WO2015105373A1 - 화살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

화살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2015105373A1
WO2015105373A1 PCT/KR2015/000231 KR2015000231W WO2015105373A1 WO 2015105373 A1 WO2015105373 A1 WO 2015105373A1 KR 2015000231 W KR2015000231 W KR 2015000231W WO 2015105373 A1 WO2015105373 A1 WO 2015105373A1
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WO
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extract
composition
fraction
asthma
methanol
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Application number
PCT/KR2015/000231
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English (en)
French (fr)
Inventor
오세량
안경섭
류형원
신인식
김정희
김두영
송혁환
권옥경
장승룡
Original Assignee
한국생명공학연구원
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Filing date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition and a food composition for the prevention, treatment and improvement of asthma comprising the Euonymus alatus extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • Asthma is a lung disease characterized by chronic airway inflammation and airway hypersensitivity, and is caused by air pollutants, yellow dust, allergens, and the like.
  • asthma is an inflammatory respiratory disease that causes respiratory distress.
  • Asthma is a disease of cyanosis, dyspnea, sneezing, and severe cyanosis and chest pain due to lack of oxygen.
  • Asthma is rapidly increasing due to exposure to air pollution, various chemicals, and westernization of diet. This is increasing and is increasing due to changes in eating habits and westernization.
  • the cause and pathogenesis of the disease are not clear in asthma patients.
  • Th2 T helper type 2 type immune response is enhanced, resulting in increased secretion of interluekin-4, 5, 13, etc.
  • many inflammatory cells including eosinophils Migration and infiltration into the lung tissue. Inflammatory cells also release various proinflammatory and chemotactic factors, exacerbating the inflammatory response, and increasing mucin secretion by increasing the expression of Mucin gene (Mucin 5AC) in goblet cells in the airways. It causes irritability.
  • asthma patients have clinical symptoms such as dyspnea, cyanosis and chest pain.
  • drugs used in the treatment of asthma are mainly used steroids, bronchodilators and antibiotics.
  • Steroids and antibiotics are used to treat asthma by suppressing immune and inflammatory responses, and bronchodilators are used to offset clinical symptoms such as dyspnea.
  • the most widely used inhaled corticosteroid preparations at present show excellent therapeutic effects, but in the long term use, adrenal suppression, decreased bone density, growth disorders, eye and skin complications, and collagen synthesis in proportion to dose and duration of use. It is known to cause an increase.
  • persistent beta-2 agonists, such as salmeterol and formeterol have a protective effect against asthma attacks, but in some cases may even kill the patient. It has been.
  • side effects have been found in long-term use, and their use is limited. Overcoming these side effects, the development of natural products or new compounds with low toxicity and excellent therapeutic effect is constantly in progress.
  • Euonymus alatus is a tree plant distributed in Northeast Asia in the center of the Korean peninsula.It has been known since postpartum blood, mental anxiety, uterine bleeding, crayfish, blood scavenging medicines, rashes, disease It has been used to cure a lot of surprises. Conventionally, the anticancer and antidiabetic activity of arrowwood extract has been reported, but there is no known preventive or therapeutic activity of asthma of arrowwood extract, fractions thereof or compounds isolated therefrom.
  • the present inventors have made efforts to find natural substances useful for the prevention or treatment of asthma without causing side effects on the human body. As a result, the arrow extract or fractions thereof can be used for the prevention or treatment of asthma without showing toxicity. This invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of asthma comprising the Euonymus alatus extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a food composition for the prevention or improvement of asthma comprising the Euonymus alatus extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • Arrowwood extract or fractions thereof of the present invention relieve airway hypersensitivity, inhibit inflammatory cell infiltration in bronchus, inhibit IgE production in serum and bronchoalveolar lavage, and Th2 cytokines (IL-4, IL) in the lung -5 and IL-13) is excellent in inhibiting the expression, so as to overcome the side effects of the currently used asthma therapeutic agent, as a non-toxic and excellent therapeutic effect to be useful as a composition for the prevention, treatment and improvement of asthma Can be.
  • Th2 cytokines IL-4, IL
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of analyzing the arrow leaf and stem methanol extract and its fraction by MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography).
  • Figure 2a is a diagram showing the results of analyzing the arrow leaf and stem methanol extract and its fractions by PDA (Photodiode-Array detection) and MS (Mass Spectrometry) using UPLC (Ultraperformance Liquid Chromatography).
  • Figure 2b is a diagram showing the results of analysis of the arrow leaf and stem methanol extract and its active fraction with UPLC-CAD (Charged Aerosol Detector).
  • UPLC-CAD Charged Aerosol Detector
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the effect of arrow leaf and stem methanol extract, fractions and hot water extract on the cell viability of A549 cells.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating the effect of arrow leaf and stem methanol extract, fraction and hot water extract on the expression of Mucin 5AC induced by tumor necrosis factor in A549 cells.
  • Figure 5 is a measure of the effect of leaf and stem methanol stem extract and active fraction of arrowwood on airway hyperresponsiveness in egg white albumin induced asthma model.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the effects of arrow leaf and stem methanol extracts and active fractions on invasion of a wide range of inflammatory cells around the airways and blood vessels of tissues in an asthma induced animal model.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating the effects of arrow leaf and stem methanol extracts and active fractions on bronchial mucus secretion in asthma-induced animal models.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of asthma comprising the Euonymus alatus extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating asthma of the present invention may include an Euonymus alatus extract or a fraction thereof.
  • the term "arrowhead ( Euonymus alatus )" is a plant belonging to the genus Rhozoaceae , it is also referred to as an ear cow . It is mainly distributed in Korea, Japan, Sakhalin, and China, and is often grown in Sanya. Its height is 3m and twigs have 2 ⁇ 4 wings. The leaves are facing each other with short petioles. The oval or the eggs are upside down and the edges are fine and hairless. It has been used for hemostasis, gut blood, etc. in oriental medicine.
  • arrow tree extract means an extract obtained by extracting an arrow tree.
  • the arrow extract extracts 1 to 4 carbon atoms such as water, methanol, ethanol and butanol in volumes of up to about 2 to 20 times, preferably about 3 to 5 times the dry weight of the arrowwood pulverization. 4 ) using a polar solvent of the lower alcohol of 4 ) or a mixed solvent having a mixing ratio of about 1: 0.1 to 1:10 thereof as the elution solvent, preferably a lower alcohol having 1 (C 1 ) to 4 (C 4 ) Most preferably, methanol can be used.
  • Extraction temperature is 20 to 100 °C, preferably at room temperature
  • extraction period is about 12 hours to 4 days, preferably 3 days extraction using extraction methods such as hot water extraction, cold extraction, reflux cooling extraction or ultrasonic extraction
  • any method of extracting a substance having a prophylactic or therapeutic activity for asthma can be used without limitation.
  • the mixture is extracted once or five times by cold extraction and filtered under reduced pressure, and the filtrate is concentrated under reduced pressure at 20 to 100 ° C., preferably at room temperature using a vacuum rotary condenser, and soluble in water, lower alcohols, or a mixed solvent thereof.
  • the arrowwood extract may be extracted from various organs of natural, hybrid, and mutant plants, for example, from roots, ground, stems, leaves, fruits or plant tissue cultures.
  • the term "fraction" means the result obtained by the fractionation method of separating a specific component or a specific group from a mixture containing various components.
  • the arrowwood fraction of the present invention can be obtained by suspending the arrowwood extract, and then fractionating using a polar solvent such as water, methanol, ethanol, or a nonpolar solvent such as hexane and ethyl acetate to obtain a polar solvent fraction and a nonpolar solvent fraction, respectively. have.
  • water of about 1 to 100 times, preferably about 1 to 5 times the volume of the suspension, alcohol having 1 (C 1 ) to 4 (C 4 ), chloroform And polar or nonpolar solvents such as ethyl acetate, hexane, butanol or a mixed solvent thereof may be added to extract and separate a polar or nonpolar solvent soluble layer from 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times.
  • polar or nonpolar solvent soluble layer from 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times.
  • each solvent of arrowwood is available after continuous extraction using water, methanol or a mixed solvent thereof [10: 90 ⁇ 100: 0 (v / v)] as a solvent. Fractions may be obtained, and more specifically, fractions may be obtained using 80 to 89% (v / v) methanol as a solvent, but not limited thereto (preparation example).
  • the term "asthma” is a condition in which the bronchus in the lung is very sensitive, and the bronchus is narrowed from time to time, and the breathing and crotch breathing sounds are severe. Is an allergic disease that occurs.
  • Representative symptoms of asthma include shortness of breath, cough, wheezing, and short-term breathing symptoms, which can alleviate the narrowed bronchus in a short time (a bronchodilator) or a disease control agent that prevents asthma attacks by suppressing allergic inflammation of the bronchus ( Anti-inflammatory agents, leukotriene modulators) and the like are used as the representative treatment.
  • the asthma may be bronchial asthma, allergic asthma, atopic asthma, non-atopic asthma, exercise-induced asthma, aspirin asthma, cardiac asthma or alveolar asthma, preferably bronchial asthma, This is not restrictive.
  • Asthma in the present invention is a comprehensive disease collectively referred to a variety of diseases characterized by inflammatory response of the trachea, bronchus, bronchioles, and airways leading to alveoli and resulting damage and changes in airway tissue (Wardlaw A et al., Clin Exp Allergy 2005; 35: 1254-62).
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the development of asthma by administration of the composition
  • treatment refers to any action that improves or beneficially changes the symptoms caused by the composition. do.
  • cytokines produced by Th2 (helper T cell Type 2) cells interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5) and interleukin-13 (IL-13), are important mediators of bronchial asthma.
  • IL-4 interleukin-4
  • IL-5 interleukin-5
  • IL-13 interleukin-13
  • antigens causing bronchial asthma are first removed by macrophages, and during this process, when activated alveolar macrophages stimulate B cells to produce IgE, IgE activates mast cells in early asthma. In charge of the reaction.
  • B cells exposed to asthma-inducing antigens stimulate CD4 T cells to differentiate into Th2 cells, which are differentiated into IL-4, IL-5 in lung tissue and bronchial alveolar lavage fluid (BALF). And promote the secretion of cytokines such as IL-13, and it is known that these promoted cytokines cause bronchial hyperresponsiveness and airway obstruction, resulting in asthmatic reactions.
  • asthma can be suppressed by inhibiting the secretion of cytokines selected from the group consisting of IL-4, IL-5 and IL-13 or inhibiting the secretion of IgE.
  • the arrow extract or fractions thereof can reduce the number of inflammatory cells around the bronchus or blood vessels or reduce the mucus secretion of goblet cells of the bronchial epithelium.
  • Bronchoalveolar lavage was performed in asthma patients to confirm airway inflammation.
  • the bronchoalveolar lavage fluid contained lymphocytes, mast cells, eosinophils, and activated macrophages.
  • asthma is commonly referred to as airway inflammatory disease, and various inflammatory cells are mostly activated to secrete various mediators to cause asthma, and the reduction of inflammatory cells is known to be related to the treatment of asthma (Haley KJ , et al., Am J Respir Crit Care Med, 1998; 158: 565-72).
  • asthma is a type of asthma symptom that increases the amount of bronchial mucus secretion because asthma and inflammatory cells infiltrate into the bronchus, goblet cells are formed to secrete mucus and collagen deposition is prominent.
  • the pharmaceutical composition comprising the arrowwood extract or fractions thereof of the present invention may further comprise a suitable carrier, non-naturally occuring carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. have.
  • a suitable carrier non-naturally occuring carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the content of the arrow extract or fractions thereof included in the composition is not particularly limited, but may be 0.001% to 99.9% by weight, preferably 0.01% to 50% by weight based on the total weight of the composition. have.
  • the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilizers and suppositories. It can have a formulation of, and can be a variety of oral or parenteral formulations. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solution solutions, emulsions, and syrups, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the present invention provides a method for preventing or treating asthma, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • composition may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level is determined by the type and severity, age, sex, disease of the individual. It may be determined according to the type, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • composition of the present invention can generally be administered in an amount of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 to 200 mg / kg, more preferably 0.1 to 100 mg / kg, divided once or several times a day.
  • preferred dosage may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the condition and weight of the individual, the severity of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration.
  • the composition is not particularly limited as long as it is an individual for the purpose of preventing or treating asthma, and any one may be applied.
  • monkeys, dogs, cats, rabbits, morphotes, rats, mice, cows, sheep, pigs, goats and the like, non-human animals, humans, birds and fish, etc. can be used, and the pharmaceutical composition is parenteral, It may be administered subcutaneously, intraperitoneally, in pulmonary and nasal, and may be administered by any suitable method, including intralesional administration if necessary for local treatment.
  • Preferred dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on the condition and weight of the individual, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the present invention provides a food composition for the prevention or improvement of asthma comprising the arrow extract or fractions thereof as an active ingredient.
  • the arrow, its extracts, fractions, asthma are as described above.
  • improvement refers to any act that improves or benefits the suspicion of a disease such as asthma and prevented or treated by using a composition comprising arrowwood extract, or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the extracts or fractions thereof of the present invention may be added to food compositions for the purpose of preventing or improving asthma.
  • Food composition of the present invention may include the form of pills, powders, granules, acupuncture, tablets, capsules or liquids, etc., there is no particular limitation on the kind of food to which the arrow extract or fractions thereof can be added.
  • the kind of food to which the arrow extract or fractions thereof can be added there are various beverages, gums, teas, vitamin complexes, and dietary supplements.
  • the food composition may be added with other ingredients, and the kind thereof is not particularly limited.
  • various herbal extracts, food acceptable food additives, natural carbohydrates, and the like may be included as additional ingredients, such as conventional foods, but are not limited thereto.
  • the term "food supplement” means a component that can be added to food supplements, and can be appropriately selected and used by those skilled in the art as being added to prepare a health functional food of each formulation.
  • food additives include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners. , pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like, but is not limited to the kind of food additives of the present invention by the above examples.
  • Examples of the natural carbohydrate include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; And polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol, and as flavoring agents other than those described above, natural flavoring agents (such as taumartin), stevia extract (rebaudioside A, glycyr) Higin and the like) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • monosaccharides such as glucose and fructose
  • Disaccharides such as maltose and sucrose
  • polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol
  • sugar alcohols such as xylitol, sorbi
  • the food composition of the present invention may include a health functional food.
  • the term "health functional food” refers to a food prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients having useful functions for the human body.
  • functional means to obtain a useful effect for health use such as nutrient control or physiological action on the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug with food as a raw material, can be excellent in portability.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the arrowwood extract of the present invention or fractions thereof in the preparation of food may be added in an amount of 1 to 50% by weight, preferably 5 to 10% by weight of the raw material composition, but is not limited thereto.
  • the amount may be used below the above range.
  • Examples of the food to which the substance can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all of the health functional foods in the conventional sense.
  • the present invention also provides the use of Euonymus alatus extract or fractions thereof for the manufacture of a pharmaceutical composition or food composition for the prevention, improvement or treatment of asthma.
  • the present inventors were crushed to a size of about 1 cm after removing the moisture through natural drying (dry) using a drier (50-55 °C) each 48 g of dried arrow leaves and stems collected in Jecheon-si, Chungbuk. 1 L of methanol was added based on the dry weight of the ground powder sample, and then extracted at room temperature. Then, once filtered with a 0.45 ⁇ m membrane filter for HPLC and concentrated under reduced pressure at 40 ° C., 4.91 g of methanol extract of the leaves and stems were obtained. In subsequent experiments it was named arrow leaf and stem methanol extract obtained.
  • distilled water is distilled from 100 mL to 50 mL to circulate again to 100 mL, and hot water is extracted at 100 ° C. for a total of 3 hours depending on extraction conditions.
  • the hydrothermal extract obtained was centrifuged at 4500 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant.
  • the obtained supernatant was concentrated under reduced pressure at 40 ° C., and then lyophilized to obtain 2.8 g of an arrow tree hot water extract.
  • Example 2 After attaching A549 1 ⁇ 10 4 cells to the plate as in Example 2, the samples were treated by concentration, and after incubation for 24 hours, 5 mg / ml of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 10 ⁇ l of -2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Amresco, OH, USA) solution was incubated for 4 hours, and then the medium was removed, and 100 ⁇ l of DMSO was dissolved to dissolve formazan, followed by absorbance at 570 nm wavelength. Was measured. The cell viability was expressed as the absorbance of the negative control group treated with 0.2% DMSO as 100%.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 10 ⁇ l of -2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Amresco, OH, USA
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium, Weljin, Korea
  • Fetal Bovine Serum Gibco-BRL, USA
  • TNF-alpha tumor necrosis factor
  • Mucin 5AC primer forward primer: 5'-CGA CAA CTA CTT CTG CGG TGC-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • reverse primer 5'-GCA CTC ATC CTT CCT GTC GTT-3' Sequence number 2
  • PCR mix PCR Master mix, Fermentas, USA
  • Mucin 5AC was increased by tumor necrosis factor in A549 cells, while the expression of Mucin 5AC was decreased in concentration-dependently in Methanol extract and arrow fraction fraction 8, whereas Rhizome hot water extract treatment In the group, expression of Mucin 5AC did not decrease (FIG. 4).
  • Example 4 Egg white albumin induced bronchial asthma animal model
  • 6-week-old BALB / c female mice having an average body weight of about 20 g were used as experimental animals. Animals were examined in which no abnormalities were observed on basic physical examination after one week of adaptation. After two weeks of infusion, 200 ⁇ l of a phosphate buffer solution containing 2 mg of aluminum hydroxide (A8222, Sigma-Aldrich, MO, USA) and 20 ug of egg white albumin (A5503, Sigma-Aldrich) was injected into the abdominal cavity. Sensitized. From the 21st to 23rd day after the first egg white albumin intraperitoneal administration, 1% egg white albumin was inhaled for 30 minutes using an ultrasonic nebulizer (NE-U12, Omron Corp., Japan).
  • an ultrasonic nebulizer NE-U12, Omron Corp., Japan
  • the experimental group included the normal control group (NC, egg white albumin administration and non-inhalation group), asthma-induced group (OVA, egg white albumin administration and inhalation group), and the positive control group (Mon, montelukast 30 mg / kg administration + egg white albumin administration and inhalation).
  • NC normal control group
  • OVA asthma-induced group
  • Mon montelukast 30 mg / kg administration + egg white albumin administration and inhalation
  • the sample administration group (arrow methanol extract and arrow 8 fraction of the preparation example (Fraction 8) to 30 mg / kg administration + egg white albumin administration and inhalation group) was set.
  • Drugs and samples were administered orally from 21 to 23 days after the first egg white albumin administration. Seven mice were used in each group. After the experiment, blood, lung wash solution and lung tissue of each group of mice were separated.
  • One chamber plethysmography (All Medicus, Korea) was used to measure airway hypersensitivity due to asthma. The degree of airway resistance was assessed by measuring enhaced pause (Pehn). Pehn was measured for 3 minutes after inhalation of PBS using ultrasonic nebulizer for 3 minutes. Thereafter, inhalation of methacholine (A2251, Sigma-Aldrich) was gradually increased to a concentration of 12, 25, and 50 mg / ml, and then Penh value was measured.
  • methacholine A2251, Sigma-Aldrich
  • asthma induction in asthma animal model treated with egg white albumin significantly increased airway hypersensitivity compared to the normal control group as the concentration of methylcholine (methylcholine) increased.
  • the montelukast-administered group a positive control group, significantly reduced airway hyperresponsiveness as the concentration of methylcholine increased.
  • the concentration of methylcholine was increased in the methanol extract of arrowwood and its fraction 8, a significant decrease in airway hyperresponsiveness was observed as compared to the asthma-induced group. Largely observed in
  • Example 6 Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) isolation and inflammatory cell count
  • the increase in eosinophils is one of the main features of asthma, to measure this, it was performed as follows.
  • the bronchoalveolar lavage fluid of each individual obtained in Example 4 was immediately stained with Trypan Blue, and the total cell number except dead cells was calculated using a hemocytometer and then cytospin (Cytospin). , Hanil, Korea), the cells were attached to the slides, and then Diff-Quik staining (Sysmex, Switzerland) was performed to examine eosinophils and other inflammatory cells under a microscope, and then the number of inflammatory cells in each sample was determined. The results were as shown in Table 2 below.
  • Th2 type cytokines IL-4, IL-5 and IL-13 were significantly increased in the asthma-induced group compared to the normal group.
  • the positive control group, Montelukast-administered group, and all the sample-subject group were significantly inhibited Th2 cytokine compared to asthma-inducing group.
  • the inhibitory amount was markedly observed in the 8 administration group of arrowwood fraction, and it was confirmed that it was almost similar to that of the positive control group.
  • Example 4 the blood obtained through the posterior vena cava was reacted at room temperature for 30 minutes, and then centrifuged (3000 rpm, 15 min) to obtain serum.
  • ELISA was used to measure serum IgE and egg white albumin specific IgE. IgE was measured using commercially available IgE (Biolegend Ins., USA). Egg white albumin-specific IgE was measured in 0.1 M NaHCO 3 buffer (pH 8.3) at a concentration of 20 ⁇ g / ml in 96-well flat bottom ELISA plates. It melt
  • BSA bovine serum albumin
  • Serum samples were diluted 1: 400 and reacted at room temperature for 2 hours, and then washed with PBS containing 0.05% Tween 20. After diluting 4000 times HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal A conjugated with peroxidase and reacting at room temperature for 1 hour, color reaction was performed with 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine substrate. Absorbance was measured at 450 nm, and the results are shown in Table 4 below.
  • the total IgE in serum was significantly increased in the asthma-induced group compared to the normal group, while the Montelukast-administered group, which was a positive control group, was significantly reduced compared to the asthma-induced group.
  • Methanol extract and fraction 8 administration of arrowwood also significantly reduced serum total IgE compared to asthma-induced group.
  • OVA specific IgE was also similar to those of total IgE.
  • egg white albumin-specific IgE OVA-specific IgE
  • positive control group and sample-administered group were significantly reduced compared to asthma-induced group.
  • the lungs were removed from the animal model of Example 4, immediately fixed in 10% formaldehyde (formaldehyde) solution, rinsed, washed with running water for 8 hours, embedded in epoxy, and then sliced with a microtome. Made. Then, (1) Hematoxylin & Eosin staining to observe inflammation in the lung tissue, (2) intrabronchial mucus secretion is significantly increased when asthma is induced, so in order to observe the periodic acid Schiff (PAS, IMEB Inc. , USA) staining was performed. Pathological changes of lung tissue were examined using an optical microscope.
  • the arrowwood extract or fractions thereof according to the present invention has an inhibitory activity of asthma.
  • compositions of the present invention are illustrated below, without being limited thereto.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
  • Health functional foods comprising the arrow extract or fraction of the present invention were prepared according to a conventional method as follows.
  • arrowwood extract or fraction prepared in the preparation of the present invention was added to flour, and bread, cake, cookies, crackers and noodles were prepared using the mixture to prepare foods for health promotion.
  • Brown rice, barley, glutinous rice, and yulmu were alphad by a known method, and then dried and roasted to prepare a powder having a particle size of 60 mesh.
  • Black beans, black sesame seeds, and perilla were also steamed and dried by a known method, and then ground to a powder having a particle size of 60 mesh.
  • the arrowwood extract or fractions prepared in the preparation example of the present invention were concentrated under reduced pressure in a vacuum concentrator, and the dried product obtained by drying with a sprayer and a hot air dryer was pulverized with a particle size of 60 mesh to obtain a dry powder.
  • the grains, seeds and arrowwood extracts or fractions prepared above were mixed and prepared in the following ratios.
  • Seeds (7% by weight perilla, 8% by weight black beans, 7% by weight black sesame seeds),
  • the resulting solution is filtered and obtained in a sterilized 2 L container, sealed sterilization and refrigerated Used to prepare the healthy beverage composition of the invention.
  • composition ratio is a composition that is relatively suitable for a preferred beverage in a preferred embodiment
  • the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, and usage.

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Abstract

본 발명은 화살나무(Euonymus alatus) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방, 치료 및 개선용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화살나무 추출물 또는 이의 분획물은 기도과민성을 경감시키고, 기관지 내 염증세포 침윤을 억제할 뿐만 아니라, 혈청과 기관지 폐포 세척액 내의 IgE 생성을 억제하고, 폐에서 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-13)의 발현을 억제하는 효과가 우수하므로, 현재 사용되는 천식 치료제의 부작용을 극복하고, 독성이 없으면서 치료효과가 탁월한 성분으로서 천식의 예방, 치료 및 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

화살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 화살나무(Euonymus alatus) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방, 치료 및 개선용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알러젠(allergen) 등에 의하여 발생한다. 특히, 천식은 호흡곤란을 야기하는 염증성 호흡기 질환으로 우리나라 인구 중 약 300만명이 천식을 앓고 있다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타내는 질환으로 최근 들어 대기오염 및 각종 화학물질에 대한 노출과 식생활의 서구화로 인하여 급격히 증가하고 있으며, 특히 소아에서 발병률이 증가하고 있고 식습관의 변화 및 서구화에 따라 증가하고 있는 추세이다. 그러나 천식 환자들에서는 질병의 원인 및 발병기전이 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 이러한 발병 기전 중에 Th2(T helper type 2) 타입의 면역반응이 항진되어 이에 따라 인터루킨(interluekin)-4, 5, 13 등의 분비가 증가되게 되며, 이러한 반응과 연계하여 호산구를 비롯한 많은 염증세포들이 폐조직 내로 이동 및 침윤하게 된다. 또한 염증세포들은 다양한 전염증인자 및 화학주성인자들을 방출하여, 염증반응을 더욱 악화시키며, 기도 내 배상세포의 Mucin 유전자(Mucin 5AC)의 발현을 증가시켜 점액분비(mucus secretion)를 증가시키고, 기도 과민성을 야기하게 된다. 이러한 일련의 반응으로 인하여 천식환자들은 호흡곤란, 청색증 및 흉통 등의 임상증상을 나타내게 된다.
현재, 천식의 치료에 사용되어지고 있는 약물은 스테로이드제제, 기관지 확장제 및 항생제가 주로 사용되고 있다. 스테로이드제제와 항생제의 경우 면역반응 및 염증반응 억제를 통하여 천식치료에 사용되고 있으며, 기관지 확장제의 경우 호흡곤란 등의 임상증상이 발현 시에 이를 상쇄시키고자 사용되고 있다. 현재 가장 광범위하게 사용되고 있는 흡입형 코르티코스테로이드(corticosteroid) 제제는 뛰어난 치료 효과를 나타내지만 장기적으로 사용할 경우 용량과 사용시간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부의 합병증, 콜라겐의 합성 증가 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 살메테롤(salmeterol)과 포르메테롤(formeterol)과 같은 지속성 베타-2 길항제(beta-2 agonist)는 천식 발작에 대해 예방 효과를 나타내지만 경우에 따라서는 환자를 사망케 할 수도 있다고 경고된 바 있다. 그리고 장기사용시 부작용이 발견되어 천식치료제로서 사용이 제한적이다. 이러한 부작용들을 극복하고 독성이 적으며, 치료효과가 탁월한 천연물 혹은 새로운 화합물의 개발이 끊임없이 진행되고 있다.
화살나무(Euonymus alatus)는 한반도 중심의 동북아에 분포되어 있는 목본식물이며, 예로부터 산후 피멎이, 정신불안, 자궁출혈, 대하, 어혈을 없애는 약, 시름시름 아픈 병, 기가 위로 치밀어 올라 생기는 병, 크게 놀라서 생기는 병 등을 고치는데 사용되어 왔다. 종래에는 화살나무 추출물의 항암, 항당뇨 활성에 대하여는 보고된 바 있으나, 화살나무 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물의 천식의 예방 또는 치료 활성에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 인체에 부작용을 유발하지 않으면서 천식 예방 또는 치료에 유용한 천연물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 화살나무 추출물 또는 이의 분획물이 독성을 나타내지 않으면서 천식의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 화살나무(Euonymus alatus) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 화살나무(Euonymus alatus) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 화살나무 추출물 또는 이의 분획물은 기도과민성을 경감시키고, 기관지 내 염증세포 침윤을 억제할 뿐만 아니라, 혈청과 기관지 폐포 세척액 내의 IgE 생성을 억제하고, 폐에서 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-13)의 발현을 억제하는 효과가 우수하므로, 현재 사용되는 천식 치료제의 부작용을 극복하고, 독성이 없으면서 치료효과가 탁월한 성분으로서 천식의 예방, 치료 및 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 화살나무 잎과 줄기 메탄올 추출물 및 이의 분획물을 MPLC(Medium pressure liquid chromatography)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 화살나무 잎과 줄기 메탄올 추출물 및 이의 분획물을 UPLC(Ultraperformance Liquid Chromatography)를 사용하여 PDA(Photodiode-Array detection) 및 MS(Mass Spectrometry)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 화살나무 잎과 줄기 메탄올 추출물 및 이의 활성 분획물을 UPLC-CAD(Charged Aerosol Detector)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 화살나무 잎과 줄기 메탄올 추출물, 분획물 및 열수추출물이 A549세포의 세포생존율에 미치는 영향을 관찰한 도이다.
도 4는 화살나무 잎과 줄기 메탄올 추출물, 분획물 및 열수 추출물이 A549세포에서 종양괴사인자에 의해 유도되는 Mucin 5AC의 발현에 미치는 영향을 관찰한 도이다.
도 5는 화살나무의 잎과 줄기 메탄올 줄기 추출물 및 활성 분획물이 난백알부민 유도된 천식 동물모델에서 기도과민성에 미치는 영향을 측정한 도이다.
도 6은 천식 유도 동물 모델에서 화살나무 잎과 줄기 메탄올 추출물 및 활성 분획물이 조직의 기도 및 혈관주위에 광범위한 염증세포의 침윤 생성에 미치는 영향을 관찰한 도이다.
도 7은 천식 유도 동물 모델에서 화살나무 잎과 줄기 메탄올 추출물 및 활성 분획물이 기관지 내 점액분비에 미치는 영향을 관찰한 도이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 화살나무(Euonymus alatus) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 화살나무(Euonymus alatus) 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "화살나무(Euonymus alatus)"는 노박덩굴목 화살나무과에 속하는 식물로서, 귀전우라고도 한다. 한국·일본·사할린·중국 등지에 주로 분포하며, 산야에서 흔히 자란다. 높이는 3 m에 달하고 잔가지에 2∼4개의 날개가 있으며, 잎은 마주 달리되 짧은 잎자루가 있으며, 타원형 또는 달걀을 거꾸로 세운 모양으로 가장자리에 잔 톱니가 있고 털이 없다. 한방에서 지혈, 구어혈 등에 사용하여 왔다.
본 발명에서 용어, "화살나무 추출물"은 화살나무를 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 화살나무 추출물은 화살나무 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 바람직하게는 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 저급 알콜, 가장 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다. 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, 천식의 예방 또는 치료 활성이 있는 물질을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압 농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 화살나무 조추출물을 수득한 결과물이 될 수 있으나, 본 발명의 천식의 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다. 상기 화살나무 추출물은 천연, 잡종, 변종식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어, 뿌리, 지상부, 줄기, 잎, 열매 또는 식물 조직 배양물 등으로부터 추출 가능하다.
본 발명에서 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명의 화살나무 분획물은 화살나무 추출물을 현탁한 후, 물, 메탄올, 에탄올 등의 극성 용매 또는 헥산, 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 각각 수득할 수 있다. 구체적으로, 화살나무 조추출물을 증류수 등에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매와 같은 극성 또는 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 극성 또는 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Plant Pathology, 1998, 3rd Ed. p6-7,). 보다 구체적으로, 상기 화살나무 조추출물을 물에 현탁한 후, 물, 메탄올 또는 이의 혼합용매[10:90→100:0(v/v)]를 용매로 이용하여 연속 추출 후 화살나무 각 용매 가용 분획물을 수득할 수 있으며, 보다 구체적으로 80 내지 89 %(v/v) 메탄올을 용매로 이용하여 분획물을 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(제조예).
본 발명에 의한 화살나무 추출물 또는 이의 분획물은 IL-4, IL-5 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인 또는 IgE의 분비를 감소시킬 수 있음이 확인됨으로써, 천식의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "천식"은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 바람직하게는 기관지성 천식일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 천식은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62).
본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 천식의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물에 의해 천식에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
Th2(helper T cell Type 2) 세포가 생산하는 사이토카인(cytokine)인 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5) 및 인터류킨-13(IL-13)은 기관지 천식의 중요한 매개 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Coyle AJ. et al. 1995. Am J Respir Cell Mol Biol. 13(1): 54-9; Nakajima H. et al. 1992. Am. Rev. Respir. Dis. 146(2): 374-7; Wills-Karp, M. et al. 1998. Sci. 282(5397): 2258-61; Cohn et al., 2004; Medoff et al., 2008).
구체적으로, 기관지 천식을 일으키는 항원은 1차적으로 대식세포에 의해 제거되고, 이 과정에서 활성화된 폐포의 대식세포가 B 세포를 자극하여 IgE를 생산하면, IgE는 비만세포를 활성화시키는 방법으로 초기 천식 반응을 담당한다. 이와 함께, 천식을 유발하는 항원에 노출된 B 세포는 CD4 T 세포를 자극하여 Th2 세포로 분화되고, 이 분화된 Th2 세포가 폐조직 및 기관지 폐포 세척액(BALF) 내에서 IL-4, IL-5 및 IL-13과 같은 사이토카인의 분비를 촉진하고, 이들 촉진된 사이토카인에 의하여 기관지 과민성과 기도 폐쇄가 유발되어 천식 반응이 일어난다고 알려져 있다.
따라서, 상기 IL-4, IL-5 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인의 분비를 억제시키거나 IgE의 분비를 억제시킴으로써 천식을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 1) 기관지 폐포 세척액으로부터 IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성량을 측정한 결과, IL-4, IL-5 및 IL-13 모두 천식유발군에서 정상대조군에 비하여 크게 증가된 반면, 화살나무 메탄올 추출물 또는 이의 분획물 투여군에서는 이들 인자들이 유의성있게 감소하였음을 확인하였고(실시예 7, 표 3), 2) 혈청 내 및 난백알부민 특이 IgE의 분비량을 측정한 결과, 혈청 내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 모두 천식유발군에서 정상대조군에 비하여 크게 증가된 반면, 화살나무 메탄올 추출물 또는 이의 분획물의 투여군에서는 유의성있게 감소하였음을 확인하였다(실시예 8, 표 4). 이는 상기 화살나무 추출물 또는 이의 분획물이 천식의 치료에 유효함을 잘 보여주는 것이다.
또한, 상기 화살나무 추출물 또는 이의 분획물은, 기관지 또는 혈관 주위의 염증세포 수를 감소시키거나 기관지상피의 배상세포의 점액분비를 감소시킬 수 있음이 본 발명에 의해 확인되었다.
천식환자들에게서 기관지 폐포 세척술을 수행하여 기도 염증을 확인한 결과, 기관지 폐포 세척액에는 림프구, 비만세포, 호산구 및 활성화된 대식세포 등이 증가해 있음이 확인되었다. 이에, 천식이 기도 염증 질환이라고 일반화되고, 여러 염증 세포들이 대부분 활성화되어 각종 매개물질들을 분비하여 천식을 유발하는 것으로 알려져 있어, 염증세포의 감소는 천식의 치료와 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Haley KJ, et al., Am J Respir Crit Care Med, 1998;158:565-72). 한편, 천식은 기도의 협착 및 기관지에 염증성 세포의 침윤과 더불어 고블렛(goblet) 세포가 형성되어 점액을 분비하며 콜라젠의 침착이 두드러지게 나타나므로, 기관지의 점액 분비량의 증가 또한 천식 증상의 일종으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예로서, H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 통해 폐조직 내 염증을 관찰하고, PAS(periodic acid Schiff) 염색을 통해 기관지 내 점액분비량을 관찰한 결과, 1) 천식유발군의 기관지 및 혈관 주위에 광범위한 염증세포의 침윤이 관찰된 반면, 화살나무 메탄올 추출물 또는 이의 분획물 투여군 모두에서, 기관지 및 혈관 주위의 염증세포의 침윤이 감소됨을 확인하였고(실시예 9, 도 6), 2) 천식유발군에서는 기관지상피의 배상세포에서 점액분비의 증가가 관찰된 반면, 화살나무 메탄올 추출물 또는 이의 분획물 투여군 모두에서 기관지상피의 배상세포의 점액분비가 현저하게 감소됨을 확인하였다(실시예 9, 도 7). 이러한 결과 또한 상기 화살나무 추출물 또는 이의 분획물이 천식의 치료에 유효함을 잘 보여주는 것이다.
본 발명의 화살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier), 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 화살나무 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99.9 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 천식의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 조성물은 천식의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 화살나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 화살나무, 이의 추출물, 분획물, 천식에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서의 용어, "개선"은 화살나무 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 천식과 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
구제적으로, 본 발명의 추출물 또는 이의 분획물을 천식의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 화살나무 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 화살나무 추출물 또는 이의 분획물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 화살나무 추출물 또는 이의 분획물은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 천식의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 제조를 위한, 화살나무(Euonymus alatus) 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
제조예: 화살나무 잎과 줄기의 추출물 및 분획물 제조
본 발명자들은 충북 제천시에서 채취하여 건조시킨 화살나무 잎과 줄기 각각 48 g을 건조기(50-55℃)를 사용하여 자연건조(음건)를 통해 수분을 제거한 후 약 1 cm의 크기로 분쇄하였다. 분쇄된 분말시료의 건조 중량을 기준으로 메탄올 1 ℓ를 가한 후 상온에서 추출하였다. 그런 다음 HPLC용 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 1회 여과 및 40℃에서 감압농축 후, 화살나무 잎과 줄기의 메탄올 추출물 4.91 g을 수득하였다. 이후의 실험에서는 수득된 화살나무 잎과 줄기 메탄올 추출물로 명명하였다.
한편, 상기 화살나무 잎과 줄기 추출물의 분획물을 제조하기 위해 MPLC(Medium pressure liquid chromatography) 기기(sepbox 2D 5000)에 칼럼(20 mm × 250 mm; Resin: Zeoprep C18, 10 ㎛)을 장착한 후 각각의 메탄올 추출물을 2 g의 양으로 로딩하였다. 이때, 용매로는 물/메탄올[10:90→100:0(v/v)]를 사용하고, 용리 속도는 40 ㎖/분이었으며, UV 200-400 ㎚의 파장에서 검출하였다. 분석 시간은 150분으로 하여 하기 표 1과 같이 총 9개의 분획물을 얻었다(도 1, 표 1).
표 1
화살나무 MeOH (%) 분석시간 (min) 무게 (mg)
분획물1 0-8 1-11 501.8
분획물2 8-28 11-35 132.5
분획물3 28-32 35-40 81.1
분획물4 32-39 40-48 220.8
분획물5 39-50 48-61 357.6
분획물6 50-69 61-83 222.8
분획물7 69-80 83-96 64.7
분획물8 80-89 96-107 155.1
분획물9 89-100 107-134 128.4
한편, 화살나무 잎과 줄기의 열수 추출물을 수득하기 위하여 상기 분쇄된 분말시료 10 g에 100 mL의 증류수를 첨가하여(화살나무 분쇄시료 : 증류수 = 1 : 10), 열수 추출 순환법으로 추출하였다. 열수 추출 순환법은 증류수가 100 mL에서 50 mL로 증류되면 다시 순환하여 100 mL가 되게 하는 방법으로, 추출조건에 따라 총 3시간 동안 100℃에서 열수 추출하였다. 상기 얻어진 열수 추출액은 4500rpm, 10분동안 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 40℃에서 감압농축한 후, 동결건조하여 화살나무 열수 추출물 2.8 g을 얻었다.
실시예 1: 화살나무 잎과 줄기 추출물 및 분획물의 분석
상기 제조예에서 수득한 화살나무의 잎과 줄기 메탄올 추출물 및 활성 분획물의 활성분획을 조사하기 위하여 이들을 액체 크로마토그래피인 UPLC(ultra performance liquid chromatography)로 분석하였다.
먼저, UPLC 분석을 위해 제조예에서 수득한 화살나무 메탄올 추출물 4.91 g 및 활성 분획물을 UPLC용 0.25 ㎛ 멤브레인 필터로 1회 여과하였다. UPLC 기기(Waters UPLC-QTOF-MS)에 칼럼(Waters BEH C18 column, 2.1 × 100 mm, 1.7 ㎛)을 장착한 후 여과된 각각의 분획물을 5 ㎕ 양으로 로딩하였다. 이때, 용매로는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산/물 + 0.1% 포름산 [10:90→100:0 (v/v)]을 사용하고, 용리 속도는 0.4 ㎖/분이었으며, UV Max plot의 파장에서 검출하였다(도 2).
실시예 2: A549 세포에서 화살나무 추출물의 세포독성 확인
실시예 2와 같이 A549 1×104세포를 플레이트에 부착시킨후, 시료를 농도별로 처리한 후, 24시간 배양한 후에 5mg/㎖의 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Amresco, OH, 미국)용액을 10㎕씩 분주하여 4시간동안 배양한 후, 배지를 제거하고 DMSO를 100㎕씩 분주하여 formazan을 용해시킨후, 570nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 DMSO를 0.2%처리한 음성대조군의 흡광도를 100%로 하여 그 비율로 표시하였다.
그 결과, 화살나무 메탄올 추출물, 화살나무 분획물 8번, 열수추출물을 0-50 ㎍/㎖을 처리한 군에서 모두 95%이상의 세포생존율을 나타내어 독성이 없음을 확인하였다(도 3).
실시예 3: A549 세포에서 Mucin 5AC 유전자 발현에 미치는 영향
소태아혈청(Fetal Bovine Serum, Gibco-BRL, 미국)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 웰진, 한국) 에 인간 폐암 상피세포주인 A549를 희석하여, 웰당 4×105 개의 세포를 플레이트에 분주하여 하루동안 5% CO2 및 37도의 조건에서 부착시킨후, 화살나무 시료를 처리하고 1시간 후에 종양괴사인자(TNF-alpha)를 10ng/ml의 농도로 처리하고 16시간 배양하였다. 처리된 세포에서 배지를 제거하고, PBS로 세척한 후, 리보핵산 용출용액 Trizol(Invitrogen, CA,미국)을 사용하여 균질화하여 리보핵산을 추출하여 상온에서 건조시킨후, DEPC(Diethylpyrocarbonate, Sigma)가 처리된 물에 현탁시켰다. 리보핵산은 정량후, 1 ㎍과 RT-kit (Omniscript RT kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 상보적 핵산 (complementary DNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 Mucin 5AC 프라이머(정방향 프라이머: 5'-CGA CAA CTA CTT CTG CGG TGC-3'(서열번호 1), 역방향 프라이머: 5'-GCA CTC ATC CTT CCT GTC GTT-3'(서열번호 2))와 PCR mix(PCR Master mix, Fermentas, 미국)를 혼합하여 94도에서 5분간 변성시킨후, 94도에서 30초, 58도에서 30초, 72도에서 45초로 30사이클(cycle)로 반응시킨후, 72도에서 5분간 효소를 불활성화시키는 PCR을 수행하였다. 대조군(내부표준)으로는 Rig/S15를 사용하였다.
그 결과, A549세포는 종양괴사인자에 의해 Mucin 5AC의 유전자 발현이 증가하였으며, 화살나무 메탄올 추출물과 화살나무 분획물 8번 처리군에서 Mucin 5AC의 유전자 발현이 농도의존적으로 감소한 반면, 화살나무 열수추출물 처리군에서는 Mucin 5AC의 발현이 감소하지 않았다(도 4).
실시예 4: 난백알부민 유도된 기관지 천식 동물모델
본 발명에서는 평균 체중 20 g 내외의 6주령 BALB/c 암컷 생쥐를 실험동물로 사용하였다. 1주간의 적응기간을 가진 후에 기본적인 신체검사 상에서 이상이 관찰되지 않는 동물을 대상으로 하였다. 순화기간을 거친 생쥐에게 2주 간격으로 2 mg 수산화알루미늄(A8222, Sigma-Aldrich, MO, USA)과 난백알부민 20 ug(A5503, Sigma-Aldrich)을 현탁한 인산완충용액 200 ㎕를 복강에 주입하여 감작시켰다. 첫 번째 난백알부민 복강투여 후 21일부터 23일까지 1% 난백알부민을 초음파분무기(NE-U12, Omron Corp., Japan)를 이용하여 30 분간 흡입시켰다. 마지막 난백알부민 노출 후 24시간 뒤, 기도과민성을 측정하였고, 48시간 뒤에 펜토바비탈(50 mg/kg, Entobal, Hanil, Korea)를 복강투여하여 마취시킨 후 복대정맥을 통하여 혈액을 채취하였고, 기관지 절개를 실시하여 총 1.4 ㎖의 PBS로 기관지폐포 세척을 실시하여 검체를 수거하였다. 실험군은 정상대조군(NC, 난백알부민 투여 및 흡입하지 않는 군), 천식유발군(OVA, 난백알부민 투여 및 흡입한 군), 양성대조군(Mon, montelukast 30 mg/kg 투여 + 난백알부민 투여 및 흡입한 군), 시료투여군(화살나무 메탄올 추출물 및 상기 제조예의 화살나무 분획물 8번(Fraction 8)을 각각 30 mg/kg 투여 + 난백알부민 투여 및 흡입한 군)으로 설정하여 진행되었다. 약물 및 시료는 첫 번째 난백알부민 투여 후 21일부터 23일까지 경구투여 하였으며. 각 군당 7 두의 생쥐를 사용하였다. 실험 종료 후 각 군 생쥐의 혈액, 폐세척액 및 폐조직을 분리하였다.
실시예 5: 기도과민성 (Airway hyperresponsiveness) 측정
천식 발생에 의한 기도과민성을 측정하기 위해 일실체적변동기록기(one chamber plethysmography, All Medicus, Korea)를 이용하였다. 기도 저항의 정도는 enhaced pause(Pehn)을 측정하여 평가하였다. Pehn의 측정은 정상 호흡 상태에서 기저값을 측정한 후, PBS를 초음파분무기를 이용하여 3분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다. 이후 메타콜린(A2251, Sigma-Aldrich)을 12, 25, 50 mg/㎖의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 Penh 값을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 난백알부민을 처리한 천식 동물모델에서 천식유도군은 메타콜린(methylcholine)의 농도가 증가함에 따라 정상대조군에 비하여 기도과민성이 크게 증가하였다. 반면, 양성대조군인 montelukast 투여군은 천식유도군에 비해 기도과민성이 메타콜린(methylcholine)의 농도가 증가함에 따라 유의성 있게 감소하였다. 또한 화살나무 메탄올 추출물 및 이의 분획물 8번 투여군에서 메타콜린(methylcholine)의 농도가 증가함에 따라 천식유발군에 비해 현저한 기도과민성의 감소가 관찰되었으며, 이러한 효과는 특히 상기 제조예의 화살나무 분획물 8번 투여군에서 크게 관찰되었다.
실시예 6: 기관지 폐포세척액 (Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 분리 및 염증세포수 측정
호산구의 증가는 천식에 있어 주요한 특징 중에 하나인 바, 이를 측정하기 위하여, 하기와 같이 실시하였다. 상기 실시예 4에서 수득한 각 개체의 기관지폐포세척액은 회수된 즉시 트리판블루(Trypan Blue)로 염색하여 죽은 세포를 제외한 총 세포수를 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 계산한 다음 사이토스핀(Cytospin, Hanil, Korea)을 이용하여 세포를 슬라이드에 부착시킨 후, Diff-Quik 염색 (Sysmex, Switzerland)을 실시하여 호산구를 비롯한 그 외 염증세포를 현미경을 통해 검경한 후, 각 샘플별 염증세포 수를 세었고, 그 결과는 하기 표 2와 같았다.
표 2
실험군 호산구(×104) 대식구(×104) 림프구(×104) 호중구(×104) 총 염증세포(×104)
정상군 0±0 7±2 2±0 0±0 9±2
천식유발군 87±16# 90±14# 11±3# 9±4# 196±28#
양성대조군 28±16* 54±11* 4±2* 3±2* 88±14*
화살나무 메탄올 추출물 56±16* 76±9 1±0* 4±2* 136±19*
화살나무 분획물8 33±10* 71±9 1±1* 3±1* 108±13*
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 천식유도군에서는 정상군에 비해 호산구를 비롯한 염증세포의 수가 크게 증가하였다. 반면, 화살나무 메탄올 추출물 및 분획물 8번의 투여군에서는 염증세포의 현저한 감소가 관찰되었으며, 이러한 감소는 특히 화살나무 분획물 8번 투여군에서 현저하게 관찰되었으며, 이는 양성대조군인 montelukast 투여군가 유사하게 나타났다.
실시예 7: 기관지 폐포세척액 (BALF) 내 사이토카인 분석
상기 실시예 4의 각 개체에서 분리한 기관지폐포세척액에서 인터루킨 (IL-4, IL-5, IL-13)의 생성량을 시판용 효소면역분석(Enzyme-liked immunosorbent assay, ELISA) 키트(R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 사이토카인의 분석은 제조사의 실험방법에 따라 실시하였으며, ELISA reader(Molecular Devices, USA)기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 3과 같다.
표 3
실험군 IL-4 (pg/mL) IL-5 (pg/mL) IL-13 (pg/mL)
정상군 10.3±2.11 19.4±2.48 32.5±2.44
천식유발군 54.8±13.95# 37.7±5.66# 86.0±8.33#
양성대조군 13.0±5.99* 26.0±3.48* 47.7±5.53*
화살나무 메탄올 추출물 19.9±6.20* 28.4±2.98* 57.9±9.38*
화살나무 분획물 8 15.1±3.89* 25.1±2.93* 51.8±5.89*
상기 표 3에 나타난 바와 같이, Th2 타입의 사이토카인인 IL-4, IL-5 및 IL-13은 천식유발군에서 정상군에 비해 현저하게 증가하였다. 반면 양성대조군인 Montelukast 투여군과 모든 시료물질 투여군은 Th2 사이토카인이 천식유발군에 비해 크게 억제되었다. 특히 화살나무 분획물 8번의 투여군에서 이러한 억제량은 현저하게 관찰되었으며, 이는 양성대조군의 억제량과 거의 유사하게 나타남을 확인하였다.
실시예 8: 혈청내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 측정
상기 실시예 4에서 후대정맥을 통하여 수득한 혈액은 상온에서 30분간 반응시킨 후, 원심분리(3000 rpm, 15 min)하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE의 측정을 위하여 ELISA법을 이용하였다. IgE는 시판되는 IgE(Biolegend Ins., USA)를 사용하여 측정하였으며, 난백알부민 특이 IgE는 96-well flat bottom ELISA plate에 난백알부민을 20 ㎍/㎖의 농도로 0.1 M NaHCO3 완충액(pH 8.3)에 녹여 4℃에서 16시간 반응시켰다. 그 후 1% bovine serum albumin(BSA)이 함유된 PBS로 비특이 반응을 억제시켰다. 혈청 검체는 1:400으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 0.05% Tween 20이 함유된 PBS로 세척하였다. 과산화효소(peroxidase)가 결합된 HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal A를 4000 배 희석하여 실온에서 1시간동안 반응시킨 후, 발색은 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine substrate로 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 4와 같다.
표 4
실험군 Total IgE (ng/mL) OVA-specific IgE (ng/mL)
정상군 84.6±41.41 -
천식유발군 2624.3±286.90# 306.2±71.18#
양성대조군 1892.9±139.23* 168.5±55.87*
화살나무 메탄올 추출물 1988.8±227.16* 224.6±43.73*
화살나무 분획물 8 1844.2±291.90* 178.0±44.83*
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 혈청내 총 IgE는 천식유발군에서 정상군에 비해 크게 증가하였으며, 반면 양성대조군인 Montelukast 투여군은 천식유발군에 비해 현저하게 감소되었다. 화살나무 메탄올 추출물 및 분획물 8번 투여군은 또한 혈청내 총 IgE가 천식유발군에 비해 크게 감소하였다.
한편, 난백알부민 특이 IgE(OVA specific IgE)의 결과 또한 총 IgE의 결과와 유사하게 나타났다. 천식유발군은 난백알부민 특이 IgE(OVA specific IgE)가 정상군에 비해 크게 증가되는 반면, 양성대조군과 시료투여군은 천식유발군에 비해 현저하게 감소됨을 확인하였다.
실시예 9: 기도염증 침윤 및 점액분비에 미치는 영향
상기 실시예 4의 동물모델로부터 폐를 떼어내어 즉시 10% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 고정한 후 세절하여 흐르는 물에 8 시간 수세한 다음, 에폭시(epoxy)에 포매하고, 이것을 마이크로톰(microtome)으로 절편을 만들었다. 이후, (1) 폐조직내 염증을 관찰하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색을, (2) 기관지내 점액분비는 천식이 유발된 경우 현저하게 증가되므로, 이를 관찰하기 위하여 periodic acid Schiff(PAS, IMEB Inc., USA) 염색을 수행하였다. 광학현미경을 이용하여 폐조직의 병리학적 변화를 검경하였다.
(1) 폐조직 내 염증반응을 관찰한 결과, 천식유발군의 폐조직의 기도 및 혈관 주위에 광범위한 염증세포의 침윤이 관찰되었다. 반면, montelukast 투여군에서는 이러한 염증세포의 침윤의 감소가 인정되었으며, 또한 화살나무 메탄올 추출물 또는 화살나무 분획물 8번 투여군 모두에서, 기관지 및 혈관 주위의 염증세포의 침윤이 감소됨이 확인되었다. 이러한 감소는 montelukast 투여군과 비교하여 볼 때, 유사하게 관찰되었다(도 6).
(2) 기관지내 점액분비 결과를 관찰한 결과, 천식유발군에서는 기관지상피의 배상세포에서 점액분비의 증가가 관찰되었다. 반면, montelukast 투여군에서는 점액분비가 감소되었고, 또한 화살나무 메탄올 추출물 또는 화살나무 분획물 8번 투여군 모두에서 기관지상피의 배상세포의 점액분비가 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 7).
이상의 결과를 통해 본 발명에 따른 화살나무 추출물 또는 이의 분획물이 천식의 억제 활성을 보유함을 확인하였다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
제제예 1: 약학적 제제의 제조
본 발명의 화살나무 추출물 또는 분획물을 포함하는 약학적 제제는 다음과 같이 통상적인 방법에 따라 제조하였다.
제제예 1-1: 산제의 제조
제조예에서 각각 제조한 화살나무 추출물 및 분획물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 1-2: 정제의 제조
제조예에서 각각 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 1-3: 캡슐제의 제조
제조예에서 각각 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 1-4: 환의 제조
제조예에서 각각 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
제제예 1-5: 과립의 제조
제조예에서 각각 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물 150 ㎎
대두 추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
제제예 2: 건강기능성 식품의 제조
본 발명의 화살나무 추출물 또는 분획물을 포함하는 건강기능성 식품들을 다음과 같이 통상적인 방법에 따라 제조하였다.
제제예 2-1: 밀가루 식품의 제조
본 발명의 제조예에서 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물 0.5 ~ 5.0 중량을 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-2: 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 제조예에서 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물 5 ~ 10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-3: 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 제조예에서 각각 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 화살나무 추출물 또는 분획물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류 (현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),
종실류 (들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),
화살나무 추출물 또는 분획물의 건조분말 (3 중량%),
영지 (0.5 중량%),
지황 (0.5 중량%)
제제예 3: 음료의 제조
제제예 3-1: 건강음료의 제조
제조예에서 각각 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실 농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제제예 3-2: 야채 주스의 제조
본 발명의 제조예에서 각각 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채 주스를 제조하였다.
제제예 3-3: 과일 주스의 제조
본 발명의 제조예에서 각각 제조한 화살나무 추출물 또는 분획물 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일 주스를 제조하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 화살나무(Euonymus alatus) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출한 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 메탄올로 추출한 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 화살나무의 메탄올 추출물을 물,탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획하여 수득한 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 화살나무 메탄올 추출물을 물, 메탄올 또는 이들의 혼합용매로 분획하여 수득한 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 화살나무 메탄올 추출물을 80 내지 89 %(v/v) 메탄올로 분획하여 수득한 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화살나무(Euonymus alatus)은 화살나무 잎, 줄기 또는 이들의 혼합물인 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화살나무 추출물 또는 이의 분획물에 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 화살나무 추출물 또는 이의 분획물은 IL-4, IL-5 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인의 분비를 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 화살나무 추출물 또는 이의 분획물은 IgE의 분비를 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 화살나무 추출물 또는 이의 분획물은, 기관지 또는 혈관 주위의 염증세포 수를 감소시키거나 기관지상피의 배상세포의 점액분비를 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 화살나무(Euonymus alatus) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출한 것인 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 추출물은 메탄올로 추출한 것인 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 분획물은 화살나무의 메탄올 추출물을 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획하여 수득한 것인 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 분획물은 화살나무 메탄올 추출물을 물, 메탄올 또는 이들의 혼합용매로 분획하여 수득한 것인 조성물.
  17. 제12항에 있어서, 상기 분획물은 화살나무 메탄올 추출물을 80 내지 89 %(v/v) 메탄올로 분획하여 수득한 것인 조성물.
  18. 제1항 내지 제11항의 조성물 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 천식의 예방 또는 치료방법.
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