WO2012148247A2 - 올레아놀린산 아세테이트를 유효성분으로 포함하는 tlr 및 il-6 매개성 질환예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

올레아놀린산 아세테이트를 유효성분으로 포함하는 tlr 및 il-6 매개성 질환예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating TLR and IL-6 mediated diseases comprising oleanolinic acid acetate as an active ingredient, and more specifically, oleanolic acid acetate or a pharmaceutically acceptable thereof.
  • Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of TLR and IL-6 mediated diseases comprising salts as active ingredients, TLR and IL-6 mediated diseases comprising red soybean extract or fractions thereof comprising the compound or salt as an active ingredient
  • the present invention also relates to a skin external preparation, a health functional food, and a personal hygiene product for preventing or improving TLR and IL-6 mediated diseases including the active ingredient.
  • An immune response is a series of reactions that activated immune cells produce against foreign and endogenous substances (antigens).
  • antigens include antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, anti
  • TLRs Toll-like receptors
  • TLR is a type I transmembrane signaling molecule that is mainly expressed in cells responsible for the innate immune system. In these cells, TLRs recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or microorganism-associated molecular patterns (MAMPs) through the extracellular domain, resulting in inflammatory cell activation in innate immune cells. Since the discovery of TLRs, efforts have been made to find PAMPs that bind to TLRs, and so far one or more ligands have been identified except for TLR10, TLR12, and TLR13 (Kawai T. et al, Ann. NY Acad. Sci., 2008). , 1143, 1-20). TLRs are different but share signaling mechanisms (Liew F.Y., et al., Nat. Rev. Immunol., 2005, 5 (6), 446-458).
  • TLRs Common in signaling by TLRs is the activation of NF- ⁇ B through the Toll / interleukin-1 receptor-like domain (TIR) domain.
  • TIR interleukin-1 receptor-like domain
  • Signaling by TLRs interacts with MyD88 with a TIR domain to form a complex.
  • the TIR domain located at the C-terminus of MyD88 forms a complex with TLR, and the Death domain located at the N-terminus is complexed with IR-1R associated kinase (IRAK-1) or IRAK-2, which is a Ser / Thr kinase. Will form.
  • IRAK-1R associated kinase IR-1R associated kinase
  • IRAK-2 IR-1R associated kinase
  • IRAK-1 in turn activates NF- ⁇ B-inducing kinase (NIK) through interaction with tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRIF6), which in turn phosphorylates IKB (I ⁇ B kinase) and phosphorylates IKK. Again phosphorylates I ⁇ B (inhibitory ⁇ B), resulting in the activation of NF- ⁇ B.
  • Activated NF- ⁇ B migrates to the nucleus, acting as a transcription factor, and induces expression of cytokine and cell junction molecule-related genes (Brown J., et al, J. Dent. Res., 2010, Epub ahead of print: Palusinska-Szysz M., et al., Folia Microbiol. (Praha), 2010, 55 (5), 508-14).
  • TLR-7 is known to recognize ssRNA (single-stranded RNA) and ssRNA analogue polyI (polyinosinic acid). That is, after TLR-7 recognizes the ssRNA, it reacts with MyD88, an adapter protein, to activate the transcription factors NFkB and AP-1 to produce inflammatory cytokines.
  • TRIF-dependent mechanisms induce the production of type I interferon by continuously signaling signals to TRIF, ANK-binding kinase 1 (TBK1), TRAF3, and the transcription factor IRF3.
  • TLR-3 is known to recognize dsRNA (double-stranded RNA) and dsRNA analogue polyI: C (polyinosinic-polycytidylic acid) that occurs during the propagation of RNA viruses.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • C polyinosinic-polycytidylic acid
  • STAT3 Signal transducers and activators of transcription
  • IL-6 interleukin-6
  • EGF epidermal growth factor
  • IL-6 a cytokine known as B-cell stimulator 2 or interferon ⁇ 2
  • B-cell stimulator 2 a cytokine known as B-cell stimulator 2 or interferon ⁇ 2
  • IL-6 was found as a differentiation factor involved in the activation of B lymphocyte cells (Hirano T., et al., Nature, 1986, 324, 73-76). Then, it was found to be a multifunctional cytokine that affects the differentiation and proliferation of T cells, differentiation of neurons, osteoclast formation, protein production in hepatocytes (Akira S., et al., Adv. In Immunology) , 1993, 54, 1-78).
  • IL-6 receptor interleukin-6 receptor
  • IL-6R interleukin-6 receptor
  • IL-6 and IL-6R form an IL-6 / IL-6R complex and then induce intracellular signaling by IL-6 by binding to another membrane protein, gp130 (Taga T., et al. , J. Exp. Med., 1987, 196, 967).
  • JAK2 Janus Kinases 2
  • STAT3 bound to the cytoplasmic domain of the receptor is released from the receptor after phosphorylation by JAK2.
  • Activated STAT3 binds to each other in the cytoplasm to form homozygotes or heterodimers, and then enters the nucleus to bind transcriptional activation regions of target molecules to increase transcription (Levy, DE, et al., Nat. Rev. Mol. Cell). Biol., 2002, 3, 651-62: Darnell, JE, Science, 1997, 277, 1630-1635).
  • IL-6 Excessive production of IL-6 has been shown to be involved in a variety of diseases, including rheumatoid arthritis, Castleman Syndrome, Crohn's disease, osteoporosis, cancer cachexia, arteriosclerosis, and diabetes (Akira S., et al., Adv. Immunology, 1993, 54, 1-78: Kallen K., et al., Exp. Opin.Invest.Drugs, 1997, 6, 237-266).
  • STAT3 structural activation and overexpression appears to be involved in many forms of cancer, including myeloma, breast carcinoma, prostate cancer, brain tumors, head and neck carcinoma, melanoma, leukemia and lymphoma, especially chronic myelogenous leukemia and multiple myeloma.
  • atopic dermatitis is a representative known among autoimmune skin diseases.
  • Atopic dermatitis is a chronic and recurrent skin disease that is accompanied by swelling, eczema, itching, and inflammatory reactions of the skin. Pathological and genetic mechanisms of action are not yet known.
  • Atopy is an immune response that has a complex effect of certain sensitive genes, the environment, the extent of damage to the skin's outer walls, and immune factors.
  • Atopic dermatitis is defined as a typical Th2 type of immune disease (Mamessier, E., et al, European Journal of Dermatology, 2006, 16 (2), 103), which suggests that the Th2 immune response plays an important role in the initiation of atopic dermatitis. Because it is in charge.
  • the allergen When the allergen, an antigen, enters the body through the skin, it recognizes and responds to antigen presenting cells located on the skin. At this time, the allergen specifically induces Th2 type immune response.
  • the Th2 phenotype APCs recognize T cells and induce differentiation into Th2 cells.
  • Th2 cells express large amounts of Th2 forms of cytokines, Th2 forms of cytokines activate mast cells to stimulate the secretion of water-soluble mediators such as histamine, and stimulate B cells to promote IgE production Let's do it. These mediators again induce immune cells to the site of inflammation to induce an enhanced Th2 form of immune response, which eventually leads to atopic dermatitis.
  • Target candidate genes for the treatment of atopic dermatitis include FceR1b having high affinity for IgE, IL-4, IL-5, IL-13, a type of Th2 cytokine, and eotaxin, a kind of chemokine, RANTES and the like and play a large role in inducing atopy (Hoffjan, S., et al., Journal of Molecular Medicine, 2005, 83 (9), 682-692: Cookson, W., Nat. Rev. Immunol. , 2004, 4 (12), 978-988). Therefore, inventing a substance that regulates the expression of Th2 cytokine and chemokine genes will help in the treatment of a variety of immune and human diseases, including atopy.
  • the present inventors have made diligent efforts to find therapeutic substances for TLR and IL-6 mediated diseases.
  • the invention of a pharmaceutical composition for preventing and treating 6-mediated diseases has been completed.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of TLR and IL-6 mediated diseases, including oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of TLR and IL-6 mediated diseases, comprising red soybean extract or fractions thereof comprising the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is the oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof; Or an external preparation for skin, health functional food, or personal hygiene product for preventing or ameliorating TLR and IL-6 mediated diseases, including red soybean extract or a fraction thereof including the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • an external preparation for skin, health functional food, or personal hygiene product for preventing or ameliorating TLR and IL-6 mediated diseases, including red soybean extract or a fraction thereof including the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the red soybean extract or compound of the present invention is derived from a natural product that has been used as a natural medicine for a long time and has no side effects, and is derived from TLR-3 and TLR derived from poly (I: C) and Poly (I), which are synthetic analogues of dsRNA and ssRNA.
  • TLR and IL-6 mediated diseases by inhibiting the activation of -7 and blocking signaling pathways including NF- ⁇ B and inhibiting the transcriptional activity and phosphorylation of STAT3, an inflammation-related transcription factor activated by IL-6,
  • a prophylactic or therapeutic agent such as atopic dermatitis or arthritis.
  • Figure 1a is a chromatogram showing the results of HPLC of red bean methanol extract, hexane fraction, ethyl acetate fraction and water fraction.
  • Figure 1b is a chromatogram showing the HPLC performance of the red bean methanol extract, hexane fraction, ethyl acetate fraction and water fraction.
  • 2A and 2B are graphs and tables showing the effect of inhibiting SEAP activity increased by poly (I) treatment in THP-1-blue cells of methanol extract, hexane fraction, ethyl acetate fraction and water fraction of red soybean.
  • Figure 3 is a graph showing the effect of inhibiting SEAP activity increased by poly (I: C) treatment in THP-1-blue cells of red soybean methanol extract.
  • FIG. 4C to 4E show the phosphorylation inhibitory effect of IKK ⁇ / ⁇ (FIG. 4C), I ⁇ B (FIG. 4D), p38 and JNK (FIG. 4E), which are phosphorylated by poly (I) treatment in THP-1 cells of methanol extracts of red beans Western blot picture showing.
  • 5C to 5E are phosphorylated IKK ⁇ / ⁇ (FIG. 5C), I ⁇ B (FIG. 5D), p38 and JNK (FIG. 5E) phosphorylated by poly (I: C) treatment in THP-1 cells of redox methanol extract. Western blot photograph showing inhibitory effect.
  • Figure 5f is a Western blot photograph showing the phosphorylation inhibitory effect of IRF3 is phosphorylated activated by poly (I: C) treatment in THP-1 cells of red soybean methanol extract.
  • Figures 6a to 6e are inflammatory cytokines TNF ⁇ (Fig. 6a), inflammatory cytokines IL-6 (Fig. 6b), chemokine RANTES (Fig. 6c), IFN ⁇ (FIG. 6D) and chemokine MCP-1 (FIG. 6E) are graphs showing the mRNA expression inhibitory effect.
  • Figure 7a is a inflammatory factor TNF ⁇ (FIG. 7a), inflammatory factor IL-6 (FIG. 7b), a cell adhesion factor ICAM-1 induced by poly (I: C) treatment in THP-1 cells of the red Soybean methanol extract 7C is a graph showing the mRNA expression inhibitory effect of chemokine MCP-1 (FIG. 7D).
  • Figure 8a is a photograph showing the effect of inhibiting the STAT3 phosphorylation induced by IL-6 treatment in Hep3B cells of red soybean methanol extract.
  • Figure 8b is a photograph showing the effect of inhibiting STAT3 phosphorylation induced by IL-6 treatment in Hep3B cells of the compound of formula (I) purified from red soybeans.
  • Figure 9 is a photograph showing the back skin of NC / Nga mice to improve the symptoms for atopic dermatitis induced by DNCB in NC / Nga mice of red soybean methanol extract.
  • FIG. 10 is a graph showing skin severity of an effect of improving the symptoms of atopic dermatitis induced by DNCB in NC / Nga mice of red bean methanol extract.
  • FIG. 11 is a graph showing the numerical value of eosinophil changes in blood for atopic dermatitis induced by DNCB in NC / Nga mice of red bean methanol extract.
  • FIG. 12 is a photograph showing the state of the front and rear legs of the normal DBA / 1 OlaHsd and CIA-induced mouse model.
  • Figure 13 is a graph showing the effect of improving the symptoms for CIA-induced arthritis in DBA / 1 OlaHsd mice of the red soybean methanol extract as the degree of CIA induction.
  • FIG. 14 is a graph showing the effect of inhibiting STAT3 luciferase activity induced by IL-6 treatment in Hep3B cells according to the concentration of oleanolinic acid or oleanolinic acid acetate.
  • FIG. 15 is a photograph showing the effect of inhibiting the differentiation of phagocytic cells separated from mouse bone marrow cells into osteoclasts.
  • Figure 16 is a photograph showing the effect of inhibiting the differentiation of phagocytic cells into osteoclasts oleanolinic acid acetate isolated from mouse bone marrow cells.
  • the present invention comprises a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, for the prevention or treatment of TLR and IL-6 mediated diseases It provides a pharmaceutical composition.
  • the present inventors obtained respective methanol extracts from red beans and red beans belonging to red bean sprouts, and fractionated the methanol extracts with water, n-hexane, ethyl acetate and the like to obtain respective fractions.
  • red beans and red beans showed similar HPLC chromatograms, and oleanolic acid acetate (Formula 1) and stigmasterol (stigmasterol), which are active ingredients, were extracted from the n-hexane fraction.
  • Formula 2 was each purified.
  • Compounds of the following formulas (1) or (2) may be obtained by a commercially available compound or a known method. Extraction, separation and purification of Compounds 1 and 2 from red soybeans according to the present invention are specifically as follows. The hexane soluble fraction of red soybean is separated by silica gel column chromatography using a mixed solvent of hexane and ethyl acetate. Among them, Fr. 3 and Fr. 4 were recrystallized using methanol, and the pure compounds of Formulas 1 and 2 were separated.
  • TLR and IL-6 mediated diseases of the present invention means that NF- ⁇ B activated by activation of TLR-3 and TLR-7 belonging to Toll-like receptors (TLR) moves to the nucleus. It is a generic term for diseases caused by the expression of various cytokine and cell junction molecule-related genes in the nucleus and the inhibition of STAT3 activation by IL-6.
  • the TLR and IL-6 mediated diseases are not particularly limited thereto, but may be largely inflammatory diseases, autoimmune diseases, cancer diseases or metabolic diseases.
  • the inflammatory disease is a generic term for a disease of which inflammation is the main lesion, and for the purposes of the present invention, it may be an inflammatory disease preferably mediated by the TLR and IL-6.
  • the inflammatory disease is not limited thereto, but preferably ssRNA and dsRNA virus infections, sepsis, multiple chondritis, scleroderma, dermatitis, eczema, gout, periodontal disease, Behcet's syndrome, edema, vasculitis, Kawasaki disease, diabetic retinitis, Autoimmune pancreatitis, vasculitis, glomerulonephritis, acute and chronic infections of bacteria and fungi, acute and chronic bronchitis, and influenza infections and the like.
  • the oleanolinic acid acetate of Formula 1 inhibits the STAT3 luciferase activity in a concentration-dependent manner (Table 7), in particular, can exhibit a prophylactic and therapeutic effect of inflammatory diseases significantly superior to the known oleolinic acid
  • the pharmaceutical composition containing the compound as an active ingredient is effective in the prevention or treatment of inflammatory diseases associated with the activation of STAT3 by IL-6.
  • the autoimmune disease is a generic term for a disease in which an immune response to a pathogen's own antigen is a direct or indirect cause.
  • autoimmunity mediated by the TLR and IL-6 is preferable. May be a disease.
  • the autoimmune disease is not limited thereto, but may preferably include atopic dermatitis, arthritis, psoriasis, asthma, graft-versus-host disease, immunodeficiency, systemic lupus erythematosus, and multiple sclerosis. Sex dermatitis or arthritis.
  • TLRs stimulate the immune response and are involved in the development of autoimmune diseases
  • STAT3 activated by IL-6 functions as an important transcription factor in a variety of autoimmune diseases, and accordingly concentration-dependent STAT3 luciferase activity in the present invention. It was confirmed that the oleanolinic acid acetate of Formula 1, which inhibited the inhibition, was effective in autoimmune diseases mediated by TLR and IL-6.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound represented by Formula 1 of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient may exhibit a therapeutic effect by a different mechanism of action than that by a conventional mechanism of action of antioxidants.
  • the cancer disease refers to a disease that forms a tumor or a tumor composed of undifferentiated cells ignoring a necessary state in a tissue and undergoes unlimited proliferation, and is a cancer mediated by TLR and IL-6 for the purposes of the present invention.
  • the cancer disease may include, but is not limited to, myeloma, breast carcinoma, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, leukemia and lymphoma.
  • STAT3, activated by IL-6 is associated with several forms of cancer, including its structural activation and overexpression, including chronic myelogenous leukemia or multiple myeloma, thereby inhibiting the activity of the STAT3 and thus preventing or treating the cancer disease.
  • the metabolic disease in the present invention is a generic term for a disease caused by metabolic disorders in vivo, and for the purposes of the present invention, it may be a metabolic disease preferably mediated by TLR and IL-6.
  • the metabolic disease may include, but is not limited to, osteoporosis, arteriosclerosis, and myocardial infarction, and more preferably, osteoporosis. Excessive production of IL-6 has been found to be particularly involved in osteoporosis, so that the compositions of the present invention can prevent or treat IL-6 mediated diseases.
  • the compound of formula (1) when treating the compound of formula (1), by confirming that the number and size of osteoclasts decreases in a concentration-dependent manner, the compound inhibits the differentiation of osteoclasts, thereby showing an effect in the prevention and treatment of osteoporosis It was confirmed (Fig. 16).
  • the TLR and IL-6 mediated diseases may include all of various diseases mediated by TLR and IL-6 in addition to the above diseases, for example, anaphylactic or hypersensitivity reactions, Alzheimer's disease, cachexia, obesity, and hyperimmunity. Globulinemia, Méimba's disease, pain, irritable lung disease, endocrine ophthalmic diseases, and the like.
  • the inventors significantly inhibited the activity of SEAP induced by poly (I) and poly (I: C) by oleanoline acetate, whereas stigmasterol was poly (I) and poly It was confirmed that the inhibitory activity against the activity of SEAP induced by (I: C) was not shown (Table 4).
  • the compound of Formula 1 inhibits TLR7 and TLR3 signaling pathways induced by ssRNA poly (I) and dsRNA poly (I: C), and fractions of TLR7 are induced by poly (I). Since signaling pathways can be inhibited, they have been found to be suitable for the prevention or treatment of TLR and IL-6 mediated diseases.
  • the present inventors found that the compounds of Formulas 1 and 2 inhibited STAT3 luciferase activity in a concentration-dependent manner (Table 7), and the compounds of Formula 1 were significantly higher than the known oleolinic acid. It was confirmed that it can exhibit a prophylactic and therapeutic effect of excellent inflammatory diseases (Fig. 14). Therefore, it was confirmed that the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention can be used for the prevention or treatment of diseases related to the activation of STAT3 by IL-6.
  • compositions comprising a compound of Formula 1 of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may further comprise suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • suitable carriers excipients or diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the content of the oleanolinic acid acetate, salts, extracts or fractions thereof contained in the composition is not particularly limited, but is 0.0001 to 10% by weight, preferably 0.001 to 1% by weight based on the total weight of the composition. It is preferable to manufacture.
  • salts refers to a salt in a form that can be used pharmaceutically among salts in which cations and anions are bound by an electrostatic attraction, and generally include metal salts and organic bases. Salts, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
  • the metal salt may be an alkali metal salt (sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt, barium salt, etc.), aluminum salt, or the like;
  • Salts with organic bases include triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, N-dibenzylethylenediamine Salts and the like;
  • Salts with inorganic acids can be salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like;
  • Salts with organic acids can be salts with formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, benzenesulf
  • compositions comprising a compound of formula (1) of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof are oral formulations, external preparations, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. It can be formulated in the form of suppositories and sterile injectable solutions.
  • carriers, excipients and diluents which may be included in the composition comprising red soybean extract and fractions include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose in the red bean extract and fractions thereof. Mixed with gelatin.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose in the red bean extract and fractions thereof.
  • lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used to include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the oleanolinic acid acetate, salts, extracts or fractions thereof of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 100 mg / kg per day. , May be administered once a day or may be divided several times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the present invention provides a method for treating TLR and IL-6 mediated disease, comprising administering the composition to a TLR and IL-6 mediated disease suspect.
  • the suspected TLR and IL-6 mediated disease means all animals including humans who may or may develop TLR and IL-6 mediated disease, and the compound of Formula 1 of the present invention or a pharmaceutical thereof
  • a pharmaceutical composition comprising an acceptable salt as an active ingredient to a suspected TLR and IL-6 mediated disease
  • the individual can be treated efficiently.
  • TLR and IL-6 mediated diseases and administration are as described above.
  • the present invention is for the prevention or treatment of TLR and IL-6 mediated diseases comprising red soybean extract or fractions thereof comprising the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can prevent or treat TLR and IL-6 mediated diseases by including red soybean extract or fractions thereof including the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • TLR and IL-6 mediated diseases are preferably autoimmune diseases, cancer diseases Or metabolic disease.
  • the red soybean extract improves the CIA induction in arthritis model mouse which is a representative disease of autoimmune diseases (Fig. 13), red soybean extract in the atopic dermatitis animal model is a representative autoimmune skin disease By confirming the improvement of symptoms (Figs. 9 and 10), it was confirmed that the red soybean extract is an effective ingredient for preventing or treating autoimmune diseases.
  • the red soybean extract when the red soybean extract is treated, by confirming that the number and size of the osteoclasts decreases in a concentration-dependent manner, the extract inhibits the differentiation of the osteoclasts, thereby showing an effect in the prevention and treatment of osteoporosis. It was confirmed (Fig. 15).
  • red cow of the present invention means a seed of the legume (Phaseolus angularis Wight) of the legume, in the form of a columnar shape is a little flat, and the seedling is reddish brown smooth and glossy, pharmacologically active In terms of diuresis, anti-inflammatory, drainage, antipyretic, systemic edema, cirrhosis, jaundice, boils, purulent diseases, edema, keratin, sogal, dysentery and diarrhea.
  • the therapeutic use of the disease induced by the TLR-3 and TLR-7 activation of the present invention is not known, it was first identified by the inventors.
  • the red beans are used to mean seeds of red beans (Phaseoli angularis Wight) or red beans (or vine red beans, Phaseolus calcaratus Roxburgh), but are not limited thereto.
  • red bean extract refers to an extract obtained by extracting red soybean.
  • the red soybean extract refers to a ground product of red beans, water, alcohol having 1 to 6 carbon atoms (methanol, ethanol, butanol, etc.).
  • the result is an extract, a dilution or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract, or these modifiers or purified products It includes everything.
  • the red bean pulverized product has 1 to 6 carbon atoms such as water, methanol, ethanol, butanol, etc. in a volume of about 2 to 20 times the dry weight, preferably about 3 to 5 times the dry weight.
  • a polar solvent of the alcohol of (C6) or a mixed solvent having a mixing ratio of about 1: 0.1 to 1:10 thereof is used as the elution solvent, and the extraction temperature is 20 to 100 ° C, preferably at room temperature, and the extraction period is about
  • Extraction may be performed using an extraction method such as hot water extraction, cold needle extraction, reflux cooling extraction, or ultrasonic extraction for 12 hours to 4 days, preferably 3 days.
  • the extract is filtered 1 to 5 times by cold extraction and subjected to filtration under reduced pressure, and the filtrate is concentrated under reduced pressure at 20 to 100 ° C., preferably at room temperature using a vacuum rotary condenser, and soluble in water, lower alcohols, or a mixed solvent thereof.
  • One red bean (red bean and red bean) crude extract can be obtained.
  • fraction of the present invention means the result obtained by the fractionation method of separating a specific component or a specific group from a mixture comprising various components.
  • the extract of red soybean may be the result of fractionation by a solvent fractionation method using a solvent such as n-hexane, ethyl acetate, and includes both a polar solvent fraction and a nonpolar solvent fraction, specifically, a hexane fraction, Ethyl acetate fraction and water fraction can all be used.
  • the red soybean crude extract obtained above is suspended in distilled water, and then added with a nonpolar solvent such as hexane and ethyl acetate in a volume of about 1 to 100 times, preferably about 1 to 5 times, the suspension. It can be obtained by extracting and separating the nonpolar solvent soluble layer from 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times. It is also possible to further carry out conventional fractionation processes (Harborne J. B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. P6-7, 1998).
  • a nonpolar solvent such as hexane and ethyl acetate
  • the soluble extract of each of the small soybean sauce can be obtained by continuous extraction using an equivalent amount of n-hexane and ethyl acetate solvent, more specifically, the red soybean crude extract in water
  • the same amount of n-hexane is mixed and fractioned to obtain n-hexane soluble fraction and water soluble fraction, and ethyl acetate is added to the water soluble fraction to obtain ethyl acetate soluble fraction and water soluble fraction.
  • n-hexane is mixed and fractioned to obtain n-hexane soluble fraction and water soluble fraction
  • ethyl acetate is added to the water soluble fraction to obtain ethyl acetate soluble fraction and water soluble fraction.
  • the present inventors significantly inhibited the activity of SEAP induced by poly (I) in methanol extract, hexane fraction, ethyl acetate fraction and water fraction of red soybean (FIG. 2), poly Significantly inhibited the activity of SEAP induced by (I: C) by methanol extracts of redox (FIG. 3), and 95% methanol extracts of redox were induced by poly (I) and poly (I: C) Significantly inhibited the activity of SEAP, but 50% ethanol extract showed a low inhibitory activity (Table 2 and Table 3), red pepper extract is inflammatory induced by poly (I) or poly (I: C) It was confirmed that the expression of the factor is inhibited (FIGS.
  • the red soybean extract of the invention inhibits the TLR7 and TLR3 signaling pathways induced by ssRNA poly (I) and dsRNA poly (I: C), and fractions thereof are signals of TLR7 induced by poly (I). Since the route of delivery can be inhibited, it has been found to be suitable for the prevention or treatment of TLR and IL-6 mediated diseases.
  • NF- ⁇ B p65, p50
  • AP-1 pc-Jun
  • red soybean extract showed concentration-dependent inhibitory activity in phosphorylation activation of IRF3, one of the signaling processes of TLR3 induced by poly (I: C) (FIG. 5F).
  • the red soybean extract in the present invention was found to be suitable for preventing or treating TLR and IL-6 mediated diseases.
  • the inventors of the red soybean extract, hexane fraction, ethyl acetate fraction and water fraction inhibit the STAT3 luciferase activity in a concentration-dependent manner (Table 5 and Table 6), atopic dermatitis
  • the symptoms for atopic dermatitis were improved (FIGS. 9 and 10), and eosinophil levels were confirmed to be reduced compared to the atopic dermatitis-induced and non-administered controls (FIG. 11).
  • red soybean extract improved the degree of CIA induction in arthritis (collagen-induced arthritis, CIA) model mice (FIG. 13).
  • redox extracts or fractions thereof comprising the compound of formula 1 of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be used for the prevention of diseases associated with activation of STAT3 by IL-6, such as atopic dermatitis, arthritis, and the like. Or it can be seen that it can be used for treatment.
  • the pharmaceutical composition comprising the red soybean extract or fractions thereof of the present invention may further include a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the preparation of the pharmaceutical composition. This is as described above.
  • the present invention provides a method for treating TLR and IL-6 mediated disease, comprising administering the composition to a TLR and IL-6 mediated disease suspect.
  • the composition is a pharmaceutical composition comprising red soybean extract or fractions thereof comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as the active ingredient, and the TLR and IL-6 mediated diseases, suspects and administration This is as described above.
  • the present invention is a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
  • the present invention provides a skin external preparation for preventing or ameliorating TLR and IL-6 mediated diseases, including red soybean extract or a fraction thereof including the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. .
  • the compound of Formula 1, red soybean extract or fractions thereof are as described above, and the active ingredient may be included in an external preparation for skin that can prevent or improve TLR and IL-6 mediated diseases.
  • the external preparation for the skin is not particularly limited thereto, and may be preferably used in the form of an ointment, lotion, spray, patch, cream, powder, suspension, gel or gel.
  • the present invention is a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving TLR and IL-6 mediated diseases, including red soybean extract or a fraction thereof including the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. do.
  • the compound of Formula 1, red soybean extract or fractions thereof are as described above, and the active ingredient may be included in a health functional food that can prevent or improve TLR and IL-6 mediated diseases.
  • the compound of formula 1 of the present invention is derived from the extract of red soybean, which has been conventionally used as a medicinal agent, and its safety has been proved, so that it may be used as a food composition.
  • the compound of Formula 1, a pharmaceutically acceptable salt thereof, red soybean extract or a fraction thereof including the same may include 0.01 to 100% by weight, more preferably 1 to 80% by weight, based on the total weight of the food composition.
  • food is a beverage, it may be included in a ratio of 1 to 30 g, preferably 3 to 20 g, based on 100 ml.
  • the composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve the smell, taste, time and the like.
  • it may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like.
  • it may include minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu). It may also contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine and the like.
  • preservatives include potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dihydroacetate, etc.
  • fungicides bleaching powder and highly bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.
  • antioxidants butylhydroxyanisol (BHA), butylhydroxytoluene (BHT)
  • Colorants such as tar pigments), colorants (such as sodium nitrite, sodium nitrite), bleach (sodium sulfite), seasonings (such as MSG glutamate), sweeteners (ducin, cyclate, saccharin, sodium, etc.),
  • Food additives such as fragrances (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum, potassium D-tartrate, etc.), reinforcing agents, emulsifiers, thickeners (pigments), coatings, gum herbicides, foam inhibitors, solvents, and improving agents. Can be added.
  • the additive is selected according to the type of food and used in an appropriate amount.
  • Various functional foods may be prepared by using a food composition including the compound of Formula 1, a pharmaceutically acceptable salt thereof, red soybean extract or a fraction thereof.
  • the term "functional food” is the same term as food for special health use (Food for special health use, FoSHU), in addition to the nutritional supply of the medical, medical effect is processed so that the bioregulatory function appears efficiently It means high food.
  • the term “health food” means a food having an active health maintenance or promotion effect compared to the general food
  • health supplement food means a food for health supplement purposes.
  • the terms functional food, health food, dietary supplement are used interchangeably.
  • the food may be prepared in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. in order to obtain useful effects in the improvement and recovery of TLR and IL-6 mediated diseases.
  • the dietary supplement comprising the composition is not particularly limited, but preferably margarine, fat continuous or water continuous or bicontinuous spreads, fat reduced spreads, chocolate, or chocolate.
  • Confectionery such as coatings or fillings or bakery, ice cream, ice cream coatings, ice cream ingredients, dressings, mayonnaise, cheese, cream substitutes, dry soups, drinks, cereal bars, sauces, snack bars, dairy products, clinical nutrition, Those manufactured in the form of pediatric foods and the like can be used.
  • the present invention is a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof; Or, to provide a personal hygiene article for the prevention or improvement of TLR and IL-6 mediated diseases comprising red soybean extract or fractions thereof comprising the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient do.
  • the compound of Formula 1, red soybean extract or fractions thereof are as described above, and the active ingredient may be included in a personal hygiene product capable of preventing or improving TLR and IL-6 mediated diseases.
  • the personal hygiene products are not particularly limited, but preferably soap, cosmetics, wet wipes, tissue paper, shampoo, skin cream, face cream, toothpaste, lipstick, perfume, make-up, foundation, ball touch, mascara, eye Shadows, sunscreen lotions, hair care products, air freshener gels, cleansing gels, and the like.
  • Red bean red bean or red bean
  • Red bean was washed with water, dried in the shade, and then powdered by Waring brand. 20 kg of powdered red beans were put in 100 l of methanol and extracted by cold extraction at room temperature for 3 days, filtered under reduced pressure with a filter paper (Watman, USA), and then the filtrate was extracted by removing the methanol solvent at room temperature with a vacuum rotary concentrator. As a red bean extract 450g was prepared.
  • the red soybean extract was suspended in 1 L of water and mixed by the addition of the same amount of n-hexane, and this process was repeated four times to repeat the process four times. 1 L of water-soluble fraction and n-hexane-soluble fraction. 4 liters were obtained.
  • n-hexane soluble fraction was then concentrated under reduced pressure to obtain 50 g of n-hexane soluble extract.
  • the obtained ethyl acetate soluble fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 35 g of ethyl acetate soluble extract, and the remaining water soluble fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 35 g, which was used as a water fraction.
  • HPLC HPLC was used for the Agilent Technologies 1200 series, and the analytical column was used for the Y 'J'sphere ODS-H80 (YMC, 4 ⁇ m, 4.6mm ID x 150mm) column (Fig. 1a and 1b).
  • the analytical solvent was analyzed at 210nm while flowing 1 ml / min 5% ⁇ 90% CH 3 CN, the sample was injected 10 ⁇ L (Table 1).
  • Figure 1a is a chromatogram showing the results of HPLC performance of methanol extract, hexane fraction, ethyl acetate fraction and water fraction of red beans
  • Figure 1b shows the HPLC performance of methanol extract, hexane fraction, ethyl acetate fraction and water fraction of red beans Chromatogram.
  • catechin-7-glucopyranoside catechin-7-glucopyranoside, catechin-7-glu
  • rutin oleanolic acid acetate
  • stigmasterol stigmasterol
  • Example 1-2 80 g of the n-hexane fraction obtained in Example 1-2 was subjected to silica gel column chromatography using a step gradient solvent system composed of hexane: ethyl acetate (100: 1 to 1: 1).
  • Five active fractions (Fr.1-5) were obtained by the application of chromatography.
  • By re-crystallization by adding methanol to fractions 3 and 4 in the active fraction two compounds showing white powdery phase were purified.
  • THP1-Blue-CD14 cells were seeded in 96-well plates at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / 100 ⁇ l and incubated at 37 ° C. for 3 hours.
  • the red soybean extract and each fraction obtained in Examples 1-1 to 1-2 were pretreated in a cell culture solution for 1 hour, and 50 ⁇ g / ml of Poly (I) or 100 ⁇ g / ml of poly (I: C).
  • NFkB / AP-1 dependent SEAP inhibitory effect was measured by treating (FIGS. 2 and 3).
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of inhibiting SEAP activity increased by poly (I) treatment in THP-1-blue cells of methanol extract, hexane fraction, ethyl acetate fraction and water fraction of red soybean, and FIG. It is a graph showing the effect of inhibiting SEAP activity increased by poly (I: C) treatment in THP-1-blue cells.
  • poly (I) and poly (I: C) were derived from 95% and 50% methanol extracts derived from red beans and red beans derived from red beans in order to confirm the difference according to the source of the red soybean extract.
  • the inhibitory activity of the SEAP was measured (Tables 2 and 3).
  • Example 3 Effect of Red Soybean Methanol Extract on Inflammatory Factor Expression Induced by poly (I) or poly (I: C)
  • THP-1 cells were divided into 12 well plates at 5 ⁇ 10 5 cells per well, and no FBS was added.
  • the resultant solution was diluted with DMSO (dimethylsulfoxide) and pretreated for 1 hour so that the final concentration of the red bean methanol extract was 60 ⁇ g / ml, and 50 ⁇ g / ml poly (I) or 100 ⁇ g / ml poly (I: C). Treatment was incubated at 37 °C for 6 hours.
  • concentration and purity of RNA were measured by 2100 Bioanalyzer system (Agilent Technologies), and cDNA was synthesized using Taqman reverse transcription reagents kit (Applied Biosystems).
  • the expression level of inflammatory factors was measured by real-time PCR using the SYBR Green PCR master mix kit (Applied Biosystem) (Figs. 6 and 7).
  • FIG. 6 is a graph showing the inhibitory effect of inflammatory cytokines induced by poly (I) treatment in THP-1 cells of redox methanol extract
  • FIG. 7 is a poly (I: C) in THP-1 cells of redox methanol extract.
  • Red Soybean Methanol Extract 60 ⁇ g / ml
  • the level was significantly inhibited in each inflammatory factor
  • the Red Soybean Methanol Extract was shown to be poly (I) or poly (I: It was confirmed that it inhibits the expression of inflammatory factors induced by C).
  • TLRs Toll-like receptors
  • MyD88 or TRIF adapters move to TLRs.
  • TLR3 When the ligand binds ssRNA to TLR7 and dsRNA to TLR3, signaling is initiated intracellularly.
  • TLR3 In common activation of MAPK / AP-1, TLR3 additionally activates the IRF-3 pathway to produce inflammatory cytokines. Therefore, the effect of the red soybean extract of the present invention on the signaling pathways of TLR7 and TLR3 was confirmed through the following experiment.
  • THP-1 cells were divided into 1.5 ⁇ 10 6 cells per well and incubated for 12 hours in RPMI 1640 medium without FBS. Thereafter, the extract was pretreated at a concentration of 30, 60 or 100 ⁇ g / ml for 1 hour, and treated with 50 ⁇ g / ml of poly (I) or 100 ⁇ g / ml of poly (I: C) for 3 hours, respectively. After 3 hours, the cells were transferred to a tube, the medium was removed by centrifugation, washed once with PBS, and the nuclear extract and total protein were extracted using NE-PER Nuclear extraction reagents (Thermo scientific) and Cell lysis buffer. Western blot analysis was performed. NFkB p65 / p50 and pc-Jun were identified in the nuclear extract, and MAPKs, IKB, IKK isoforms, and IRF3 were measured in total proteins (FIGS. 4 and 5).
  • Figure 4a is a Western blot photograph showing the effect of inhibiting the activity of NF ⁇ B P50 that is activated by poly (I) treatment in THP-1 cells of red soybean methanol extract to move to the nucleus
  • Figure 4b is C-Jun of AP-1 Western blot picture showing the effect of inhibiting activity
  • Figure 4c is a Western blot picture showing the phosphorylation inhibitory effect of IKK ⁇ / ⁇
  • Figure 4d is a Western blot picture showing the phosphorylation inhibitory effect of I ⁇ B
  • Figure 4e is p38 and Western blot photograph showing the phosphorylation inhibitory effect of JNK.
  • Figure 5a is a Western blot photograph showing the effect of inhibiting the activity of NF ⁇ B P65 / p50 is activated by poly (I: C) treatment in THP-1 cells of the red soybean methanol extract to move to the nucleus
  • Figure 5b is AP Western blot picture showing the effect of inhibiting the C-Jun activity of -1
  • Figure 5c is a Western blot picture showing the phosphorylation inhibitory effect of IKK ⁇ / ⁇
  • Figure 5d is a Western blot picture showing the phosphorylation inhibitory effect of I ⁇ B FIG.
  • FIG. 5E is a Western blot photograph showing the phosphorylation inhibitory effect of p38 and JNK phosphorylated by poly (I) treatment in THP-1 cells of red bean methanol extract
  • FIG. 5F is a Western blot photograph showing the phosphorylation inhibitory effect of IRF3. .
  • the red soybean extract was found to decrease concentration-dependently the nuclear transfer of NFkB and pc-Jun by poly (I) and poly (I: C) (FIGS. 4A and 4B). , 5a and 5b), it was confirmed that the activation of IKK, IkB, which is the upper level of NFkB, also decreased in a concentration-dependent manner (FIGS. 4C, 4D, 5C, and 5D). , p-38 activation also decreased concentration-dependently by the extract (Figs. 4e and 5e), red-bean extract showed a concentration-dependent inhibitory activity in P-IRF3 activation in TLR3 signaling It was confirmed that (Fig. 5f).
  • red pepper extract inhibited the expression of inflammatory factors by inhibiting the activation of NFkB and MAPKs / AP-1 in TLR-7 and TLR-3 signaling pathways.
  • PStat3-Luc and pcDNA3.1 (+) (Clontech laboratories, Palo Alto, Calif.) Were transfected into Hep3B cells (ATCC HB-8064) with lipofectamin plus (Infratrogen, Carlsbad, Calif., USA). . After two days, hygromycin was treated (100 ⁇ g / ml) to obtain a clone stably expressing luciferase. Whether luciferase was stably expressed in the clones was confirmed by luciferase assay.
  • the cultured cells were washed with PBS, 50 ⁇ l lysis buffer (luciferase assay system, promega, USA) was added and stirred for 20 minutes, and then 30-100 ⁇ l luciferase substrate (luciferase assay system, promega, USA) was added thereto. Color development was measured within 5 minutes with a luminometer (EG & G BERTHOLD, USA) (Tables 5 and 6).
  • Hep3B cells were aliquoted to 6 ⁇ 10 5 cells per well and cultured at about 80% in a culture dish, exchanged with serum-free medium for 12 hours, and the samples were treated for 60 minutes as follows.
  • Protein concentration was quantified using a DC protein test kit (Bio-Rad, USA), and loaded on a 4-12% SDS polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and electrophoresed at 175 mA for 2 hours. After electrophoresis, the protein of the gel was transferred to a PVDF membrane (Westran® S, pore size 0.2 mm; Whatman, USA) for 90 minutes at 35V. The transferred membrane was blocked with Tris-buffer solution (T-TBS; 50 mM Tri-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.2% Tween-20, 5% skim milk; Sigma, USA) for 1 hour at room temperature and Washed five times.
  • Tris-buffer solution T-TBS; 50 mM Tri-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.2% Tween-20, 5% skim milk; Sigma, USA
  • the membrane was treated with a polyclonal antibody of phospho-STAT3 (1: 1000 dilution) at 4 ° C. for 12 hours as a primary antibody. After washing 5 times with T-TBS, HRP-binding anti-mouse antibody (1: 5000 dilution) was reacted with secondary antibody for 1 hour. After washing with T-TBS the film was developed using an ECL kit (Amersham, USA) in the dark (FIGS. 8A and 8B).
  • Figure 8a is a photograph showing the effect of inhibiting the STAT3 phosphorylation induced by IL-6 treatment in Hep3B cells of the red Soybean methanol extract
  • Figure 8b is induced by IL-6 treatment in Hep3B cells of Compound 1 isolated from the red Soybean It is a photograph showing the effect of inhibiting STAT3 phosphorylation.
  • the red soybean extract and the compound of Formula 1 was found to exhibit IL-6 induced STAT3 phosphorylation inhibitory activity.
  • NC / Nga mice used in experimental animal models were purchased from SLC, Inc. (Japan), and these mice were subjected to constant temperature (23 ⁇ 3 ° C), humidity ( 55 ⁇ 15%) and irradiation (7:00 to 19:00) was raised. After purchase, 8-week-old female NC / Nga mice were used for experiments after being stabilized for 1 week in SPF animal kennel.
  • SPPF Specific Pathogen Free
  • NC / Nga mice were divided into three experimental groups. Specifically, 1 negative control group that did not induce atopic dermatitis, 2 atopic dermatitis induction and non-dose control group and 3 atopic dermatitis induction and administration group.
  • Red bean methanol extract an activity evaluation sample
  • 1% DNCB (2,4-Dinitrochlorobenzene) was diluted to 0.2% to induce atopic dermatitis, and 100 ⁇ l was applied to the entire back skin of NC / Nga mice for 4 days at the same time. Sensitized. After application of DNCB, skin severity was examined as compared to NC / Nga mice inducing atopic dermatitis and non-dose control groups and dosing groups.
  • Skin severity for atopic dermatitis is quantified for each symptom using clinical indicators of erythema, edema, dryness, and epidermal exfoliation. These values are shown by the average value of the experimental group. The values for each symptom were expressed in lightness (score 1), moderate (score 2), and severeness (score 3) according to the symptoms through visual observation, and the skin severity was calculated by the following formula (Fig. 9 and 10).
  • Skin severity ⁇ Number of individuals (erythema + edema + dryness + epidermal detachment) / number of individuals
  • FIG. 9 is a photograph showing the effect of improving the symptoms of DNCB-induced atopic dermatitis in NC / Nga mice of the red Soybean Methanol extract
  • Figure 10 is the NC / Nga of red pepper methanol extract It is a graph showing the skin severity of the effect of improving the symptoms for atopic dermatitis induced by DNCB in mice.
  • the negative control group that did not induce atopic dermatitis did not observe any clinical symptoms, including atopic dermatitis, but in the atopic dermatitis induced and non-administered control group after 7 days of age after applying the DNCB erythema and It was confirmed that symptoms of atopic dermatitis, including symptoms of edema and the like, occurred.
  • atopic dermatitis induction and administration group was ingested red soybean methanol extract at a concentration of 50 mg / kg, 250 mg / kg, 500 mg / kg for one day, and resulted in atopic dermatitis and non-administration control in each dosing group. Compared to erythema and edema, the effects of atopic dermatitis were improved.
  • the changes in eosinophil counts were examined for the negative control group that did not induce atopic dermatitis of Example 6, the atopic dermatitis induction and non-dose control group, and the atopic dermatitis induction and administration group.
  • eosinophil levels in blood were measured using an automated hematology analyzer at the expense of NC / Nga mice in each experimental group 22 days after the first day of application of DNCB (FIG. 11).
  • FIG. 11 is a graph showing the numerical value of eosinophil changes in blood for atopic dermatitis induced by DNCB in NC / Nga mice of red bean methanol extract.
  • eosinophil levels were increased in atopic dermatitis-induced and non-dose control groups compared to the negative control group that did not induce atopic dermatitis.
  • eosinophil levels were reduced in all the dosing groups compared to the atopic dermatitis-induced and non-dose control groups.
  • Example 8 Effect of Symptom Improvement on CIA Arthritis Mice by Collagen Induction of Red Soybean Methanol Extract
  • mice Female 6-week-old DBA / 1 OlaHsd mice (15-20 g) were supplied by HArlan (San Jese, CA, USA) and the animals were fed solid feed (no antibiotics, Samyang Feed Co.) and water until the day of the experiment. A sufficient supply was made for 1 week in an environment of temperature 22 ⁇ 2 ° C., humidity 55 ⁇ 15%, and 12 hours (light-dark cycle), and then used for subsequent experiments.
  • CIA rheumatoid arthritis mouse
  • CIA induction was injected subcutaneously into the dorsal portion of the mouse tail by mixing 100 ⁇ g of bovine type 2 collagen and 0.1 ml Complete Freund's Adjuvants in 8-week-old DBA / 1 OlaHsd mice and boosting the same amount 21 days later.
  • a CIA model was prepared.
  • red pepper methanol extract was administered to the prepared CIA model, and arthritis index (AI) and incidence analysis were performed.
  • the normal group and the control group were orally injected with physiological saline once each day 0.1ml each day, MTX concentration of 2mg / kg, red soybean methanol extract (100mg / kg) treated group at 11 am daily Orally administered to.
  • the type 2 collagen was then boosted, and the incidence (%) was determined based on the following criteria for arthritis signs in each of the four paws of DBA / 1 OlaHsd mice, and the CIA induction shown in Table 8 below.
  • the symptoms of the mice were recorded once a week according to the degree indicator (FIGS. 12 and 13).
  • Figure 12 is a photograph showing the state of the forelimbs and hind limbs of the normal DBA / 1 OlaHsd and CIA-induced mouse model
  • Figure 13 is an effect of improving the symptoms for arthritis induced by CIA in DBA / 1 OlaHsd mice of the red soybean methanol extract It is a graph showing the degree of CIA induction.
  • the red bean ethanol methanol extract in the DBA / 1 OlaHsd mouse CIA-induced arthritis model was found to have an effect of improving the degree of CIA induction compared to the control.
  • the oleanolinic acid acetate of the present invention derived from red soybean can exhibit a prophylactic or therapeutic effect of TLR and IL-6 mediated diseases.
  • the oleanolinic acid acetate of the present invention is a specific derivative having a remarkable effect compared to the conventional oleanolinic acid
  • the above example shows how the oleanolinic acid acetate of the present invention exhibits a difference in activity compared to a known oleolinic acid. It was confirmed using the method of 5-2.
  • Example 5-2 the same method as Example 5-2 was carried out, except that oleanolinic acid or oleanolinic acid acetate was treated with 0.1, 1, 3, 6 or 10 ⁇ M, respectively, as a sample to perform oleanolinic acid on STAT3 luciferase activity. Or the inhibitory effect of oleanolinic acid acetate was measured and compared with each other (FIG. 14).
  • FIG. 14 is a graph showing the effect of inhibiting STAT3 luciferase activity induced by IL-6 treatment in Hep3B cells according to the concentration of oleanolinic acid or oleanolinic acid acetate.
  • the oleanolinic acid acetate of the present invention can exhibit a prophylactic and therapeutic effect of inflammatory diseases remarkably superior to known oleanolinic acid.
  • the femur and tibia of five-week-old mice were separated and bone marrow cells were washed with a 1 cc syringe to obtain bone marrow cells.
  • the isolated myeloid cells were cultured in ⁇ -MEM ( ⁇ -minimum essential medium) medium containing 10% FBS, antibiotics, M-CSF (30 ng / ml) for 3 days. After 3 days, the attached cells were used as bone marrow macrophage (BMM).
  • Phagocytes were cultured by adding M-CSF (30 ng / mL) and osteoclast differentiation factor RNAKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) (50 ng / mL), and red soybean extract and oleanolinate acetate by concentration. Treated. After 4 days, the cultured cells were stained with TRAP solution (Sigma Aldrich, USA) and the cells stained in red were determined as differentiated osteoclasts.
  • M-CSF 30 ng / mL
  • osteoclast differentiation factor RNAKL Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand
  • 15 and 16 are photographs showing the effect of inhibiting the differentiation of phagocytic cells separated from mouse bone marrow cells into osteoclasts, respectively, from the red soybean methanol extract and the oleanolinic acid acetate.
  • TRAP-positive multinuclear osteoclasts were well formed in control cells not treated with the red soybean extract, but the number and size of osteoclasts decreased in a concentration-dependent manner in the experimental group treated with the red soybean extract. I could confirm that.
  • the concentration of 50 ⁇ g / ml was found to significantly reduce the differentiation of osteoclasts.
  • the concentration of 50 ⁇ g / ml was found to significantly reduce the differentiation of osteoclasts.
  • the concentration of 50 ⁇ g / ml was found to significantly reduce the differentiation of osteoclasts.
  • the concentration of 50 ⁇ g / ml was found to significantly reduce the differentiation of osteoclasts.
  • the concentration of 50 ⁇ g / ml was found to significantly reduce the differentiation of osteoclasts.
  • the concentration of 50 ⁇ g / ml was found to significantly reduce the differentiation of osteoclasts.
  • the red soybean extract and oleanolinic acid acetate of the present invention was found to have a significant effect on the prevention and treatment of osteoporosis by inhibiting osteoclast differentiation.
  • a powder was prepared by mixing 0.1 g of oleanolinic acid acetate, red soybean extract containing the same or a fraction of the extract, 1.5 g of lactose and 0.5 g of talc and filling into an airtight bag.
  • oleanolinic acid acetate 0.1 g of oleanolinic acid acetate, red soybean extract containing the same or a fraction of the extract, 7.9 g of lactose, 1.5 g of crystalline cellulose and 0.5 g of magnesium stearate are mixed, and 50 mg of the active ingredient is obtained by direct tableting method. 500 mg tablets were prepared.
  • Oleanolinic acid acetate, red soybean extract containing the same or fractions of the extract 0.1g, corn starch 5g and carboxy cellulose 4.9g were mixed well to prepare a powder, 500mg of the powder in a hard capsule to prepare a capsule.
  • an injection ampoule which contained 0.1 g of oleanolinic acid acetate, red soybean extract or fraction thereof, and an appropriate amount of sterile distilled water for injection and a pH adjuster.
  • oleanolinic acid acetate 0.1 g of oleanolinic acid acetate, red ginseng extract containing the same or fractions of the extract, 10 g of isomerized sugar and 5 g of mannitol are dissolved in purified water, and a suitable amount of lemon flavor is added, followed by mixing the above components.
  • purified water was added thereto to adjust the total volume to 100 ml, and the solution was prepared by sterilization by filling in a brown bottle.

Abstract

본 발명은 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 화합물 또는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 적소두 추출물 또는 화합물은 오랫동안 천연약재로서 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없으면서도, dsRNA 및 ssRNA의 합성 유사체인 Poly(I:C)와 Poly(I)에 의해 유도되는 TLR-3 및 TLR-7의 활성저해 및 NF-κB를 포함하는 신호전달 경로를 차단하고, IL-6에 의해 활성화되는 염증관련 전사인자인 STAT3의 전사활성 및 인산화를 저해함으로써, TLR 및 IL-6 매개성 질환, 예컨대 아토피성 피부염 또는 관절염 등의 예방 또는 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

올레아놀린산 아세테이트를 유효성분으로 포함하는 TLR 및 IL-6 매개성 질환예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 올레아놀린산 아세테이트를 유효성분으로 포함하는 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 화합물 또는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 TLR 및 IL-6 매개성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유효성분을 포함하는 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제, 건강기능식품 및 개인위생용품에 관한 것이다.
면역반응은 활성화된 면역세포가 외래성 및 내인성 물질(항원)에 대하여 일으키는 일련의 반응이다. 세균, 바이러스 등을 포함한 미생물 및 생체의 이물질 등이 생체로 유입되면, 숙주세포는 감염을 극복하기 위해 염증반응의 원인이 되는 사이토카인 등의 인자를 분비하여 염증반응을 유발시킨다. 그리고 이러한 미생물 및 생체의 이물질 등이 면역세포에 의해 인식이 되면 면역세포가 활성화되고, 활성화된 면역세포에서도 염증반응의 원인이 되는 많은 인자를 분비하여 염증반응을 유발한다(Chen G.Y., Nat. Rev. Immunol., 10(12): 826-837, 2010).
분자생물학 및 유전공학의 발전으로 염증과 관련된 세포내의 분자표적들이 밝혀지고 있으며, 특히 감염초기 비 특이적 선천성 면역반응 단계에서 병원체의 특정부분을 인지하는 유전자가 밝혀지면서 염증초기의 발생과정에 대한 새로운 분자적 기전 해석이 이루어지고 있다. 최근 염증초기의 병원체를 인지하는 유전자로서 톨-유사 수용체(Toll-like recepor, TLR)가 병원체의 원형질 막 구성물(lipopolysaccharide(LPS:endotoxin), peptidoglycan)과 핵산 구성물(ds RNA, single strand RNA, GpG DNA etc.)을 인지하는 것이 알려지면서, TLR에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Brown J., et al, J. Dent. Res., 2010, Epub ahead of print: Palusinska-Szysz M., et al., Folia Microbiol.(Praha), 2010, 55(5), 508-14).
TLR은 제1형 막투과 신호전달 분자(type I transmembrane signaling molecule)로서 선천성 면역계(innate immune system)를 담당하는 세포에서 주로 발현되어 있다. 이 세포에서 TLR은 세포외 도메인(extracellular domain)을 통해서 PAMPs(pathogen-associated molecular patterns)나 MAMPs(microorganism-associated molecular patterns)를 인식하며 그 결과 선천성 면역세포에서 염증성 세포 활성화를 유도한다. TLRs가 밝혀진 이래로 TLRs에 결합하는 PAMPs를 찾는 노력이 계속되어왔으며, 지금까지 TLR10, TLR12, TLR13을 제외하고 각각 하나 이상의 리간드가 밝혀졌다(Kawai T. et a.l, Ann. N.Y. Acad. Sci., 2008, 1143, 1-20). TLRs은 서로 다르지만 신호 전달 기작을 공유한다(Liew F.Y., et al., Nat. Rev. Immunol., 2005, 5(6), 446-458).
TLR들에 의한 신호전달에서 공통점은 TIR(Toll/interleukin-1 receptor-like domain)도메인을 통한 NF-κB의 활성화이다. TLR에 의한 신호전달과정은 TIR 도메인을 가진 MyD88과 상호작용하여 복합체를 형성한다. MyD88의 C-말단에 위치한 TIR 도메인은 TLR와의 복합체를 형성하고, N-말단에 위치한 Death 도메인은 인산화효소(Ser/Thr kinase)인 IRAK(IL-1R associated kinase)-1 또는 IRAK-2와 복합체를 형성하게 된다. IRAK-1은 다시 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)와의 상호작용을 통해 NIK(NF-κB-inducing kinase)를 활성화시키고, NIK의 활성화는 다시 IKK(IκB kinase)를 인산화하고 인산화된 IKK는 다시 IκB(inhibitory κB)를 인산화시키게 되며, 결과적으로 NF-κB의 활성화를 야기시킨다. 활성화된 NF-κB는 핵으로 이동하여 전사인자로써 작용하고 사이토카인 및 세포접합분자 관련 유전자의 발현을 유도한다(Brown J., et al, J. Dent. Res., 2010, Epub ahead of print: Palusinska-Szysz M., et al., Folia Microbiol.(Praha), 2010, 55(5), 508-14).
특히 TLR-7은 ssRNA(single-stranded RNA)와 ssRNA 유사체인 polyI(polyinosinic acid)을 인지하는 것으로 알려져 있다. 즉, TLR-7이 ssRNA를 인식한 후, 어댑터 단백질(adaptor protein)인 MyD88과 반응하여 전사인자인 NFkB와 AP-1을 활성화시켜 염증성 사이토카인을 생성하게 된다. 또 하나의 기작으로, TRIF에 의존적인 기작은 TRIF, TBK1(ANK-binding kinase 1), TRAF3와 전사인자인 IRF3에 연속적으로 신호를 전달하여 타입 I 인터페론의 생산을 유도한다. 그리고 TLR-3는 RNA 바이러스의 증식 중에 생기는 dsRNA(double-stranded RNA)와 dsRNA 유사체인 polyI:C(polyinosinic-polycytidylic acid)를 인지하는 것으로 알려져 있다. 즉, TLR-3의 루신-풍부 반복모티프(leucine-rich repeat motif) 형태의 엑토도메인(ectodomain)인 dsRNA를 인식한 후, 어댑터 단백질인 TRIF와 반응하여 전사인자인 IRF3와 NFκB를 활성화시켜 제1형 IFN과 IL-6 및 IL-12 등의 염증성 사이토카인을 생성시킨다(Alexopoulou L., et al, Nature, 2001, 413, 732-738). 염증매개물질이 과량 생산되면, 과도한 면역반응을 야기하게 되고 이로써 대장염, 췌장염, 류마티스 관절염, 천식 등의 각종 인체질환을 악화시키는 원인이 된다. 따라서, TNF-α, IL-1β 및 IL-6, IL-10과 같은 염증 매개물질을 억제하는 물질을 개발할 수 있다면, 각종 면역질환 및 인체질환의 치료에 도움이 될 것이다.
STAT3(signal transducers and activators of transcription)는 류마티스 관절염을 포함한 자가면역 질병에서 NF-κB와는 또 다른 하나의 중요한 전사인자로서 역할을 하는 것이 알려져 있다. 특히, STAT3는 염증반응을 매개하는 사이토카인인 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)에 의해서 활성화 되는 것이 잘 알려져 있으며, 표피 성장 인자(EGF)에도 활성화되는 것으로 알려졌다(Darnell Jr. J.E., et al., Science, 1994, 264, 1415-1421).
IL-6는 B-세포 자극인자 2 또는 인터페론 β2로 알려진 사이토카인으로 B임파구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되었고(Hirano T., et al., Nature, 1986, 324, 73-76), 그 후 T세포의 분화 및 증식, 신경세포의 분화, 파골세포형성, 간세포에서 단백질의 생산 등에 영향을 미치는 다기능성 사이토카인인 것으로 밝혀졌다(Akira S., et al., Adv. In Immunology, 1993, 54, 1-78).
2개의 작용적으로 상이한 막 수용체 분자가 IL-6 활성을 유도하는데 필요한데, 이들 중 하나는 IL-6에 특이적으로 결합하는 분자량이 약 80 KD인 인터루킨-6수용체(IL-6R)이며 다른 하나는 시그널 전달에 관여하는 분자량이 약 130 KD인 gp130이다. IL-6와 IL-6R은 IL-6/IL-6R 복합체를 형성한 다음, 다른 하나의 막 단백질인 gp130과 결합함으로써 IL-6에 의한 세포내의 신호전달이 유도된다(Taga T., et al., J. Exp. Med., 1987, 196, 967). 또한 IL-6의 세포내 신호전달을 유도하는 과정에서 gp130 및 JAK(Janus kinase)의 인산화가 STAT3의 전사활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다(Heinrich P., et al., Biochem. J., 2003, 374, 1-20). IL-6와 수용체들의 결합 후, 세포내에서는 JAK2(Janus Kinases 2)가 인산화에 의해 활성화되며, 활성화된 JAK2에 의해 수용체 세포질 내 도메인의 여러 타이로신 잔기가 인산화 되고 이것은 SH2나 다른 인산화타이로신 결합 모티프를 가지고 있는 STAT3와 같은 세포질 내 단백질의 결합 역할을 하게 된다. 수용체의 세포질 내 도메인에 결합한 STAT3는 JAK2에 의해 인산화된 후 수용체에서 떨어져 나온다. 활성화된 STAT3는 세포질 내에 서로서로 결합하여 동형 또는 이형이량체를 이룬 후 핵 내로 들어가 표적분자의 전사활성 영역에 결합하여 전사를 증가시킨다(Levy, D.E., et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2002, 3, 651-62: Darnell, J.E., Science, 1997, 277, 1630-1635). 이러한 IL-6의 과도한 생산은 류마티스 관절염, 캐슬맨 증후군(Castleman Syndrome), 크론씨 병, 골다공증, 암성 악액질(Cancer cachexia), 동맥경화, 당뇨 등 다양한 질환에 관여하는 것으로 밝혀지고 있다(Akira S., et al., Adv. Immunology, 1993, 54, 1-78: Kallen K., et al., Exp. Opin. Invest. Drugs, 1997, 6, 237-266). 아울러, STAT3의 구조적 활성화 및 과다발현이 골수종, 유방 암종, 전립선 암, 뇌 종양, 두경부 암종, 흑색종, 백혈병 및 림프종, 특히 만성 골수성 백혈병 및 다발성 골수종을 포함하여 여러 형태의 암에 관여하는 것으로 보인다(Niu, et al., Cancer Res., 1999, 59, 5059-5063).
기존의 보고에 있어서는 어떤 물질의 iNOS 활성 억제 등 항산화 효과 등을 관찰하고, 곧바로 이와 같은 물질이 염증성 질환의 치료효과도 있을 것이라는 보고가 있었으나, 항산화제가 류마티스 관절염 및 루프스병 등과 같은 염증질환으로 분류된 질환에 효과가 없다는 보고가 있는 등(Karen H. Costenbader, et al., American Journal of Epidemiology, 172(2):205-216, 2010), 항산화효과가 곧바로 염증질환의 치료에 적용할 수 없는 문제점 등이 있었다.
한편, 자가면역 피부질환 중 대표적으로 알려진 것이 아토피성 피부염이다. 아토피성 피부염은 만성적이며 재발성이 높은 피부질환으로써 피부의 부스럼, 습진, 간지러움, 염증 반응을 동반한다. 병리학적, 유전학적 작용기작은 아직까지 정확히 밝혀지지 않았다. 아토피는 민감성이 높은 특정 유전자, 환경, 피부외벽의 손상 정도, 면역적인 요인 등이 복합적인 영향을 미치는 면역 반응이다. 아토피 피부염은 전형적인 Th2 형태의 면역질환으로 정의되는데(Mamessier, E., et al, European Journal of Dermatology, 2006, 16(2), 103), 이는 아토피 피부염의 시작에 있어서 Th2 면역반응이 중요한 기능을 담당하고 있기 때문이다. 항원인 알레르겐이 피부를 통해 체내로 유입되면 피부에 위치하고 있는 항원 제시세포를 이를 인지하고 그에 반응하게 된다. 이때, 알레르겐은 특이적으로 Th2 형태의 면역반응을 유도하고 이렇게 Th2 표현형의 APCs는 T 세포를 자각하여 Th2 세포로의 분화를 유도하게 된다. Th2 세포는 다량의 Th2 형태의 사이토카인을 발현시키고, Th2 형태의 사이토카인은 비만세포(mast cell)를 활성화 시켜 히스타민과 같은 수용성 매개인자의 분비를 촉진시키며 B 세포를 자극하여 IgE의 생산을 촉진시킨다. 이러한 매개인자는 다시 면역세포를 염증 부위로 유도함으로서 더욱 강화되어진 Th2 형태의 면역반응을 유도하게 되어 결국 아토피 피부염을 유발하게 된다. 이러한 아토피성 피부염의 치료를 위한 표적 후보 유전자로는 IgE에 높은 친화성을 가지는 FceR1b, Th2 형태의 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13, 케모카인의 일종인 에오탁신(eotaxin), RANTES 등이 있으며 아토피의 유발에 있어 큰 역할을 한다(Hoffjan, S., et al., Journal of Molecular Medicine, 2005, 83(9), 682-692: Cookson, W., Nat. Rev. Immunol., 2004, 4(12), 978-988). 따라서, Th2 형태의 사이토카인과 케모카인의 유전자의 발현을 조절하는 물질을 발명한다면, 아토피를 비롯한 다양한 각종 면역질환 및 인체질환의 치료에 도움이 될 것이다.
본 발명자들은 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 치료물질을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 천연자원 가운데 적소두(팥 및 이팥) 추출물, 분획물 그리고 이로부터 정제된 화합물을 이용하여, 첫째, dsRNA 및 ssRNA의 합성 유사체인 Poly(I:C)와 Poly(I)에 의해 유도되는 TLR-3 및 TLR-7의 활성저해 및 NF-κB를 포함하는 신호전달 경로를 차단하는 활성을 확인하고, 둘째, IL-6에 의해 활성화되는 염증관련 전사인자인 STAT3의 전사활성 및 인산화를 저해하는 것을 확인하고, 마지막으로 DNCB에 의한 NC/Nga 마우스의 아토피성 피부염 및 콜라겐 유도 관절염을 억제하는 효과를 규명함으로써 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 TLR 및 IL-6 매개성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 또는 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제, 건강기능식품, 또는 개인위생용품을 제공하는 것이다.
본 발명의 적소두 추출물 또는 화합물은 오랫동안 천연약재로서 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없으면서도, dsRNA 및 ssRNA의 합성 유사체인 Poly(I:C)와 Poly(I)에 의해 유도되는 TLR-3 및 TLR-7의 활성저해 및 NF-κB를 포함하는 신호전달 경로를 차단하고, IL-6에 의해 활성화되는 염증관련 전사인자인 STAT3의 전사활성 및 인산화를 저해함으로써, TLR 및 IL-6 매개성 질환, 예컨대 아토피성 피부염 또는 관절염 등의 예방 또는 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 팥 메탄올 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 HPLC 수행결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 1b는 이팥 메탄올 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 HPLC 수행결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 2a 및 2b는 적소두의 메탄올 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 THP-1-blue 세포에서 poly(I) 처리에 의해 증가된 SEAP 활성 저해 효과를 나타낸 그래프 및 표이다.
도 3은 적소두 메탄올 추출물의 THP-1-blue 세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 증가된 SEAP 활성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 및 4b는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1세포에서 poly(I) 처리에 의해 활성화 되어 핵으로 이동하는 NFκB P50(도 4a) 및 AP-1의 C-Jun(도 4b)의 활성을 억제하는 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이다.
도 4c 내지 도 4e는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1세포에서 poly(I) 처리에 의해 인산화되는 IKK α/β(도 4c), IκB(도 4d), p38 및 JNK(도 4e)의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이다.
도 5a 및 5b는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 활성화 되어 핵으로 이동하는 NFκB P65/p50(도 5a) 및 AP-1의 C-Jun(도 5b)의 활성을 억제하는 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이다.
도 5c 내지 도 5e는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 인산화되는 IKK α/β(도 5c), IκB(도 5d), p38 및 JNK(도 5e)의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이다.
도 5f는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 활성화 되어 인산화되는 IRF3의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이다.
도 6a 내지 6e는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1 세포에서 poly(I) 처리에 의해 유도된 염증성 사이토카인인 TNFα(도 6a), 염증성 사이토카인인 IL-6(도 6b), 케모카인인 RANTES(도 6c), IFNβ(도 6d), 케모카인인 MCP-1(도 6e)의 mRNA 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1 세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 유도된 염증성 인자인 TNFα(도 7a), 염증성 인자인 IL-6(도 7b), 세포접착인자인 ICAM-1(도 7c), 케모카인인 MCP-1(도 7d)의 mRNA 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 적소두 메탄올 추출물의 Hep3B 세포에서 IL-6 처리에 의해 유도되는 STAT3 인산화를 저해하는 효과를 나타내는 사진이다.
도 8b는 적소두로부터 분리 정제된 화학식 1의 화합물의 Hep3B 세포에서 IL-6 처리에 의해 유도되는 STAT3 인산화를 저해하는 효과를 나타내는 사진이다.
도 9는 적소두 메탄올 추출물의 NC/Nga 마우스에서 DNCB에 의해 유도되는 아토피성 피부염에 대한 증세가 개선되는 효과를 NC/Nga 마우스의 등 피부를 나타내는 사진이다.
도 10은 적소두 메탄올 추출물의 NC/Nga 마우스에서 DNCB에 의해 유도되는 아토피성 피부염에 대한 증세가 개선되는 효과를 피부 중증도로 나타내는 그래프이다.
도 11은 적소두 메탄올 추출물의 NC/Nga 마우스에서 DNCB에 의해 유도되는 아토피성 피부염에 대한 혈액내의 호산구 변화를 수치로 나타내는 그래프이다.
도 12는 정상 DBA/1 OlaHsd와 CIA 유발 마우스모델의 앞다리와 뒷다리의 상태를 나타내는 사진이다.
도 13은 적소두 메탄올 추출물의 DBA/1 OlaHsd 마우스 에서 CIA로 유발시킨 관절염에 대한 증세가 개선되는 효과를 CIA 유발정도로 나타내는 그래프이다.
도 14는 올레아놀린산 또는 올레아놀린산 아세테이트의 농도에 따른 Hep3B 세포에서 IL-6 처리에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 적소두 메탄올 추출물이 마우스 골수세포로부터 분리된 포식세포가 파골세포로 분화되는 것을 저해하는 효과를 나타내는 사진이다.
도 16은 올레아놀린산 아세테이트가 마우스 골수세포로부터 분리된 포식세포가 파골세포로 분화되는 것을 저해하는 효과를 나타내는 사진이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2012003383-appb-I000001
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 적소두에 속하는 팥과 이팥으로부터 각각의 메탄올 추출물을 수득하고, 상기 메탄올 추출물을 물, n-헥산, 에틸아세테이트 등으로 분획하여 각각의 분획물을 수득하였다. 상기 추출물과 분획물을 HPLC로 분석한 결과, 팥과 이팥은 상호 유사한 HPLC 크로마토그램을 나타내었고, 상기 n-헥산 분획물로부터 유효성분인 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate, 화학식 1)와 스티그마스테롤(stigmasterol, 화학식 2)을 각각 정제하였다.
하기 화학식 1 또는 2의 화합물은 상용화된 화합물 또는 공지의 방법에 의해 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 적소두로부터 화합물 1과 2의 추출, 분리 및 정제방법은 구체적으로 다음과 같다. 적소두의 헥산 가용성 분획물을 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 이중 Fr.3과 Fr.4는 메탄올을 이용하여 재결정을 실시하였으며, 화학식 1, 2의 순수한 화합물을 분리한다.
화학식 1
Figure PCTKR2012003383-appb-I000002
화학식 2
Figure PCTKR2012003383-appb-I000003
본 발명의 용어 "TLR 및 IL-6 매개성 질환"이란 톨-유사 수용체(Toll-like recepor, TLR)에 속하는 TLR-3와 TLR-7의 활성화에 의하여 활성화된 NF-κB가 핵으로 이동하여 핵에서 각종 사이토카인 및 세포접합분자 관련 유전자가 발현되고, IL-6에 의하여 STAT3의 활성화가 억제됨에 의하여 발병되는 질환을 총칭하는 의미이다. 상기 TLR 및 IL-6 매개성 질환은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 크게 염증성 질환, 자가면역질환, 암 질환 또는 대사성 질환일 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 본 발명의 목적상 바람직하게는 상기 TLR 및 IL-6에 의하여 매개되는 염증성 질환일 수 있다. 상기 염증성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 경피증, 피부염, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 세균 및 진균의 급성 및 만성 감염, 급성 및 만성 기관지염, 및 인플루엔자 감염증 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 화학식 1의 올레아놀린산 아세테이트가 농도 의존적으로 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해시킴을 확인하였으며(표 7), 특히 공지된 올레아놀린산보다도 현저히 우수한 염증성 질환의 예방 및 치료효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써(도 14), 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물이 IL-6에 의한 STAT3의 활성화와 관련된 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과적임을 확인하였다.
본 발명에서 상기 자가면역질환은 병적인 개체의 자체 항원에 대한 면역반응이 직간접 원인으로 나타나는 질환을 총칭하는 의미로서, 본 발명의 목적상 바람직하게는 상기 TLR 및 IL-6에 의하여 매개되는 자가면역질환일 수 있다. 상기 자가면역질환은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 아토피성 피부염, 관절염, 건선, 천식, 이식편대 숙주질환, 면역결핍증, 전신 홍반성 루프스, 및 다발성 경화증이 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 아토피성 피부염 또는 관절염일 수 있다. TLR는 면역반응을 자극하고 자가면역질환의 발달에 연관되어 있고, IL-6에 의해서 활성화되는 STAT3는 다양한 자가면역질환에서 중요한 전사인자로서 기능하며, 그에 따라 본 발명에서 농도 의존적으로 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해시킴을 확인한 화학식 1의 올레아놀린산 아세테이트는 TLR 및 IL-6에 의해 매개되는 자가면역질환에 효과적임을 확인하였다. 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 종래의 항산화제의 작용기작에 의한 것과는 상이한 작용기작에 의하여 치료효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 상기 암 질환은 조직 내에서 필요한 상태를 무시하고 무제한 증식을 하는 미분화 세포로 구성된 종괴 또는 종양을 형성하는 질환을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 TLR 및 IL-6에 의하여 매개되는 암 질환일 수 있다. 상기 암 질환은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 골수종, 유방 암종, 전립선 암, 뇌 종양, 두경부 암종, 흑색종, 백혈병 및 림프종을 포함할 수 있다. IL-6에 의해서 활성화되는 STAT3는 그 구조적 활성화 및 과다발현이 만성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종을 포함한 여러 형태의 암에 관련되어 있어, 상기 STAT3의 활성을 저해시킴으로써 상기 암 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 상기 대사성 질환은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환을 총칭하는 의미로서, 본 발명의 목적상 바람직하게는 TLR 및 IL-6에 의하여 매개되는 대사성 질환일 수 있다. 상기 대사성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 골다공증, 동맥경화, 및 심근경색을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 골다공증일 수 있다. IL-6의 과도한 생산은 특히 골다공증에 관여하는 것이 다양하게 밝혀지고 있으며, 이에 따라 본 발명의 조성물은 IL-6 매개성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 화학식 1의 화합물을 처리하는 경우, 농도 의존적으로 파골세포의 수와 크기가 줄어드는 것을 확인함으로써, 상기 화합물이 파골세포의 분화를 억제하여 골다공증의 예방 및 치료에 효과를 나타냄을 확인하였다(도 16).
본 발명에서 상기 TLR 및 IL-6 매개성 질환은 상기 질환 외에도 TLR 및 IL-6에 의하여 매개되는 다양한 질환을 모두 포함할 수 있으며, 그 예로 아나필락시스 또는 과민성 반응, 알츠하이머병, 악액질, 비만, 초면역성 글로불린 혈증, 메니에르병, 통증, 과민성 폐질환, 내분비성 안과질환 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 올레아놀린산 아세테이트가 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성을 유의적으로 저해하였으나, 스티그마스테롤은 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성에 대한 저해활성을 나타내지 않음을 확인하였다(표 4). 따라서, 상기 화학식 1의 화합물은 ssRNA인 poly(I)와 dsRNA인 poly(I:C)에 의해 유도되는 TLR7과 TLR3 신호전달 경로를 억제하고, 이의 분획물은 poly(I)에 의해 유도되는 TLR7의 신호전달 경로를 억제할 수 있으므로, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료에 적합함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 화학식 1 및 2의 화합물이 농도 의존적으로 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해시켰으며(표 7), 화학식 1의 화합물은 공지된 올레아놀린산 보다도 현저하게 우수한 염증성 질환의 예방 및 치료효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 14). 따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 IL-6에 의한 STAT3의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 상기 올레아놀린산 아세테이트, 이의 염, 추출물 또는 분획물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함하도록 제조함이 바람직하다.
본 발명의 용어 "약학적으로 허용되는 염"이란, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 적소두 추출물과 분획물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 적소두 추출물과 이의 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 보다 효과적인 예방 또는 치료를 위하여, 본 발명의 상기 올레아놀린산 아세테이트, 이의 염, 추출물 또는 분획물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여함이 바람직하고, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 TLR 및 IL-6 매개성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 TLR 및 IL-6 매개성 질환 의심개체는 TLR 및 IL-6 매개성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 TLR 및 IL-6 매개성 질환 의심개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. TLR 및 IL-6 매개성 질환 및 투여에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함함으로써, TLR 및 IL-6 매개성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. TLR 및 IL-6 매개성 질환에 대해서는 상기에서 언급한 바와 같으며, 상기 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 경우, TLR 및 IL-6 매개성 질환은 바람직하게는 자가면역질환, 암 질환 또는 대사성 질환일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 자가면역질환 중 대표적인 질환인 관절염 모델 마우스에서 적소두 추출물이 CIA 유발정도를 개선시킴을 확인하였으며(도 13), 대표적인 자가면역 피부질환인 아토피성 피부염 동물모델에서 적소두 추출물이 증세 개선 효과가 있음을 확인함으로써(도 9 및 10), 상기 적소두 추출물이 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 데에 효과적인 유효성분임을 확인하였다. 또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 적소두 추출물을 처리하는 경우, 농도 의존적으로 파골세포의 수와 크기가 줄어드는 것을 확인함으로써, 상기 추출물이 파골세포의 분화를 억제하여 골다공증의 예방 및 치료에 효과를 나타냄을 확인하였다(도 15).
본 발명의 용어 "적소두(赤小豆)"란 콩과의 팥(Phaseolus angularis Wight)의 종자를 의미하는데, 형태적으로는 원주모양으로 조금 납작하고 종피는 적갈색으로 매끈매끈하며 광택이 있으며, 약리활성의 측면에서는 이뇨, 소염, 배농, 해열, 전신부종, 간경화, 황달, 종기, 화농성 질환, 수종, 각기병, 소갈, 이질설사 등의 치료를 위한 민간요법에 사용되어 왔다. 그러나, 본 발명의 TLR-3 및 TLR-7 활성화에 의해 유도되는 질환의 치료용도에 대하여는 알려진 바 없으며, 본 발명자들에 의하여 최초로 규명되었다. 본 발명의 목적상, 상기 적소두는 팥(Phaseoli angularis Wight) 또는 이팥(또는 덩굴팥, Phaseolus calcaratus Roxburgh)의 종자를 의미하는 것으로 사용되지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "적소두 추출물"이란 적소두를 추출하여 수득한 추출물을 의미하는데, 본 발명의 목적상, 적소두 추출물은 적소두의 분쇄물을 물, 탄소수 1 내지 6의 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 이들의 혼합 용매 등으로 추출하여 수득한 결과물이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않고, 상기 결과물은 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 등을 모두 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 적소두 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 6(C6)의 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 적소두(팥 및 이팥) 조추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 용어 "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명에서는 바람직하게는 적소두의 추출물을 n-헥산, 에틸아세테이트 등의 용매를 이용한 용매분획방법으로 분획한 결과물일 수 있으며, 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 모두 포함하며, 구체적으로는 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물 등이 모두 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 수득한 적소두 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. p6-7, 1998). 구체적으로, 상기 적소두 조추출물을 물에 현탁한 후, 등량의 n-헥산 및 에틸아세테이트 용매를 이용하여 연속 추출로 적소두 각 용매 가용 추출물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 적소두 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 적소두의 메탄올 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물이 poly(I)에 의해 유도된 SEAP의 활성을 유의적으로 저해하고(도 2), poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성을 적소두의 메탄올 추출물이 유의적으로 저해하며(도 3), 적소두의 95% 메탄올 추출물은 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성을 유의적으로 저해하였으나, 50% 에탄올 추출물에서는 낮은 저해활성을 나타냄을 확인하였고(표 2 및 표 3), 적소두 추출물은 poly(I) 또는 poly(I:C)에 의해 유도되는 염증성 인자의 발현을 억제시킴을 확인하였다(도 6 및 도 7). 따라서, 발명의 적소두 추출물은 ssRNA인 poly(I)와 dsRNA인 poly(I:C)에 의해 유도되는 TLR7과 TLR3 신호전달 경로를 억제하고, 이의 분획물은 poly(I)에 의해 유도되는 TLR7의 신호전달 경로를 억제할 수 있으므로, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료에 적합함을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 적소두 추출물이 poly(I)와 poly(I:C)에 의해 활성화되는 전사인자인 NF-κB(p65, p50)와 AP-1(p-c-Jun)의 핵내 이동을 농도 의존적으로 감소시키고(도 4a, 4b, 5a 및 5b), NF-κB의 상위 단계인 IKK, IκB의 활성화를 농도 의존적으로 감소시키며(도 4c, 4d, 5c 및 5d), MAP 키나아제 신호전달계인 JNK, p-38의 인산화 활성을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 4e 및 5e). 또한 poly(I:C)에 의해 유도되는 TLR3의 신호전달과정 중 하나인 IRF3의 인산화 활성화에도 적소두 추출물이 농도 의존적인 억제활성을 나타냄을 확인하였다(도 5f). 이상의 결과로, 본 발명에서 적소두 추출물은 TLR 및 IL-6 매개성 질환을 예방 또는 치료하는데 적합함을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 적소두의 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물은 농도 의존적으로 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해시키고(표 5 및 표 6), 아토피성 피부염 동물모델에 적소두 추출물을 섭취시킨 결과, 아토피성 피부염에 대한 증세가 개선되었으며(도 9 및 도 10), 호산구 수치가 아토피성 피부염 유발 및 비투약 대조군에 비해 감소됨을 확인하였다(도 11). 아울러, 적소두 추출물은 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 모델 마우스에서 CIA 유발정도를 개선시켰다(도 13). 따라서, 본 발명의 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물은 IL-6에 의한 STAT3의 활성화와 관련된 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 관절염 등의 예방 또는 치료에 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 상기 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 약학적 조성물 역시 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 TLR 및 IL-6 매개성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환 치료 방법을 제공한다. 상기 조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물이며, 상기 TLR 및 IL-6 매개성 질환, 의심개체 및 투여에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 또는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공한다.
상기 화학식 1의 화합물, 적소두 추출물 또는 이의 분획물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 상기 유효성분은 TLR 및 IL-6 매개성 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 피부 외용제에 포함될 수 있다. 상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 또는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 화학식 1의 화합물, 적소두 추출물 또는 이의 분획물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 상기 유효성분은 TLR 및 IL-6 매개성 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품에 포함될 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 종래로부터 약재로 사용되어온 적소두의 추출물로부터 유래되어 그의 안전성이 입증되었으므로 식품 조성물로 사용할 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이들을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물은 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함한다. 식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1~30g, 바람직하게는 3 ~ 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이들을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 식품 조성물을 이용하여 다양한 기능성식품을 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "기능성식품(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 본 발명에서 용어, "건강식품(health food)"은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다. 상기 식품은 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 개선 및 회복에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
이러한 기능성 식품의 구체적인 예로, 상기 조성물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다. 상기 조성물을 포함하는 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 마아가린, 지방 지속성(fat continuous) 또는 물 지속성(water continuous) 또는 양쪽 지속성(bicontinuous) 스프레드, 지방 감소된 스프레드, 초콜렛, 또는 초콜렛 코팅 또는 초콜렛 속(fillings) 또는 베이커리 속과 같은 과자류, 아이스크림, 아이스크림 코팅, 아이스크림 함유물, 드레싱, 마요네즈, 치즈, 크림 대체물, 건조 스프, 드링크, 시리얼 바, 소스, 스낵바, 유제품, 임상 영양식품, 소아용식품 등의 형태로 제조된 것을 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 또는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 개인위생용품을 제공한다.
상기 화학식 1의 화합물, 적소두 추출물 또는 이의 분획물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 상기 유효성분은 TLR 및 IL-6 매개성 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 개인위생용품에 포함될 수 있다. 이때, 상기 개인위생용품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크-업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔, 세정 겔 등이 될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 적소두 추출물 및 분획물의 제조 및 화학식 1 및 2의 화합물의 분리정제
실시예 1-1: 적소두 추출물의 제조
적소두(팥 또는 이팥)는 물로 깨끗이 세척하여 그늘에서 건조한 후, 와링 브랜드로 분말화시켰다. 분말화된 적소두 20 ㎏을 메탄올 100 ℓ에 넣고 실온에서 3일간 냉침 추출한 후, 여지(와트만사, 미국)로 감압 여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 실온에서 메탄올 용매를 제거한 후 추출된 잔사로서 적소두 추출물 450g을 제조하였다.
실시예 1-2: 분획물의 제조
상기 제조된 적소두 추출물에서 활성 분획물을 분리하기 위하여, 적소두 추출물을 물 1ℓ에 현탁시키고 동량의 n-헥산을 가하여 혼합하여 분획하고, 이 과정을 4회 반복하여 수가용성 분획물 1ℓ와 n-헥산 가용성 분획물 4ℓ를 수득하였다.
이어, 상기 n-헥산 가용성 분획물을 감압 농축하여 n-헥산 가용 추출물 50g을 수득하였다.
또한, 상기 수가용성 분획물 1ℓ에 동량의 에틸아세테이트를 가하여 혼합하여 분획하고, 이 과정을 3회 반복하여 수가용성 분획물 1ℓ와 에틸아세테이트 가용성 분획물 3ℓ를 다시 수득하였다.
상기 수득한 에틸아세테이트 가용성 분획물을 감압농축하여 에틸아세테이트 가용 추출물 35g을 수득하고, 남은 수가용성 분획물을 감압농축하여 35g을 수득하였으며, 이를 물 분획물로 사용하였다.
실시예 1-3: 적소두 추출물 및 분획물의 HPLC 분석
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 수득한 각각의 적소두 추출물 및 분획물을 대상으로 하여 HPLC 분석을 수행하였다.
이때, HPLC는 Agilent Technologies 1200 series를 사용하였고, 분석용 컬럼은 YMC 사의 J'sphere ODS-H80(YMC, 4μm, 4.6mm I.D. x 150mm) 컬럼을 사용하였다(도 1a 및 1b). 이때, 분석용매는 5%~90% CH3CN을 1㎖/min 흘려주면서 210nm에서 분석하였고, 시료는 10㎕를 주입하였다(표 1).
표 1 용매조건
시간(분) 용매(%)
CH3CN H2O
0 5 95
15 5 95
25 30 70
30 30 70
50 90 10
70 90 10
도 1a는 팥의 메탄올 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 HPLC 수행결과를 나타내는 크로마토그램이고, 도 1b는 이팥의 메탄올 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 HPLC 수행결과를 나타내는 크로마토그램이다.
상기 도 1a 및 1b에서 보듯이, 카테킨-7-글루코피라노시드(catechin-7- glucopyranoside, catechin-7-glu), 루틴(rutin), 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate, OAA) 및 스티그마스테롤(stigmasterol)의 피크는 각각 5.5, 24.5, 35.5, 35.5 분대에 관찰되었으며, 팥 및 이팥의 HPLC 크로마토그램은 상호 유사한 패턴을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 1-4: 유효성분의 정제
상기 실시예 1-2에서 수득한 n-헥산 분획물 80g을 헥산:에틸아세테이트(100:1 → 1:1)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)에 적용하여 5개의 활성분획(Fr.1-5)을 수득하였다. 상기 활성분획 중에서 3번 및 4번 분획에 메탄올을 가하여 재결정과정을 수행함으로써, 흰색분말상을 나타내는 2종의 화합물을 정제하였다.
상기 정제한 2종의 화합물을 기기분석(1H-, 13C-NMR, MS) 및 문헌 값(Voutquenne L. et al. Phytochemistry 2003, 64, 781?789; Kongduang D. et al. Tetrahedron letters 2008, 49, 4067-4072)에 적용하여, 각각 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate, 화학식 1) 및 스티그마스테롤(stigmasterol, 화학식 2)임을 확인할 수 있었다.
화학식 1: 올레아놀린산 아세테이트
Figure PCTKR2012003383-appb-I000004
4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carboxylic acid acetate
화학식 2: 스티그마스테롤
Figure PCTKR2012003383-appb-I000005
(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(E,2R,5S)-5-ethyl-6-methylhept-3-en-2-yl]-10,13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol
실시예 2: 적소두 추출물, 분획물 및 화합물의 poly(I) 또는 poly(I:C) 처리에 의한 NFkB/AP-1 의존적 SEAP 활성 저해 효과
THP1-Blue-CD14 세포를 2×105 cells/100㎕의 농도로 96웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다.
시료로서 상기 실시예 1-1 내지 1-2에서 수득한 적소두 추출물 및 각 분획물을 세포배양액에 1시간 전처리 하고, 50㎍/㎖의 Poly(I) 혹은 100㎍/㎖의 poly(I:C)를 처리함으로써 NFkB/AP-1 의존적 SEAP 활성저해 효과를 측정하였다(도 2 및 도 3).
도 2는 적소두의 메탄올 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 THP-1-blue 세포에서 poly(I) 처리에 의해 증가된 SEAP 활성 저해 효과를 나타낸 그래프이고, 도 3은 적소두 메탄올 추출물의 THP-1-blue 세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 증가된 SEAP 활성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2에서 보듯이, 적소두의 메탄올 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물이 poly(I)에 의해 유도된 SEAP의 활성을 유의적으로 저해하는 것을 확인하였고, 도 3에서 보듯이, poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성을 적소두의 메탄올 추출물이 유의적으로 저해함을 확인하였다.
또한, 적소두 추출물의 원천에 따라 차이를 나타내는 지를 확인하기 위하여, 팥으로부터 유래된 추출물과 이팥으로부터 유래된 95% 및 50% 메탄올 추출물을 대상으로 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 저해활성을 측정하였다(표 2 및 3).
표 2 poly(I) 처리에 의해 증가된 SEAP 활성 저해 효과
시료(㎍/㎖) 저해도(%)
팥95% 메탄올 추출물 100 27.09
60 12.58
30 -
팥50% 메탄올 추출물 100 3.07
60 8.79
30 15.23
이팥95% 메탄올 추출물 100 41.66
60 27.21
30 16.80
이팥50% 메탄올 추출물 100 17.04
60 24.92
30 26.07
루테올린(μM) 60 96.27
30 79.23
표 3 poly(I:C) 처리에 의해 증가된 SEAP 활성 저해 효과
시료(㎍/㎖) 저해도(%)
팥95% 메탄올 추출물 100 71.61
60 64.64
30 36.96
팥50% 메탄올 추출물 100 16.07
60 30.71
30 10.71
이팥95% 메탄올 추출물 100 87.50
60 82.14
30 68.57
이팥50% 메탄올 추출물 100 27.68
60 27.68
30 7.14
루테올린(μM) 60 67.32
30 47.68
상기 표 2 및 표 3에서 보듯이, 적소두의 종류(팥 또는 이팥)에 상관없이 95% 메탄올 추출물은 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성을 유의적으로 저해하였으나, 50% 에탄올 추출물에서는 낮은 저해활성을 나타냄을 확인하였다.
한편, 헥산 분획물로부터 정제한 화학식 1의 올레아놀린산 아세테이트 또는 화학식 2의 스티그마스테롤의 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성에 미치는 영향을 조사하였다(표 4).
표 4 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성에 미치는 올레아놀린산 아세테이트 또는 스티그마스테롤의 효과
시료(μM) 저해도(%)
poly(I:C) poly(I)
올레아놀린산 아세테이트 100 64.39 83.01
60 47.16 74.58
30 9.28 43.90
10 - 2.02
스티그마스테롤 100 - 1.42
60 4.92 2.63
30 8.71 -
카테킨-7-글루코피라노시드 60 11.16 -
30 13.19 -
루틴 60 - -
30 - -
상기 표 4에서 보듯이, 올레아놀린산 아세테이트는 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성을 유의적으로 저해하였으나, 스티그마스테롤은 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성에 대한 저해활성을 나타내지 않았다. 뿐만 아니라, 적소두의 주요 화합물로 알려진 카테킨-7-글루코피라노시드 및 루틴에 대한 저해활성을 검증해본 결과 poly(I) 및 poly(I:C)에 의해 유도된 SEAP의 활성에는 영향을 주지 않음을 확인하였다.
실시예 3: poly(I) 또는 poly(I:C)에 의해 유도되는 염증성 인자 발현에 대한 적소두 메탄올 추출물의 효과
적소두 메탄올 추출물의 poly(I)와 poly(I:C)에 의해 유도되는 염증성 인자 발현 억제효과를 측정하기 위해, Human peripheral blood monocytic cell line인 THP-1을 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, poly(I) 혹은 poly(I:C)에 의해 유도되는 염증성 인자 억제 효과 측정을 위해 THP-1 세포를 12웰 플레이트에 각 웰당 5×105 세포수가 되도록 분주하고, FBS를 첨가 하지 않은 RPMI 1640(penicillin 100 units, streptomycin 100 ㎍) 배지로 배양하였다. 12 시간 후, 적소두 메탄올 추출물의 최종농도가 60㎍/㎖ 가 되도록 DMSO(dimethylsulfoxide) 로 희석하여 1시간 전처리 하고, 50㎍/㎖의 poly(I) 혹은 100㎍/㎖의 poly(I:C)를 처리하여 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 세포를 튜브에 모아 원심분리 하여 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 후, RNeasy Mini Elute Cleanup kit를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA의 농도와 순도는 2100 Bioanalyzer system(Agilent Technologies)로 측정하였고, Taqman reverse transcription reagents kit(Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 염증성인자의 발현 정도는 SYBR Green PCR master mix kit(Applied Biosystem)를 사용해 Real-time PCR을 통해 측정하였다(도 6 및 도 7).
도 6은 적소두 메탄올 추출물의 THP-1 세포에서 poly(I) 처리에 의해 유도된 염증성 사이토카인의 발현억제효과를 나타내는 그래프이고, 도 7은 적소두 메탄올 추출물의 THP-1 세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 유도된 염증성 사이토카인의 발현억제효과를 나타내는 그래프이다. 도 6 및 도 7에서 보듯이, 대조군에 비해 50㎍/㎖의 poly(I)를 처리한 군에서는 염증성 인자인 TNFα, IL-6, MCP-1, RANTES, IFNβ의 발현이 유의적으로 증가하고, 100㎍/㎖의 poly(I:C)를 처리한 군에서 대조군과 비교할 때 염증성 인자인 TNF-α, IL-6, ICAM-1, MCP-1의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이에 반하여, 적소두 메탄올 추출물(60㎍/㎖)을 1시간 전 처리한 군에서는 각각의 염증성 인자 모두에서 그 수치가 유의적으로 억제되는 것으로 나타나, 적소두 메탄올 추출물이 poly(I) 또는 poly(I:C)에 의해 유도되는 염증성 인자의 발현을 억제시킨다는 사실을 확인 할 수 있었다.
실시예 4: 적소두 메탄올 추출물에 의해 조절되는 TLR-7 및 TLR-3 신호전달 경로
TLRs(Toll-like receptors)에 각각의 리간드가 결합하면, MyD88 혹은 TRIF adaptor가 TLRs로 이동하게 되는데, 리간드로 TLR7에는 ssRNA가, TLR3에는 dsRNA가 결합하게 되면 세포내로 신호전달이 개시되어, NFkB와 MAPK/AP-1를 공통으로 활성화시키고, TLR3는 IRF-3 경로를 추가적으로 활성화 시켜 염증성 사이토카인을 생성한다. 따라서, 본 발명의 적소두 추출물이 TLR7, TLR3의 신호전달 경로에 미치는 영향을 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.
먼저, THP-1 세포를 각 웰당 1.5×106 세포수가 되도록 분주하여 FBS를 첨가하지 않은 RPMI 1640 배지에 12시간 배양하였다. 그 후, 추출물을 30, 60 또는 100㎍/㎖의 농도로 1시간동안 전처리 하고, 50㎍/㎖의 poly(I) 혹은 100㎍/㎖의 poly(I:C)를 각각 3시간 처리하였다. 3시간 후, 세포를 튜브에 옮겨 원심분리를 통해 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 다음, NE-PER Nuclear extraction reagents(Thermo scientific)과 Cell lysis buffer를 사용해 핵 추출물과 총 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿분석을 수행하였다. 상기 핵추출물에서는 NFkB p65/p50 및 p-c-Jun을 확인하였고, 총 단백질에서는 MAPKs, IKB, IKK isoforms, IRF3를 측정하였다(도 4 및 도 5).
도 4a는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1세포에서 poly(I) 처리에 의해 활성화 되어 핵으로 이동하는 NFκB P50의 활성을 억제하는 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이고, 도 4b는 AP-1의 C-Jun 활성을 억제하는 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이며, 도 4c는 IKK α/β의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이고, 도 4d는 IκB의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이며, 도 4e는 p38 및 JNK 의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이다.
또한, 도 5a는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 활성화 되어 핵으로 이동하는 NFκB P65/p50의 활성을 억제하는 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이고, 도 5b는 AP-1의 C-Jun 활성을 억제하는 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이고, 도 5c는 IKK α/β의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이며, 도 5d는 IκB의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이고, 도 5e는 적소두 메탄올 추출물의 THP-1세포에서 poly(I) 처리에 의해 인산화되는 p38 및 JNK 의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이며, 도 5f는 IRF3의 인산화 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 사진이다.
상기 도 4 및 도 5에서 보듯이, 적소두 추출물이 poly(I)와 poly(I:C)에 의한 NFkB와 p-c-Jun의 핵내 이동을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인 할 수 있었고(도 4a, 4b, 5a 및 5b), NFkB의 상위 단계인 IKK, IkB의 활성화도 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인 할 수 있었으며(도 4c, 4d, 5c 및 5d), AP-1 활성화의 상위 단계인 MAPKs, 즉 JNK, p-38의 활성화 또한, 추출물에 의해서 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인 할 수 있었고(도 4e 및 5e), TLR3의 신호전달에서 나타나는 P-IRF3의 활성화에도 적소두 추출물이 농도 의존적인 억제활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다(도 5f).
이상의 결과들을 종합해보면, 적소두 추출물은 TLR-7와 TLR-3의 신호전달 경로에서 NFkB와 MAPKs/ AP-1의 활성화를 억제시킴으로서, 염증성 인자들의 발현을 억제 한다는 사실을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 적소두 추출물, 분획물 및 화합물의 IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 전사활성 억제 효과
적소두 추출물, 분획물 및 이로부터 정제된 각 화합물의 IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 발현억제 효과를 확인하였다.
실시예 5-1: 형질전환체 제조
Hep3B 세포(ATCC HB-8064)에 pStat3-Luc와 pcDNA3.1(+)(Clontech laboratories, Palo Alto, CA)을 리포펙타민 플러스(lipofectamin plus, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 함께 형질감염 시켰다. 이틀 후 부터 하이그로마이신을 처리(100㎍/㎖)하여, 루시퍼라제가 안정하게 발현되는 클론을 얻었다. 상기 클론에서 루시퍼라제가 안정하게 발현되는지는 루시퍼라제 분석법을 통해 확인하였다.
실시예 5-2: IL-6 반응성 STAT3 리포터 유전자 검사
상기 실시예 5-1에서 수득한 클론에 포함된 형질감염된 세포를 DMEM(GIBCO 119950965)으로 무혈청 배양(serum starvation)하고 시료를 하기와 같이 1시간 처리한 후 10ng/㎖ IL-6(R&D system, USA)를 첨가하여 12시간 동안 배양하였다.
1: 음성대조군(비처리군);
2: 양성대조군(IL-6 10ng/㎖); 및
3: 분획물(10, 30, 60㎍/㎖) 및 화합물.
상기 배양된 세포를 PBS로 세척하고 50㎕ 용해 완충용액(luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 20분간 교반한 후, 30-100㎕의 루시퍼라제 기질(luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 발색정도를 루미노미터(luminometer; EG&G BERTHOLD, USA)로 5분 안에 측정하였다(표 5 및 표 6).
표 5 STAT3 루시퍼라제 활성에 대한 적소두 메탄올 추출물 및 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물의 활성저해 효과
시료(㎍/㎖) 저해율(%) 세포생존율(%)
메탄올 60 34.3 98.5
30 31.1 97.0
10 13.9 94.8
6 3.3 93.5
헥산 60 102.2 94.1
30 96.2 99.4
10 53.2 101.5
6 18.2 103.0
에탄올 60 100.9 93.7
30 98.6 98.9
10 74.4 98.5
6 52.1 96.7
부탄올 60 25.1 105.2
30 25.8 101.1
10 5.8 97.3
6 - 94.3
증류수 60 27.2 89.0
30 30.2 91.2
10 17.3 95.2
6 9.4 93.1
제니스테인(μM) 100 95.2 -
상기 표 5에서 보듯이, 적소두의 메탄올 추출물, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물은 농도 의존적으로 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해함을 알 수 있었다.
표 6 STAT3 루시퍼라제 활성에 대한 팥 및 이팥의 95% 및 50% 메탄올 추출물의 활성저해 효과
시료(㎍/㎖) 저해율(%) 세포생존율(%)
팥 95% 메탄올 추출물 60 37.7 94.1
30 5.9 91.4
팥 50% 메탄올 추출물 60 24.9 96.3
30 - 99.9
이팥 95% 메탄올 추출물 60 68.3 87.3
30 34.8 89.5
이팥 50% 메탄올 추출물 60 22.2 101.2
30 8.7 104.3
제니스테인(μM) 100 95.1 -
상기 표 6에서 보듯이, 팥 및 이팥의 95% 및 50% 에탄올 추출물들은 농도 의존적으로 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해함을 알 수 있었다.
한편, 헥산 분획물로부터 정제된 올레아놀린산 아세테이트와 스티그마스테롤에 의한 STAT3 루시퍼라제 활성억제 효과를 측정하였다(표 7).
표 7 STAT3 루시퍼라제 활성에 대한 올레아놀린산 아세테이트와 스티그마스테롤의 활성저해 효과
시료(μM) 저해율(%)
올레아놀린산 아세테이트 30 100
10 97.2
6 95.1
3 84.3
1 51.2
스티그마스테롤 100 58.4
60 29.4
30 -
10 -
카테킨-7-글루코피라노시드 100 0.4
60 15.9
30 8.3
10 -
루틴 100 -
60 -
30 -
10 -
제니스테인 100 95.4
상기 표 7에서 보듯이, 올레아놀린산 아세테이트와 스티그마스테롤은 농도 의존적으로 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해하였으며, IC50 값은 각각 <1μM 과 90μM로 측정되었다. 그러나, 적소두의 주요 화합물로 알려진 카테킨-7-글루코피라노시드와 루틴은 STAT3 루시퍼라제 저해활성을 나타내지 않음을 확인하였다.
실시예 5-3: IL-6 유도 STAT3 인산화 저해활성 검정
6 웰 플레이트에 각 웰당 5×105 세포수가 되도록 Hep3B 세포를 분주하여 배양접시에 80% 정도로 배양한 후, 무혈청 배지로 교환하여 추가로 12시간 배양하고 하기와 같이 시료를 60분간 처리하였다.
1: 음성대조군(비처리군);
2: 양성대조군(IL-16 10ng/㎖);
3: 분획물(10, 30 또는 60㎍/㎖) 및 화합물 1(3, 6, 10 또는 30μM)
4: 제니스테인 처리군(100μM).
그런 다음, 20ng/㎖ IL-6를 처리하여 20분간 반응한 뒤 40㎕ 용해 완충용액(pH 8, 20mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1mM Na3VO4, 2mM EDTA, 1mM APMSF, 20μM 류펩틴(leupeptin), 20㎍/㎖ 아프로토닌(aprotonin); Sigma, USA)을 사용하여 세포를 용해시킨 후, 원심분리(13000g, 15분)하여 단백질이 포함된 상등액을 수득하였다. 단백질의 농도는 DC 단백질 검사 키트(Bio-Rad, USA)를 이용하여 정량하였고, 4~12% SDS 폴리아크릴아마이드 겔(SDS-PAGE)에 단백질을 로딩하여 175mA에서 2시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후 겔의 단백질을 PVDF 멤브레인(Westran　S, pore size 0.2㎜; Whatman, USA)으로 35V에서 90분 동안 전사시켰다. 전사된 멤브레인을 Tris-완충용액(T-TBS; 50mM Tri-HCl, pH 7.6, 150mM NaCl, 0.2% Tween-20, 5% skim milk; Sigma, USA)으로 상온에서 1시간 차단하고 T-TBS로 5번 세척하였다. 상기 멤브레인에 일차항체로 phospho-STAT3(1:1000 희석)의 다클론 항체를 4℃에서 12시간 동안 처리하였다. T-TBS로 5번 세척 후 이차항체로 HRP-결합 항-마우스 항체(1:5000 희석)를 1시간 반응시켰다. T-TBS로 세척한 다음 암실에서 ECL 키트(Amersham, USA)를 이용하여 필름을 현상시켰다(도 8a 및 8b).
도 8a는 적소두 메탄올 추출물의 Hep3B 세포에서 IL-6 처리에 의해 유도되는 STAT3 인산화를 저해하는 효과를 나타내는 사진이고, 도 8b는 적소두로부터 분리 정제된 화합물 1의 Hep3B 세포에서 IL-6 처리에 의해 유도되는 STAT3 인산화를 저해하는 효과를 나타내는 사진이다.
도 8a 및 8b에서 보듯이, 적소두 추출물 및 화합식 1의 화합물은 IL-6 유도 STAT3 인산화 저해 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 적소두 메탄올 추출물의 아토피성 피부염에 대한 증상개선 효과
실험동물모델에 사용되는 무특이 병원체(Specific Pathogen Free, SPF) NC/Nga 마우스는 SLC, Inc.(Japan)으로부터 구입하였으며, 실험을 하기 위하여 이들 마우스를 일정한 온도(23±3℃), 습도(55±15%) 및 조사량(7:00시부터 19:00시까지) 하에서 사육하였다. 구입 후 생후 8주령 된 암컷 NC/Nga 마우스를 SPF 동물사육실에서 1주일 동안 안정시킨 후 실험에 사용하였다.
NC/Nga 마우스는 크게 3개의 실험군으로 나누었다. 구체적으로, ① 아토피성 피부염을 유발하지 않은 음성대조군, ② 아토피성 피부염 유발 및 비투약 대조군 및 ③ 아토피성 피부염 유발 및 투약군으로 설정하였다.
활성평가용 시료인 적소두 메탄올 추출물은 100% 에탄올을 이용하여 녹인 후 사료에 첨가하여 2주 동안 개체에 용량별로 섭취하게 하였다. 2주 후 아토피성 피부염을 유발하기 위해 1% 농도의 DNCB(2,4-Dinitrochlorobenzene)를 0.2%로 희석하여 100㎕를 4일 간격으로 전 실험 기간 동안 NC/Nga 마우스의 등 피부 전체에 도포하여 감작시켰다. DNCB를 도포한 후 아토피성 피부염 유발 및 비투약 대조군 및 투약군에 있는 NC/Nga 마우스와 비교하여 피부 중증도(skin severity)를 조사하였다.
아토피성 피부염에 대한 피부 중증도(skin severity)는 홍반(erythema), 부종(edema), 건조도(dryness), 표피박리증(excoriation)에 대한 정도를 임상적 지표로 하여 각각의 증상에 대해 수치화한 후 이들의 값을 실험군의 평균 수치로 나타내었다. 각각의 증상에 대한 값은 육안 관찰을 통해 증상에 따라 가벼움(점수 1), 보통(점수 2), 심함(점수 3)으로 표기하였으며, 피부 중증도는 아래의 수식을 계산한 값을 나타내었다(도 9 및 10).
피부중증도 =∑개체의(홍반 + 부종 + 건조도 + 표피박리증)/개체수
도 9는 적소두 메탄올 추출물의 NC/Nga 마우스에서 DNCB에 의해 유도되는 아토피성 피부염에 대한 증세가 개선되는 효과를 NC/Nga 마우스의 등 피부를 나타내는 사진이고, 도 10은 적소두 메탄올 추출물의 NC/Nga 마우스에서 DNCB에 의해 유도되는 아토피성 피부염에 대한 증세가 개선되는 효과를 피부 중증도로 나타내는 그래프이다.
도 9 및 10에서 보듯이, 아토피성 피부염을 유발하지 않은 음성대조군은 아토피성 피부염을 포함하여 어떠한 임상증상도 관찰되지 않았지만 아토피성 피부염 유발 및 비투약 대조군에서는 DNCB를 도포한 후 7일령부터 홍반 및 부종 등의 증세를 포함하는 아토피성 피부염의 증세가 발생함을 확인하였다.
한편, 아토피성 피부염 유발 및 투약군은 적소두 메탄올 추출물을 하루 동안 50㎎/㎏, 250㎎/㎏, 500㎎/㎏ 농도로 섭취하게 한 결과 각각의 투약군 모두에서 아토피성 피부염 유발 및 비투약 대조군에 비해 홍반, 부종 등의 아토피성 피부염에 대한 증세가 개선되는 효과를 확인할 수 있었다.
실시예 7: 적소두 메탄올 추출물의 혈액내의 호산구(eosinophil) 수치에 대한 감소 효과
실시예 6의 아토피성 피부염을 유발하지 않은 음성대조군, 아토피성 피부염 유발 및 비투약 대조군, 그리고 아토피성 피부염 유발 및 투약군에 대해 호산구 수치에 대한 변화를 조사하였다.
구체적으로, DNCB를 도포하기 시작한 최초일로부터 22일 후 각각 실험군의 NC/Nga 마우스를 희생하여 혈액내의 호산구 수치를 자동혈액분석기(Automated Hematology Analyzer)를 이용하여 측정하였다(도 11).
도 11은 적소두 메탄올 추출물의 NC/Nga 마우스에서 DNCB에 의해 유도되는 아토피성 피부염에 대한 혈액내의 호산구 변화를 수치로 나타내는 그래프이다. 도 11에서 보듯이, 아토피성 피부염을 유발하지 않은 음성대조군에 비해 아토피성 피부염 유발 및 비투약 대조군에서는 호산구(eosinophil) 수치가 증가하였으며, 아토피성 피부염 유발 및 투약군은 적소두 메탄올 추출물을 하루 동안 50㎎/㎏, 250㎎/㎏, 500㎎/㎏ 농도로 섭취하게 한 결과 각각의 투약군 모두에서 호산구(eosinophil) 수치가 아토피성 피부염 유발 및 비투약 대조군에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 적소두 메탄올 추출물의 콜라겐 유도에 의한 CIA 관절염마우스에 대한 증상개선 효과
먼저, 암컷 6주령의 DBA/1 OlaHsd 마우스(15~20g)는 HArlan(San Jese, CA, USA)사에서 공급받았고, 동물은 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12 시간(light-dark cycle)의 환경에서 1 주간 적응시킨 다음, 이후의 실험에 사용하였다.
다음으로, 상기 적응된 DBA/1 OlaHsd 마우스를 이용하여 류마티스 관절염 마우스(CIA) 모델을 제조하였다.
구체적으로, DBA/1 OlaHsd 마우스 6마리를 한 군으로 관절염을 유발시키지 않은 정상군과 CIA로 유발시키고 약물을 처리하지 않은 대조군 및 methotrexate(2 mg/kg) 처리군, 적소두 메탄올 추출물 처리군(100 mg/kg)으로 나누었다. CIA 유발은 8주령의 DBA/1 OlaHsd 마우스에 100㎍의 소의 제2형 콜라겐과 0.1㎖ 어쥬번트(Complete Freund's Adjuvants)를 혼합하여 마우스 꼬리의 등위 부분에 피하 주사하고, 21일 후 동량을 부스팅하여 CIA 모델을 제조하였다.
끝으로, 상기 제조된 CIA 모델에 적소두 메탄올 추출물 투여하고 관절염 지표(Arthritis index, AI) 및 발병율 분석을 수행하였다.
구체적으로, 정상군과 대조군에게는 생리식염수를 매일 1회 각각 0.1㎖ 씩 매일 경구에 주사하였고, MTX는 2㎎/㎏의 농도로, 적소두 메탄올 추출물(100㎎/㎏) 처리군은 매일 오전 11시에 경구투여 하였다. 이어, 제2형 콜라겐으로 부스팅하고, DBA/1 OlaHsd 마우스의 각 4개의 발(paw)에서 관절염 징후를 아래의 기준으로 발병율(incidence,%)을 결정하고, 하기의 표 8에 도시된 CIA유발정도 지표에 따라 마우스의 증상을 1주일에 1회씩 기록하였다(도 12 및 도 13).
표 8 CIA 유발정도
관절염 지표 유 발 정 도
0 작은 관절(손가락뼈, 중수지절(손허리, 손가락 뼈 관절, 중족지절) 또는 큰 관절(손묵/손묵뼈, 발목/족근골)에 부종 또는 발적이 없음.
1 작은 또는 큰 관절에 약간의 부종 및 또는 발적이 발생
2 하나 또는 여러 개의 작은 또는 큰 관절에 보통의 부종 및 또는 발적이 발생
3 큰 관절에 심한 부종과 발적이 있고, 보통의 부종 및 또는 발적이 작은 관절에 발생
4 큰 관절에 매우 심한 부종과 발적이 있고, 심한 부종 및 도는 발적이 작은 관절에 발생
도 12는 정상 DBA/1 OlaHsd와 CIA 유발 마우스모델의 앞다리와 뒷다리의 상태를 나타내는 사진이고, 도 13은 적소두 메탄올 추출물의 DBA/1 OlaHsd 마우스에서 CIA로 유발시킨 관절염에 대한 증세가 개선되는 효과를 CIA 유발정도로 나타낸 그래프이다.
상기 도 13에서 보듯이, 적소두 메탄올 추출물은 DBA/1 OlaHsd 마우스 에 CIA로 관절염을 유발 시킨 모델에서 대조군과 비교하여 CIA 유발정도를 개선시키는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 9: IL-6 유도 STAT3 인산화 저해활성 검정을 이용한 올레아놀린산과 올레아놀린산 아세테이트의 활성비교
상술한 실시예를 통하여, 적소두로부터 유래된 본 발명의 올레아놀린산 아세테이트가 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 본 발명의 올레아놀린산 아세테이트가 기존의 올레아놀린산에 비해 현저한 효과가 있는 특이 유도체임을 확인하기 위해, 본 발명의 올레아놀린산 아세테이트가 공지된 올레아놀린산에 비하여 활성면에서 어떠한 차이를 나타내는지를 상기 실시예 5-2의 방법을 이용하여 확인하고자 하였다.
구체적으로, 시료로서 올레아놀린산 또는 올레아놀린산 아세테이트를 각각 0.1, 1, 3, 6 또는 10μM로 처리하는 것을 제외하고는, 실시예 5-2와 동일한 방법을 수행하여, STAT3 루시퍼라제 활성에 대한 올레아놀린산 또는 올레아놀린산 아세테이트의 저해효과를 측정하고, 상호 비교하였다(도 14).
도 14는 올레아놀린산 또는 올레아놀린산 아세테이트의 농도에 따른 Hep3B 세포에서 IL-6 처리에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해하는 효과를 나타낸 그래프이다. 도 14에서 보듯이, 본 발명의 올레아놀린산 아세테이트는 IC50=0.9μM의 저해활성을 나타낸 반면, 공지된 올레아놀린산은 10μM에서도 약 14%의 저해활성을 나타냄에 불과함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 올레아놀린산 아세테이트는 공지된 올레아놀린산 보다도 현저하게 우수한 염증성 질환의 예방 및 치료효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 10: RNAKL에 의해 유도되는 파골세포 분화에 미치는 적소두 추출물 및 올레아놀린산 아세테이트의 효과
5주령 생쥐의 넙적다리뼈와 정강뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1 cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/㎖)가 포함된 α-MEM (α-minimum essential medium) 배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 포식세포는 M-CSF (30 ng/㎖) 와 파골세포 분화 인자인 RNAKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) (50 ng/㎖)을 첨가하여 배양하고 적소두 추출물 및 올레아놀린산 아세테이트를 농도별로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP 용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 분화된 파골세포로 판단하였다.
그 결과, 적소두 추출물 및 올레아놀린산 아세테이트를 처리한 실험군에서 파골세포의 분화를 억제하는 것을 확인하였다. 도 15 및 16은 각각 적소두 메탄올 추출물 및 올레아놀린산 아세테이트가 마우스 골수세포로부터 분리된 포식세포가 파골세포로 분화되는 것을 저해하는 효과를 나타내는 사진이다. 상기 도 15에서 보듯이, 적소두 추출물을 처리하지 않은 대조군 세포에서는 TRAP 양성 다핵형 뼈파골세포가 잘 형성되는 것을 확인할 수 있었지만, 적소두 추출물을 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 파골세포의 수와 크기가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 50 ㎍/㎖ 의 농도에서는 현저하게 파골세포의 분화를 줄이는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 16에서 보듯이, 올레아놀린산 아세테이트를 처리한 군에서도 역시 파골세포포의 분화를 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 10μM의 낮은 농도에서도 현저한 효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 적소두 추출물 및 올레아놀린산 아세테이트는 파골세포 분화를 억제함으로써, 골다공증의 예방 및 치료에 현저한 효과가 있음을 알 수 있었다.
제제예 1: 산제의 제조
올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g, 유당 1.5g 및 탈크 0.5g를 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g, 락토스 7.9g, 결정성 셀룰로오스 1.5g 및 마그네슘 스테아레이트 0.5g을 혼합하고, 직타법(direct tableting method)에 의해 유효성분을 50 ㎎으로 포함하는 500 ㎎짜리 정제를 제조하였다.
제제예 3: 분말제의 제조
올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g, 옥수수전분 5g 및 카르복시 셀룰로오스 4.9g을 잘 혼합하여 분말을 제조하고, 경질 캡슐에 상기 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g과 적량의 주사용 멸균 증류수 및 pH 조절제를 포함하는 2㎖ 용량의 주사용 앰플을 제조하였다.
제제예 5: 액제의 제조
통상적인 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g, 이성화당 10g 및 만니톨 5g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

Claims (22)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003383-appb-I000006
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TLR 및 IL-6 매개성 질환은 염증성 질환, 자가면역질환, 암 질환 및 대사성 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 염증성 질환은 ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 경피증, 피부염, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 세균 및 진균의 급성 및 만성 감염, 급성 및 만성 기관지염, 및 인플루엔자 감염증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 자가면역질환은 아토피성 피부염, 관절염, 건선, 천식, 이식편대 숙주질환, 면역결핍증, 전신 홍반성 루프스, 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 암 질환은 골수종, 유방 암종, 전립선 암, 뇌 종양, 두경부 암종, 흑색종, 백혈병 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 대사성 질환은 골다공증, 동맥경화 및 심근경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003383-appb-I000007
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003383-appb-I000008
  10. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 개인위생용품.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003383-appb-I000009
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 TLR 및 IL-6 매개성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환 치료 방법.
  12. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003383-appb-I000010
  13. 제12항에 있어서, 상기 적소두 추출물은 적소두를 물, 탄소수 1 내지 6의 알콜 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 수득한 것인 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 분획물은 적소두 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 물 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 분획하여 수득한 것인 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 TLR 및 IL-6 매개성 질환은 자가면역질환, 암 질환, 대사성 질환, ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 자가면역질환은 아토피성 피부염, 관절염, 건선, 천식, 이식편대 숙주질환, 면역결핍증, 전신 홍반성 루프스, 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 암 질환은 골수종, 유방 암종, 전립선 암, 뇌 종양, 두경부 암종, 흑색종, 백혈병 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 대사성 질환은 골다공증, 동맥경화 및 심근경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  19. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003383-appb-I000011
  20. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003383-appb-I000012
  21. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 개인위생용품.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003383-appb-I000013
  22. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조성물을 TLR 및 IL-6 매개성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, TLR 및 IL-6 매개성 질환 치료 방법.
PCT/KR2012/003383 2011-04-29 2012-04-30 올레아놀린산 아세테이트를 유효성분으로 포함하는 tlr 및 il-6 매개성 질환예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2012148247A2 (ko)

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