우스 모델을 대상으로 모르피난 알칼로이드계 화합물의 종양 성장 억제 활성을 조사하였다. 조사를 위해 OrientBio(성남, 한국)으로부터 40마리의 8주령의 수컷 Crl: NU/NU-nu 마우스를 구입하여 22±3℃의 온도에서 12시간의 빛/어둠을 주기로 하여 7일간 사육하였으며, 이때 Purina 식이(Purina Korea, Korea)를 물과 함께 자유롭게 섭취시켰다. 이후 상기 마우스들에 5×106의 MDA-MB-231 세포를 피하 주입시켜 종양의 크기가 100-150 mm3정도가 되었을 때, 마우스를 4개의 군으로 그룹핑 하였다. 1군(n=7)은 대조군으로서 DMSO만을 주입하였고, 2, 3 및 4군(각, n=8)은 각각 파클리탁셀, 즉 탁솔(paclitaxel; 시그마 알드리치사) 10mg/kg을 일주일에 한 번씩 복강내 주사한 군, FK-3000 1mg/kg을 매일 복강내 주사한 군 및 파클리탁셀(10mg/kg을 일주일에 한번씩 복강내 주사)과 FK-3000(1mg/kg을 매일 복강내 주사)을 함께 처리한 군으로서 이들을 24일 동안 사육하였다. 이후 상기 각 마우스 군에서 형성된 종양의 크기를 칼리퍼(caliper)를 사용하여 3일 마다 측정하였고, 종양의 부피는 a×b2/2(여기서 상기 a는 가장 큰 종양의 너비(width)이며, b는 상기 a에 대한 수직의 길이 나타낸 것임)의 식으로 계산하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 항암제로 알려진 파클리탁셀을 처리한 군의 경우, 대조군에 비해 종양의 크기가 감소된 것으로 나타났고, FK-3000을 처리한 군도 종양의 크기가 감소된 것으로 나타났으며, 파클리탁셀 및 FK-3000을 함께 처리한 군의 경우에서는 종양의 크기가 현저하게 감소된 것으로 나타났다. 특히 소량의 FK-3000(1mg/kg)을 처리한 군은 10mg/kg의 파클리탁셀을 처리한 군과 종양의 크기가 거의 유사하게 감소된 것으로 나타났다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 종양의 부피를 측정한 결과, 대조군의 경우 시간이 경과할수록 종양의 부피가 점차 증가한 반면, 파클리탁셀 또는 FK-3000을 처리한 군의 경우는 대조군에 비해 종양의 부피가 감소하는 것으로 나타났으며, 파클리탁셀 및 FK-3000을 함께 처리한 군의 경우에는 종양의 부피가 현저하게 감소하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 종양의 성장을 억제하는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었으며, 1mg/kg의 FK-3000을 처리한 종양의 크기가 10mg/kg의 탁솔을 처리한 종양의 크기와 거의 유사한 결과를 통해 기존의 항암제로 사용되는 탁솔에 비해 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물이 더 우수한 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 모르피난 알칼로이드계 화합물을 탁솔과 함께 처리할 경우, 모르피난 알칼로이드계 화합물 또는 탁솔의 단독처리에 비해 종양 억제 효과가 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5>
모르피난 알칼로이드계 화합물의 안정성 테스트
<5-1> 시료의 준비
본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물의 안정성을 조사하기 위해 OrientBio 사로부터 암컷 및 수컷 10마리를 구입한 후 상기 실시예 4에 기재된 조건에서 마우스들을 사육하였다. 이후 5마의 수컷 및 5마리의 암컷 마우스를 대상으로 10/ FK-3000을 하루에 한번씩 5일간 주입시켰다. 그런 뒤 매일 이들의 몸무게를 측정하였으며, 마지막 주입 후, 1일이 경과한 후에는 마우스의 몸무게 및 외형을 관찰하였고, 이소프란으로 마우스들을 마취시킨 다음 intracardic를 통해 혈액을 수득하였다. 또한, 조직병리학 검사를 위해 상기 마우스들로부터 간, 신장 및 비장(spleen) 등 각 조직을 수득하였으며, 특히 10마리의 마우스 시료들 중 3개의 비장시료는 비장세포(splenocytes)를 수득하는데 사용하였다. 이때 대조군으로는 10/ FK-3000 대신 PBS 용액을 투여한 마우스 군을 사용하였다.
<5-2> 안정성 테스트
상기 <5-1>에서 준비한 혈액 시료들을 대상으로 CBC(leukocyte related component), 즉, 백혈구 관련 성분들의 양을 Hemavet 950(Drew Scientific Group, USA)을 이용하여 측정하였고, <5-1>에서 수득한 각 조직들의 병리학적 형태를 육안으로 관찰하였으며, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 방광, 정소 및 난소를 10% 중성 포르말린으로 고정시켰다, 고정된 시료들은 Tissue-Tek VIP(Sakura, Japan)을 이용하여 파라핀으로 포매(embed)한 후, 3의 두께로 잘랐다. 이후 모든 슬라이스(slice)들은 H&E 시약을 이용하여 염색한 후 광학현미경을 이용하여 조직 병리학 검사를 수행하였고, 결과를 하기 표 2 및 표 3에 기재하였다.
표 2 5일 동안 FK-3000을 매일 주입한 마우스의 혈액학적 분석 결과
대조군 10mg/kg의 FK-3000 투여군
Leukocytes WBC (k/㎕) 8.44±4.33NS) 11.19±5.13
NE (k/㎕) 2.22±1.34NS) 3.13±1.41
LY (k/㎕) 5.29±2.53NS) 6.73±3.23
MO (k/㎕) 0.47±0.31NS) 0.62±0.25
EO (k/㎕) 0.34±0.25NS) 0.55±0.36
BA (k/㎕) 0.11±0.05NS) 0.16±0.11
Erythrocytes RBC (M/㎕) 7.62±0.54NS) 7.75±0.67
Hb (M/dL) 12.52±0.55NS) 12.18±0.59
HCT (%) 43.8±3.62NS) 44.64±4.67
MCV (fL) 57.56±3.68NS) 57.61±3.51
MCH (pg) 4.07±0.86NS) 4.55±1.14
MCHC (g/dL) 7.11±1.51NS) 7.89±1.78
RDW (%) 15.78±0.65NS) 16.05±0.34
Thrombocyte PLT (k/㎕) 532.4±209.9NS) 378.4±180.1
MPV (fL) 4.66±0.18NS) 4.8±0.17
상기에서 각 수치 값은 평균±S.D이고, N=10임.
WBC: White blood cell, NE: Neutrophil, LY: Lymphocyte, MO: Monocyte, EO: Eosinophil, BA: Basophil, RBC: Red blood cell, Hb: Hemoglobin, HCT: Hematocrit, MCV: Mean Corpuscular Volume, MCH: Mean Corpuscular Hemoglobin, MCHC: Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, RDW: Red cell Distribution Width, PLT: Platelet, MPV: Mean Platelet Volume를 나타낸 것임.
표 3 5일 동안 FK-3000을 주입한 마우스의 혈액학적 효소 변화량
Control 10 mg/kg
GOT(U/I) 79.29±25.93NS) 69.13±32.47
GPT(U/I) 34.14±15.49NS) 27.5±13.1
BUN(mg/dl) 18.29±4.21NS) 15.65±2.6
NH3(㎕/dl) 97.29±30.94NS) 82.25±13.32
TBIL(mg/dl) 0.27±0.05NS) 0.25±0.08
ALB(g/dl) 2.26±0.13NS) 2.41±0.17
상기에서 각 수치 값은 평균 ±S.D이고, N=10임.
NS는 Tukey's multiple 범위 테스트를 통해 p<0.05에서 유의하지 않는 수치를 나타낸 것이고, GOT: glutamic oxaloacetic transaminase, GPT: glutamic pyruvic transaminase, BUN: blood urea nitrogen, TBIL: directbilirubin 및 ALB: albumin을 나타낸 것임.
분석 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 FK-3000 화합물의 처리는 생체 내에서 비장 관련 성분들을 약간 상향 조절하는 경향이 있었으나 향상된 수치 범위 또한 정상치와 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한, 간 및 신장에서의 안정성 확인을 위해 GOT, GPT, BUN, TBIL 및 ALB을 포함하는 혈청 생화학적 지표를 대조군과 비교한 결과, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이 각 성분의 수치가 대조군의 수치와 유의한 차이를 보이지 않았다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 생체 내에서 다른 부작용을 일으키지 않으며 안정성이 우수하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 6>
모르피난 알칼로이드계 화합물의 면역 조절 효과
<6-1> FK-3000의 림프구 증식에 미치는 영향
나아가 본 발명자들은 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물이 면역 조절 효과를 갖는지 조사하기 위해 림프구의 증식 및 세포 표면 분자들의 발현을 조사하였다. 먼저, FK-3000에 의한 림프구의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 상기 실시예 <5-1>의 방법으로 FK-3000을 투여한 마우스를 대상으로 Ahemed 등에 의해 공지된 방법에 따라 림프구의 증식정도를 분석하였다. 즉, 상기 마우스로부터 수득한 비장세포(splenocyte)를 스트렙토마이신 및 10% 소태아 혈청이 함유된 RPMI 배지를 이용하여 96웰 플레이트에 5 105 세포수/웰/100ul이 되도록 분주한 후, LPS, ConA 및 PWM을 각각 0, 2.5 및 5/씩 상기 세포에 첨가한 다음, 총 부피가 200 /well이 되도록 배지를 첨가하였다. 이후 5%의 CO2 및 37의 온도 조건에서 24 시간 및 48 시간 동안 각각 배앙하였다. 이후 Alamar Blue(Alamar, Sacramento, CA)분석을 수행하였으며, Multi-Detection Microplate-Reader(Bio-redTM, USA)를 이용하여 수치를 측정하였다. 이때 대조군으로는 FK-3000을 처리하지 않은 마우스 군을 대상으로 상기 방법과 동일한 과정을 수행하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, FK-3000이 처리된 마우스의 경우, 비장세포에서 LPS에 의한 B 세포의 증식이 대조군에 비해 감소되는 것으로 나타난 반면, 도 13에 나타낸 바와 같이, T 세포 자극제인 콘카나발린 A(ConA) 및 T와 B 세포의 자극을 돕는 포크 위드 마이토젠(PWN)의 처리를 통한 T 세포의 증식 작용에서는 FK-3000이 존재여부에 상관없이 대조군과 유사한 증식율을 보이는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 LPS에 의한 B 세포의 증식을 감소시키는 작용이 있음을 알 수 있었으며, T 세포의 증식에는 관여하지 않는다는 것을 알 수 있었다.
<6-2> FK-3000에 의한 세포 표면 분자의 발현 양상 분석
모르피난 알칼로이드계 화합물에 의한 비장세포 표면에서 발현되는 면역 관련 인자들의 발현양상을 FACS 분석 방법을 통해 조사하였다. 이를 위해 상기 실시예 <5-1>의 방법으로 FK-3000을 투여한 마우스를 대상으로 수득한 비장세포를 1×108 이 되도록 배양한 후, 상기 세포들을 튜브에 수득한 다음, T 세포 관련 분자들인 FITC anti-mouse CD3, PE rat anti-mouse CD4, PerCP rat anti-mouse CD8a, PE rat anti-mouse CD11B(단핵구/마크로파지 관련 분자) 및 PE labeled anti-mouse NK 1.1(NK 세포 관련 분자)와 B 세포 관련 분자인 PE anti-mouse CD19 항체를 혼합하여 2 시간 동안 4에서 반응시킨 후, 1 의 PBS 용액으로 세포들을 세척한 다음 BD Model FACscan(Becton Dickinson Inc., USA)을 이용하여 분석하였고, 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 이때 대조군으로는 FK-3000을 처리하지 않은 마우스로부터 수득한 비장세포를 대상으로 상기 방법과 동일하게 항체 반응을 수행하였다.
표 4 FK-3000에 의한 비장세포의 세포 표면 분자의 발현 양상 분석 결과
Control 10mg/kg
CD3(T Cells) 73.27±4.6NS) 69.99±6.58
CD4(Class II MHC-restricted T cell) 31.14±4.54NS) 32.23±5.46
CD8(Class I MHC-restricted T cell) 10.95±3.27NS) 9.54±2.59
CD19(B Cells) 38.62±2.99 43.57±3.16*
CD11b(Monocytes/Macrophage) 10.8±3.54NS) 8.72±1.72
NK 1.1 (NK cells) 8.76±2.22NS) 8.68±1.74
여기서 상기 수치는 평균값 ±S.D이고 N=5이며, NS는 Tukey's multiple 범위 테스트를 통해 p<0.05에서 유의하지 않는 값을 나타낸 것임.
그 결과, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, T 세포 관련 분자들인 CD3, CD4 및 CD8a와 단핵구/마크로 파지 관련 분자인 CD11B 및 NK 세포 관련 분자인 NK 1.1의 발현 정도는 대조군과 거의 유사한 값, 즉 대조군에 비해 유의한 차이를 보이지 않은 반면, B 세포 관련 분자인 CD19의 경우는 대조군에 비해 FK-3000을 처리한 군에서 발현 정도가 38.62%에서 43.57%(p<0.05)로 유의하게 증가한 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 모르피난 알칼로이드계 화합물은 LPS에 의한 B 세포의 증식은 억제하는 한편, B 세포와 관련된 분자인 CD19를 활성화시킨다는 것을 알 수 있었으며, 이를 통해 B 세포 매개의 면역 반응을 조절할 수 있음을 알 수 있었다. 그러나 T 세포 자극제인 ConA 및 PWN을 처리한 경우에서는 대조군과 유사한 결과를 나타냄으로써 본 발명의 모르피난 알칼로이드계 화합물은 T 세포에 의한 면역 기능에는 아무런 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 연구는 농촌진흥청 바이오그린21사업(과제번호: 20070301-034-044-007-01)의 지원에 의해 이루어진 것임.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 모르피난 알칼로이드계(morphinane alkaloids) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
    Figure PCTKR2010008096-appb-I000003
    상기 식에서, R1 또는 R2는 독립적으로 수소; 1 내지 18의 알킬 그룹; 치환기를 가지는 탄소수 5 내지 7의 시클로 알킬 그룹; 1 내지 3개의 치환기를 가지는 페닐 그룹을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 저급알킬 그룹; 히드록시와 탄소수 1 내지 5개의 알콕시 및 아실옥시 그룹을 가지는 탄소수 1 내지 6의 저급알킬 그룹; 히드록시와 탄소수 1 내지 5개의 알콕시 및 아실옥시 그룹을 가지는 탄소수 1 내지 7의 저급아실 그룹; 1 내지 3의 치환기를 가지는 탄소수 5 내지 7의 시클로알킬카르보닐 그룹; 및 1 내지 3의 치환기를 가지는 페닐 그룹을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 아실 그룹으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1 또는 R2는 독립적으로 수소, 메틸 및 아세틸로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 6,7-디-오-아세틸시노코쿨린(6,7-di-O-acetylsinococuline:FK-3000)인 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
    Figure PCTKR2010008096-appb-I000004
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 일문전(Stephania delavayi Diels)으로부터 추출 및 분리된 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 추출은 물 또는 유기용매를 이용한 용매추출인 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 분리는 세파덱스 LH-20 크로마토그래피 및 C18 HPLC 크로마토그래피를 병행하여 수행하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 암 세포의 세포증식 억제, 세포사멸 유도, 세포주기 억류(arrest) 또는 세포성장을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 화합물은 NF-kB 또는 COX-2의 발현 억제를 통해 암 세포의 세포증식 억제 및 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 세포주기 억류는 세포주기 진행 과정에서 G2/M 단계를 억류하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 CD19를 활성화시켜 B 세포의 면역계의 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 후두암, 폐암, 상피암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 대장암, 간암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 담낭암, 구강암, 결장암, 간암 및 방광암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역 증강용 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 항암 또는 면역 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품.
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