WO2015072734A1 - 사철쑥 유래 스코파론 함유 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

사철쑥 유래 스코파론 함유 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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extract
scoparone
osteoporosis
bone
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라정찬
배형석
김영호
장해동
주영철
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    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating osteoporosis comprising an extract containing scoparone containing artemisia capillaris as an active ingredient, and more particularly, to a scoparone or the scoparone-containing extract of scoparone as an active ingredient. It relates to a composition for preventing or treating osteoporosis and health functional food comprising a.
  • Bone tissue is a dynamic tissue in which absorption and formation are constantly taking place to maintain bone mass and skeletal homeostasis, and these two types of bone remodeling are involved in cells with two special functions. do. Osteoclasts absorb bone, while osteoblasts play a role in synthesizing and filling bone matrix, so bone mass depends on the relative function of these cells. There is always a balance between bone resorption and bone formation in normal adults. Bone remodeling occurs at regular intervals and occurs locally in narrow areas to maintain the structure of the skeletal system, which is regulated by the complex interactions between systemic hormones and local factors (Canalis, E. et al., J. Clin. Invest ., 81: 277, 1988; Raisz, LG, CIBA Foundation Symposium , 136: 226, 1988).
  • osteoblasts and osteoclasts Through the action of osteoblasts and osteoclasts, the process of aggregate formation proceeds through repeated formation and absorption throughout life.
  • These aggregate formation processes include various growth factors secreted by hormones such as parathyroid hormone (PTH), calci-tonin, estrogen and insulin-like growth factor I (IGF-I), and tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ).
  • Cytokines such as) regulate the activity balance between osteoblasts and osteoclasts and maintain homeostasis.
  • metabolic disease occurs when osteoblast activity decreases with changes in genetic, physiological and environmental factors, resulting in decreased bone formation, increased bone resorption due to enhanced osteoclast activity, or when both factors act simultaneously. This will occur.
  • Osteoporosis which is one of the major problems in the elderly society, is caused by the balance of bone resorption and bone formation. It is caused by excessive bone resorption than bone formation. Osteoporosis is caused by the reduction of bone tissue. Dense thinning of the bone marrow cavity, thereby widening, as the symptoms progress as the bone weakens, so it is easy to fracture even a small impact. Bone tissue is a dynamic tissue that is formed by osteoblasts and constantly breaks down and absorbed by osteoclasts.
  • Osteoporosis is not a symptom itself but rather various fractures that are easily caused by bone weakness, especially femoral fractures or vertebral fractures, which limit the long-term activity and lead to a healthy life. It is known to do. Bone mass is influenced by several factors, including genetic factors, nutrition, hormone changes, differences in exercise and lifestyle, and the causes of osteoporosis include old age, lack of exercise, low weight, smoking, low calcium diet, menopause, Ovarian ablation and the like are known. On the other hand, although there are individual differences, blacks have lower bone resorption levels than whites, resulting in higher bone mass, usually the highest at 14-18 years of age, and decreasing by about 1% per year in old age. In particular, postmenopausal women are known to have the highest incidence due to lack of estrogen (Jilka RL., Bone , 23:75, 1998).
  • Estrogen administered for the treatment of postmenopausal osteoporosis in addition to the function of sex hormones in vivo, binds to the estrogen receptor ⁇ (ER ⁇ ) or ⁇ (ER ⁇ ) of osteoblasts and then moves to the nucleus to participate in bone metabolism.
  • ER ⁇ estrogen receptor ⁇
  • ER ⁇ ⁇
  • ER ⁇ ⁇
  • IGF-I a growth factor
  • RANKL RANK ligand
  • phytoestrogen derived from plants showing weak estrogen activity is very useful for preventing postmenopausal osteoporosis (Aldercreutz H, Mazur W., Proc Nutr Soc., 55: 399, 1996).
  • isoflavones contained in soybeans genistein and diadzein are estrogen-like active substances, osteoblast-like or osteoblast and oxidative stress and free radical of soybean ethanol extract.
  • calcium supplements such as calcium salt, right bone meal, and vitamin D metabolite therapy are used to treat non-menopausal osteoporosis (Orcel P, Krane SM. Secondary osteoporosis and glucocorticoid include osteoporosis. Ann Med Interne. 151: 497, 2000), they are problematic in terms of solubility, absorbency, and taste. Research on the use of growth factors as treatments and prophylaxis is also underway (Karen MP, Carol CP, Lawrence GR. Treatment of osteoporosis.Annu Rev Med. 6: 249-256 (1995)), but they are common in terms of cost and side effects. There is a disadvantage to be difficult.
  • Saechuljae is a perennial herb belonging to the chrysanthemum family which grows in the sandy ground of the streams and rivers of Korea. It does not die in winter, but the shoots come out again from the stem the following year and are called Sacheol mugwort or Aetang mugwort, and it is called Injin, Injinho or Chuho in the herbal medicine name.
  • scoparone (scoparone; 6,7-dimethoxycoumarin), a coumarin derivative present in cedars, has a structure in which benzene and pyrone-ring are combined, immunosuppression, vascular relaxation, lipid lowering, It has been reported that there are various effects such as blood pressure lowering action, dipharymia effect, anti-inflammatory action (Korean Patent No. 1116217; Korean Patent No. 1093930). Although the prior art has been reported to be effective in the prevention and treatment of osteoporosis of the cedar mugwort extract, in particular, osteoporosis under oxidative stress (Korean Patent Publication No. 2013-0091160), the prevention or treatment of osteoporosis of cephalococci-derived scoparon There was no disclosure of.
  • the present inventors have made efforts to develop a natural extract-derived material that has no side effects and is effective in preventing or treating osteoporosis.
  • scoparone increases osteoblast activity and inhibits osteoclast activity and bone resorption activity.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of osteoporosis or the composition comprising scoparone (scoparone) represented by the following formula (1) or the scoparon-containing cephalococci as an active ingredient.
  • scoparone represented by the following formula (1) or the scoparon-containing cephalococci as an active ingredient.
  • the present invention also provides a scoparone (scoparone) represented by the formula (1) or provides a health functional food for osteoporosis prevention or improvement comprising the scoparon-containing cephalococci extract as an active ingredient.
  • a scoparone represented by the formula (1) or provides a health functional food for osteoporosis prevention or improvement comprising the scoparon-containing cephalococci extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to prevent or treat osteoporosis, characterized in that the administration of the extract containing the scoparon derived from cephalococci excellent in the effects of increasing osteoblast activity, inhibition of osteoclast activity and inhibition of bone resorption activity and compositions comprising the same To provide a method.
  • the present invention provides a method for preventing or treating osteoporosis, characterized in that for administering a composition comprising a scoparone (scoparone) represented by the formula (1) or the scoparon-containing cephalococci as an active ingredient .
  • a composition comprising a scoparone (scoparone) represented by the formula (1) or the scoparon-containing cephalococci as an active ingredient .
  • Still another object of the present invention is to use the extract containing the scoparon derived from cephalococci excellent in the effects of increasing osteoblast activity, inhibiting osteoclast activity, and inhibiting bone resorption activity, and a composition containing the same, for use in preventing or treating osteoporosis.
  • the present invention is to provide a use for the prevention or treatment of osteoporosis using a composition comprising scoparone (scoparone) represented by the formula (1) or the scoparon-containing cephalococci as an active ingredient.
  • scoparone represented by the formula (1) or the scoparon-containing cephalococci as an active ingredient.
  • 1 is a schematic diagram of separation and purification of cedars.
  • Figure 2 is a diagram showing the chemical formula for the 14 substances isolated from cedars.
  • Figure 3 is a data showing the osteoblast proliferation effect of 14 compounds derived from cedars.
  • Figure 4 is a data showing the effect of 14 species derived from cedars mugwort on osteoblast ALP (alkaline phophatase) activity.
  • Figure 5 is a data showing the effect of 14 kinds of cedar mugwort derived from osteoblast collagen (collagen) synthesis.
  • Figure 6 is a data showing the effect of 14 compounds derived from cedars in the osteoblastic bone nodule (mineralization).
  • Figure 7 is a data showing the effect of the four different compounds derived from cephalococci through the differentiation activity of osteoclasts through the staining (top) and activity measurement (bottom) of the osteoclasts TRAP expression.
  • Figure 9 is a data showing the effect of scoparon on ALP activity of osteoblasts.
  • Figure 11 is a data showing the effect of scoparon on osteoblast bone nominal (mineralization) formation (mineralization).
  • Figure 12 is a data showing the degree of toxicity for osteoclasts of scoparon extract.
  • Figure 13 is a data showing the osteoclast TRAP staining and osteoclast counting (counting) value for the osteoclast TRAP activity inhibitory effect of scoparon.
  • FIG 16 is data showing the scoparon effect on ROS (A), O 2 (B), H 2 O 2 (C) and GSH (D) levels during osteoclast differentiation.
  • Figure 17 is a data showing the effect of scoparon on MMP (Mitochondrial membrane potential) during osteoclast differentiation.
  • FIG. 21 is data showing the scoparon effect on phosphorylation of the MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) signal pathway proteins JNK, ERK and p38.
  • MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase
  • FIG. 23 is data showing the effect of scoparon on osteoclast markers, Catepsin K, and TRA expression.
  • 24 is a schematic diagram of a method for preparing scoparon-containing cedar extract.
  • Figure 25 is a data showing the effect of scoparon containing cephalococci extract on the weight and dietary efficiency of the experimental animals.
  • Figure 26 is a data showing the effect of scoparon containing cephalococci extract on the kidney, liver, uterus of the experimental animals.
  • Figure 27 is a data showing the effect of the scoparon containing cephalococci extract on BMC (A), BMD (B) of the experimental animal.
  • Figure 29 is a data showing the effect of the scoparon containing cephalococci extract on blood BALP (Bone alkaline phosphatase) content of the experimental animal.
  • Figure 31 is a data showing the effect of the scoparon containing cephalococci extract on the blood OPG (osteoprotegerin) content of the experimental animal.
  • FIG. 32 shows data showing the effect of scoparon-containing cephalopod extract on the content of receptor activator of NF- ⁇ B ligand (RANKL) in experimental animals.
  • FIG. 33 is a data showing the effect of scoparon-containing cephalococci extract on blood TRAP (tartrate resistant acid phosphatase) content of experimental animals.
  • the present invention in one aspect, relates to a composition for preventing or treating osteoporosis containing scoparone (scoparone) represented by the formula (1) and the extract of the scoparon containing artemisia capillaris as an active ingredient.
  • scoparone represented by the formula (1)
  • extract of the scoparon containing artemisia capillaris as an active ingredient.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating osteoporosis, comprising administering a composition containing scoparone represented by Formula 1 and the extract of scoparon-containing artemisia capillaris as an active ingredient. .
  • the present invention relates to the use of scoparone represented by the formula (1) and the composition containing the scoparon-containing artemisia capillaris extract as an active ingredient for the prevention or treatment of osteoporosis.
  • the content of the scoparon may be characterized in that 0.001 to 20% by weight.
  • osteoblast proliferation effect and cytotoxicity Fig. 3
  • ALP alkaline phophatase activity
  • Fig. 4 collagen synthesis ability
  • Fig. 5 Bone module formation
  • FIG. 6 osteoclast TRAP activity degree
  • Osteoporosis is a disease caused by excessive bone resorption rather than bone formation. Osteoporosis is weakened due to a decrease in osteoblast activity and increased bone resorption due to osteoclast activity. Since bone metabolic disease occurs in the case, in the present invention, to determine the osteoporosis prevention and treatment effect was measured the degree of osteoblast activation and osteoclast differentiation inhibition.
  • osteoblast collagen synthesis resulted in scoparon 1, 10 and 20 ⁇ M concentrations, resulting in increased collagen synthesis from 163.43 to 181.85%, showing collagen synthesis similar to E2 (173.04%) used as a positive control. It was confirmed (Fig. 10). Previous studies have shown that collagen I-producing collagen accounts for 85-90% of total bone protein (Noriyoshi K et al., Endocrinology . 1986). It was confirmed that it may affect the bone formation.
  • Bone formation consists of three stages: proliferation, maturation and calcification of the matrix (Pittenger JJ. Et al. Science ., 1999), and the formation of bone nodule is known as an important marker for osteoblast differentiation.
  • Alizarin is a vegetable dye that is highly adsorbable to calcium, which is known to be proportional to the amount of mineralization and the degree of staining since it is stained on the extracellular matrix of mineralized cells (Schiller PC, et al, Bone ., 2001).
  • ROS Free radicals
  • GSH glutathione
  • MMP osteoclast-induced mitochondrial membrane potential
  • ROS generation in the osteoclast differentiation process by RANKL is made in mitochondria, and scoparon may be regarded as inhibiting osteoclast differentiation by controlling ROS generation by preventing the reduction of MMP by RANKL treatment.
  • Treatment of RANKL during osteoclast differentiation increases intracellular ROS production via a signaling system via TRAF6 and NADPH oxidase, which acts as a second important signaling pathway for osteoclast differentiation. It was.
  • TRAF6 or the expression of a dominant mutant form inhibits the activity of Rac1, one of the elements of NADNADPH oxidase, and reports that Rac1 is an important mediator of osteoclast differentiation that functions in the submechanism of TRAF6.
  • Rac1 is an important mediator of osteoclast differentiation that functions in the submechanism of TRAF6.
  • Src one of the family of c-Src is sikimyeo phosphorylation of p47 phox
  • phosphorylation of p47 phox is to facilitate the binding to membrane oxidation element (membrane oxidases componet)
  • membrane oxidation element membrane oxidases componet
  • Oxidative stress caused by excessive generation of free radicals (ROS) in vivo can be defined as a biological phenomenon caused by the balance of the antioxidant and oxidant in the cell or tissue.
  • Antioxidant enzymes present in the body such as catalase, glutathione (GSH), glutathione peroxidase (GPX), and superoxide demutase-1 (SOD-1), are responsible for the body's defense system.
  • MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase pathway
  • MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase pathway
  • a series of stimuli such as stress, heat shock, radiation, etc. to induce various biological responses such as inflammatory reactions, apoptosis and cell differentiation ( Ono K, et al. Cell signal, 2000).
  • the binding of RANKL and RANK promotes TRAF-associated protein binding, and the RANKL signal is transmitted, such as JNK (c-Jun N-terminal kinase), p38, and extracellular signal-regulated kinases (ERK) related to MAPK signal.
  • JNK c-Jun N-terminal kinase
  • p38 p38
  • ERK extracellular signal-regulated kinases
  • NF-kB NFATc1
  • c-Fos Signaling proteins are activated and they are known to induce NF-kB, NFATc1 and c-Fos, which are essential for osteoclast differentiation, to regulate osteoclast differentiation and maintenance in osteoclasts (Galibert L, et al. J Biol Chem). 1998).
  • Bone homeostasis is maintained by osteoblasts, which produce the proteins that make up bone, and by mineral accumulation, and by osteoclasts, which secrete proteolytic enzymes and destroy bone components on the surface of bone.
  • osteoblasts which produce the proteins that make up bone, and by mineral accumulation
  • osteoclasts which secrete proteolytic enzymes and destroy bone components on the surface of bone.
  • TRAP and cathepsin K secreted from osteoclasts are known as proteolytic enzymes secreted from osteoclasts.
  • cathepsin K is an important cysteine protease that is selectively expressed only in osteoclasts, and bone constituents break down bones by breaking down proteins and minerals (Kim JM et al, Int J Mol Med, 2007). .
  • the suppression of bone resorption by scoparon reduces the ROS generated during osteoclast differentiation through the regulation of signal pathways leading to TRAF6 / Rac1 / Nox1, and stress, heat shock, and radiation.
  • ROS stimuli
  • the scoparon or scoparon-containing cedar mugwort extract of the present invention is characterized in that it is extracted by using an extraction solvent containing 50% (v / v) spirit in the cedar mugwort sample, the method of producing the scoparone-containing cephalococci extract of the present invention As follows: (a) finely chopped cedar mugwort sample, adding a primary extraction solvent containing 50% spirit (v / v) and heating to 55-65 ° C. for primary extraction; (b) recovering and concentrating the primary extract, followed by adding a secondary extraction solvent containing 50% spirit (v / v) and heating to 45 to 55 ° C. for secondary extraction; And (c) recovering the secondary extract, and then concentrating and drying to obtain a scoparone-containing cedar extract (FIG. 24).
  • the first extraction solvent in the step (a) is added to the ratio of 1: 7 to 1: 9 with the iron mugwort sample, characterized in that extracted for 4 hours to 8 hours, (b) secondary The extracting solvent is added to the ratio of 1: 4 to 1: 6 with the iron mugwort sample, characterized in that the extraction for 4 to 18 hours.
  • the cephalococci extract obtained in step (c) is characterized in that it contains 5.0 to 7.0 mg / g of scoparon.
  • the primary and secondary extracts were recovered by vacuum or reduced pressure concentration, and the concentrated primary and secondary extracts were mixed and lyophilized or spray-dried to obtain the cephalococci extract containing scoparon, and each extract was frozen.
  • the average yield was 13.8% (Table 2).
  • the body weights of the test animals were measured during the 12-week period.
  • Group I, Group II (OVA) and Group III OVA + E2 50 ⁇ g / kg
  • Group IV OVA + ACE 125 mg / kg
  • Group V OVA + ACE 250 mg / kg
  • there was no significant difference but in the case of body weight, weight gain appeared as fat accumulation rate due to ovarian ablation increased.
  • the weight, length, and thickness of the femoral bones were not significantly different between group II, III, IV, and V.
  • the bone density and mineral content of the femoral bones were in group II (OVA).
  • cedar mugwort extract group IV: OVA + ACE 125mg / kg
  • V OVA + ACE 250mg / kg. 27).
  • PICP procollagen type I C-terminal peptide
  • BALP (Bone alkaline phosphatase) control effect of the cephalococci extract containing scoparon
  • group III OVA + E2 50 ⁇ g / kg
  • BALP activity was significantly increased in group IV (OVA + ACE 125 mg / kg) and group V (OVA + ACE 250 mg / kg) (FIG. 29).
  • BALP is a bone-specific enzyme that is secreted during osteoblast differentiation fixation, and is involved in bone remodeling. Increased BALP secretion by the cephalococci extract containing scoparon promotes bone remodeling to prevent osteoporosis. And it was confirmed that can contribute to the treatment.
  • Osteocalcin is formed in osteoblasts and then deposited in bone matrix and acts as a bone resorption signal for osteoclasts. Osteocalcin, which is known to be involved in bone mineralization, is known for its degree of bone formation because some of its new formation is released into the blood (Calvo. MS. Et al. Endocr Rev. , 1996).
  • OVA osteocalcin control effect of cephalococci extract containing scoparone
  • the results of measuring the osteocalcin (OC) concentration in the blood of experimental animals showed that the increased osteocalcin level in ovarian resection group II (OVA) Significant decrease was observed in group IV (OVA + ACE 125 mg / kg) and group V (OVA + ACE 250 mg / kg) (FIG. 30). This resulted in the reduction of bone turnover caused by ovarian ablation by extracting scoparone-containing cephalococci.
  • Osteoprotegerin is a soluble decoy receptor that binds to RANKL and has the effect of blocking RANKL signaling, thus inhibiting the differentiation into mature osteoclasts.
  • the results of measuring the OPG concentration in the experimental animals were compared to the group III (OVA + E2 50 ⁇ g / kg) and the group V (OVA + ACE) administered with scoparone containing group compared to the group II (OVA). 250 mg / kg) was found to increase the secretion of OPG (Fig. 31).
  • the cephalococci extract containing scoparone can block the RANK / RANKL signal by increasing the secretion of OPG and reduce bone loss by reducing bone resorption by osteoclasts by inhibiting differentiation into mature osteoclasts. It confirmed that there was.
  • RANKL receptor activator of NF- ⁇ B ligand
  • group III O2 50 ⁇ g / kg
  • group IV OVA + ACE 125mg
  • group II OVA
  • group V OVA + ACE 250mg / kg
  • ICTP cross-linked C-terminal telopeptide of type Icollagen
  • the scoparon-containing cedar mugwort extract prepared by the method of the present invention has an effect of increasing bone mineral density and mineral content of bone, and promotes bone formation by increasing type I collagen formation and BALP secretion to prevent osteoporosis. And to help with treatment.
  • the composition for improving the bone tendon containing the scoparone derived from the iron wormwood of the present invention as an active ingredient promotes the activity of osteoblasts, inhibits the bone absorption of osteoclasts to help prevent and treat osteoporosis It was confirmed.
  • composition for preventing and treating osteoporosis of the present invention can be formulated or used in combination with a medicament already used.
  • the pharmaceutical dosage forms of the compositions of the present invention may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts and may also be used alone or in combination with other pharmaceutical mg / kg active compounds as well as in a suitable collection.
  • Composition for the prevention and treatment of osteoporosis containing scoparon or scoparon-containing cephalococci extract according to the present invention as an active ingredient respectively, powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. It may be used in the form of a dosage form, an external preparation, a suppository, and a sterile injectable solution.
  • Preferred dosages of the extracts of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the extract of the present invention is preferably administered at 0.001 to 200 mg / kg, preferably 0.01 to 100 mg / kg per day. Administration may be administered once a day or may be divided orally. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the extract of the present invention can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections.
  • the present invention relates to a health functional food for osteoporosis prevention improvement containing scoparone represented by Formula 1 or the scoparon-containing cephalococci extract as an active ingredient.
  • the content of scoparone (scoparone) or the scoparon-containing cephalococci extract contained in the health functional food for preventing and improving osteoporosis may be characterized in that 0.001 to 20% by weight.
  • the "health functional food” means a food that has improved the functionality of the general food by adding the extract of the present invention to the general food. Functionality can be roughly divided into physical properties and physiological functions. When the extract of the present invention is added to general foods, the physical properties and physiological functions of general foods will be improved, and the present invention provides a comprehensive 'health function' Food '.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and its Salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the composition of the present invention may contain fruit flesh for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is usually selected in the range of 0.01 to 20 parts by weight per 100 parts by weight of the extract of the present invention.
  • cedar mugwort ingredients Separation and purification of cedar mugwort ingredients was carried out to confirm the effect of preventing and treating osteoporosis of each ingredient included in the cedar mugwort extract.
  • the distilled water fraction (140 g) was subjected to Diaion HP 20 column chromatography using a gradient solvent of distilled water: methanol 1: 0 to 0: 1, and then fractionated into five fractions (Fr). 7 to Fr. 11), and Fr. Compounds 10, 11, 12, 13 and 14 were separated and purified at 9 (FIG. 1).
  • osteoporosis prevention and treatment efficacy of the 14 isolates derived from cephalococci, osteoblast proliferation effect, cytotoxicity, ALP (alkaline phophatase) activity, collagen synthesis ability, bone module formation and osteoclast activity analysis It was.
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells (osteoblasts, ATCC, No. CRL-2593) were placed in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and attached in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours ( After pre-incubation, each well was treated with 14 substances derived from cedars from 1 ⁇ M and 10 ⁇ M, and then incubated for 48 hours. After 48 hours, the medium was removed, and 5 mg / ml of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) solution was added to each well, followed by 4 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator. Incubated.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4), and then treated with 300 ⁇ l DMSO (dimethyl sulfoxide) to lyse the cells. 200 ⁇ l of the dissolved supernatant was transferred to a 96-well plate and the absorbance was measured at 570 nm with a microplate reader.
  • PBS pH 7.4
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells were placed in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, followed by differentiation-inducing medium (10 mM).
  • differentiation-inducing medium (10 mM).
  • ⁇ -glycerolphosphate, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid was replaced with medium and 14 ⁇ L-derived 14 materials were treated with 10 ⁇ M after 24 hours of culture.
  • the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH7.4) after replacing the medium with 14 substances derived from cephalopods at 3 day intervals, and 100 ⁇ l of 0.1% Triton X- 100 was added and dissolved for 30 minutes at 37 ° C.
  • the lysed cells were centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and 5 ⁇ l of the supernatant was used for protein quantification.
  • 30 ⁇ l of the supernatant was 0.5 M Tris-HCl buffer containing 1 mM MgCl 2 and 6 mM p-nitrophenyl phosphate.
  • the calibration curve was prepared using 0, 10, 50, 100, 200 and 500 nM 4-nitrophenol.Alkaline phosphatase activity may be affected by the number of cells. The activity of phosphatase was calculated and alkaline phosphatase activity was expressed as 1 unit (nM PNPP / mg of protein / min).
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells induced differentiation with differentiation-inducing medium increased ALP activity up to 10.63 units compared to cells not treated with differentiation-inducing medium. Samples were found to increase ALP activity from 11.06 to 12.13 units ( Figure 4).
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells were placed in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, followed by differentiation-inducing medium (10 mM).
  • differentiation-inducing medium (10 mM).
  • ⁇ -glycerolphosphate, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid) medium was exchanged for 24 hours after 14 hours of treatment with 14 materials derived from cedars to 50 ⁇ M.
  • the cells were replaced with medium containing 14 substances derived from cephalopods at 3 days intervals. After the medium was removed, the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4) and then washed with 500 ⁇ l Bouin's fluid solution.
  • the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4). After staining with 0.1% Direct red 80 (Sirius red F3BA) solution for 1 hour, the undyed dye was removed using Acidic water, treated with 500 ⁇ l of 0.1N NaOH solution, The absorbance was measured at 540 nm using an ELISA reader.
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells induced differentiation with differentiation-inducing medium increased collagen synthesis by 131.47% compared with cells not treated with differentiation-inducing medium.
  • collagen synthesis was increased by most substances except 1, 4, and 9 (FIG. 5).
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells were placed in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, followed by differentiation-inducing medium (10 mM).
  • differentiation-inducing medium (10 mM).
  • ⁇ -glycerolphosphate, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid) medium was exchanged for 24 hours after 14 hours of treatment with 14 materials derived from cedars to 50 ⁇ M.
  • the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4) after removing the medium. The solution was fixed at 4 ° C. for 1 hour and then washed twice with 500 ⁇ l distilled water.
  • the cells were dyed for 10 minutes with a 40 mM Alrizarin red S (pH 4.2) solution, and then the undyed dye was removed using 500 ⁇ l of distilled water. After dissolving 500 ⁇ l of 10% cetylpyridinium chloride, 200 ⁇ l was transferred to a 96-well plate and the absorbance was measured at 562 nm with an ELISA reader.
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells induced differentiation with differentiation-inducing medium increased bone nodule formation by 142.5% compared with cells not treated with differentiation-inducing medium.
  • Most substances except 1 and 13 were confirmed to increase bone nodule formation compared to the group that induced differentiation (FIG. 6), and 14 substances fractionated from cedars were extracellular matrix of osteoblasts. To promote bone formation.
  • RAW 264.7 cells (osteoblasts, ATCC, No. TIB-71) were placed in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well and attached in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours (pre-incubation). Then, 14 different substances derived from cedars were treated with 5 ⁇ M with differentiation-inducing medium (50 ng / ml receptor activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (RANKL)). After culturing for 5 days, the cells were replaced with medium containing 14 substances derived from cedar wormwood at 2 days intervals.
  • differentiation-inducing medium 50 ng / ml receptor activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (RANKL)
  • the cells were washed once with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4), followed by 4% formaldehyde (formaldehyde). Cells were fixed by treatment for 10 minutes with ethanol / acetone (1: 1) for 1 minute. After washing twice with 500 ⁇ l of distilled water, TRAP staining was performed using the Leukocyte Acid Phosphatase Kit 387-A (Sigma, USA).
  • TRAP activity was treated with RAW 264.7 cells up to ethanol / acetone in the same manner as the staining process, and then washed twice with distilled water and 50 mM sheet containing 10 mM sodium tartrate and 5 mM ⁇ -nitrophenylphosphate. 500 ⁇ l of rate buffer (pH 4.5) was dispensed and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, 100 ⁇ l of the enzyme reaction solution was dispensed into a new plate, the reaction was stopped with 0.1 N NaOH, and the absorbance was measured at 405 nm.
  • rate buffer pH 4.5
  • the scoparon substance was selected from the 14 substances isolated from the cedars, which have the effect of promoting the activity of osteoblasts and inhibiting the activity of osteoclasts. was performed.
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells were placed in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours. This was treated to 0, 1, 10, 20 ⁇ M and then cultured for 6 days and 15 days. After incubation, the medium was removed, and 5 mg / ml of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) solution was added to each well, followed by incubation in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 4 hours. .
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4), and then treated with 300 ⁇ l DMSO (dimethyl sulfoxide) to lyse the cells. After 200 ⁇ l of the dissolved supernatant was transferred to a 96-well plate, the absorbance was measured at 570 nm with a microplate reader (ELISA reader).
  • PBS pH 7.4
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells (cell information) were placed in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well, pre-incubated at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 24 hours, and then differentiated. After replacing the medium with induction medium (10mM ⁇ -glycerolphosphate, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid) and incubated for 24 hours and treated with scofarone to 0, 1, 10, 20 ⁇ M concentration. After culturing for 3 days, 6 days, and 9 days, the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH7.4) after replacing the medium with the scoparon at 3 day intervals. Triton X-100 was added and dissolved at 37 ° C.
  • the lysed cells were centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and 5 ⁇ l of the supernatant was used for protein quantification.
  • 30 ⁇ l of the supernatant was 0.5 M Tris-HCl buffer containing 1 mM MgCl 2 and 6 mM p-nitrophenyl phosphate ( pH 9.8) 70 ⁇ l was added to 96-well plates, respectively, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Then, 100 ⁇ l of 0.1N NaOH was added to stop the reaction, and the absorbance was measured at 405 nm with an ELISA reader.
  • the calibration curve was prepared using 0, 10, 50, 100, 200 and 500 nM 4-nitrophenol.Alkaline phosphatase activity may be affected by the number of cells. The activity of phosphatase was calculated and alkaline phosphatase activity was expressed as 1 unit (nM PNPP / mg of protein / min).
  • 17 ⁇ -estradiol used as a positive control increased the activity up to 15.60 units at 6 days of differentiation compared to cells treated with differentiation-inducing media, and 15.62 units and 16.44, respectively, were treated with 1, 10 and 20 ⁇ M concentrations. It was confirmed that ALP activity was increased in a concentration-dependent manner in units and 18.19 units (FIG. 9). On the 9th day of differentiation, ALP activity tended to decrease in each group compared to the 6th day, which is thought to be due to the formation of bone nodule, which caused the scoparon to induce osteoblast differentiation. It is thought to be involved in the calcification of cells.
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells were placed in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, followed by differentiation-inducing medium (10 mM). ⁇ -glycerolphosphate, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid) medium was replaced after 24 hours incubation was treated with scofaron to 0, 1, 10, 20 ⁇ M concentration. After culturing for a total of 8 days, the medium was removed and exchanged with a scofaron-containing medium every 3 days.
  • the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4), and then washed with 500 ⁇ l Bouin's fluid solution at 37 ° C. After fixing for an hour, the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4). After staining with 0.1% Direct red 80 (Sirius red F3BA) solution for 1 hour, the undyed dye was removed using acidic water, and then treated with 500 ⁇ l of 0.1 N NaOH solution, and 200 ⁇ l 96- The absorbance was measured at 540 nm using an ELISA reader.
  • Direct red 80 Small red F3BA
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells induced differentiation with differentiation-inducing medium increased collagen synthesis by 154.45% compared with cells not treated with differentiation-inducing medium, and 173.04 for E2 used as a positive control group.
  • Collagen synthesis was increased by%.
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells were placed in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, followed by differentiation-inducing medium (10 mM). ⁇ -glycerolphosphate, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid) medium was replaced after 24 hours incubation was treated with scofaron to 0, 1, 10, 20 ⁇ M concentration. After culturing for 15 days, the medium was removed and exchanged with a medium containing scoparon every three days. After the medium was removed, the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4), and 500 ⁇ l of 70% ethanol at 1 ° C.
  • MC3T3-E1 subclone 4 cells induced differentiation with differentiation-inducing medium showed increased bone nodule formation by 121.74% compared with cells not treated with differentiation-inducing medium, and E2 used as a positive control group.
  • Bone nodule formation increased by 157.84% (FIG. 11).
  • Treatment with scoparone at concentrations of 1, 10, and 20 ⁇ M increased bone nodule synthesis by 141.56 to 154.01%, which may have a positive effect on bone formation by promoting extracellular matrix of osteoblasts. I think it is.
  • RAW 264.7 cells were placed in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours. After treatment to 1, 2, 5, 10, 20 ⁇ M and incubated for 5 days. After incubation, the medium was removed, and 5 mg / ml of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) solution was added to each well, followed by incubation in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 4 hours. .
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the cells were washed twice with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4), and then treated with 300 ⁇ l DMSO (dimethyl sulfoxide) to lyse the cells. After 200 ⁇ l of the dissolved supernatant was transferred to a 96-well plate, the absorbance was measured at 570 nm with a microplate reader (ELISA reader).
  • PBS pH 7.4
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Scofarone was treated to 1, 2, 5, 10 and 20 ⁇ M concentrations, and then cultured for 5 days to confirm cytotoxicity, and did not show cytotoxicity at all concentrations (FIG. 12). It was performed with scofaron at a concentration of from 20 ⁇ M.
  • RAW 264.7 cells were placed in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, followed by differentiation induction medium (50 ng / ml receptor). Scoparon with activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (RANKL) was treated to concentrations of 0, 1, 10 and 20 ⁇ M. After culturing for 5 days, the medium was removed and exchanged with a medium containing scoparon at 2 days intervals. After the medium was removed, the cells were washed once with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4), followed by 10 minutes with 4% formaldehyde (formaldehyde).
  • RAW 264.7 cells were placed in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, followed by differentiation induction medium (50 ng / ml receptor). Scoparon with activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (
  • TRAP staining was performed using the Leukocyte Acid Phosphatase Kit 387-A (Sigma, USA).
  • TRAP-positive multinucleated cells with three or more nuclei were counted using an optical microscope and used as an index for generating osteoclasts.
  • osteoclast formation was reduced depending on the scoparon concentration, and the results of counting TRAP-positive multinucleated cells confirmed that the osteoclasts were effectively inhibited from 61.69 to 93.15% (FIG. 13).
  • RAW 264.7 cells were placed in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, followed by differentiation induction medium (50 ng / ml receptor). Scoparon with activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (RANKL) was treated to concentrations of 0, 1, 10 and 20 ⁇ M. After incubation for 5 days, the cells were washed once with 500 ⁇ l PBS (pH 7.4), followed by 10 minutes with 4% formaldehyde. Cells were fixed by treatment with ethanol / acetone (1: 1) for 1 minute.
  • RAW 264.7 cells were placed in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well and pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, followed by differentiation induction medium (50 ng / ml receptor). Scoparon with activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (RANKL) was treated to concentrations of 0, 1, 10 and 20
  • TRAP activity which is a differentiation marker of osteoclasts
  • TRAP activity was reduced to 196.70 to 254.70% depending on the concentration of scoparone (FIG. 14). Inhibiting absorption can have a positive effect on the prevention and treatment of osteoporosis.
  • Bone resorption activity by osteoclasts was determined using Cosmobio's bone resorption assay kit (CSR-BRA-48KIT). Calcium phosphate-coded (CaP-coated plate) 48 well plates were treated with 250 ⁇ l of Fluoresceinamine-labeled chondroitin sulfate (FACS) and labeled at 37 ° C. for 2 hours. After removing the FACS solution, the cells were washed twice with PBS (pH 7.4) and then treated with 1 ml of phenol red free medium until the culture of RAW 264.7 cells.
  • FACS Fluoresceinamine-labeled chondroitin sulfate
  • differentiation induction medium 100 ng / ml receptor activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (RANKL)
  • the cells were incubated for 6 days while being replaced
  • ROS Free radicals
  • GSH glutathione
  • RAW 264.7 cells were placed in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well, pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, and then differentiated (50 ng / ml receptor). Scofarone was treated with activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (RANKL) to a concentration of 0, 1, 10, 20 ⁇ M. After 2 days of culture, the medium was removed, exchanged with 200 ⁇ l of HBSS, and then DCFH-DA (40 ⁇ M), DHE (50 ⁇ M), DHR123 (20 ⁇ M), and mBCL (50 ⁇ M) were added to each well. Incubate for minutes.
  • RAW 264.7 cells were placed in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well, pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, and then differentiated (50 ng / ml receptor). Scofarone was treated with activator of nuclear factor- ⁇ B ligand
  • MMP Mitochondrial membrane potential
  • RAW 264.7 cells were placed in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well, pre-incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, and then differentiated (50 ng / ml receptor). Scofarone was treated with activator of nuclear factor- ⁇ B ligand (RANKL) to a concentration of 0, 1, 10, 20 ⁇ M. After a total of 2 days of culture, the medium was removed, exchanged with 200 ⁇ l of HBSS, and then additionally 5 ⁇ M of rhodamine 123 was incubated for 30 minutes.
  • RNKL nuclear factor- ⁇ B ligand
  • TRAF6 the highest regulator of the RANKL / RANK signal pathway
  • Rac1 a submechanism mediator of TRAF6
  • Spharon regulates the expression of TRAF6, thereby reducing the expression of GTP-Rac1, the active form of Rac1, the cytoplasmic subunit of NADPH oxidase, and impedes the translocation of Rac1 to the cell membrane. Inhibiting the formation of NADPH oxidase complex can be seen to control the development of ROS.
  • the suppression of bone resorption by scoparon reduces the ROS generated during osteoclast differentiation through the regulation of signal pathways leading to TRAF6 / Rac1 / Nox1, and stress, heat shock, and radiation.
  • Inhibition of bone resorption by osteoclasts by inhibiting MAPKs pathway activity sensitive to a series of stimuli (ROS) (FIG. 23).
  • the cedar mugwort sample was divided into five and the cedar mugwort was extracted using the extraction solvent containing 50% alcohol in the same manner as described above, and each extract was lyophilized to measure the concentrated amount of the extract concentrate.
  • the average yield was 13.8%.
  • Example 5-1 Each sample was dissolved in 70% MeOH and then filtered through a 0.45 ⁇ m filter membrane to analyze the content of scoparon contained in the cedar mugwort extract extracted by the method of Example 5-1 (Table 2). The concentration was adjusted to 10 mg / ml and used for HPLC analysis.
  • the sample of cedar mugwort purchased from Uljin, Gyeongbuk was finely chopped (1.0 g), treated with 100 ml of 70% MeOH, extracted by ultrasonic method, and filtered with a 0.45 ⁇ m filter membrane. Finally the concentration was adjusted to 10 mg / ml and 10 ⁇ l of the filtrate was taken and used for HPLC analysis.
  • the control group contained about 0.12% by weight of scoparon, but the average of 0.54 to 0.67% by weight in the five kinds of cedar extract extracted by the method of Example 5-1 It was confirmed that the scoparon contained.
  • Example 6 Effect of sageparon extract containing scoparon on body weight and dietary efficiency using animal experiments
  • SD Sprague-Dawley
  • a total of 84 days of calcium deficiency diet was supplied to experimental animals, and a fixed control group was supplied with 50 ⁇ g / kg of 17 ⁇ -estradiol (E 2 ) and 125 mg / kg and 250 mg / kg of cedar extract daily for 12 weeks. It was.
  • Dietary intake was measured at a defined time between 9 and 10 hours daily.
  • the aviary was controlled by artificial lighting to adjust lighting time from 9 am to 9 pm for 12 hours, and kept at room temperature 25 ⁇ 3 °C and relative humidity 50 ⁇ 10%.
  • Water was used as regular drinking water, and the feed and water supply were not limited, and the water was supplied every day between 9 am and 10 am.
  • Example 7 Determination of bone growth and bone health activity of cephalococci extract containing scoparone using animal experiment
  • Bone mineral density (BMD) and bone mineral content (BMC) of the femoral bones were measured using PIXImus (GE medical systems Lunar, USA).
  • BMD of the femoral bone tissue is expressed in g units per cm 2
  • BMC is expressed in g units.
  • the weight, length, and thickness of the femoral bones were measured and showed significant differences between group I (Sham) and group II (OVA), and did not show significant differences between group II and III, IV and V. Did.
  • BMD and mineral content of femoral bones were decreased in group II (OVA) compared to group I (Sham), but positive control group (OVA + E2 50 ⁇ g / kg) and cedar extract group (IV: OVA + ACE 125mg / kg, V) : OVA + ACE 250 mg / kg) was significantly increased (Fig. 27).
  • Blood PICP of experimental animals was measured using USCN enzyme-linked immunosorbent assay (E90570Ra). After the test animal was opened, blood was quickly collected from the heart and centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes to separate plasma from whole blood. The separated plasma was stored at ⁇ 70 ° C. and used for analysis.
  • E90570Ra USCN enzyme-linked immunosorbent assay
  • administration of the scoparon-containing cephalococci extract could increase the type I collagen formation and help to form bone.
  • the blood BALP of the experimental animals was measured using MBS Bone Alkaline Phosphatase (MBS731429), and the plasma isolated in Example 7-2 was used.
  • BALP activity was significantly higher in Group III (OVA + E2 50 ⁇ g / kg), Group IV (OVA + ACE 125 mg / kg) and Group V (OVA + ACE 250 mg / kg) than Group II (OVA). Increased as shown in FIG. 29.
  • BALP is a bone-specific enzyme that is secreted during osteoblast differentiation fixation, and is involved in bone remodeling. Increased BALP secretion by the cephalococci extract containing scoparon promotes bone remodeling to prevent osteoporosis. And it was confirmed that can contribute to the treatment.
  • OC Blood osteocalcin
  • Each well was diluted 10-fold with working sample buffer BT-471R in all wells except for the blank wells of a rat osteocalcin coated 96-well plate.
  • 25 ⁇ l of plasma and 100 ⁇ l of osteocalcin antiserum were dispensed and reacted at 37 ° C. for 2 hours 30 minutes.
  • each well was washed five times using 300 ⁇ l of washing buffer.
  • 100 ⁇ l of donkey anti-Goat IgG peroxidase was added to all wells, and the reaction was performed at room temperature for 1 hour. Each well was washed five times.
  • the blood OPG concentration of the experimental animals was measured using the mouse OPG kit (MOP00) of the R & D system, and the plasma isolated in Example 7-2 was used.
  • Pear-diluted plasma was aliquoted into 25 ⁇ l and reacted at room temperature for 2 hours. After removing the reaction solution, each well was washed five times using 400 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of substrate solution was added to all wells and allowed to react at room temperature for 30 minutes in a light-blocked state.
  • the absorbance was measured at 450 nm with ELISA reader, and mouse OPG standard of 0, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 and 2,000 pg / ml
  • mouse OPG standard of 0, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 and 2,000 pg / ml The calibration line was prepared using.
  • the blood RANKL concentration of the experimental animals was measured using the mouse TRANCE / RANKL / TNFSF11 kit (MTR00) of the R & D system, and the plasma isolated in Example 7-2 was used. It was.
  • assay diluent RD1W 50 ⁇ l of assay diluent RD1W was dispensed into all wells except for the blank wells of rat TRANCE coated 96-well plate (blank wells), followed by calibrator diluent RD6-12. Two-fold dilutions of 25 ⁇ l of plasma were reacted at room temperature for 2 hours. After removing the reaction solution, each well was washed five times using 400 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of conjugate solution was reacted at room temperature for 2 hours, followed by 400 ⁇ l of wash buffer. Each well was washed five times. Then, 100 ⁇ l of substrate solution was added to all wells and allowed to react at room temperature for 30 minutes in a light-blocked state.
  • group III OVA + E2 50 ⁇ g / kg
  • group IV OVA + ACE 125mg / kg
  • group OV OVA
  • group II OVA
  • the blood TRAP concentration of the experimental animals was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay kit (E90902Ra, USCN), and the plasma separated in Example 7-2 was used.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for a time. Thereafter, 100 ⁇ l of detection reagent A was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Then, the reaction solution was removed and each well was washed three times using 350 ⁇ l of washing buffer. Then, 100 ⁇ l of detection reagent B was added to all the wells and reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then each well was washed five times using 350 ⁇ l of washing buffer. 90 ⁇ l of substrate solution was added to all wells, the reaction was stopped at 37 ° C.
  • TRAP content was increased in group II (OVA), an ovarian resection group, but in group III (OVA + E2 50 ⁇ g / kg), control group VI (OVA + ACE 125 mg / kg).
  • group V OVA + ACE 250mg / kg was confirmed that the TRAP content significantly reduced compared to the group II (Fig. 33).
  • scoparon-containing cephalococci extract was found to help prevent and treat osteoporosis by reducing TRAP secretion of osteoclasts induced by ovarian ablation.
  • the blood ICTP concentration of the test animals was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay kit (E90665Ra, USCN), and the plasma isolated in Example 7-2 was used.
  • 50 ⁇ l of detection reagent A was dispensed and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • 100 ⁇ l of detection reagent B was added to all wells and reacted at 37 ° C. for 30 minutes, followed by 350 ⁇ l of Each well was washed five times using wash buffer.
  • 90 ⁇ l of substrate solution was added to all wells, the reaction was stopped at 37 ° C. for 20 minutes under light blocking, and then the reaction was stopped by treatment with 50 ⁇ l stop solution, followed by ELISA reader. Absorbance was measured at 450 nm, and calibration lines were prepared using rat ICTP standards of 0, 123.5, 370.4, 1,111.1, 3,333.3 and 10,000 pg / ml.
  • the blood ICTP concentration of the ovarian ablation group II was significantly increased compared to the group I (Sham), but the positive control group III (OVA + E2 50 ⁇ g / kg) and the scoparone-containing cephalococci extract group Group V OVA + ACE 250 mg / kg) was found to significantly reduce ICTP levels compared to group II (OVA) (FIG. 33).
  • Scoparone (scoparone) or the scoparone-containing cephalococci extract of the present invention increases osteoblast activity and inhibits osteoclast activity and bone resorption activity, thereby preventing and treating osteoporosis, as well as promoting and improving bone health, bone loss

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Abstract

본 발명은 사철쑥(artemisia capillaris) 유래 스코파론(scoparone) 함유 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 및 건강기능성 식품에 관한 것이다. 본 발명의 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 조골세포 활성을 증가시키고 파골세포의 활성억제 및 뼈 흡수 활성을 억제하므로, 골다공증 예방 및 치료뿐만 아니라, 뼈 건강 증진 및 개선, 골손실 방지를 위한 약학조성물, 건강기능 식품 또는 음료로서 유용하다.

Description

사철쑥 유래 스코파론 함유 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 사철쑥(artemisia capillaris) 유래 스코파론(scoparone) 함유 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 및 건강기능성 식품에 관한 것이다.
골조직은 골량(bone mass) 및 골격의 항상성(skeletal homeostasis)을 유지하기 위해 흡수와 형성이 끊임없이 일어나는 동적인 조직으로, 이러한 뼈의 재형성(bone remodeling)에는 두 종류의 특수한 기능을 하는 세포가 관여한다. 파골세포는 뼈를 흡수하는 반면, 조골세포는 뼈기질을 합성하고 채우는 역할을 하므로, 골량은 이러한 세포의 상대적인 기능에 의존하게 된다. 정상 성인에서는 골흡수 양과 골형성 양 사이에는 항상 균형이 유지되고 있다. 골개조는 일정한 주기를 통해 일어나며 국소적으로 좁은 부위에서 일어남으로써 골격계의 구조가 유지되는데 이러한 골격계의 구조와 기능은 전신적인 호르몬과 국소적 인자 사이의 복잡한 상호작용에 의해 조절된다 (Canalis, E. et al., J. Clin. Invest., 81:277, 1988; Raisz, L.G., CIBA Foundation Symposium, 136:226, 1988).
조골세포와 파골세포의 작용을 매개로 일생동안 끊임없이 형성과 흡수를 반복하며 골재형성 과정을 진행해 나간다. 이러한 골재형성 과정은 parathyroid hormone(PTH), calci-tonin, 에스트로겐 등과 같은 호르몬과 insulin-like growth factor I(IGF-I) 등의 골조직에서 분비되는 다양한 성장인자, tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등과 같은 사이토카인을 통해 조골세포와 파골세포의 활성 균형을 조절하며 항상성을 유지시킨다. 그러나 유전적, 생리적, 환경적 인자의 변화와 더불어 조골세포의 활성도가 약화되어 골형성이 감소하거나 파골세포의 활성도 강화로 골흡수가 증가되는 경우, 또는 두 가지 요소가 동시에 작용되는 경우에 골대사 질환이 발생하게 된다. 이러한 골대사 불균형은 일차적으로 조골세포의 기능저하에 의한 것인지, 혹은 골흡수의 증가 즉, 파골세포의 활성도 강화에 의한 것인지에 대하여는 여러 가지 이론과 주장이 제기되고 있으며 골다공증의 요인으로는 연령의 증가, 영양 결핍, 운동부족, 칼슘 섭취의 부족, 유전적 요소, 약물복용, 호르몬의 영향 등을 꼽는다 (Ryan PJ et al., J Bone Miner Res., 7:1455, 1992).
골대사 질환 중 고령사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증은 골흡수와 골형성의 균형이 무너져 발생하는 것으로 골형성 보다 과다하게 골흡수가 진행되는데 기인한 질환으로, 골다공증은 골조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지고, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골조직은 조골세포에 의해 형성되고 파골세포에 의해 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다.
골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등이 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15 %에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이,폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14 ~ 18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1 %씩 감소한다. 특히 폐경 후 여성들의 경우 에스트로겐(estrogen)의 분비부족으로 인하여 가장 그 발생빈도가 높게 나타난다고 알려져 있다 (Jilka RL., Bone, 23:75, 1998).
그러나, 남성이라도 노화에 따라 골질량이 감소하는 경향이 나타나며(Stein GS et al., Physiol Rew., 76:593, 1996), 최근 20년간 초중학생의 골절률은 2배 이상 증가하고 있는 실정이다. 골 대사 불균형으로 인한 골질환의 예방 또는 치료 측면에서, 젊은 때부터 골질량을 높이는 것이 상당히 중요하며, 이와 같이 뼈의 건강을 유지하는 것은 성별이나 연령과 관계없이 중요한 문제이다.
현재 골다공증 예방 및 치료에 사용되고 있는 약제는 대부분 골흡수를 억제하는 작용을 하기 때문에 이미 진행된 골소실을 완전히 회복할 수 없으며, 따라서 궁극적인 목표인 골다공증의 발생을 완전히 예방할 수 없는 현실이다. 이에 골다공증의 예방과 치료를 위해 골형성 증가에 관한 연구가 최근 주목받고 있으며 골조직 재생능력에 미치는 영향 등에 대한 과학적인 접근이 필요한 실정이다 (Cho SH et al., Korean J Obstet Gynecol., 39:1497, 1996; Boonen A et al., J Internal Medicine., 242:285, 1997).
폐경성 골다공증(postmenopausal osteoporosis)의 치료를 위해 투여되는 에스트로겐은 생체 내에서 성호르몬의 기능 외에도 조골세포의 에스트로겐 수용체 α(ER α) 혹은 β(ER β)와 결합한 후 핵으로 이동하여 골대사에 관여하는 국소인자 유전자의 전사활성을 조절할 뿐만 아니라, 콜라겐의 발현, 칼슘과 인 대사에 관여하는 알칼라인 포스파타제(ALP)의 활성 및 성장인자인 IGF-I의 생성과 유전자의 발현을 증가시킴으로써 골 형성에 관여하는 것으로 보고되고 있다. 또한 조골세포를 자극하여 골의 석회화를 촉진하고, 파골세포의 생성을 촉진하는 RANK ligand(RANKL)의 분비를 억제하여 새로운 파골세포의 생성을 억제하는 한편, 기 생성된 파골세포의 세포사멸을 촉진하는 것으로 보고된 바 있다. 그러나 장기간 사용 시 오심, 체중증가, 불규칙한 자궁출혈, 자궁내막암 및 유방암과 같은 부작용을 유발하는 것으로 보고되고 있다.
현재 약한 에스트로겐 활성을 나타내는 식물 유래의 피토에스트로겐 (phytoestrogen)이 폐경 후 골다공증 예방에 매우 유용하다는 연구가 활발히 진행되고 있다 (Aldercreutz H, Mazur W., Proc Nutr Soc., 55:399, 1996). 그 예로서, 콩에 다량 함유된 이소플라본(isoflavone)류 중 제니스테인(genistein)과 디아드제인(diadzein) 등은 에스트로겐 유사 활성 물질로, 대두 에탄올 추출물의 조골 유사 세포 또는 조골세포 및 산화성 스트레스 및 유리기(free radical)소거능 등에 미치는 영향에 대한 연구결과도 보고된 바 있다 (Lee YS et al., Korea Soybean Digest., 18:35, 2001; Choi EM et al., Phytochemistry, 56:733, 2001; Choi EM et al., Food Research International, 35:893, 2002). 그러나 이 방법은 폐경성 골다공증 이외의 원인에는 제한적으로 사용된다는 한계점을 가진다.
이 밖에 칼슘염, 우골분 등의 칼슘보충제, 비타민 D 대사산물 요법 등이 비 폐경성 골다공증 치료에 이용되고 있으나(Orcel P, Krane SM. Secondary osteoporosis and glucocorticoid include osteoporosis. Ann Med Interne. 151: 497, 2000), 이들은 용해성이나 흡수성, 미각적 측면에서 문제점이 있다. 성장인자를 치료와 예방법으로 사용하는 것에 대한 연구도 진행되고 있으나(Karen MP, Carol CP, Lawrence GR. Treatment of osteoporosis. Annu Rev Med. 6: 249-256 (1995)), 비용 및 부작용 측면에서 보편화되기 어려운 단점이 있다. 한편, 적당한 운동은 골량을 늘리고 뼈를 강화시킬 수 있으나, 허약체질인 환자나 운동시간이 부족할 수 밖에 없는 수험생, 거동이 힘든 노인 등은 운동을 하기 어려운 문제점이 있다. 약물 투여에는 비스포스포네이트(bisphosphonates)나 칼시토닌 제제 등이 사용되며 골다공증의 치료에 유효하다고 알려져 있으나, 이러한 약물은 전문의약품이고, 식도에 협착될 수 있는 등의 부작용이 있어 복용에 매우 주의를 요하며, 이명, 두통, 식욕 부진 등의 부작용도 나타낼 수 있다고 보고된 바 있다.
한편, 사철쑥은 우리나라 냇가나 강가의 모래땅에서 자생하는 국화과에 속하는 다년생 초본이다. 겨울철에도 죽지 않고 이듬해 줄기에서 다시 싹이 나온다 하여 사철쑥 또는 애탕쑥이라 불리며, 생약명으로는 인진, 인진호 또는 추호라 불린다.
또한 사철쑥에는 정유성분, 쿠마린류(coumarin), 크로몬류(chromone), 라보노이드류(flavonoids), 카페익산(caffeic acid), 방향족 옥시카본산(oxycarbonic acid) 및 각종 무기질과 비타민을 함유하고 있다고 알려져 있고, 주로 간기능 보호, 항바이러스, 혈압강화, 혈관 이완작용, 진통 및 해열작용, 담낭염, 황달, 거담, 소화불량, 월경장애, 임신중독 등 여러 질병의 치료 및 예방을 위해 사용되어져 왔다. 사철쑥의 주요 약리성분은 스코파론(scoparone, 6,7-dimethoxycumarine)과 베타인(betaine)으로 스코파론(scoparone)은 쿠마린(coumarin) 유도체로 사철쑥의 지상부에 존재하며 답즙 생성분비를 촉진시키는 이담제, 이뇨제로 쓰이며, 항산화 활성이 높은 것으로 보고되어 있고, 특히 간 질환에 효과적인 물질로 알려져 있다.
특히, 사철쑥에 존재하는 쿠마린 유도체인 스코파론(scoparone; 6,7-dimethoxycoumarin)은 벤젠(benzene)과 피론링 (pyrone-ring)이 결합된 구조를 가지고 있으며, 면역억제나 혈관 이완, 지질강하, 혈압강하작용, 이담작용, 소염작용 등의 다양한 효과가 있는 것으로 보고되고 있다 (한국 등록특허 제1169217호; 한국등록특허 제1093930호). 종래의 기술에서 사철쑥 추출물의 골다공증 예방 효과, 특히 산화적 스트레스 하에서 골다공증 치료 및 예방에 효과가 있다는 점이 보고된 적이 있으나(한국 공개특허 제2013-0091160호), 사철쑥 유래 스코파론의 골다공증 예방 또는 치료 효과에 대한 개시는 없었다.
이에, 본 발명자들은 부작용이 없고 골다공증 예방 또는 치료 효능이 있는 천연 추출물 유래 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 스코파론(scoparone)이 조골세포 활성을 증가시키고, 파골세포의 활성억제 및 뼈 흡수 활성을 억제하여 골다공증 예방 및 치료에 효과가 있는 것을 확인하고, 사철쑥 유래 스코파론을 함유하는 추출물을 분리하였으며, 상기 추출물의 골다공증 예방 또는 치료 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 조골세포 활성 증가, 파골세포의 활성억제 및 뼈 흡수 활성 억제 등의 효과가 뛰어난 사철쑥 유래 스코파론을 함유하는 추출물 및 이를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 조성물을 제공한다.
화학식 1
Figure PCTKR2014010833-appb-I000001
본 발명은 또한, 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 조골세포 활성 증가, 파골세포의 활성억제 및 뼈 흡수 활성 억제 등의 효과가 뛰어난 사철쑥 유래 스코파론을 함유하는 추출물 및 이를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 조골세포 활성 증가, 파골세포의 활성억제 및 뼈 흡수 활성 억제 등의 효과가 뛰어난 사철쑥 유래 스코파론을 함유하는 추출물 및 이를 포함하는 조성물을 골다공증 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 골다공증 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공하는데 있다.
도 1은 사철쑥 성분의 분리정제 모식도이다.
도 2는 사철쑥에서 분리한 14가지 물질에 대한 화학식을 나타낸 그림이다.
1: (+)-피노레시놀(pinoresinol), 2: 스코폴레틴(scopoletin), 3: 에탄온(ethanone), 4: 5-에피-유데스마-4(15)-엔-1β-6β-디올(5-epi-eudesma-4(15)-ene-1β-6β-diol), 5: 스코파론(scoparone), 6: 피쿠식산(ficusic acid), 7: D-3-메톡시-4-하이드록시-페닐글리콜(D-3-methoxy-4-hydroxy-phenylglycol), 8: 움벨리페론(umbelliferone), 9: 5,4'-디하이드록시-3,7-디메톡시플라본(5,4'-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone), 10: 데카-9-엔-4,6-디인-1,8-디올 1-O-β-D-글루토피라노사이드(deca-9-en-4,6-diyne-1,8-diol 1-O-β-D-glucopyranoside), 11: 푸미라사이드(pumilaside), 12: 사이클로펜타논(cyclopentanone), 13: 7S,7'S, 8R, 8'R-이카리올 A2-9-O-β-D-글루토피라노사이드(7S,7'S, 8R, 8'R-icariol A2-9-O-β-D-glucopyranoside), 14: 투베로닉산(tuberonic acid).
도 3은 사철쑥 유래 14가지 물질의 조골세포 증식 효과를 나타낸 데이터이다.
도 4는 조골세포 ALP(alkaline phophatase) 활성에 미치는 사철쑥 유래 14가지 물질의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 5는 조골세포 콜라겐(collagen) 합성에 미치는 사철쑥 유래 14가지 물질의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 6은 조골세포 골결절(bone nodule) 형성(mineralization)에 미치는 사철쑥 유래 14가지 물질의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 7은 파골세포의 TRAP 발현정도를 염색(위) 및 활성측정(아래)를 통해 사철쑥 유래 14가지 물질이 파골세포의 분화 활성에 미치는 효과를 나타낸 데이터이다.
도 8은 스코파론의 조골세포 증식 촉진효과를 나타낸 데이터이다.
도 9는 조골세포의 ALP 활성에 미치는 스코파론의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 10은 조골세포 콜라겐 합성(collagen synthesis)에 미치는 스코파론의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 11은 조골세포 골결절(bone nodule) 형성(mineralization)에 미치는 스코파론의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 12는 스코파론 추출물의 파골세포에 대한 독성 정도를 나타낸 데이터이다.
도 13은 스코파론의 파골세포 TRAP 활성 억제 효과에 대해 파골세포 TRAP 염색 사진 및 파골세포 계수(counting) 값을 나타낸 데이터이다.
도 14는 파골세포 TRAP 활성 미치는 스코파론의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 15는 스코파론의 파골세포 분화에 의한 골 흡수 억제 효과를 나타낸 데이터이다.
도 16은 파골세포 분화 중 ROS(A), O2(B), H2O2(C) 및 GSH(D) 레벨이 대한 스코파론 효과를 나타낸 데이터이다.
도 17은 파골세포 분화 중 MMP(Mitochondrial membrane potential)에 대한 스코파론의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 18은 TRAF6/Rac1/Nox1/ROS 신호전달 경로에 대한 스코파론의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 19는 Rac1의 상위조절 매개체인 c-Src 및 PI3K 발현 및 활성에 대한 스코파론의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 20은 항산화 효소(카탈라제(Catalase) 및 SOD1) 발현에 대한 스코파론의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 21은 MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase) 시그널 경로 단백질인 JNK, ERK 및 p38의 인산화에 대한 스코파론 효과를 나타낸 데이터이다.
도 22는 스코파론의 c-Fos 및 NFATc1의 발현조절 효과를 나타낸 데이터이다.
도 23은 파골세포 마커인 카텝신 K(Cathepsin K) 및 TRA 발현에 대한 스코파론의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 24는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 제조방법 모식도이다.
도 25는 실험동물의 체중 및 식이효율에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 26은 실험동물의 신장, 간, 자궁에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 27은 실험동물의 BMC(A), BMD(B)에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 28은 실험동물의 혈중 PICP(procollagen type Ⅰ C-terminal peptide) 함량에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 29는 실험동물의 혈중 BALP(Bone alkaline phosphatase) 함량에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 30은 실험동물의 혈중 OC(osteocalcin) 함량에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 31은 실험동물의 혈중 OPG(osteoprotegerin) 함량에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 32는 실험동물의 혈중 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)함량에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과를 나타낸 데이터이다.
도 33은 실험동물의 혈중 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 함량에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과를 나타낸 데이터이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 및 상기 스코파론 함유 사철쑥(artemisia capillaris) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
화학식 1
Figure PCTKR2014010833-appb-I000002
본 발명은 다른 관점에서, 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 및 상기 스코파론 함유 사철쑥(artemisia capillaris) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 및 상기 스코파론 함유 사철쑥(artemisia capillaris) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 골다공증 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 스코파론의 함량은 0.001 내지 20 중량% 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 사철쑥 추출물에 포함되어있는 각 성분들의 골다공증 예방 또는 치료 효과에 대해 확인하기 위해 사철쑥 성분의 분리정제를 수행하였으며, 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 사철쑥 추출물 성분을 분석한 결과, 1: (+)-피노레시놀(pinoresinol), 2: 스코폴레틴(scopoletin), 3: 에탄온(ethanone), 4: 5-에피-유데스마-4(15)-엔-1β-6β-디올(5-epi-eudesma-4(15)-ene-1β-6β-diol), 5: 스코파론(scoparone), 6: 피쿠식산(ficusic acid), 7: D-3-메톡시-4-하이드록시-페닐글리콜(D-3-methoxy-4-hydroxy-phenylglycol), 8: 움벨리페론(umbelliferone), 9: 5,4'-디하이드록시-3,7-디메톡시플라본(5,4'-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone), 10: 데카-9-엔-4,6-디인-1,8-디올 1-O-β-D-글루토피라노사이드(deca-9-en-4,6-diyne-1,8-diol 1-O-β-D-glucopyranoside), 11: 푸미라사이드(pumilaside), 12: 사이클로펜타논(cyclopentanone), 13: 7S,7'S, 8R, 8'R-이카리올 A2-9-O-β-D-글루토피라노사이드(7S,7'S, 8R, 8'R-icariol A2-9-O-β-D-glucopyranoside), 14: 투베로닉산(tuberonic acid)을 분리하였다.
상기 분리된 사철쑥 유래 14가지 물질의 골다공증 예방 또는 치료 효능 여부를 확인하기 위해, 조골세포 증식촉진 효과 및 세포독성(도 3), ALP(alkaline phophatase) 활성(도 4), 콜라겐합성 능력(도 5), 골결절(bone module) 형성(도 6) 및 파골세포 TRAP 활성 정도(도 7)를 분석한 결과, 사철쑥 유래 14가지 물질 대부분이 조골세포의 활성을 촉신시키고, 파골세포의 활성을 억제시키는 효과를 가지고 있는 것을 확인하였으며, 본 발명에서는 사철쑥 유래 14가지 물질 중에서 스코파론(scoparone)을 선별하여 사철쑥 유래 스코파론이 골다공증 예방 또는 치료에 미치는 효과를 알아보는 실험을 수행하였다.
골다공증은 골형성 보다 과다하게 골흡수가 진행되어 발생하는 질환으로, 조골세포의 활성도가 약화되어 골형성이 감소하거나 파골세포의 활성도 강화로 골흡수가 증가되는 경우, 또는 두 가지 요소가 동시에 작용되는 경우에 골대사 질환이이 발생하므로, 본 발명에서는 골다공증 예방 및 치료 효과를 확인하기 위해 조골세포의 활성화 및 파골세포의 분화억제 정도를 측정하였다.
본 발명에서 스코파론이 조골세포의 활성에 미치는 효과를 알아보기 위해, MC3T3-E1 subclone 4 세포를 이용하여 조골세포의 증식 촉진 정도, ALP 활성, 콜라겐 합성(collagen synthesis) 및 골결절(bone nodule) 형성(mineralization)을 확인하였다. 스코파론을 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리한 후, 6일 및 15일간 배양하여 세포 증식 및 세포독성을 확인한 결과, 약간의 세포증식활성을 나타내었으며, 15일 배양기간 동안 세포독성은 관찰되지 않았다 (도 8). 조골세포 ALP 활성의 경우, 1, 10, 20μM 농도로 처리한 스코파론은 각각 15.62unit, 16.44unit 및 18.19 unit로 농도 의존적으로 ALP 활성이 증가하였으며, 양성대조군으로 사용한 17β-estradiol은 분화유도배지를 처리한 세포(분화 6일에 15.60 unit)보다 ALP 활성이 높아진 것을 확인하였다 (도 9).
또한, 조골세포 콜라겐 합성의 경우 스코파론을 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리한 결과, 163.43 내지 181.85%까지 콜라겐 합성이 증가되었으며, 양성대조군으로 사용한 E2(173.04%)와 유사한 콜라겐 합성 효과를 보이는 것을 확인하였다 (도 10). 기존의 여러 연구들에 따르면 조골세포에서 생성되는 I형 콜라겐은 전체 골 단백질의 85~90%를 차지하는 것으로 알려졌는데(Noriyoshi K et al., Endocrinology. 1986), 이는 스코파론이 콜라겐 합성을 촉진하여 골 생성에 영향을 줄 수 있는 것을 확인하였다.
골의 생성은 기질의 증식, 성숙 및 석회화의 세 단계로 이루어지며(Pittenger JJ. et al. Science., 1999), 골결절(Bone nodule)의 형성능은 조골세포 분화에 중요한 표식인자로 알려져 있다. 알리자린(alizarin)은 칼슘(calcium)에 특이적으로 흡착력이 높은 식물성 염료로서 이것은 무기질화된 세포의 세포외 기질에 염색되므로 무기질화된 양과 염색된 정도가 상호 비례하는 것으로 알려져 있다 (Schiller PC, et al, Bone., 2001).
본 발명에서 스코파론을 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리한 결과, 양성대조군과 유사하게(E2; 157.84%) 141.56 내지 154.01%까지 골결절 합성이 증가된 것을 확인하였으며(도 11), 이는 스코파론이 조골세포의 세포외 기질화를 촉진시켜 골 생성에 긍정적인 영향을 줄 수 있는 것으로 판단된다.
본 발명에서 스코파론이 파골세포 분화 활성에 미치는 효과를 알아보기 위해, 스코파론을 1, 2, 5, 10 및 20 μM 농도가 되도록 RAW 264.7 세포에 처리한 후 5일간 배양하여 세포독성을 확인한 결과, 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않은 것을 확인하였다(도 12). 1 내지 20 μM 농도의 스코파론을 처리하여 TRAP 양성인 다핵성 파골세포를 확인한 결과, 스코파론 농도 의존적으로 파골세포 형성이 감소되었으며, TRAP-양성 다핵세포를 계수한 결과 파골세포의 분화정도를 61.69 내지 93.15%로 효과적으로 억제시키는 것을 확인하였으며(도 13), 파골세포의 분화 마커인 TRAP 활성을 측정한 결과, 스코파론 농도 의존적으로 TRAP 활성이 196.70 내지 254.70%로 감소되는 것을 확인하였다 (도 14). 즉, 스코파론이 파골세포 형성과 TRAP 활성을 억제시켜 뼈의 재흡수를 억제함으로써 골다공증 예방 및 치료 효과가 있는 것을 확인하였다.
또한, 파골세포 분화에 의한 골 흡수 활성을 측정한 결과, 스코파론 농도 의존적으로 골 흡수 활성이 192.76 내지 228.64%로 감소되는 것을 확인하였다 (도 15). 이는 스코파론이 파골세포 분화를 억제시켜 골 흡수 활성을 억제함으로써 골 대사(bone metabolism)를 조절하는 것으로 볼 수 있다.
활성산소(ROS) 및 글루타치온(GSH)가 파골세포 분화를 조절하는 것으로 알려져 있어(레퍼), 스코파론에 의한 파골세포 내 ROS, O2, H2O2 및 GSH 레벨의 변화를 DCFH-DA, DHE, DHR123 및 mBCL 형광 프로브(probe)를 이용하여 측정한 결과, RANKL 처리에 의해 증가한 ROS 와 O2 레벨은 스코파론 농도 의존적으로 감소된 것을 확인하였으며, H2O2 와 GSH 레벨에는 영향을 주지 않는 것을 확인하였다 (도 16). 파골세포 분화 과정 중 ROS 특히, O2 발생은 파골세포 분화에 중요한 신호전달자로 작용하며, 스코파론은 이러한 ROS (O2) 발생을 조절하여 파골세포 분화를 억제한다고 볼 수 있다.
스코파론에 의한 파골세포내 MMP(Mitochondrial membrane potential)의 변화를 로다민123(rhodamine123) 형광 프로브를 이용하여 측정한 결과, 파골세포 내 MMP는 분화유도 기간 동안 대조군에 비해 34.94% 감소하였으나, 스코파론을 처리한 경우 35.59 내지 54.47%로 농도 의존적으로 MMP가 증가한 것을 확인하였다 (도 17).
상기 결과를 종합하면 RANKL에 의한 파골세포 분화과정에서 ROS 발생은 mitochondria에서 이루어지며, 스코파론은 RANKL 처리에 의한 MMP의 감소를 막아줌으로써 ROS 발생을 조절하여 파골세포 분화를 억제하는 것으로 볼 수 있다.
본 발명에서 스코파론에 의한 파골세포의 활성 억제 기작을 자세히 알아보기 위해, 파골세포 분화 시그널 관련 단백질 발현 정도 및 활성을 측정하였다. RAW 264.7 세포에 분화유도배지(50 ng/㎖ receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL))와 함께 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하여 2일간 배양한 다음, 단백질을 분리하여 단백질 발현 확인 실험에 사용하였다.
파골세포 분화 과정에서 RANKL의 처리는 TRAF6와 NADPH 산화효소(NADPH oxidase)를 경유하는 신호전달 체계를 통해 세포 내 ROS 발생량을 증가시키고, 이는 파골세포의 분화에 2차적인 중요한 신호전달자로 작용한다고 보고되었으며. TRAF6의 결여나 우성 돌연변이(dominant mutant form)의 발현은 NADNADPH 산화효소의 요소 중 하나인 Rac1의 활성을 억제하고, 이는 Rac1이 TRAF6의 하위기전에서 기능을 하는 파골세포 분화를 조절하는 중요한 매개체임이 보고되었다 (Lee NK. et al. Blood., 2005).
본 발명에서 RANKL로 유도된 파골세포 분화 과정에서 스코파론을 농도별로 처리하였을 때 TRAF6/Rac1/Nox1와 관련된 ROS 발생 신호 분자 조절에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 웨스턴 블랏(Wetstern blotting)을 실시한 결과, 스코파론은 RANKL/RANK 시그널 경로의 최상위 조절자인 TRAF6의 발현을 농도 의존적으로 감소시키고, TRAF6의 하위기전 매개체인 Rac1의 활성도 감소시키는 것을 확인하였다 (도 18). 이러한 결과는 스크파론이 TRAF6의 발현을 조절하여, NADPH 산화효소의 세포질 서브유닛(cytoplasmic subunit)인 Rac1의 활성형태인 GTP-Rac1의 발현을 감소시켜, Rac1의 세포막으로의 이동(translocation)을 방해하여 NADPH 산화효소의 복합체 형성을 억제하는 것으로 ROS의 발생을 조절하는 것으로 볼 수 있다.
Src 패밀리중 하나인 c-Src는 NADPH 산화효소의 세포질 서브유닛(cytoplasmic subunit) 중 하나인 p47phox를 인산화 시키며, p47phox의 인산화는 세포막 산화 요소(membrane oxidases componet)에 결합을 촉진하고, PI3K 및 Rac1의 활성화에 관여한다고 보고되어져 있다 (Cai H. et al. Trends in Pharm, 2003). 또한, 파골세포 내 TRAF6/c-Src/PI3K를 경유하는 신호 전달체계는 세포골격 재구성(cytoskeletal reorganization) 및 세포사멸 저해(anti-apoptosis)를 통해 파골세포의 생존기간을 조절하는 것으로 보고 되었다 (Steven L, et al. Nat. Rev. Genet, 2003).
이는 c-Src와 PI3K 신호전달 체계는 파골세포의 생존 조절뿐 아니라, TRAF6/Rac1/Nox1와 관련된 ROS 발생 신호 분자 조절에서 Rac1의 활성화에 관여하는 중요한 매개체인 것으로 보이며, 스코파론을 농도별로 처리하였을 때 c-Src 및 PI3K의 발현 및 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 웨스턴 블랏(Western blotting)을 실시한 결과, 스코파론 농도 의존적으로 c-Src의 발현이 감소되는 것을 확인하였으며, c-Src의 하위기전으로 알려진 PI3K의 인산화를 억제하는 것으로 확인되었다 (도 19). 이러한 결과는 스코파론이 c-Src의 발현을 감소시켜 PI3K의 인산화를 억제하여 Rac1의 활성을 조절하는 것으로 볼 수 있다.
생체 내 과도한 활성산소(ROS) 발생에 의한 산화적 스트레스(oxidative stress)는 세포 또는 조직 내 항산화제 (antioxidant)와 산화제 (oxidant)의 균형이 깨짐으로써 일어나는 생체현상으로 정의할 수 있다. 카탈라제(Catalase), 글루타치온(glutathione; GSH), 글루타치온 과산화효소(glutathione peroxidase; GPX) 및 과산화물제거효소(SuperOxide Dismutase-1; SOD-1) 등 체내 존재하는 항산화 효소들은 체내 방어 시스템을 맡고 있다.
스코파론이 RANKL/RANK 신호 전달 체계를 통해 발생되는 ROS와 관련하여 파골세포 내 항산화 효소 (카탈라제(Catalase) 및 SOD1)의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 스코파론에 의해 RANKL 처리에 의해 감소된 카탈라제(Catalase) 및 SOD1의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며(도 20), 스코파론은 항산화 효소(카탈라제(Catalase) 및 SOD1)의 발현을 증가시켜 발생된 ROS를 소거하는 두 가지 신호 전달 경로를 통해 파골세포 내 ROS 발생을 조절하는 것을 확인하였다.
MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase) 경로는 스트레스, 열 충격(heat shock), 방사선(radiation) 등과 같은 일련의 자극에 의해 활성화되어 염증반응, 세포사멸, 세포분화 등 다양한 생물학적 반응을 유도한다고 알려져 있다 (Ono K, et al. Cell signal, 2000). 파골세포 내에서는 RANKL과 RANK의 결합으로 TRAF계열 단백질 결합이 촉진되고, RANKL 시그널이 전달되어 MAPK 시그널에 관련된 JNK(c-Jun N-terminal kinase), p38, ERK(Extracellular signal-regulated kinases)와 같은 신호전달 단백질이 활성화되며, 이들은 파골세포 분화에 필수적인 NF-kB, NFATc1, c-Fos를 유도하여 파골전구세포에서 파골세포의 분화 및 유지를 조절한다고 알려져 있다 (Galibert L, et al. J Biol Chem. 1998).
스코파론이 RANKL/RANK 신호 전달 체계를 통해 활성화되는 JNK, ERK 및 p38의 발현 및 하위 신호분자인 c-Fos 및 NFATc1에 미치는 영향을 알아보기 위해 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 스코파론은 RANKL/TRAF6/Rac1/Nox 신호전달 경로를 통해 발생된 oxidative stress를 통해 활성화된 JNK, ERK 및 p38의 인산화를 억제하는 것을 확인하였으며(도 21), JNK와 ERK의 활성화에 의해 조절되는 c-Fos의 발현을 감소시켜, 이들에 의해 조절되는 NFATc1의 발현을 조절하는 것을 확인하였다 (도 22).
뼈의 항상성(homeostasis)은 뼈를 구성하는 단백질을 생성하고, 미네랄 축적을 유도하는 조골세포(osteoblast)와 뼈의 표면에 단백질 분해 효소 분비 및 뼈 구성성분을 파괴하는 파골세포(osteoclast)에 의해 유지된다 (Boisvert CA. et al, Nature, 2005). 파골세포에서 분비되는 TRAP과 카텝신 K는 파골세포에서 분비되는 단백질 분해 효소로 알려져 있다. 특히, 카텝신 K는 파골세포에서만 선택적으로 발현되는 중요한 시스테인 단백 분해 효소로 뼈의 구성성분이 단백질과 미네랄을 분해하여 뼈를 파괴하는 역할을 한다 (Kim JM et al, Int J Mol Med, 2007).
스코파론이 뼈 흡수에 직접적으로 작용하는 효소들인 카텝신 K 및 TRAP에 미치는 영향을 알아보기 위해 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 스코파론에 의해 파골세포에서 분비되는 카텝신 K 및 TRAP의 발현이 감소되는 것을 확인하였다 (도 23).
결론적으로, 스코파론의 뼈 흡수 억제 작용은 TRAF6/Rac1/Nox1으로 이어지는 시그널 경로 조절을 통해 파골세포 분화 과정 중 발생하는 ROS를 감소시키고, 스트레스, 열 충격(heat shock), 방사선(radiation) 등과 같은 일련의 자극(ROS)에 민감한 MAPKs 경로 활성을 억제하여 파골세포에 의한 뼈 흡수 작용을 억제하므로, 스코파론이 골다공증 예방 및 치료에 효과가 있는 것을 증명하였다.
본 발명의 스코파론 또는 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 사철쑥 시료에 50%(v/v) 주정이 포함된 추출용매를 이용하여 추출하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 제조방법은 다음과 같다 : (a) 사철쑥 시료를 잘게 세절한 후, 50% 주정(v/v)을 포함하는 1차 추출용매를 첨가하고 55 내지 65℃로 가열하여 1차 추출하는 단계; (b) 상기 1차 추출물을 회수하여 농축시킨 다음, 50% 주정(v/v)을 포함하는 2차 추출용매를 첨가하고 45 내지 55℃로 가열하여 2차 추출하는 단계; 및 (c) 상기 2차 추출물을 회수한 다음, 농축 및 건조시켜 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 수득하는 단계를 포함한다 (도 24).
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 1차 추출용매는 사철쑥 시료와 1:7 내지 1:9 비율이 되도록 첨가하여 4시간 내지 8시간 추출하는 것을 특징으로 하며, (b) 단계에서 2차 추출용매는 사철쑥 시료와 1:4 내지 1:6 비율이 되도록 첨가하여, 4시간 내지 18시간 추출하는 것을 특징으로 한다. 또한, (c) 단계에서 수득한 사철쑥 추출물에는 5.0 내지 7.0 ㎎/ｇ의 스코파론이 포함된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 경북 영천에서 구입한 사철쑥 시료를 5개로 나누어(4㎏) 잘게 세절한 후, 사철쑥 시료와 1:8의 비율이 되도록 50% 주정(v/v)을 포함하는 1차 추출용매 32ℓ를 첨가하여 60±2℃에서 6시간 동안 추출하여 1차 추출액을 회수하였다. 1차 추출하고 남은 사철쑥 시료와 1:5의 비율이 되도록 50% 주정(v/v)을 포함하는 2차 추출용매 20ℓ를 첨가하여 50±2℃에서 16시간 동안 추출하여 2차 추출액을 회수하였다. 상기 1차 추출물 및 2차 추출물은 진공 또는 감압농축하여 회수하였으며, 농축된 1차 추출물 및 2차 추출을 혼합하여 동결건조 또는 분무건조시켜 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물을 수득하였으며, 각 추출물을 동결건조하여 추출농축액의 농축된 양을 측정한 결과, 평균 수율은 13.8%로 나타났다 (표 2).
본 발명의 방법으로 추출한 사철쑥 추출물에 포함된 스코파론의 함량을 HPLC 분석한 결과(표 3 및 표4), 대조군의 경우 약 0.12%의 스코파론이 포함되어 있었으나, 실시예 5-1의 방법으로 추출한 5종의 사철쑥 추출물에는 평균 0.54 내지 0.67%의 스코파론이 함유된 것을 확인하였다.
본 발명의 방법으로 분리한 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 골다공증 예방 및 치료 효과를 확인하기 위해, 난소 절제(ovariectomized)와 가짜수술(sham operation)를 실행한 생후 8주령의 암컷 Sprague-Dawley (SD) rat을 표 5에 나타낸 바와 같이, 5개 그룹으로 분리하였으며(n=12 per group), 실험동물에게 칼슘결핍식이를 총 84일간 공급하면서, 양성대조군으로 17β-estradiol (E2) 50μg/㎏을 그리고 사철쑥 추출물 125㎎/㎏와 250㎎/㎏을 매일 경구투여로서 정해진 양을 12주간 공급하였다.
12주간의 실험기간 동안 실험동물의 체중을 측정한 결과, I군, II군 (OVA)과 III군 (OVA+E2 50μg/㎏), Ⅳ군(OVA+ACE 125㎎/㎏), Ⅴ군 (OVA+ACE 250㎎/㎏) 간에 유의적인 차이가 없었으나, 체중의 경우, 난소절제에 의한 지방 축척률이 증가하면서 체중증가가 나타났다. 하지만, 사철쑥 추출물에 의한 독성 및 섭취거부가 없으며 실험동물의 영양대사에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다 (도 25).
실험동물의 신장, 간, 자궁 및 대퇴부 뼈 (BMC, BMD)에 미치는 스코파론 포함 사철쑥 추출물의 효과를 확인하기 위해,실험이 종료되는 시점 (12주)에 신장, 간 및 자궁을 적출하여 분석하였으며, 좌측 및 우측 대퇴부 뼈를 적출하여 분석한 결과, 신장 및 간 무게는 각 그룹별 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 자궁 무게의 경우 양성대조군인 III군에서는 자궁 무게가 약간 증가하였으나, 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물을 처리한 그룹(Ⅳ군 및 Ⅴ군)에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다 (도 26).
대퇴부 뼈의 무게, 길이 및 두께를 측정한 결과, II군과 III군, Ⅳ군 및 Ⅴ군 간의 유의적 차이는 나타나지 않았으나, 대퇴부 뼈의 골밀도와 무기질 함량은 II군(OVA)이 I군(Sham)에 비해 감소하였으나 양성대조군(OVA+E2 50μg/㎏)과 사철쑥 추출물 투여군(Ⅳ: OVA+ACE 125㎎/㎏, Ⅴ: OVA+ACE 250㎎/㎏)에서는 유의적으로 증가한 것을 확인하였다 (도 27).
이는 사철쑥 함유 추출물이 간 및 신장에 독성을 나타내지 않은 것을 확인하였으며, 자궁무게 결과 양성대조군(III: Ova+E2 50μg/㎏)으로 사용한 17β-estradiol의 경우 난소절제에 의한 자궁의 퇴화를 감소시키지만, 사철쑥 추출물 투여군(Ⅳ: OVA+ACE 125㎎/㎏, Ⅴ: OVA+ACE 250㎎/㎏)의 경우 자궁 무게가 유의적 차이가 없는 것으로 보아 호르몬으로서의 효과는 없는 것으로 판단된다. 또한 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 난소 절제한 쥐에 12주간 경구 투여하였을 때 대퇴부 골밀도와 무기질 함량이 난소 절제하지 않은 쥐의 수준으로 회복된 것으로 보아 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 갱년기 여성의 골다공증 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
PICP(procollagen type Ⅰ C-terminal peptide)는 조골세포에서 전구물질인 프로콜라겐(procollagen)으로 분비된 후 콜라겐(collagen)이 되기 위해 단백분해 효소에 의해 말단부가 절단되면서 생성되기 때문에 뼈 형성을 반영하는 표지자로 사용할 수 있다 (Calvo. MS. et al. Endocr Rev., 1996). 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물의 PICP 조절효과를 확인하기 위해, 실험동물의 혈중 PICP를 측정한 결과, Ⅱ군(OVA)에 비해 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏)과 사철쑥 추출물 투여군인 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)의 PICP 수준이 유의적으로 증가된 것을 확인하였으며(도 28), 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물의 투여가 타입Ⅰ 콜라겐(typeⅠ collagen) 형성을 증가시켜 뼈 형성에 도움을 줄 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물의 BALP(Bone alkaline phosphatase) 조절효과를 확인하기 위해, 실험동물의 혈중 BALP를 측정한 결과, II군(OVA)에 비해 III군(OVA+E2 50μg/㎏), Ⅳ군(OVA+ACE 125㎎/㎏) 및 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)에서 BALP 활성이 유의적으로 증가된 것으로 나타났다 (도 29). BALP는 뼈에 특이적인(specific) 효소로 조골세포 분화 고정 중 분비되며, 뼈의 재형성에 관여하는 것으로, 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물에 의한 BALP분비 증가는 뼈의 재형성을 촉진하여 골다공증 예방 및 치료에 기여할 수 있는 것을 확인하였다.
오스테오칼신(osteocalcin; OC)은 조골세포에서 형성된 후 골기질 속에 침착되며 파골세포의 뼈 흡수 signal로 작용한다. 뼈의 무기질화에 관여하는 것으로 알려진 오스테오칼신은 새로 형성되는 것의 일부가 혈액으로 방출되기 때문에 뼈 형성 정도를 알 수 있다 (Calvo. MS. et al. Endocr Rev., 1996). 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물의 오스테오칼신 조절효과를 확인하기 위해, 실험동물의 혈중 오스테오칼신(OC) 농도를 측정한 결과, 난소절제군인 II군(OVA)에서 증가된 오스테오칼신 수준이 스코파론 함유 사철쑥 추출물 투여군인 Ⅳ군(OVA+ACE 125㎎/㎏)과 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)에서 유의적인 감소가 관찰되었다 (도 30). 이는 스코파론 함유 사철쑥 추출에 의해 난소절제로 인해 유발되는 골교체율(bone turnover)이 감소된 것이다.
OPG(osteoprotegerin)는 RANKL에 결합하는 가용성 미끼 수용체(soluble decoy receptor)로서 RANKL 시그널을 차단하는 효과를 가지며 따라서 성숙한 파골세포로의 분화를 저해할 수 있으므로, 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 OPG 조절 효과를 알아보기 위해 실험동물의 혈중 OPG 농도를 측정한 결과, 난소절제군인 II군(OVA)에 비해 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏) 및 스코파론 함유 사철쑥 추출물 투여군인 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)에서 OPG의 분비가 증가된 것을 확인하였다 (도 31). 즉, 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물은 OPG의 분비를 증가시켜 RANK/RANKL 시그널을 차단시키고, 성숙한 파골세포로의 분화를 억제함으로써 파골세포에 의한 뼈 흡수를 감소를 시켜 뼈의 손실을 감소시킬 수 있는 것을 확인하였다.
RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)은 RANK와 결합하여 조혈모세포에서 성숙한 파골세포로의 분화를 유도하며 성숙한 파골세포의 생존기간을 증가시키므로, 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 RANKL 조절 효과를 알아보기 위해 실험동물의 혈중 RANKL 농도를 측정한 결과, 난소절제군인 II군(OVA)에 비해 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏)과 소코파론 함유 사철쑥 투여군인 Ⅳ군(OVA+ACE 125㎎/㎏)과 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)에서 RANKL 생성이 유의적으로 감소된 것을 확인하였다 (도 32). 이는 스코파론 함유 사철쑥 추출물에 의해 RANKL 생성이 감소되면 RANK/RANKL 시그널이 차단되어 성숙한 파골세포로의 분화가 억제되고, 결국 파골세포에 의한 뼈 흡수를 감소시켜 골다공증 예방 및 치료에 도움을 주는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 조절 효과를 알아보기 위해 실험동물의 혈중 TRAP 농도를 측정한 결과, 난소절제군인 II군(OVA)에서 TRAP 함량이 증가하였으나, 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏), 스코파론 함유 사철쑥 추출물 투여군인 VI군(OVA+ACE 125㎎/㎏) 및 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)은 II군에 비해 TRAP 함량이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다 (도 33). 즉 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 난소절제로 인해 유발되는 파골세포의 TRAP 분비를 감소시켜 골다공증 예방 및 치료에 도움을 주는 것을 확인하였다.
ICTP(cross-linked C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen)는 뼈 흡수 중에 콜라겐 N말단부와 C말단부의 짧은 부분이 파골세포에 의해 분해되어 혈액 내로 방출되는 것으로, 파골세포에 의한 뼈 흡수율을 반영하므로(Mora S. et al. Calcif Tissue Int., 1998), 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 ICTP 조절 효과를 알아보기 위해 실험동물의 혈중 ICTP 농도를 측정한 결과, I군(Sham)에 비해 난소절제군인 II군(OVA)의 혈중 ICTP 농도는 유의적으로 증가하였으나, 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏) 및 스코파론 함유 사철쑥 추출물 투여군인 Ⅴ군 OVA+ACE 250㎎/㎏)은 II군(OVA)에 비해 ICTP 수준이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 33).
즉, 본 발명의 방법으로 제조한 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 뼈의 골밀도 및 무기질 함량을 증가시키는 효과가 있으며, 타입Ⅰ 콜라겐(typeⅠ collagen) 형성 및 BALP 분비를 증가시켜 뼈의 형성을 촉진하여 골다공증 예방 및 치료에 도움을 주는 것을 확인하였다. 또한, 난소절제로 야기되는 골교체율(bone turnover)을 감소시키는 효과가 있으며, OPG 분비, RANK/RANKL 시그널, TRAP 및 ICTP를 감소시켜, 성숙한 파골세포로의 분화를 억제함으로써 파골세포에 의한 뼈 흡수를 감소시키는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 사철쑥 유래 스코파론을 유효성분으로 함유하는 뼈 건간 증진용 조성물은 조골세포의 활성을 촉진시키고, 파골세포의 골 흡수를 억제시켜 골다공증 예방 및 치료에 도움을 주는 것을 확인하였다.
본 발명의 골다공증 예방 및 치료용 조성물은 이미 사용되고 있는 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적㎎/㎏ 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 스코파론 또는 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.001 내지 200㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.01 내지 100㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 경구 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 개선용 건강기능 식품에 관한 것이다.
화학식 1
Figure PCTKR2014010833-appb-I000003
본 발명에 있어서, 골다공증 예방 및 개선용 건강기능 식품에 함유된 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 함량은 0.001 내지 20 중량% 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 '건강기능 식품'이란, 일반 식품에 본 발명의 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 '건강기능 식품'이라 정의한다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제,안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0.01 내지 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 사철쑥 성분의 분리정제 및 사철쑥 성분의 뼈 건강 증진 효능 확인
1-1 : 사철쑥 성분의 분리정제
사철쑥 추출물에 포함되어 있는 각 성분들의 골다공증 예방 및 치료 효과에 대해 확인하기 위해 사철쑥 성분의 분리정제를 수행하였다.
경북 영천에서 수집한 사철쑥 2.5㎏을 70% 메탄올(MeOH)로 3회 열탕 추출하여 추출물 185ｇ을 얻었다. 얻어진 메탄올 추출물을 증류수(H2O)에 현탁하여 사염화탄소(CH2Cl2)와 에틸아세테이트(ethylacetate; EtOAc)를 이용하여 차례로 분획하여 사염화탄소 분획, 에틸아세테이트 분획, 증류수 분획을 얻었다. 사염화탄소 분획을 헥산:에틸아세테이트(Hexane:EtOAc)가 1:0 내지 0:1로 혼합된 구배(gradient)용매를 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silicagel column chromatography)를 실시하여 2개의 분획(Fr. 1, Fr. 2)을 얻었으며, Fr. 2를 아세톤:증류수(Acetone:H2O)가 1:0 내지 0:1로 혼합된 전개용매를 이용하여 세파텍스 LH20 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH 20 column chromatography)를 실시하여 3개의 분획 (Fr. 2A - Fr. 2C)를 얻었다. 최종적으로 Fr. 2A분획에서 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 을 분리정제 하였으며, Fr. 2B 분획에서 화합물 9를 분리정제하였다.
또한, 증류수 분획(140ｇ)을 증류수:메탄올이 1:0 내지 0:1로 혼합된 구배(gradient)용매를 이용하여 다이아 HP20 컬럼 크로마토그래피(Diaion HP 20 column chromatography)를 수행하여 5개의 분획 (Fr. 7 내지 Fr. 11)를 얻었으며, Fr. 9에서 화합물 10, 11, 12, 13, 14를 분리정제하였다 (도 1).
표 1
Figure PCTKR2014010833-appb-T000001
표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 사철쑥 추출물 성분을 분석한 결과, 1: (+)-피노레시놀(pinoresinol), 2: 스코폴레틴(scopoletin), 3: 에탄온(ethanone), 4: 5-에피-유데스마-4(15)-엔-1β-6β-디올(5-epi-eudesma-4(15)-ene-1β-6β-diol), 5: 스코파론(scoparone), 6: 피쿠식산(ficusic acid), 7: D-3-메톡시-4-하이드록시-페닐글리콜(D-3-methoxy-4-hydroxy-phenylglycol), 8: 움벨리페론(umbelliferone), 9: 5,4'-디하이드록시-3,7-디메톡시플라본(5,4'-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone), 10: 데카-9-엔-4,6-디인-1,8-디올 1-O-β-D-글루토피라노사이드(deca-9-en-4,6-diyne-1,8-diol 1-O-β-D-glucopyranoside), 11: 푸미라사이드(pumilaside), 12: 사이클로펜타논(cyclopentanone), 13: 7S,7'S, 8R, 8'R-이카리올 A2-9-O-β-D-글루토피라노사이드(7S,7'S, 8R, 8'R-icariol A2-9-O-β-D-glucopyranoside), 14: 투베로닉산(tuberonic acid)를 분리하였다.
상기 분리된 사철쑥 유래 14가지 물질의 골다공증 예방 및 치료 효능 여부를 확인하기 위해, 조골세포 증식촉진 효과, 세포독성, ALP(alkaline phophatase) 활성, 콜라겐합성 능력, bone module 형성 및 파골세포 활성 정도를 분석하였다.
1-2 : 사철쑥 유래 14가지 물질의 조골세포 증식촉진 효능 및 세포독성 분석
MC3T3-E1 subclone 4 세포(조골세포, ATCC, No. CRL-2593)를 24-웰 플레이트(well plate)에 5×104 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 각 웰에 사철쑥 유래 14가지 물질이 1μM, 10μM이 되도록 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 48시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 5㎎/㎖의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)용액을 넣은 후 4시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. MTT용액을 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척한 후, 300㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 처리하여 세포를 용해시켰다. 용해된 상등액 200㎕씩을 96-웰 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 리더로 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 1μM 및 10μM의 농도로 처리한 사철쑥 유래 14종 물질 중 7, 8, 9 번을 제외한 모든 물질이 대조군에 비해 조골세포의 증식을 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였다 (도 3).
1-3 : 조골세포 ALP(alkaline phophatase) 활성에 미치는 사철쑥 유래 14가지 물질의 효능 측정
MC3T3-E1 subclone 4 세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 5×104 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(10mM β-glycerolphosphate, 50 μg/㎖ ascorbic acid)로 배지를 교환한 뒤 24시간 배양 후 사철쑥 유래 14가지 물질을 10μM로 처리하였다. 3일 간격으로 사철쑥 유래 14가지 물질이 포함된 배지로 교환해주면서 총 6일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척하고, 100㎕의 0.1% Triton X-100를 첨가하여 37℃에서 30분간 용해(lysis)시켰다. 용해된 세포를 14000rpm, 4℃ 조건에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액 5㎕는 단백질 정량에 사용하였으며, 상등액 30㎕는 1mM MgCl2와 6mM p-nitrophenyl phosphate가 포함된 0.5M Tris-HCl buffer(pH 9.8) 70㎕를 96-웰 플레이트에 각각 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 100㎕의 0.1N NaOH를 넣어 반응을 정지시킨 다음 ELISA reader로 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
0, 10, 50, 100, 200 그리고 500nM의 4-nitrophenol을 이용하여 검정선 작성하였으며, alkaline phosphatase 활성은 세포 수에 따라 영향을 받을 수 있으므로 총 단백질 양을 측정하여 나누어 줌으로써 단위 세포 수에 대한 alkaline phosphatase의 활성을 계산하였고 alkaline phosphatase 활성은 1unit (nM PNPP/mg of protein/min)으로 표시하였다.
그 결과, 분화유도배지로 분화를 유도한 MC3T3-E1 subclone 4 세포의 경우 분화유도배지를 처리하지 않은 세포에 비해 10.63unit까지 ALP 활성이 증가하였으며, 사철쑥 유래 14가지 물질들 중 2, 5 및 9번 시료가 11.06 ~ 12.13 unit까지 ALP 활성을 증가시키는 것을 확인하였다 (도 4).
1-4 : 조골세포 콜라겐(collagen) 합성에 미치는 사철쑥 유래 14가지 물질의 효능 측정
MC3T3-E1 subclone 4 세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 5×104 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(10mM β-glycerolphosphate, 50μg/㎖ ascorbic acid)로 배지를 교환한 뒤 24시간 배양 후 사철쑥 유래 14가지 물질을 50μM 이 되도록 처리하였다. 3일 간격으로 사철쑥 유래 14가지 물질이 포함된 배지로 교환해주면서 총 8일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척하고, 500㎕의 Bouin's fluid 용액으로 37℃에서 1시간 동안 고정시킨 후 다시 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척하였다. 그 후, 0.1% Direct red 80 (Sirius red F3BA) 용액으로 1시간 동안 염색한 다음, Acidic water를 이용하여 염색되지 않은 dye를 제거하고 500㎕의 0.1N NaOH 용액을 처리하고, 200㎕를 96-웰 플레이트로 옮겨 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 분화유도배지로 분화를 유도한 MC3T3-E1 subclone 4 세포의 경우 분화유도배지를 처리하지 않은 세포에 비해 131.47%까지 콜라겐 합성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 사철쑥 유래 14가지 물질을 50 μM 농도로 처리한 결과 1, 4, 9번을 제외한 대부분의 물질에 의해 콜라겐 합성이 증가한 것을 확인하였다 (도 5). 이 같은 결과는 사철쑥에서 분획한 대부분의 물질들이 조골세포의 콜라겐 생성을 촉진시켜 뼈 생성에 긍정적인 영향을 줄 수 있는 것으로 판단된다.
1-5 : 조골세포 골결절(bone nodule) 형성(mineralization)에 미치는 사철쑥 유래 14가지 물질의 효능 측정
MC3T3-E1 subclone 4 세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 5×104 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(10mM β-glycerolphosphate, 50μg/㎖ ascorbic acid)로 배지를 교환한 뒤 24시간 배양 후 사철쑥 유래 14가지 물질을 50μM 이 되도록 처리하였다. 3일 간격으로 사철쑥 유래 14가지 물질이 포함된 배지로 교환해주면서 총 15일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척하고, 500㎕의 PBS (pH 7.4) 용액으로 4℃에서 1시간 동안 고정시킨 후 다시 500㎕ 증류수로 세포를 2회 세척하였다. 그 후, 40mM 알리자린 레드 S(Alrizarin red S; pH 4.2)용액으로 10분 동안 염색한 다음, 500㎕ 증류수를 이용하여 염색되지 않은 dye를 제거하였다. 500㎕의 10% 세틸피리디움클로라이드 (cetylpyridinium chloride)를 가하여 녹인 다음, 200㎕를 96-웰 플레이트로 옮겨 ELISA reader로 562 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 분화유도배지로 분화를 유도한 MC3T3-E1 subclone 4 세포의 경우 분화유도배지를 처리하지 않은 세포에 비해 142.5 %까지 골결절(bone nodule) 형성이 증가하였으며, 사철쑥에서 분획한 14가지 중 1번과 13번 제외한 대부분의 물질은 분화를 유도한 군에 비해 골결절(bone nodule) 형성을 증가시키는 것을 확인하여(도 6), 사철쑥에서 분획한 14가지 물질들이 조골세포의 세포외 기질화를 촉진시켜 뼈 생성에 도움을 주는 것을 확인할 수 있었다
1-6 : 파골세포 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색과 활성에 미치는 사철쑥에서 분리된 14가지 물질의 효과
RAW 264.7 세포(파골세포, ATCC, No. TIB-71)를 24-웰 플레이트(well plate)에 1×105 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(50ng/㎖ receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL))와 함께 사철쑥 유래 14가지 물질이 5μM가 되도록 처리하였다. 2일 간격으로 사철쑥 유래 14가지 물질이 포함된 배지로 교환해주면서 총 5일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 1회 세척하고, 4% 포름알데하이드(formaldehyde)으로 10분, 에탄올/아세톤(ethanol/acetone; 1:1)으로 1분 동안 처리하여 세포를 고정시켰다. 그 다음, 500㎕의 증류수를 이용하여 2회 세척후 백혈구 산성 인산화효소 키트(Leukocyte Acid Phosphatase Kit) 387-A(Sigma, 미국)을 이용하여 TRAP 염색을 수행하였다.
TRAP 활성은 RAW 264.7 세포를 염색과정과 동일하게 에탄올/아세톤까지 처리한 후, 증류수로 2회 세척하고 10mM 주석산나트륨(sodium tartrate) 및 5mM ρ-니트로페닐포스페이트(ρ-nitrophenylphosphate)가 포함된 50mM 시트레이트 버퍼(citrate buffer; pH 4.5)를 500㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 효소 반응액을 새로운 플레이트에 100㎕씩 분주하고 0.1N NaOH로 반응을 중지시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
사철쑥에서 분리한 14가지 물질을 5 μM의 농도로 처리하였을 때, 4번과 12번 물질을 제외한 대부분 물질은 분화유도군(196.85%)에 비해 TRAP 활성을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다 (도 7).
본 발명에서는 사철쑥에서 분리한 14가지 물질 중에서 조골세포의 활성을 촉진시키고 파골세포의 활성은 억제시키는 효과를 가지는 스코파론 물질을 선별하였으며, 이후 사철쑥 유래 스코파론이 뼈 건강에 미치는 효과를 알아보는 실험을 수행하였다.
실시예 2: 조골세포 분화 활성에 미치는 사철쑥 유래 스코파론의 효과
2-1 : 스코파론의 조골세포 증식 촉진 및 세포독성 분석
MC3T3-E1 subclone 4 세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 5×104 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 각 웰에 스코파론이 0, 1, 10, 20μM이 되도록 처리한 후 6일, 15일 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 각 웰 당 5㎎/㎖의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)용액을 넣은 후 4시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. MTT용액을 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척한 후, 300㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 처리하여 세포를 용해시켰다. 용해된 상등액 200㎕씩을 96-웰 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 리더(ELISA reader)로 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
스코파론을 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리한 후, 6일 및 15일간 배양하여 세포 증식 및 세포독성을 확인한 결과, 약간의 세포증식활성을 보였으며, 15일 배양 기간 동안 세포독성은 관찰되지 않았다 (도 8). 이후 진행될 활성평가에서 1 내지 20 μM 농도의 스코파론을 설정하여 진행하였다.
2-2 : 조골세포 ALP 활성에 미치는 스코파론의 효능 측정
MC3T3-E1 subclone 4 세포(세포 정보)를 24-웰 플레이트(well plate)에 5×104 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(10mM β-glycerolphosphate, 50μg/㎖ ascorbic acid)로 배지를 교환한 뒤 24시간 배양 후 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하였다. 3일 간격으로 스코파론이 포함된 배지로 교환해주면서 총 3일, 6일, 9일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척하고, 100㎕의 0.1% Triton X-100를 첨가하여 37℃에서 30분간 용해(lysis)시켰다. 용해된 세포를 14000rpm, 4℃ 조건에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액 5㎕는 단백질 정량에 사용하였으며, 상등액 30㎕는 1mM MgCl2와 6mM p-nitrophenyl phosphate가 포함된 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 9.8) 70㎕를 96-웰 플레이트에 각각 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 100㎕의 0.1N NaOH를 넣어 반응을 정지시킨 다음 ELISA reader로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 0, 10, 50, 100, 200 그리고 500nM의 4-nitrophenol을 이용하여 검정선 작성하였으며, alkaline phosphatase 활성은 세포 수에 따라 영향을 받을 수 있으므로 총 단백질 양을 측정하여 나누어 줌으로써 단위 세포 수에 대한 alkaline phosphatase의 활성을 계산하였고 alkaline phosphatase 활성은 1unit (nM PNPP/mg of protein/min)으로 표시하였다.
그 결과, 양성대조군으로 사용한 17β-estradiol은 분화유도배지를 처리한 세포에 비해 분화 6일에 15.60unit까지 활성을 증가시켰으며, 1, 10, 20μM 농도로 처리한 스코파론은 각각 15.62unit, 16.44unit 및 18.19unit로 농도 의존적으로 ALP 활성이 증가하는 것을 확인하였다 (도 9). 분화 9일째의 경우, ALP 활성은 6일째에 비해 각 군 모두 감소하는 경향을 보였는데, 이는 골결절(bone nodule)의 형성으로 인한 것으로 판단되며, 이는 스코파론이 조골세포의 분화를 유도하여 조골세포의 석회화에 관여할 수 있을 것으로 판단된다.
2-3 : 조골세포 콜라겐 합성 (collagen synthesis)에 미치는 스코파론의 효과
MC3T3-E1 subclone 4 세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 5×104 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(10mM β-glycerolphosphate, 50μg/㎖ ascorbic acid)로 배지를 교환한 뒤 24시간 배양 후 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하였다. 3일 간격으로 스코파론이 포함된 배지로 교환해주면서 총 8일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척하고, 500㎕의 Bouin's fluid 용액으로 37℃에서 1시간 동안 고정시킨 후 다시 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척하였다. 그 후, 0.1% Direct red 80 (Sirius red F3BA) 용액으로 1시간 동안 염색한 다음, acidic water를 이용하여 염색되지 않은 dye를 제거하고 500㎕의 0.1 N NaOH 용액을 처리하고, 200㎕를 96-웰 플레이트로 옮겨 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 분화유도배지로 분화를 유도한 MC3T3-E1 subclone 4 세포의 경우 분화유도배지를 처리하지 않은 세포에 비해 154.45%까지 콜라겐 합성이 증가된 것을 확인하였으며, 양성대조군으로 사용된 E2의 경우 173.04% 까지 콜라겐 합성이 증가되었다. 스코파론을 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리한 결과, 163.43 내지 181.85%까지 콜라겐 합성이 증가된 것을 확인하였다 (도 10).
2-4 : 조골세포 골결절(bone nodule) 형성(mineralization)에 미치는 스코파론의 효과
MC3T3-E1 subclone 4 세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 5×104 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(10mM β-glycerolphosphate, 50μg/㎖ ascorbic acid)로 배지를 교환한 뒤 24시간 배양 후 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하였다. 3일 간격으로 스코파론이 포함된 배지로 교환해주면서 총 15일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척하고, 500㎕의 70% 에탄올로 4℃에서 1시간 동안 고정시킨 다음, 500㎕의 증류수로 세포를 2회 세척하였다. 40mM 알리자린 레드 S(Alrizarin red S; pH 4.2) 용액으로 10분 동안 염색한 후 500㎕의 증류수를 이용하여 염색되지 않은 dye를 제거하고 500㎕의 10% 세틸피리니늄클로라이드(cetylpyridinium chloride) 용액을 가하여 녹인 다음, 200㎕를 96-웰 플레이트로 옮겨 ELISA reader로 562nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 분화유도배지로 분화를 유도한 MC3T3-E1 subclone 4 세포의 경우 분화유도배지를 처리하지 않은 세포에 비해 121.74%까지 골결절 형성이 증가된 것으로 나타났으며, 양성대조군으로 사용한 E2의 경우 157.84% 까지 골결절 형성이 증가하였다 (도 11). 스코파론을 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리한 결과, 141.56 내지 154.01%까지 골결절 합성이 증가되었으며, 이는 스코파론이 조골세포의 세포외 기질화를 촉진시켜 골 생성에 긍정적인 영향을 줄 수 있는 것으로 판단된다.
실시예 3: 파골세포 분화 활성에 미치는 스코파론의 효과 및 작용기전
3-1 : 스코파론 추출물의 파골세포 독성 분석
RAW 264.7 세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 1×105 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 각 웰에 스코파론이 0, 1, 2, 5, 10, 20μM이 되도록 처리한 후 5일 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 각 웰 당 5㎎/㎖의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)용액을 넣은 후 4시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. MTT용액을 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 2회 세척한 후, 300㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 처리하여 세포를 용해시켰다. 용해된 상등액 200㎕씩을 96-웰 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 리더(ELISA reader)로 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
스코파론을 1, 2, 5, 10 및 20 μM 농도가 되도록 처리한 후, 5일간 배양하여 세포독성을 확인한 결과, 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았으며(도 12), 이후 진행될 활성평가에서 1 내지 20 μM 농도의 스코파론으로 수행하였다.
3-2 : 파골세포 분화 활성에 미치는 스코파론의 효과 - 파골세포 TRAP 염색과 파골세포 계수(counting)
RAW 264.7 세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 1×105 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(50ng/㎖ receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL))와 함께 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하였다. 2일 간격으로 스코파론이 포함된 배지로 교환해주면서 총 5일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 1회 세척하고, 4% 포름알데하이드(formaldehyde)으로 10분, 에탄올/아세톤(ethanol/acetone; 1:1)으로 1분 동안 처리하여 세포를 고정시켰다. 그 다음, 500㎕의 증류수를 이용하여 2회 세척후 백혈구 산성 인산화효소 키트(Leukocyte Acid Phosphatase Kit) 387-A(Sigma, 미국)을 이용하여 TRAP 염색을 수행하였다.
염색이 끝난 후 광학 현미경을 이용하여 핵이 3개 이상인 TRAP-양성 다핵세포를 계수하여 파골세포의 생성 지표로 사용하였다.
TRAP 양성인 다핵성 파골세포를 확인한 결과, 스코파론 농도 의존적으로 파골세포 형성이 감소되었으며, TRAP-양성 다핵세포를 계수한 결과 파골세포의 분화정도를 61.69 내지 93.15%로 효과적으로 억제시키는 것을 확인하였다 (도 13).
3-3 : 파골세포 분화 활성에 미치는 스코파론의 효과 - 파골세포 TRAP 활성
RAW 264.7 세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 1×105 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(50ng/㎖ receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL))와 함께 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하였다. 2일 간격으로 스코파론이 포함된 분화배지로 교환해주면서 총 5일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 1회 세척하고, 4% 포름알데하이드(formaldehyde)으로 10분, 에탄올/아세톤(ethanol/acetone; 1:1)으로 1분 동안 처리하여 세포를 고정시켰다. 그 다음, 500㎕의 증류수를 이용하여 2회 세척 후 10mM 주석산나트륨(sodium tartrate) 및 5mM ρ-니트로페닐포스페이트(ρ-nitrophenylphosphate)가 포함된 50mM 시트레이트 버퍼(citrate buffer; pH 4.5)를 500㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 효소 반응액을 새로운 플레이트에 100㎕씩 분주하고 0.1N NaOH로 반응을 중지시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
파골세포의 분화 마커인 TRAP 활성을 측정한 결과, 스코파론 농도 의존적으로 TRAP 활성이 196.70 내지 254.70%로 감소되는 것을 확인하였으며(도 14), 스코파론이 파골세포 형성와 TRAP 활성을 억제시켜 뼈의 재흡수를 억제함으로써 골다공증 예방 및 치료에 긍정적인 효과를 줄 수 있다.
3-4 : 파골세포에 의한 골 흡수 활성에 미치는 스코파론의 효과
파골세포에 의한 골 흡수(bone resorption) 활성은 Cosmobio의 골 흡수 측정 키트(bone resorption assay kit, CSR-BRA-48KIT)를 이용하였다. 인산칼슘이 코딩된(CaP-coated plate) 48 웰 플레이트에 FACS(Fluoresceinamine-labeld chondroitin sulfate)를 250㎕씩 처리하고 2시간 동안 37℃에서 라벨링(labeling) 하였다. FACS 용액을 제거한 후, PBS (pH 7.4)로 2회 세척한 다음 RAW 264.7 세포를 배양하기 전까지 페놀 레드가 포함되어 있지 않은 배지(phenol red free) 1㎖씩 처리하여 보관하였다.
RAW 264.7 세포를 상기의 48 웰 플레이트(FACS labeled CaP-coated plate)에 5×103 cells/well이 되도록 분주하고 페놀 레드가 포함되어 있지 않은 배지(phenol red free)를 이용하여 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(100ng/㎖ receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL))와 함께 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하였다. 2일 간격으로 스코파론이 포함된 분화배지로 교환해주면서 총 6일간 배양하였으며, 100㎕의 배양액을 96 웰 블랙 플레이트(96-well black plate)로 옮긴 후, 50㎕의 골 흡수 측정 버퍼(bone resorption assay buffer)를 각 웰에 넣어준 다음 형광(Ex 485nm/Em 535nm)을 측정하였다.
파골세포 분화에 의한 골 흡수 활성을 측정한 결과, 스코파론 농도 의존적으로 골 흡수 활성이 192.76 내지 228.64%로 감소되는 것을 확인하였다 (도 15). 이는 스코파론이 파골세포 분화를 억제시켜 골 흡수 활성을 억제함으로써 골 대사(bone metabolism)를 조절하는 것으로 볼 수 있다.
3-5 : 파골세포 분화 중 ROS, O2, H2O2 및 GSH 레벨이 대한 스코파론 효과
활성산소(ROS) 및 글루타치온(GSH)가 파골세포 분화를 조절하는 것으로 알려져 있어(레퍼), 스코파론에 의한 파골세포 내 ROS, O2, H2O2 및 GSH 레벨의 변화를 DCFH-DA, DHE, DHR123 및 mBCL 형광 프로브(probe)를 이용하여 측정하였다.
RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트(well plate)에 1×105 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(50ng/㎖ receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL))와 함께 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하였다. 총 2일 배양 후 배지를 제거하고, 200㎕의 HBSS로 교환해 준 다음, DCFH-DA(40μM), DHE(50μM), DHR123(20μM), mBCL(50μM)를 각 웰에 추가로 첨가하여 30분 동안 배양하였다. 그 다음 DCFH-DA(Ex 485nm/ Em 535nm), DHE(Ex 485nm/ Em 590nm), DHR123(Ex 485nm/ Em 535nm), mBCL(Ex 380nm/ Em 465nm)의 형광을 GENios fluorescence plate reader(TECAN trading AG, Switzerland)를 이용하여 측정하였다.
파골세포 내 ROS, O2, H2O2 및 GSH 레벨을 측정한 결과, RANKL 처리에 의해 증가한 ROS 와 O2 레벨은 스코파론 농도 의존적으로 감소된 것을 확인하였으며, H2O2 와 GSH 레벨에는 영향을 주지 않는 것을 확인하였다 (도 16).
3-6 : 파골세포 분화 중 MMP(Mitochondrial membrane potential)에 대한 스코파론의 효과
스코파론에 의한 파골세포내 MMP(Mitochondrial membrane potential)의 변화를 로다민123(rhodamine123) 형광 프로브를 이용하여 측정하였다.
RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트(well plate)에 1×105 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(50ng/㎖ receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL))와 함께 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하였다. 총 2일 배양 후 배지를 제거하고, 200㎕의 HBSS로 교환해 준 다음, 5μM의 로다민123을 추가로 첨가하여 30분 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 50㎕의 HBSS로 세포를 세척한 후에, 다시 200㎕의 HBSS를 넣어준 후 GENios fluorescence plate reader(TECAN trading AG, Switzerland)를 이용하여 Ex 485 nm/ Em 535 nm에서 형광을 측정하였다.
그 결과, 파골세포 내 MMP는 분화유도 기간 동안 대조군에 비해 34.94% 감소하였으나, 스코파론을 처리한 경우 35.59 내지 54.47%로 농도 의존적으로 MMP가 증가한 것을 확인하였다 (도 17).
실시예 4: 파골세포 분화 시그널(signaling pathway) 관련 단백질의 발현 및 활성에 대한 스코파론의 효과
파골세포 분화 시그널 관련 단백질의 발현 및 활성에 대한 스코파론의 효과를 확인하기 위해, RAW 264.7 세포 24-웰 플레이트(well plate)에 1×105 cells/well이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 부착(pre-incubation)시킨 다음, 분화유도배지(50ng/㎖ receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL))와 함께 스코파론이 0, 1, 10, 20μM 농도가 되도록 처리하였다. 총 2일간 배양하였으며, 배지를 제거한 후 500㎕ PBS(pH7.4)로 세포를 1회 세척하고, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 이후의 단백질 발현 확인 실험에 사용하였다.
4-1 : TRAF6/Rac1/Nox1/ROS 신호전달 경로에 대한 스코파론의 효과
RANKL로 유도된 파골세포 분화 과정에서 스코파론을 농도별로 처리하였을 때 TRAF6/Rac1/Nox1와 관련된 ROS 발생 신호 분자 조절에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 웨스턴 블랏(Wetstern blotting)을 실시하였다.
그 결과, 스코파론은 RANKL/RANK 시그널 경로의 최상위 조절자인 TRAF6의 발현을 농도 의존적으로 감소시키고, TRAF6의 하위기전 매개체인 Rac1의 활성도 감소시키는 것을 확인하였다 (도 18). 이러한 결과는 스크파론이 TRAF6의 발현을 조절하여, NADPH 산화효소의 세포질 서브유닛(cytoplasmic subunit)인 Rac1의 활성형태인 GTP-Rac1의 발현을 감소시켜, Rac1의 세포막으로의 이동(translocation)을 방해하여 NADPH 산화효소의 복합체 형성을 억제하는 것으로 ROS의 발생을 조절하는 것으로 볼 수 있다.
4-2 : Rac1의 상위조절 매개체인 c-Src 및 PI3K 발현 및 활성에 대한 스코파론의 효과
스코파론을 농도별로 처리하였을 때 c-Src 및 PI3K의 발현 및 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 웨스턴 블랏(Western blotting)을 실시하였다.
그 결과, 스코파론 농도 의존적으로 c-Src의 발현이 감소되는 것을 확인하였으며, c-Src의 하위기전으로 알려진 PI3K의 인산화를 억제하는 것으로 확인되었다 (도 19). 이러한 결과는 스코파론이 c-Src의 발현을 감소시켜 PI3K의 인산화를 억제하여 Rac1의 활성을 조절하는 것으로 볼 수 있다.
4-3 : 항산화 효소(카탈라제(Catalase) 및 SOD1) 발현에 대한 스코파론의 효과
스코파론이 RANKL/RANK 신호 전달 체계를 통해 발생되는 ROS와 관련하여 파골세포 내 항산화 효소 (카탈라제(Catalase) 및 SOD1)의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 웨스턴 블랏을 실시하였다.
그 결과, 스코파론에 의해 RANKL 처리에 의해 감소된 카탈라제(Catalase) 및 SOD1의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며(도 20), 스코파론은 항산화 효소(카탈라제(Catalase) 및 SOD1)의 발현을 증가시켜 발생된 ROS를 소거하는 두 가지 신호 전달 경로를 통해 파골세포 내 ROS 발생을 조절하는 것을 확인하였다.
4-4 : MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase) 신호 경로에 대한 스코파론 효과
스코파론이 RANKL/RANK 신호 전달 체계를 통해 활성화되는 JNK, ERK 및 p38의 발현 및 하위 신호분자인 c-Fos 및 NFATc1에 미치는 영향을 알아보기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 스코파론은 RANKL/TRAF6/Rac1/Nox 신호전달 경로를 통해 발생된 oxidative stress를 통해 활성화된 JNK, ERK 및 p38의 인산화를 억제하는 것을 확인하였으며(도 21), JNK와 ERK의 활성화에 의해 조절되는 c-Fos의 발현을 감소시켜, 이들에 의해 조절되는 NFATc1의 발현을 조절하는 것을 확인하였다 (도 22).
4-5 : 파골세포 마커인 카텝신 K(Cathepsin K) 및 TRA 발현에 대한 스코파론의 효과
스코파론이 뼈 흡수에 직접적으로 작용하는 효소들인 카텝신 K 및 TRAP에 미치는 영향을 알아보기 위해 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 스코파론에 의해 파골세포에서 분비되는 카텝신 K 및 TRAP의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
결론적으로, 스코파론의 뼈 흡수 억제 작용은 TRAF6/Rac1/Nox1으로 이어지는 시그널 경로 조절을 통해 파골세포 분화 과정 중 발생하는 ROS를 감소시키고, 스트레스, 열 충격(heat shock), 방사선(radiation) 등과 같은 일련의 자극(ROS)에 민감한 MAPKs 경로 활성을 억제하여 파골세포에 의한 뼈 흡수 작용을 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (도 23).
실시예 5: 스코파론 함유 사철쑥 추출물 제조
5-1 : 사철쑥 추출물의 제조
경북 영천에서 구입한 사철쑥 시료(4㎏)를 잘게 세절한 후, 사철쑥 시료와 1:8의 비율이 되도록 50% 주정(v/v)을 포함하는 1차 추출용매 32ℓ를 첨가하여 60±2℃에서 6시간 동안 추출하여 1차 추출액을 감압농축하여 회수하였다.
그 다음 사철쑥 시료와 1:5의 비율이 되도록 50% 주정(v/v)을 포함하는 2차 추출용매 20ℓ를 첨가하여 50±2℃에서 16시간 동안 추출하여 2차 추출액을 감압농축하여 회수하였다. 상기 1차 농축액과 2차 농축액을 혼합시킨 다음, 동결건조 또는 분무건조하여 스크파론 함유 사철쑥 추출물 분말을 제조하였다 (도 24).
표 2
Figure PCTKR2014010833-appb-T000002
표 2에 나타난 바와 같이, 사철쑥 시료를 5개로 나누어 상기와 같은 방법으로 50% 주정이 포함된 추출용매를 이용해 사철쑥을 추출하였으며, 각 추출물을 동결건조하여 추출농축액의 농축된 양을 측정한 결과, 평균 수율은 13.8%로 나타났다.
5-2 : 사철쑥 추출물에 포함된 스코파론 함량 분석
상기 실시예 5-1의 방법으로 추출한 사철쑥 추출물에 포함된 스코파론의 함량을 분석하기 위해 각각의 시료는(표 2) 70% MeOH로 녹인 후 0.45μm 필터 멤브레인(filter membrane)으로 여과하고, 최종적으로 농도를 10mg/㎖으로 조정하고 HPLC 분석에 사용하였다.
대조군으로 경북 울진에서 구입한 사철쑥 시료를 잘게 세절한 후(1.0 g), 70% MeOH 100㎖을 처리하여 초음파 방법으로 추출하고, 0.45μm 필터 멤브레인(filter membrane)으로 여과하였다. 최종적으로 농도를 10mg/㎖으로 조정하고 여액 10㎕를 취하여 HPLC 분석에 사용하였다.
사철쑥 추출물에 포함된 스코파론 함량 분석은 표 3의 HPLC 조건으로 수행하였다.
표 3
Figure PCTKR2014010833-appb-T000003
표 4
Figure PCTKR2014010833-appb-T000004
사철쑥 추출물에 포함된 스코파론의 함량을 분석한 결과, 대조군의 경우 약 0.12 중량%의 스코파론이 포함되어 있었으나, 실시예 5-1의 방법으로 추출한 5종의 사철쑥 추출물에는 평균 0.54 내지 0.67 중량%의 스코파론이 함유된 것을 확인하였다.
실시예 6: 동물실험을 이용한 체중 및 식이효율에 미치는 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물의 효과
6-1 : 실험동물의 사육 및 식이
난소 절제(ovariectomized)와 가짜수술(sham operation)를 실행한 생후 8주령의 암컷 Sprague-Dawley (SD) rat을 (주)중앙실험동물로부터 구입하여 고형사료(삼양사료)를 먹이면서 14일간 환경에 적응시킨 후 체중에 따라 난괴법으로 총 5군으로 분리하였다 (n=12 per group).
실험동물에게 칼슘결핍식이를 총 84일간 공급하였으며 양성대조군으로 17β-estradiol (E2) 50 μg/㎏을 그리고 사철쑥 추출물 125㎎/㎏과 250㎎/㎏을 매일 경구투여로서 정해진 양을 12주간 공급하였다.
표 5
Figure PCTKR2014010833-appb-T000005
식이 섭취량은 매일 9~10시 정해진 시간에 측정하였다. 사육장은 인공조명에 의하여 조명시간을 아침 9시부터 저녁 9시까지 12시간으로 조절하였으며 실내온도 25 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%로 유지하였다. 급수는 정수된 일반 식수를 사용하였고 사료와 급수는 제한하지 않았으며 매일 오전 9시에서 10시 사이에 정해진 시간에 공급하였다.
6-2 : 실험동물의 체중 및 식이효율에 미치는 사철쑥 추출물의 효과
스코파론을 포함하는 사철쑥 추출물이 실험동물의 체중 및 식이효율에 미치는 영향을 알아보기 위해, 실시예 6-1의 실험동물의 체중을 측정한 결과, 12주간의 실험기간동안 평균 식이섭취량은 I군과 II군 간에 유의적인 차이가 있었으며, II군 (OVA)과 III군 (OVA+E2 50μg/㎏), Ⅳ군(OVA+ACE 125㎎/㎏), Ⅴ군 (OVA+ACE 250㎎/㎏) 간에 유의적인 차이가 없었다.
표 6
Figure PCTKR2014010833-appb-T000006
그러나 체중 증가는 II군 (OVA)과 Ⅳ군 (Ova+ACE 125㎎/㎏)간에 유의적인 차이가 나타났다. 이는 난소절제에 의해 지방 축적률이 증가하여 체중증가가 나타났으며, 사철쑥 추출물은 독성 및 섭취거부가 없으며 영양대사에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다 (도 25).
실시예 7: 동물실험을 이용한 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물의 뼈 성장 및 뼈 건강 활성 측정
7-1 : 실험동물의 신장, 간, 자궁 및 대퇴부 뼈 (BMC, BMD)에 미치는 스코파론 포함 사철쑥 추출물의 효과
실험이 종료되는 시점 (12주)에서 실험동물을 희생시켜 신장, 간 및 자궁을 적출하여 분석하였으며, 좌측 및 우측 대퇴부 뼈를 적출하여 -70℃에서 보관하여 분석에 사용하였다.
대퇴부 뼈의 골밀도(bone mineral density, BMD)와 뼈 무기질 함량(bone mineral content, BMC)은 PIXImus (GE medical systems Lunar, USA)를 이용하여 측정하였다. 대퇴부 뼈 조직의 BMD는 cm2 당 g 단위로 표시하였으며, BMC는 g단위로 표시하였다.
표 7
Figure PCTKR2014010833-appb-T000007
표 7에 나타난 봐와 같이, 신장과 간 무게에서 유의적인 차이가 보이지 않았으며, 자궁 무게의 경우 II군(OVA)에 비해 III군(OVA+E2 50μg/㎏)의 자궁 무게가 약간 증가하였으나, Ⅳ군(OVA+ACE 125㎎/㎏), Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다 (도 26).
대퇴부 뼈의 무게, 길이 및 두께를 측정한 결과, I군(Sham) 군과 II군(OVA)간 유의적인 차이를 나타내었으며, II군과 III군, Ⅳ군 및 Ⅴ군 간의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 그러나 대퇴부 뼈의 골밀도와 무기질 함량은 II군(OVA)이 I군(Sham)에 비해 감소하였으나 양성대조군(OVA+E2 50μg/㎏)과 사철쑥 추출물 투여군(Ⅳ: OVA+ACE 125㎎/㎏, Ⅴ: OVA+ACE 250㎎/㎏)에서는 유의적으로 증가한 것을 확인하였다 (도 27).
7-2 : 실험동물의 혈중 PICP(procollagen type Ⅰ C-terminal peptide) 함량에 미치는 스코파론 포함 사철쑥 추출물의 효과
실험동물의 혈중 PICP은 USCN의 enzyme-linked immunosorbent assay (E90570Ra)를 사용하여 측정하였다. 실험동물을 개복한 후 심장에서 재빨리 혈액을 채취하여 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 전혈에서 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장은 -70℃에 보관하며 분석에 사용하였다.
쥐의 PICP가 코팅된 96웰 스트립 플레이트(Rat PICP coated 96-well strip plate)의 블랭크 웰(blank well)을 제외한 모든 웰에 각 그룹별로 PBS를 이용해 10배 희석한 혈장을 100㎕씩 분주하고 2시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 희석된 혈장을 제거한 후 100㎕의 검출 시약 A(detection reagent A)을 가하고 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, 검출 시약 A를 제거하고 350㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 3회씩 세척하였다. 그 다음 모든 웰에 100㎕의 검출 시약 B(detection reagent B)를 가하고 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 350㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 5회씩 세척하였다. 90㎕의 기질 용액(substrate solution)을 모든 웰에 첨가하고 빛을 차단한 상태에서 20분 동안 37℃에에 반응시킨 다음 50㎕의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 정지시킨 후, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 그리고 80ng/㎖의 rat PICP standard을 이용하여 검정선을 작성하였다.
그 결과, II군(OVA)에 비해 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏)과 사철쑥 추출물 투여군인 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)의 PICP 수준이 유의적으로 증가된 것을 확인하였으며(도 28), 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물의 투여가 타입Ⅰ 콜라겐(typeⅠ collagen) 형성을 증가시켜 뼈 형성에 도움을 줄 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
7-3 : 실험동물의 혈중 BALP(Bone alkaline phosphatase) 함량에 미치는 스코파론 포함 사철쑥 추출물의 효과
실험동물의 혈중 BALP은 MBS의 Bone Alkaline Phosphatase (MBS731429)을 이용하여 측정하였으며, 실시예 7-2에서 분리한 혈장을 이용하였다.
BALP가 코팅된 96웰 스트립 플레이트(BALP coated 96-well strip plate)의 블랭크 웰(blank well)을 제외한 모든 웰에 각 그룹별로 PBS를 이용해 2배 희석한 혈장 100㎕ 및 컨쥬게이션 용액(conjugate solution) 50㎕씩 분주하여 믹싱(mixing) 한 뒤, 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응액을 제거한 후 350㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 5회 세척한 다음, 기질 A 용액 및 기질 B 용액을 1:1 비율로 혼합한 용액을 각 웰에 50㎕씩 첨가하고, 빛을 차단한 상태에서 약 15분 동안 37℃에서 반응시켰다. 50㎕의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 정지시킨 후, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 0, 0.5, 1, 2.5, 5 그리고 10ng/㎖의 BALP standard을 이용하여 검정선을 작성하였다.
그 결과, II군(OVA)에 비해 III군(OVA+E2 50μg/㎏), Ⅳ군(OVA+ACE 125㎎/㎏) 및 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)에서 BALP 활성이 유의적으로 증가된 것으로 나타났다 (도 29). BALP는 뼈에 특이적인(specific) 효소로 조골세포 분화 고정 중 분비되며, 뼈의 재형성에 관여하는 것으로, 스코파론이 포함된 사철쑥 추출물에 의한 BALP분비 증가는 뼈의 재형성을 촉진하여 골다공증 예방 및 치료에 기여할 수 있는 것을 확인하였다.
7-4 : 실험동물의 혈중 OC(osteocalcin) 함량에 미치는 스코파론 포함 사철쑥 추출물의 효과
실험동물의 혈중 오스테오칼신(OC)은 Biomedical Technologies Inc의 rat osteoclacin kit (BT-490)를 사용하여 측정하였으며, 실시예 7-2에서 분리한 혈장을 이용하였다.
쥐 오스테오칼신이 코팅된 96웰 스트립 플레이트(BRat osteocalcin coated 96-well plate)의 블랭크 웰(blank well)을 제외한 모든 웰에 각 그룹별로위킹 샘플 버퍼(working sample buffer BT-471R)를 이용해 10배 희석한 혈장 25㎕ 및 오스테오칼신 안티세럼(osteocalcin antiserum) 100㎕씩 분주하여 2시간 30분 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응액을 제거한 후 300㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 5회 세척한 다음, 모든 웰에 100㎕의 donkey anti-Goat IgG peroxidase를 가하고 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 300㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 5회 세척하였다. TMB 용액 BT-497(TMB solution BT-497)과 과산화수소 용액 BT-498를 1:1로 혼합한 용액 100㎕을 모든 웰에 처리하여 빛이 차단된 상태에서 30분 동안 상온에서 반응시킨 다음, 100㎕의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 정지시킨 후, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 그리고 20ng/㎖의 rat osteocalcin standard BT-493을 이용하여 검정선을 작성하였다.
그 결과, 12주간의 실험에서 난소절제군인 II군(OVA)에서 증가된 오스테오칼신 수준이 스코파론 함유 사철쑥 추출물 투여군인 Ⅳ군(OVA+ACE 125㎎/㎏)과 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)에서 유의적인 감소가 관찰되었다 (도 30). 이는 스코파론 함유 사철쑥 추출에 의해 난소절제로 인해 유발되는 골교체율(bone turnover)이 감소된 것이다.
7-5 : 실험동물의 혈중 OPG(osteoprotegerin) 함량에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과
스코파론 함유 사철쑥 추출물의 OPG 조절 효과를 알아보기 위해 실험동물의 혈중 OPG 농도를 R&D system의 mouse OPG kit (MOP00)를 사용하여 측정하였으며, 실시예 7-2에서 분리한 혈장을 이용하였다.
쥐 OPG가 코팅된 96웰 스트립 플레이트(Rat OPG coated 96-well plate)의 블랭크 웰(blank well)을 제외한 모든 웰에 assay diluent RD1-21을 50㎕씩 분주한 후, calibrator diluent RD5-3로 5배 희석된 혈장을 25㎕씩 분주하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응액을 제거한 후 400㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 5회 세척한 다음, 100㎕의 기질 용액(substrate solution)을 모든 웰에 가하고 빛이 차단된 상태에서 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 100㎕의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 정지시킨 후, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 0, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 그리고 2,000pg/㎖의 mouse OPG standard을 이용하여 검정선을 작성하였다.
그 결과, 12주간 실험에서 난소절제군인 II군(OVA)에 비해 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏) 및 스코파론 함유 사철쑥 추출물 투여군인 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)에서 OPG의 분비가 증가된 것을 확인하였다 (도 31).
7-6 : 실험동물의 혈중 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)함량에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과
스코파론 함유 사철쑥 추출물의 RANKL 조절 효과를 알아보기 위해 실험동물의 혈중 RANKL 농도를 R＆D system의 mouse TRANCE/RANKL/TNFSF11 kit (MTR00)를 사용하여 측정하였으며, 실시예 7-2에서 분리한 혈장을 이용하였다.
쥐 TRANCE가 코팅된 96웰 스트립 플레이트(Rat TRANCE coated 96-well plate에 blank well)의 블랭크 웰(blank well)을 제외한 모든 웰에 assay diluent RD1W을 50㎕씩 분주한 후, calibrator diluent RD6-12로 2배 희석시킨 혈장을 25㎕씩 분주하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응액을 제거한 후 400㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 5회 세척한 다음, 100㎕의 컨쥬게이션 용액(conjugate solution)을 분주하여 2시간 동안 상온에서 반응시킨 후, 400㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 5회 세척하였다. 그 다음, 100㎕의 기질용액(substrate solution)을 모든 웰에 가하고 빛이 차단된 상태에서 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 100㎕의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 정지시킨 후, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 0, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 그리고 2,000 pg/㎖의 mouse TRANCE standard을 이용하여 검정선을 작성하였다.
그 결과, 난소절제군인 II군(OVA)에 비해 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏)과 소코파론 함유 사철쑥 투여군인 Ⅳ군(OVA+ACE 125㎎/㎏)과 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)에서 RANKL 생성이 유의적으로 감소된 것을 확인하였다 (도 32).
7-7 : 실험동물의 혈중 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 함량에 미치는 스코파론 함유사철쑥 추출물의 효과
스코파론 함유 사철쑥 추출물의 TRAP 조절 효과를 알아보기 위해 실험동물의 혈중 TRAP 농도를 enzyme-linked immunosorbent assay kit(E90902Ra, USCN)를 사용하여 측정하였으며, 실시예 7-2에서 분리한 혈장을 이용하였다.
쥐의 TRAP가 코팅된 96웰 스트립 플레이트(Rat TRAP coated 96-well strip plate)의 블랭크 웰(blank well)을 제외한 모든 웰에 각 그룹별로 PBS를 이용해 5배 희석한 혈장을 100㎕씩 분주하고 2시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이후 100㎕의 검출 시약 A(detection reagent A)을 가하고 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, 반응액을 제거하고 350㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 3회씩 세척하였다. 그 다음 모든 웰에 100㎕의 검출 시약 B(detection reagent B)를 가하고 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 350㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 5회씩 세척하였다. 90㎕의 기질 용액(substrate solution)을 모든 웰에 첨가하고 빛을 차단한 상태에서 20분 동안 37℃에에 반응시킨 다음 50㎕의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 정지시킨 후, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 0, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25 그리고 50ng/㎖의 rat TRAP standard을 이용하여 검정선을 작성하였다.
그 결과, 난소절제군인 II군(OVA)에서 TRAP 함량이 증가하였으나, 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏), 스코파론 함유 사철쑥 추출물 투여군인 VI군(OVA+ACE 125㎎/㎏) 및 Ⅴ군(OVA+ACE 250㎎/㎏)은 Ⅱ군에 비해 TRAP 함량이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다 (도 33). 즉 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 난소절제로 인해 유발되는 파골세포의 TRAP 분비를 감소시켜 골다공증 예방 및 치료에 도움을 주는 것을 확인하였다.
7-8 : 실험동물의 혈중 ICTP(cross-linked C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen) 함량에 미치는 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 효과
스코파론 함유 사철쑥 추출물의 ICTP 조절 효과를 알아보기 위해 실험동물의 혈중 ICTP 농도를 enzyme-linked immunosorbent assay kit(E90665Ra, USCN)를 사용하여 측정하였으며, 실시예 7-2에서 분리한 혈장을 이용하였다.
쥐의 ICTP가 코팅된 96웰 스트립 플레이트(Rat ICTP coated 96-well strip plate)의 블랭크 웰(blank well)을 제외한 모든 웰에 각 그룹별로 PBS를 이용해 10배 희석한 혈장을 500㎕씩 분주한 다음, 50㎕의 검출 시약 A(detection reagent A)을 분주하고 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 350㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 3회씩 세척한 다음 모든 웰에 100㎕의 검출 시약 B(detection reagent B)를 가하고 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 350㎕의 세척 버퍼를 이용하여 각 웰을 5회씩 세척하였다. 90㎕의 기질 용액(substrate solution)을 모든 웰에 첨가하고 빛을 차단한 상태에서 20분 동안 37℃에에 반응시킨 다음 50㎕의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 정지시킨 후, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 0, 123.5, 370.4, 1,111.1, 3,333.3 그리고 10,000pg/㎖의 rat ICTP standard을 이용하여 검정선을 작성하였다.
그 결과, I군(Sham)에 비해 난소절제군인 II군(OVA)의 혈중 ICTP 농도는 유의적으로 증가하였으나, 양성대조군인 III군(OVA+E2 50μg/㎏) 및 스코파론 함유 사철쑥 추출물 투여군인 Ⅴ군 OVA+ACE 250㎎/㎏)은 II군(OVA)에 비해 ICTP 수준이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 33).
본 발명의 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 조골세포 활성을 증가시키고 파골세포의 활성억제 및 뼈 흡수 활성을 억제하므로, 골다공증 예방 및 치료뿐만 아니라, 뼈 건강 증진 및 개선, 골손실 방지를 위한 약학조성물, 건강기능 식품 또는 음료로서 유용하다
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
    화학식 1
    Figure PCTKR2014010833-appb-I000004
  2. 제1항에 있어서, 스코파론 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 함량은 0.001 내지 20 중량% 인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 스코파론 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 조골세포의 활성을 촉진시키고, 파골세포 분화 및 골 흡수를 억제시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 다음 단계에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물:
    (a) 사철쑥 시료를 잘게 세절한 후, 50% 주정(v/v)을 포함하는 1차 추출용매를 첨가하고 55 내지 65℃로 가열하여 1차 추출하는 단계;
    (b) 상기 1차 추출물을 회수하여 농축시킨 다음, 50% 주정(v/v)을 포함하는 2차 추출용매를 첨가하고 45 내지 55℃로 가열하여 2차 추출하는 단계; 및
    (c) 상기 2차 추출물을 회수한 다음, 농축 및 건조시켜 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 수득하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 1차 추출용매는 사철쑥 시료와 1:7 내지 1:9 비율이 되도록 첨가하여 4시간 내지 8시간 추출하는 것을 특징으로 하는 스코파론을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 2차 추출용매는 사철쑥 시료와 1:4 내지 1:6 비율이 되도록 첨가하여, 4시간 내지 18시간 추출하는 것을 특징으로 하는 스코파론을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 수득한 사철쑥 추출물에는 5.0 내지 7.0 ㎎/ｇ의 스코파론이 포함된 것을 특징으로 하는 스코파론을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 화학식 1로 표시되는 스코파론(scoparone) 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
    화학식 1
    Figure PCTKR2014010833-appb-I000005
  9. 제8항에 있어서, 스코파론 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물의 함량은 0.001 내지 20 중량% 인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  10. 제8항에 있어서, 스코파론 또는 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 조골세포의 활성을 촉진시키고, 파골세포 분화 및 골 흡수를 억제시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  11. 제8항에 있어서, 상기 스코파론 함유 사철쑥 추출물은 다음 단계에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능 식품:
    (a) 사철쑥 시료를 잘게 세절한 후, 50% 주정(v/v)을 포함하는 1차 추출용매를 첨가하고 55 내지 65℃로 가열하여 1차 추출하는 단계;
    (b) 상기 1차 추출물을 회수하여 농축시킨 다음, 50% 주정(v/v)을 포함하는 2차 추출용매를 첨가하고 45 내지 55℃로 가열하여 2차 추출하는 단계; 및
    (c) 상기 2차 추출물을 회수한 다음, 농축 및 건조시켜 스코파론 함유 사철쑥 추출물을 수득하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 1차 추출용매는 사철쑥 시료와 1:7 내지 1:9 비율이 되도록 첨가하여 4시간 내지 8시간 추출하는 것을 특징으로 하는 스코파론을 함유하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  13. 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 2차 추출용매는 사철쑥 시료와 1:4 내지 1:6 비율이 되도록 첨가하여, 4시간 내지 18시간 추출하는 것을 특징으로 하는 스코파론을 함유하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  14. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 수득한 사철쑥 추출물에는 5.0 내지 7.0 ㎎/ｇ의 스코파론이 포함된 것을 특징으로 하는 스코파론을 함유하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
PCT/KR2014/010833 2013-11-13 2014-11-12 사철쑥 유래 스코파론 함유 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 WO2015072734A1 (ko)

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