WO2020050633A1 - 갯대추나무 추출물 등을 포함하는 호흡기 질환 개선용 조성물 - Google Patents

갯대추나무 추출물 등을 포함하는 호흡기 질환 개선용 조성물 Download PDF

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WO2020050633A1
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extract
cells
respiratory
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신희순
김승용
신동욱
엄지은
이소영
정선영
최대운
남영도
박소림
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한국식품연구원
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving allergies, asthma or chronic obstructive pulmonary disease (COPD) using the extract of jujube tree.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Allergic reactions are classified into five types: type I anaphylaxis type, type II cell lysis type, type III immune complex type, type IV cell mediation type, and type V stimulatory hypersensitivity type, most of which belong to type I.
  • the allergic reaction is used in the same sense as type I (Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology 6th eds. USA. Mosby. 2001: 323-383).
  • Suitable allergic diseases include atopic dermatitis, bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic keratitis, and skin hives, and mast cells are known as important effector cells for these allergic diseases (Wills-Karp M., et al., Science, 282: 2258-61, 1998; Grunig G., et al., Science, 282: 2261-2263, 1998).
  • Mast cells are cells that are widely distributed in organs of the whole body, such as the skin, respiratory system, lymphatic vessels, mucous membranes of the gastrointestinal tract, blood vessels, and brain (Ishizaka t., Et al. J. Immunol. 119: 1589, 1997).
  • Allergic reaction is that when allergens such as ticks and pollen are bound to IgE bound to the IgE high affinity receptor (Fc ⁇ RI) on the mast cell surface, mast cells are activated by crosslinking and aggregation of the receptor (FcRI ⁇ ) and calcium in the cytoplasm.
  • the concentration of ions (Ca ++) increases.
  • the increase in the concentration of calcium ion acts on various types of intracellular regulatory factors such as the cholesterol of the cell membrane or the cytoskeletal system, thereby moving granules to the cell membrane, and at the same time, through the fear of granules, fusion of granules, and fusion of granules and cell membranes, degranulation Causes When degranulation, histamine, serotonin, and leukotriene, which have the effects of vasodilation, hyperpermeability, and contraction or secretion of bronchial smooth muscle, are released, as well as NCF, which acts as a chemotactic factor of inflammatory cells such as eosinophils and neutrophils , ECF, PAF, etc.
  • Bronchial asthma is an allergic disease characterized by reversible airway obstruction, airway hypersensitivity (increased airway resistance), hypersecretion of mucus, and high levels of IgE in serum.
  • TH2 T helper 2
  • IL-4 T helper 2
  • inflammatory cells such as T cells, eosinophils, and mast cells proliferate, differentiate and activate. It is also recognized as a chronic inflammatory disease because it migrates to and infiltrates the tissues around the airways (J Clin Invest, 111: 291-297, 2003; N Engl J. Med. 2001; 44 (5): 350-62; Toshio Hirano Cytokine molecular biology.World Science. 2002). Therefore, in the development of a therapeutic agent for asthma, suppression of infiltration of inflammatory cells such as eosinophils is one of the important targets.
  • COPD Chronic obstructive pulmonary disease
  • COPD chronic lung disease 2019
  • COPD chronic lung disease 2019
  • inflammation inflammation, protease activation in the lung, and oxidative stress are involved.
  • Cells involved in inflammation are mainly neutrophils, macrophages, and T lymphocytes.
  • neutrophils secrete substances such as elastase, collagenase, proteases such as myeloperoxidase (MPO), arachidonate, reactive oxygen free radicals, etc.
  • MPO myeloperoxidase
  • bronchoalveolar lavage is used as a means to view the progress of diseases such as COPD, asthma, etc.
  • BALF bronchoalveolar lavage fluid
  • inflammatory cytokines, reactive oxygen species, leukotriene, and activation Inflammatory mediators such as complement increase
  • neutrophils which account for less than 5% in normal lung, increase to 80% of total cells
  • the object of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating respiratory diseases using fortress tree extract, etc., a food composition for enhancing respiratory function and improving respiratory disease using extract of cane tree, etc., It is to provide an anti-allergic food composition and a health functional food comprising the same.
  • Other or specific objects of the present invention will be presented below.
  • the present invention in one aspect, at least one selected from the group consisting of jujube jujube tree, raw juniper tree, botanical tree, tea tree, hoe's eyes, walnut root, quince, cornus and arrowwood extracts It can be identified as an anti-allergic composition containing as an active ingredient, and in other aspects, from the group consisting of jujube tree, raw heat tree, bovine tree, tea tree, hoe's eye, walnut root, quince tree, cornice, and arrowwood extract It may be identified as a composition for improving COPD comprising at least one selected as an active ingredient.
  • a composition for improving asthma comprising at least one member selected from the group consisting of jujube jujube, fresh walnut tree, bovine tree, tea tree, hoe's eye, walnut root, quince, cornus and arrowwood extracts as an active ingredient
  • Respiratory function that can be identified as, and further includes at least one selected from the group consisting of jujube jujube, fresh walnut tree, bovine tree, tea tree, hoe's eye, walnut root, quince tree, cornice, and arrowwood extract as an active ingredient
  • the present invention is selected from the group consisting of jujube jujube tree, raw juniper tree, bovine tree, tea tree, hoe's eye, walnut root, quince tree, cornice, and arrowwood extract.
  • lung diseases include the aforementioned asthma or COPD, as well as diffuse interstitial lung disease, acute respiratory distress syndrome (ARDS), acute lung injury, etc.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • pulmonary diseases caused by contamination, genetic predisposition, etc. it includes pulmonary diseases caused by fine dust, which has recently become a problem.
  • Fine dust containing various components such as carbon components such as soot and biological carbon, ionic components such as chlorine, nitric acid, ammonium, sodium, and calcium, metal components such as lead, arsenic, and mercury, and polycyclic aromatic hydrocarbons such as benzopyrene, etc. It is known to cause various lung diseases such as asthma and COPD by depositing in the trachea, bronchus, small airways, alveoli (J Korean Med Assoc, 2014; 57: 763-768).
  • extract refers to the stem, leaves, fruit, flowers, roots, mixtures, etc. of plants to be extracted, water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethanol, butanol, etc.), methylene chloride, ethylene, Acetone, hexane, ether, chloroform, ethyl acetate, butyl acetate, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), 1,3-butylene glycol, propylene glycol or a mixed solvent thereof.
  • An extract obtained by leaching an extract obtained by using a supercritical extraction solvent such as carbon dioxide or pentane, or a fraction obtained by fractionating the extract, and the extraction method is cold immersion, reflux, considering the polarity, extraction degree, and storage degree of the active substance. Any method such as heating, ultrasonic radiation, and supercritical extraction can be applied.
  • the meaning of the extract includes a concentrated liquid extract or a solid extract in which the extraction solvent is removed by a method such as freeze drying, vacuum drying, hot air drying, spray drying, and the like.
  • it is an extract obtained by using water, ethanol or a mixed solvent thereof as an extraction solvent, and more preferably an extract obtained by using a mixed solvent of water and ethanol as an extraction solvent.
  • active ingredient refers to a component that exhibits the desired activity alone or can itself exhibit activity with an inactive carrier.
  • the term "reinforcing respiratory function" in the present invention maintains the original function of the respiratory organs such as the nasal cavity, pharynx, larynx, trachea, bronchi, and lungs in a healthy state, or may cause smoking, fine dust, neutrophil activation, or other respiratory diseases. Refers to any act that improves the functioning of the respiratory organs that have been reduced due to symptoms to a healthy state.
  • the "respiratory disease” refers to a disease occurring in the respiratory tract of an individual, such as the nasal cavity, pharynx, larynx, trachea, bronchi, and lungs.
  • the respiratory disease is a respiratory disease caused by smoking or fine dust ; Or it may mean a lung disease accompanied by Netosis, but is not particularly limited thereto.
  • the respiratory disease may refer to pulmonary disease accompanied by sputum, difficulty breathing, airway irritability, airway obstruction, mucus hypersecretion, a decrease in expiratory flow rate and / or disorder of gas exchange, and more specifically asthma.
  • COPD Chronic obstructive pulmonary disease
  • tracheitis bronchitis
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • acute lung injury cystic fibrosis
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • cystic fibrosis Moses It may mean one or more selected from the group consisting of bronchitis, influenza virus infection, pneumonia, tuberculosis and transfusion-related acute lung injury.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the active ingredient in the composition of the present invention anti-inflammatory activity, anti-allergic activity, asthma improvement activity, COPD improvement activity, other lung disease improvement activity, as long as it can exhibit respiratory function improvement and respiratory disease improvement activity, specific use, formulation It may be included in any amount (effective amount) according to the like, the typical effective amount will be determined within the range of 0.001% by weight to 20.0% by weight based on the total weight of the composition.
  • the term “effective amount” means intended functional and pharmacological effects, such as anti-inflammatory effect and anti-allergic effect, when the composition of the present invention is administered to a mammal, preferably a person, to which the object is applied, according to the recommendation of a medical expert or the like. It refers to the amount of active ingredients contained in the composition of the present invention. Such an effective amount can be determined empirically within the ordinary skill in the art.
  • compositions of the present invention are mammals and humans, particularly human beings.
  • composition of the present invention in addition to the active ingredient, to increase the anti-inflammatory effect, anti-allergic effect, asthma improvement effect, in addition to any compounds or natural extracts already known to have safety in the art and known to have the corresponding activity It can contain.
  • These compounds or extracts include compounds or extracts, medicines, etc. that are listed in the Pharmacopoeia of each country (“Korea Republic of Korea Pharmacopoeia”), and health functional food exhibitions of each country (“Korea Food and Drug Administration's" health functional food standards and standards "). Laws governing the manufacture and sale of compounds or extracts and health functional foods that have been granted an item in accordance with the laws of each country governing the manufacture and sale of foods (the "Pharmaceutical Law” in Korea) (“Act on Health Functional Foods in Korea”) ”) May contain a compound or extract that is recognized for its functionality.
  • MSM dimethylsulfonylmethane
  • N-acetylglucosamine whose anti-inflammatory ("arthritis improvement") functionality was recognized
  • Enterococcus faecalis heat treated dry powder complexes such as guava leaf extract, sage extract, leaflet extract, complexes such as picopreto powder, PLAG (1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol), etc. It may correspond to a compound or extract, but is not particularly limited thereto.
  • compositions of the present invention may be included in the composition of the present invention together with one or more of its active ingredients.
  • the composition of the present invention can be grasped as a food composition.
  • the food of the present invention may include a health functional (sex) food.
  • the term "health functional food” refers to food produced and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills, etc. using ingredients or ingredients having useful functionality for the human body.
  • the term “functional” means to obtain a useful effect for health use, such as adjusting nutrients or physiological effects on the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention can be manufactured by a method conventionally used in the art, and may be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • the formulation of the health functional food can also be prepared without limitation as long as the formulation is recognized as a health functional food.
  • the food composition of the present invention can be manufactured in various types of formulations, and has the advantage of not having side effects that may occur when taking the drug for a long time by using food as a raw material, unlike general medicines, and is excellent in portability.
  • Health functional foods can be consumed as supplements to enhance the anti-allergic effect, asthma improvement effect or COPD improvement effect, and further enhance respiratory function and respiratory disease improvement effect.
  • the food composition of the present invention can be produced in any form, for example, beverages such as tea, juice, carbonated beverages, ionic beverages, processed oils such as milk, yogurt, gums, rice cakes, Chinese medicine, bread, It can be made of foods such as confectionery, noodles, tablets, capsules, pills, granules, liquids, powders, flakes, pastes, syrups, gels, jelly, bars, etc.
  • beverages such as tea, juice, carbonated beverages, ionic beverages, processed oils such as milk, yogurt, gums, rice cakes, Chinese medicine, bread
  • It can be made of foods such as confectionery, noodles, tablets, capsules, pills, granules, liquids, powders, flakes, pastes, syrups, gels, jelly, bars, etc.
  • the food composition of the present invention can be classified into any product as long as it complies with the enforcement regulations at the time of manufacture and distribution in terms of legal and functional classification.
  • the food composition of the present invention may contain food additives in addition to the active ingredient.
  • Food additives can be generally understood as substances added to foods, mixed or infiltrated in the manufacture, processing, or preservation of foods, and their safety must be ensured because they are consumed daily and for a long time with foods.
  • Food additives in accordance with national laws governing the manufacture and distribution of food (“Food Sanitation Act” in Korea) are limited in terms of ingredients or functions in terms of safety and food additives.
  • Food Additives Fair Korean Food Additives Fair (Korea Food and Drug Administration's notice, ⁇ Food Additive Standards and Standards '')
  • food additives are classified into chemical synthetic products, natural additives, and mixed preparations in terms of ingredients, and these food additives are sweeteners and flavors in terms of functionality. It is divided into agents, preservatives, emulsifiers, acidulants, and thickeners.
  • Sweeteners are used to impart a moderate sweetness to food, and natural or synthetic ones can be used.
  • a natural sweetener is used, and examples of the natural sweetener include sugar sweeteners such as corn syrup solids, honey, sucrose, fructose, lactose, and maltose.
  • Flavoring agents can be used to enhance the taste or aroma, and both natural and synthetic can be used. Preferably, it is the case of using a natural thing. In addition to flavor, when using natural ones, the purpose of enhancing nutrition can also be combined.
  • a natural flavoring agent it may be obtained from apples, lemons, citrus fruits, grapes, strawberries, peaches, etc., or may be obtained from green tea leaves, perilla, large leaves, cinnamon, chrysanthemum leaves, jasmine, and the like. In addition, those obtained from ginseng (red ginseng), bamboo shoots, aloe vera, and ginkgo can be used. Natural flavoring agents may be liquid concentrates or solid extracts. In some cases, synthetic flavoring agents may be used. As the synthetic flavoring agent, esters, alcohols, aldehydes, terpenes, and the like may be used.
  • calcium sorbate, sodium sorbate, potassium sorbate, calcium benzoate, sodium benzoate, potassium benzoate, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), etc. can be used, and as an emulsifier, acacia gum, carboxymethylcellulose, xanthan gum, pectin Etc. can be used, and as acidulant, arithmetic, malic acid, fumaric acid, adipic acid, phosphoric acid, gluconic acid, tartaric acid, ascorbic acid, acetic acid, phosphoric acid and the like can be used.
  • the acidulant may be added so that the food composition has an appropriate acidity for the purpose of suppressing the growth of microorganisms in addition to the purpose of enhancing taste.
  • a suspending agent As a thickener, a suspending agent, sedimentation agent, gel forming agent, swelling agent, etc. may be used.
  • the food composition of the present invention may include bioactive substances or minerals known in the art for the purpose of supplementing and reinforcing functional and nutritional properties in addition to the food additives described above, and guaranteed stability as food additives.
  • bioactive substances examples include catechins contained in green tea, vitamins such as vitamin B1, vitamin C, vitamin E, and vitamin B12, tocopherol, dibenzoylthiamine, and the like, and calcium preparations such as calcium citrate and magnesium stearate as minerals
  • catechins contained in green tea vitamins such as vitamin B1, vitamin C, vitamin E, and vitamin B12, tocopherol, dibenzoylthiamine, and the like
  • calcium preparations such as calcium citrate and magnesium stearate as minerals
  • Magnesium preparations such as iron, iron preparations such as iron citrate, chromium chloride, potassium iodide, selenium, germanium, vanadium, zinc, and the like.
  • the food composition of the present invention may include the food additives as described above in an appropriate amount to achieve the purpose of addition according to the product type.
  • composition of the present invention can be identified as a pharmaceutical composition in other specific embodiments.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in an oral dosage form or a parenteral dosage form according to the route of administration by a conventional method known in the art, including a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • the route of administration may be any suitable route including a local route, an oral route, an intravenous route, an intramuscular route, and direct absorption through mucosal tissue, and two or more routes may be used in combination.
  • An example of a combination of two or more routes is when two or more formulations of the drug are combined according to the route of administration, for example, when one drug is administered by intravenous route and the second drug is administered by topical route.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art depending on the route of administration or formulation, and specifically refer to the pharmacopeia of each country, including "Korea Pharmacopoeia”.
  • composition of the present invention is prepared in an oral dosage form, powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, suspensions, wafers according to methods known in the art with suitable carriers And the like.
  • suitable carriers at this time include sugars such as lactose, glucose, sucrose, dextrose, sorbitol, mannitol, xylitol, starches such as corn starch, potato starch, wheat starch, cellulose, methylcellulose, ethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, Celluloses such as hydroxypropyl methylcellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, magnesium stearate, mineral oil, malt, gelatin, talc, polyol, vegetable oil, ethanol, green Serol, etc. are mentioned.
  • sugars such as lactose, glucose, sucrose, dextrose, sorbitol, mannitol, xylitol
  • starches such as corn starch, potato starch, wheat starch, cellulose, methylcellulose, ethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose
  • Celluloses such as hydroxypropyl methylcellulose,
  • suitable binders include starch, magnesium aluminum silicate, starch ferist, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, glucose, corn sweetener, sodium alginate, polyethylene glycol, wax, etc.
  • lubricants include oleic acid Sodium, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate, sodium acetate, sodium chloride, silica, talcum, stearic acid, magnesium salts and calcium salts thereof, polydetylene glycol, and the like, and starch and methyl cellulose as disintegrants , Agar, bentonite, xanthan gum, starch, alginic acid or its sodium salt.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when prepared in a parenteral dosage form, it may be formulated in the form of injections, transdermal administrations, nasal inhalants and suppositories according to methods known in the art with suitable carriers.
  • an aqueous isotonic solution or suspension may be used as a suitable carrier.
  • an isotonic solution such as PBS (phosphate buffered saline) containing triethanol amine, sterile water for injection, or 5% dextrose may be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • sterile water for injection or 5% dextrose
  • 5% dextrose may be used.
  • transdermal dosage form it can be formulated in the form of ointments, creams, lotions, gels, external solutions, pasta, linen agents, aerosols, and the like.
  • Nasal inhalers can be formulated in the form of aerosol sprays using suitable propellants, such as dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide, etc. witepsol), tween 61, polyethylene glycols, cacao butter, laurin paper, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene stearate, sorbitan fatty acid esters and the like.
  • suitable propellants such as dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide, etc. witepsol
  • tween 61 polyethylene glycols, cacao butter, laurin paper, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene stearate, sorbitan fatty acid esters and the like.
  • Preferred dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention range from 0.001 mg / kg to 10 g / kg per day, preferably 0.001 mg / kg to 1 g per day, depending on the patient's condition, weight, sex, age, patient severity, and route of administration. / kg range. Administration can be made once a day or divided into several times. Such dosages should not be construed as limiting the scope of the invention in any aspect.
  • a composition for improving allergy, asthma, or COPD using extracts of jujube tree, fresh-leaved tree, bovine tree, tea tree, hoe's eye, walnut root, quince, cornice, and / or arrowwood can do.
  • the composition of the present invention is commercialized as a food, especially a health functional food or a drug, and may be usefully used for anti-allergic effect, asthma improvement effect or COPD improvement effect, further strengthening respiratory function and improving respiratory disease, cough, Other pulmonary diseases that include symptoms such as sputum, difficulty breathing, airway irritability, airway obstruction, mucus hypersecretion, and other effects such as diffuse interstitial lung disease, acute respiratory distress syndrome (ARDS), and acute lung injury. This can also be useful.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • Figure 1 shows the results of evaluating the Netosis level (%) when treated by concentration of bovine tree extract for HL-60 cells.
  • Figure 2 shows the results of evaluating the Netosis level (%) when processing the tea tree extract for HL-60 cells.
  • Figure 3 shows the results of evaluating the Netosis level (%) when treating neutrophil extract with respect to HL-60 cells.
  • Figure 4 shows the results of evaluating the Netosis level (%) in the treatment of the quince (branch, leaf) extract for HL-60 cells.
  • Figure 5 shows the results of evaluating the Netosis level (%) in the treatment of arrowwood extract for HL-60 cells.
  • Figure 6 shows the results of evaluating IL-8 inhibitory activity in the treatment of H. japonica extract for H292 cells.
  • Figure 7 shows the results of evaluating IL-8 inhibitory activity in the treatment of bovine tree extract for H292 cells.
  • Figure 8 shows the results of evaluating IL-8 inhibitory activity in the treatment of H292 cells tea tree extract.
  • Figure 9 shows the results of evaluating IL-8 inhibitory activity in the treatment of hoeun extract for H292 cells.
  • Figure 10 shows the results of evaluating the IL-8 inhibitory activity in the treatment of neutrophil extract for H292 cells.
  • 11 and 12 show the results of evaluating IL-8 inhibitory activity in the treatment of H292 cells with the quince branch, leaf extract and fruit extract, respectively.
  • FIG. 13 and 14 show the results of evaluating IL-8 inhibitory activity in the treatment of H292 cells with the arrow leaf extract and eggplant extract, respectively.
  • Figure 15 shows the results of evaluating the MIP-2 inhibitory activity in the treatment of the jujube tree extract for MH-S cells.
  • Figure 16 shows the results of evaluating the MIP-2 inhibitory activity in the treatment of raw heat ginkgo extract for MH-S cells.
  • FIG. 17 shows the results of evaluating MIP-2 inhibitory activity upon treatment of fetal bovine extract against MH-S cells.
  • FIG. 18 shows the results of evaluating MIP-2 inhibitory activity upon treatment of tea tree extract against MH-S cells.
  • Figure 19 shows the results of evaluating the MIP-2 inhibitory activity in the treatment of hoeun extract for MH-S cells.
  • Figure 20 shows the results of evaluating the MIP-2 inhibitory activity when treating the quince fruit extract on MH-S cells.
  • Figure 21 shows the results of evaluating MIP-2 inhibitory activity in the treatment of arrowwood extract for MH-S cells.
  • FIG. 31 shows the results of immune cell analysis in BALF through Diff-Quick staining after administration of the jujube tree extract for the PPE / CSE-induced respiratory disease mouse model.
  • FIG. 32 shows the results of immune cell analysis in BALF through Diff-Quick staining after administering the extract of Hyeop-gwi-nak to the PPE / CSE-induced respiratory disease mouse model.
  • FIG. 33 shows the results of immune cell analysis in BALF through Diff-Quick staining after administration of bovine tree extract for a mouse model of respiratory disease induced by PPE / CSE.
  • 34 and 35 show the results of immune cell analysis in BALF through Diff-Quick staining after administration of tea tree extract to a mouse model of respiratory disease induced by PPE / CSE.
  • Figure 36 shows the results of immune cell analysis in BALF through Diff-Quick staining after administration of neutrophil extract for PPE / CSE induced respiratory disease mouse model.
  • FIG. 39 shows the results of immune cell analysis in BALF through Diff-Quick staining after administration of Cornus officinalis extract for a mouse model of respiratory disease induced by PPE / CSE.
  • Figures 40 and 41 show the results of immune cell analysis in BALF through Diff-Quick staining after administration of arrowwood extract for a mouse model of respiratory disease induced by PPE / CSE.
  • 45 to 50 show the results of analyzing Cytokine in BALF for a mouse model administered with bovine, tea, walnut root, quince, cornus, and arrowwood extracts, respectively, in order.
  • FIG. 51 is Cytokine (KC, MCP-1, MDC, TARC, GM-CSF, MIP-2, IL-6, TNF-alpha, IL-1beta, INF-gamma) from lung tissue of a mouse model to which an arrowwood extract was administered. , IL-10 and IL-17).
  • KC Cytokine
  • Jujube jujube (extraction site: leaf), fresh fruit tree (extraction site: leaf, stem), bovine tree (extraction site: leaf), tea tree (extraction site: leaf, stem), hoeeye (extraction site: outpost), ho Extracts of Jangeun (extraction site: root), Cornus Hydrangea (extraction site: ground part), arrowwood (extraction site: leaf, branch), and quince (extraction site: leaf, branch, fruit) produce pulmonary disease improvement activity Confirmed.
  • the extract was obtained by adding 10 times the weight of 70% ethanol to the dry powder of each material, repeatedly extracting it at 50 ° C. for 6 hours twice, filtering, concentrated under reduced pressure and freeze-dried to obtain a powder.
  • Neutrophil extracellular traps are known to be involved in the pathogenesis of chronic pulmonary / respiratory disease patients including chronic obstructive pulmonary disease (PLoS One. 2014 May 15; 9 (5): e97784 .; Respir Res. 2015 May 22; 16: 59 .; J Immunol Res. 2017; 2017: 6710278; Respirology. 2016 Apr; 21 (3): 467-75.). Accordingly, in the model treated with phorbol myristate acetate (PMA) on neutrophil cells, the Netosis activity of each extract was confirmed.
  • PMA phorbol myristate acetate
  • HL-60 Human promyelocytic leukemia cells
  • RPMI fetal bovine serum
  • penicillin 100 U / mL penicillin, 100 mg / mL streptomycin
  • DMSO 1% DMSO
  • Cytox green was treated with 500 nM and measured at a wavelength of 485/520 nm (excitation / emission maxima) using a fluorescent plate reader.
  • PMA is generally used to elicit Netosis activity of neutrophil cells.
  • the netosis inhibitory activity of the jujube, hoeun, and cornice extract was measured as a percentage, and the average values thereof are shown in% in Tables 1 to 3 (n> 3).
  • the extract of fresh heat nori tree exhibits an inhibitory activity of about 71.1% at a concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • HL-60 cells were seeded at 2 ⁇ 10 5 cells / mL in RPMI (10% FBS, 100 U / mL penicillin, 100 mg / mL streptomycin) medium treated with 1% DMSO and seeded in a cell incubator (37 °C, 5% CO Cultured in 2 ) for 5 days to differentiate into a mature neutrophil phenotype. After 5 days, after centrifugation at 1,300 rpm for 5 minutes, HBSS (with Mg +, Ca + ) was treated with 10 mL and washed by centrifugation at 1,300 rpm for 5 minutes.
  • RPMI % FBS, 100 U / mL penicillin, 100 mg / mL streptomycin
  • the recovered cells were diluted in HBSS at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL and dispensed at 100 ⁇ L in 96 well plates, and 50 ⁇ L of samples prepared at each concentration were treated. Thereafter, 50 ⁇ L of PMA prepared at 400 nM was treated in each well and cultured for 3 hours. After 3 hours, Cytox green (500 nM) was treated and fluorescence was measured at excitation / emission maxima: 485/520 nm using a fluorescent plate reader.
  • H292 cells prepared at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / mL in a 24 well plate were passaged and cultured at 500 ⁇ L / well, and when the cells became more than 80% confluent, they were exchanged with serum-free RPMI1640 medium and starvated for 24 hours. After that, using the Serum-free RPMI1640 medium, the stimulator (CSE; final 2%) and each sample were diluted to reflect the desired final concentration, and then treated with 500 uL per well. After incubation overnight, the supernatant was recovered and used for IL-8 measurement. Human IL-8 was measured by ELISA, and was performed according to the manufacturer's (BD) protocol. At this time, the IL-8 measurement supernatant was diluted 5 times and analyzed.
  • CSE stimulator
  • BD manufacturer's
  • the concentration of IL-8 was independently inhibited depending on the concentrations of the treated jujube, bovine, tea, hoe, walnut root, quince (branches / leaves, fruits), and arrowwood (leaves, branches) extracts, respectively. It was confirmed (Figs. 6 to 14). On the other hand, it was confirmed that the extract of fresh heat nori tree exhibits an IL-8 inhibitory activity of about 60.1% at a concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • the bronchial epithelial cell line, NCI-H292 was obtained from the Korea Cell Line Bank and used.
  • RPMI1640 WELGENE, cat.LM011-51 containing 10% fetal calf serum (WELGENE, cat.S001-07) and 1% penicillin-streptomycin (WELGENE, cat.LS202-02) was used as the culture medium. Cultured in an incubator (37 ° C, 5% CO2).
  • NCI-H292 cells at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / ml were cultured by dispensing 200 ⁇ l per well of a 96-well plate and exchanged with serum-free RPMI medium when 80% was full. After one day, CSE (final 1%) and a sample were added to 200 ⁇ l of serum-free RPMI medium, and after 24 hours, 150 ⁇ l of the supernatant was collected and used for cytokine measurement (ELISA).
  • the capture antibody for IL-8 was diluted to a suitable concentration in PBS, dispensed 100 ⁇ l per well of a 96 well immune plate (SPL), and left overnight. Thereafter, after washing 3 times with a washing solution of 350 ⁇ l per well, 300 ⁇ l of Reagent Diluent was added and left at room temperature for 1 hour, followed by washing twice. Then, the standard and the supernatant samples were diluted in the diluted solution to an appropriate concentration, and then treated with 100 ⁇ l per well, incubated at room temperature for 2 hours, and washed twice.
  • SPL 96 well immune plate
  • IL-8 detection antibody (Detection Antibody) was diluted to a suitable concentration using a diluted solution, and treated with 100 ⁇ l per well and incubated at room temperature for 2 hours. After washing twice, the dilute solution containing streptavidin-HRP was treated with 100 ⁇ l and incubated at room temperature for 20 minutes, followed by washing twice. Finally, the substrate solution was treated with 50 ⁇ l per well, the plate was lightly tapped, and absorbance was measured at a wavelength of 450 nm using a microplate reader. As a negative control group, a group not treated with any substance was used, and as a control group (sham control), a group treated with CSE (final concentration 1%) was used. It was calculated as the average percentage of the experimental control.
  • the Cornus Hydrangea extract showed 83.8% of IL-8 inhibitory activity at a concentration of 100 ⁇ g / mL.
  • Jujube jujube raw walnut tree, cedar tree, tea tree, hoe's eye, walnut root, quince tree, arrow tree extract
  • the MH-S cell line was purchased from ATCC, and the medium composition used for culture was RMPI-1640 (WELGENE, cat.LM 011-01), 10% FBS (WELGENE, cat.S 001-07), 1% Penicillin- Streptomycin (WELGENE, cat. LS 202-02), 14.3 mM 2-Mercptoethanol (SIGMA).
  • MH-S cells were seeded in a cell culture 96 well plate (SPL, cat. 30096) at a concentration of 5x10 4 / well and cultured for 24 hours.
  • the stimulators CSE; final 1% and LPS; final 10 ng / mL
  • each sample were diluted with MH-S cell culture medium to reflect the desired final concentration, and treated with 250 uL per well.
  • the supernatant was recovered and used for MIP-2 measurement.
  • MIP-2 was measured by ELISA, and was performed according to the protocol of the manufacturer (R & D, DY452).
  • the measured result of suppressing the expression of MIP-2 was calculated as an average percentage of the experimental control group (group treated with CSE) (FIGS. 15 to 21).
  • MH-S cells were RPMI- containing 10% fetal calf serum (WELGENE, cat.S 001-07) and 1% penicillin-streptomycin (WELGENE, cat.LS 202-02) and 0.05mM 2-Mercaptoethanol (SIGMA). 1640 (WELGENE, cat. LM 011-01) cultured in a cell culture medium (37 °C, 5% CO2) using a medium.
  • the medium present in the MH-S culture dish After removing the medium present in the MH-S culture dish, it was washed twice with 5 ml of DPBS. After removing the DPBS, 10 ml of MH-S culture medium was dispensed into the dish, and cells were collected using a scraper. After transferring the cells to a 15 ml tube, the supernatant was removed by centrifugation at 1000 rpm, 24 ° C., and 10 minute conditions, and 1 ml of medium was dispensed. After measuring the number of cells using a cell counter, the cells were diluted to 2 ⁇ 10 5 cells / ml and dispensed at 250 ⁇ l in 96 well plates (SPL, cat. 30096).
  • the culture medium containing 1% CSE, 10 ng / ml LPS and each sample was replaced with 250 ⁇ L and cultured for 24 hours. After 24 hours, the supernatant present in 96 wells was removed separately for cytokine measurement (ELISA).
  • the expression level of MIP-2 in alveolar macrophages was measured by the ELISA method in the same manner as in Experimental Example 2.
  • the measured result of suppressing the expression of MIP-2 was calculated as an average percentage of the experimental control.
  • the cornice extract showed excellent MIP-2 expression inhibitory activity of 85.9% at a concentration of 25 ⁇ g / mL, 97.4% at a concentration of 50 ⁇ g / mL, and 99.5% at a concentration of 100 ⁇ g / mL, respectively (Table 4).
  • 200 mg / kg of the sample was orally administered for 24 days from a week prior to the start of COPD induction to anatomy, and the same amount of PBS was administered to the Naive and COPD groups.
  • the Roflumilast group which is a positive control, was orally administered daily at 10 mg / kg farm after induction.
  • Porcine Pancreatic Elastase (PPE) 1.2 unit and 100% Cigarette Smoke Extraction (CSE) were used for COPD induction.
  • PPE 1.2 unit was injected 3 times through intra nasal once every 7 days, and CSE was treated with 20 ⁇ l through intra nasal for 3 days from the day following PPE treatment, but after the last PPE treatment, dissection was performed without CSE treatment the next day. Did. Dissection was performed after anesthesia with isoflurane using an inhalation anesthesia. During the experiment, feed and drinking water were provided in the form of autonomous feeding, and kept in an environment of 24 ° C and 60% humidity.
  • bronchoalveolar lavage fluid (BALF). 10 uL of the recovered BALF solution was mixed with the Accustain T solution in the same amount and 12 uL was injected into the Accuchip channel, and the total cells were automatically counted using a cell counter (ADAM-MC, NANOENTEK. INC, Korea). The results of administration of each extract are shown in FIGS. 22 to 30.
  • the recovered BALF was separated into a supernatant and a cell pellet through centrifugation at 300 ⁇ g, 5 minutes.
  • the cell pellet was resuspended by adding 700 ⁇ L of PBS, and 150 ⁇ L of this BALF suspension was centrifuged at 1000 rpm, 10 min, 4 ° C. with a Cytospin device (Centrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg, Germany) to transfer BALF cells to the slide. Attached.
  • the lung tissue was removed from the dissected mouse, and the mesenchyme of the lung was removed, and then fixed in 10% neutral buffered formalin for 3 days.
  • the fixed tissue was dehydrated with ethyl alcohol and xylene, embedded with paraffin, trimmed, and cut to a thickness of 5 um. After attaching the prepared section to the slide, it was observed with a microscope after staining with H & E to confirm the general morphology.
  • the results of administration of each extract are shown in FIGS. 42 to 44.
  • bronchoalveolar lavage fluid BALF
  • the recovered BALF was centrifuged at 300 ⁇ g, 5 minutes, and the supernatant was separated, followed by cytokines and chemokines analysis (TARC, KC, MCP-1, MDC, GM-CSF, MIP-2, TNF- ⁇ , IL- 6, IL-1 ⁇ , IL-17, IL-10, IFN- ⁇ ).
  • TARC, KC, MCP-1, MDC, GM-CSF, MIP-2 TNF- ⁇ , IL- 6, IL-1 ⁇ , IL-17, IL-10, IFN- ⁇
  • 30 uL of the supernatant was taken, and the experiment was conducted according to the protocol of the Q-plex ELISA array kit (Quansis biosciences). The results of administration of each extract are shown in FIGS. 45-50.
  • cytokines and chemokines TARC, KC, MCP-1, MDC, GM-CSF, MIP-2, TNF- ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ , IL-17, IL-10, IFN- ⁇ ).
  • cytokines and chemokines 30 uL of the supernatant was taken, and then experiments were performed according to the manufacturer (Quansis biosciences) protocol of the Q-plex ELISA array kit (FIG. 51).

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Abstract

본 발명은 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및/또는 화살나무 추출물을 이용한 천식 또는 만성폐쇄성폐질환 등의 폐질환 개선용 조성물을 개시한다. 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및/또는 화살나무 추출물은 PMA(phorbol myristate acetate)에 의해 유도된 호중구 세포외 트랩(Neutrophil extracellular traps)의 네토시스(Netosis) 활성화를 억제하고, 점액질을 생성하는 기관지 상피세포주인 NCI-H292 세포의 CSE에 의한 염증성 사이토카인인 IL-8의 발현을 억제하며, CES와 LPS(lipopolysaccaride)에 의해 활성된 폐포 대식세포인 MH-S 세포의 염증성 사이토카인인 MIP-2의 발현을 억제하는 활성을 가진다. 또한, CSE와 PPE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에서 폐 조직 손상을 억제하고, BALF 내에 총 세포(Total cell), 대식세포(macrophages), 림프구(Lymphocytes), 호산구(Eosinophil), 호중구(Neutrophil) 등의 면역세포 침윤을 억제하며, BALF 및 폐 조직에서 염증성 사이토카인과 케모카인 분비를 억제하는 활성을 가진다.

Description

갯대추나무 추출물 등을 포함하는 호흡기 질환 개선용 조성물
본 발명은 갯대추나무 추출물 등을 이용한 알러지, 천식 또는 만성폐쇄성폐질환(COPD) 개선용 조성물에 관한 것이다.
알러지 반응은 Ⅰ형 anaphylaxis형, Ⅱ형 세포용해형, Ⅲ형 면역복합체형, Ⅳ형 세포중개형, Ⅴ형 자극성 과민반응형의 5가지 유형으로 분류되는데, 대부분은 제Ⅰ형에 속하며, 일반적으로 알러지 반응이라 하면 제Ⅰ형과 동일한 의미로 사용된다(Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology 6th eds. U.S.A.. Mosby. 2001:323-383).
대표적인 알러지 질환으로는 아토피성 피부염, 기관지 천식, 알러지성 비염, 알러지성 각막염, 피부 두드러기 등이 있으며, 이들 알러지 질환에는 비만세포(mast cell)가 중요한 작동세포로 알려져 있다(Wills-Karp M., et al., Science, 282:2258-61, 1998; Grunig G., et al., Science, 282:2261-2263, 1998). 비만세포는 피부, 호흡기, 림프관 주위, 위장관의 점막, 혈관 주위, 뇌 등 전신의 장기에 널리 분포하고 있는 세포이다(Ishizaka t., et al. J. Immunol. 119:1589, 1997).
알러지 반응은 이러한 비만세포 표면의 IgE 고친화성 수용체 (FcεRI)에 결합되어 있는 IgE에 진드기, 꽃가루 등의 알러지원이 결합하면, 수용체(FcRIα)의 가교 및 응집에 의하여 비만세포가 활성화되어 세포질 내의 칼슘이온(Ca++) 농도 등이 상승한다. 칼슘이온 농도의 상승은 세포막의 콜레스테롤이나 세포 골격계 등 여러 종류의 세포 내 조절인자에 작용하여 과립을 세포막에 이동시킴과 동시에 과립의 공포화, 과립 상호의 융합 및 과립과 세포막의 융합 등을 거쳐 탈과립을 일으킨다. 탈과립이 되면 혈관확장, 혈관투과성 항진, 기관지 평활근의 수축이나 분비항진 등의 작용을 갖는 히스타민, 세로토닌(serotonin), 류코트리엔 등이 유리될 뿐만 아니라 호산구나 호중구 등 염증 세포의 주화성 인자로 작용하는 NCF, ECF, PAF등이 함께 유리되어 알러지 반응이 일어나게 된다(Ennis M, et al., Br J Pharmacol 70:329-334, 1980; Metcalfe DD, et al., Crit Rev Immunol 3:23-74, 1981; Miyajima I, et al., J Clin Invest 99:901-914, 1997; Church MK, et al., J Allergy Clin Immunol 99:155-160, 1997; Jones DA, et al., J Biol Chem 268:9049-9054, 1993).
기관지 천식은 가역적인 기도 폐쇄, 기도의 과민성(기도 저항의 증가), 점액의 과분비, 혈청 중 IgE의 높은 수치가 특징인 알레르기성 질환이다. 기도 내로 흡입된 여러 항원에 의하여 자극된 TH2(T helper 2) 타입 면역세포가 IL-4, 5, 13 등을 생성하면 T 세포, 호산구, 비만세포 등의 염증 세포들이 증식, 분화 및 활성화되어 기도와 기도 주변 조직으로 이동, 침윤하기 때문에 만성 염증질환으로도 인식되고 있다(J Clin Invest, 111: 291-297, 2003; N Engl J. Med. 2001; 44(5): 350-62; Toshio Hirano. Cytokine molecular biology. World Science. 2002). 따라서, 천식 치료제의 개발에 있어서는 호산구 등의 염증세포의 침윤 등의 억제가 중요 표적 중 하나이다.
만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 기침, 객담, 호흡 곤란, 호기 유속의 감소, 가스 교환의 장애 등을 보이는 만성 기도 질환으로서, 해마다 전세계적으로 그 발병 인구가 증가하고 있으며, 2020년에는 인류의 사망원인 중 3번째 원인이 될 것으로 예측되고 있다(Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187:347-365; Am J Respir Crit Care Med, 2009, 180:396-406).
COPD는 흡연, 대기오염, 화학물질, 직업성 인자, 유전적 소인 등 다양한 원인에 의해서 발병하는데, 이중 흡연이 주요한 원인으로 지목되고 있으며, 실제 COPD 환자의 80% 이상이 흡연자로 밝혀진 바 있다(Biol Pharm Bull, 2012, 35:1752-1760). COPD의 발병 기전에는 염증, 폐에서의 단백분해효소 활성화, 산화적 스트레스(oxidative stress) 등이 관여하며, 염증에 관여하는 세포는 주로 호중구와 대식세포, T 림프구 등이다. 이러한 염증세포들은 활성산소종(reactive oxygen species), 다양한 염증성 사이토카인, 조직 손상을 야기하는 여러 단백분해 효소들을 생성한다(대한결핵 및 호흡기학회 호흡기학 서울: 군자출판사; 2007, p 301-5;Am J Respir Crit Care Med, 1997 155, 1441-1447; Am J Physiol Lung CellMol Physiol, 2010, 298:L262-L269). 특히, 호중구는 세포 외로 엘라스타아제, 콜라게나아제, MPO(myeloperoxidase)와 같은 단백분해효소(proteases), 아라키돈산대사물(arachidonate), 활성산소종(reactive oxygen free radical) 등의 물질을 분비하여 폐손상을 야기함으로써 COPD가 발병하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 COPD 치료제의 개발에 있어 중요한 표적이 되고 있다(Am J Respir Cell Mol Biol, 2013, 48:531-539; Eur Respir J, 1998, 12:1200-1208).
최근 호중구 세포외 트랩(Neutrophil extracellular traps)의 네토시스(Netosis) 활성화가 COPD를 비롯한 만성 폐/호흡기 질환의 발병 기전에 관여하는 것으로 보고되어 있다(PLoS One. 2014 May 15;9(5):e97784.; Respir Res. 2015 May 22;16:59.; J Immunol Res. 2017;2017:6710278; Respirology. 2016 Apr;21(3):467-75).
현재 COPD, 천식 등 질환의 경과 등을 보기 위한 수단으로 기관지폐포세척술(bronchoalveolar lavage: BAL)이 이용되는데, 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid: BALF) 내에는 염증성 사이토카인, 활성 산소종, 류코트리엔, 활성화 보체 등 염증 매개 물질들이 증가하고, 정상 폐에서 5% 미만을 차지하는 호중구가 전체 세포의 80%를 차지할 정도로 증가한다(Am J Respir Crit Care Med 154(1): 76-81, 1996).
이제까지 COPD나 천식을 직접적으로 개선시키는 약물은 보고된 바 없으며, 현재의 COPD나 천식 치료제로는 증상과 합병증을 감소시키기 위한 것으로 기관지확장제(β2-작용제, 항콜린제, methylxanthines)와 스테로이드제(흡입, 경구) 등이 주로 사용되고 있다.
본 발명의 목적은 갯대추나무 추출물 등을 이용한 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선용 식품 조성물, 상기 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품, 갯대추나무 추출물 등을 이용한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 항알러지용 식품 조성물 및 이를 포함하는 건강기능식품을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 갯대추나무(Paliurus ramosissimus), 생열귀나무(Rosa davurica), 소태나무(Picrasma quassioides), 차나무(Camellia sinensis), 괭이눈(Chrysosplenium grayanum), 호장근(Reynoutria elliptica), 모과나무(Chaenomeles sinensis), 산수국(Hydrangea serrata) 및/또는 화살나무(Euonymus alatus) 추출물이 PMA(phorbol myristate acetate)에 의해 유도된 호중구 세포외 트랩(Neutrophil extracellular traps)의 네토시스(Netosis) 활성화를 억제하고, 기관지 상피세포주인 NCI-H292 세포의 CSE에 의한 염증성 사이토카인인 IL-8의 발현을 억제하며, 또한 CES와 LPS(lipopolysaccharide) 의해 활성된 폐포 대식세포인 MH-S 세포에서도 염증성 사이토카인인 MIP2의 발현을 억제함을 확인함으로써 완성된 것이다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명은, 일 측면에 있어서, 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및 화살나무 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항알러지 조성물로 파악될 수 있으며, 다른 측면에 있어서는 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및 화살나무 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 COPD 개선용 조성물로 파악될 수 있다. 또 다른 측면에 있어서는 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및 화살나무 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 천식 개선용 조성물로 파악될 수 있으며, 나아가 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및 화살나무 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선용 조성물로도 파악할 수 있으며, 또한 본 발명은 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및 화살나무 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 기침, 객담, 호흡 곤란, 기도 과민성, 기도 폐쇄, 점액 과분비, 호기 유속의 감소 및/또는 가스 교환의 장애 증상을 수반하는 폐질환 개선용 조성물로도 파악할 수 있다. 이러한 폐질환은 앞서 언급한 천식이나 COPD 뿐 아니라 미만성 간질성 폐질환, 급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 급성 폐손상 등을 포함하며, 발생 원인을 불문하고 앞서 언급한 흡연, 대기오염, 유전적 소인 등에 의한 폐질환 이외에 특히, 최근 문제가 되고 있는 미세먼지에 의한 폐질환을 포함한다. 검댕, 생물체 유기탄소 등 탄소성분과 염소, 질산, 암모늄, 나트륨, 칼슘 등의 이온성분, 납, 비소, 수은과 같은 금속성분, 벤조피렌 등과 같은 다환방향족 탄화수소 등 다양한 성분을 포함하고 있는 미세먼지는 상기도, 기관지, 소기도, 폐포 등에 침착하여 천식, COPD 등 다양한 폐질환을 일으키는 것으로 알려져 있다(J Korean Med Assoc, 2014; 57: 763-768).
본 명세서에서, "추출물"이란 추출 대상인 식물의 줄기, 잎, 열매, 꽃, 뿌리, 이들의 혼합물 등을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.
본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명에서 용어 "호흡기 기능 강화"는 비강, 인두, 후두, 기관, 기관지 및 폐 등 호흡 기관의 본래 기능을 건강한 상태로 유지시키거나, 흡연, 미세먼지, 호중구 네토시스 활성화 또는 기타 호흡기 질환 등에 따른 증상으로 인해 저하된 호흡 기관의 기능을 본래 건강한 상태로 개선시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 상기 "호흡기 질환"은 비강, 인두, 후두, 기관, 기관지 및 폐 등 개체의 호흡 기관에 발생하는 질환을 의미하는 것으로, 구체적으로 상기 호흡기 질환은 흡연 또는 미세먼지에 의한 호흡기 질환; 또는 네토시스(Netosis)를 수반하는 폐질환을 의미할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 호흡기 질환은 객담, 호흡 곤란, 기도 과민성, 기도 폐쇄, 점액 과분비, 호기 유속의 감소 및/또는 가스 교환의 장애 증상을 수반하는 폐질환을 의미할 수 있고, 보다 더 구체적으로 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기관염(tracheitis), 기관지염(bronchitis), 미만성 간질성 폐질환, 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 급성 폐손상, 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 모세기관지염(bronchiolitis), 인플루엔자 바이러스 감염증(influenza virus infection), 폐렴(pneumonia), 결핵(tuberculosis) 및 수혈관련급성폐장애(transfusion-related acute lung injury)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 의미할 수 있으며, 가장 구체적으로는 천식 또는 COPD를 의미할 수 있다. 한편, 최근 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps)의 네토시스(Netosis) 활성화가 COPD를 비롯한 만성 호흡기 질환의 발병 기전에 관여하는 것으로 보고되어 있다.
본 발명의 조성물에서 그 유효성분은 항염증 활성, 항알러지 활성, 천식 개선 활성, COPD 개선 활성, 기타 폐질환 개선 활성, 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선 활성을 나타낼 수 있는 한, 그 구체적 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 항염증 효과, 항알러지 효과 등 의도한 기능적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.
본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 항염증 효과, 항알러지 효과, 천식 개선 효과의 상승·보강을 위하여 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 기능성이 인정된 화합물 또는 추출물이 포함될 수 있다.
예컨대, 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라, 항염증("관절염 개선") 기능성이 인정된 MSM(dimethylsulfonylmethane), N-아세틸글루코사민 등과, 항알러지("과민 면역반응 완화") 기능성이 인정된 Enterococcus faecalis 가열 처리 건조 분말, 구아바 잎 추출물 등의 복합물, 다래 추출물, 소엽 추출물, 피카오프레토 분말 등의 복합물, PLAG(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol) 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이러한 화합물 또는 천연 추출물은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품에는 건강기능(성)식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능식품"이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항알러지 효과, 천식 개선 효과 또는 COPD 개선 효과, 나아가 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.
감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.
약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.
약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및/또는 화살나무 추출물을 이용한 알러지, 천식 또는 COPD 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품, 특히 건강기능식품 또는 약품으로 제품화되어, 항알러지 효과, 천식 개선 효과 또는 COPD 개선 효과를 위하여, 나아가 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선 효과를 위하여 유용하게 사용될 수 있으며, 기침, 객담, 호흡 곤란, 기도 과민성, 기도 폐쇄, 점액 과분비 등의 증상을 수반하는 기타 폐질환 예컨대 미만성 간질성 폐질환, 급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 급성 폐손상 등의 개선 효과를 위하여서도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 HL-60 세포에 대해 소태나무 추출물의 농도별 처리 시 Netosis 수준(%)을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HL-60 세포에 대해 차나무 추출물의 처리 시 Netosis 수준(%)을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HL-60 세포에 대해 호장근 추출물의 처리 시 Netosis 수준(%)을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HL-60 세포에 대해 모과나무(가지, 잎) 추출물의 처리 시 Netosis 수준(%)을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HL-60 세포에 대해 화살나무 추출물의 처리 시 Netosis 수준(%)을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 H292 세포에 대해 갯대추나무 추출물의 처리 시 IL-8 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 H292 세포에 대해 소태나무 추출물의 처리 시 IL-8 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 H292 세포에 대해 차나무 추출물의 처리 시 IL-8 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 H292 세포에 대해 괭이눈 추출물의 처리 시 IL-8 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 H292 세포에 대해 호장근 추출물의 처리 시 IL-8 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 11 및 12는 H292 세포에 대해 각각 모과나무 가지, 잎 추출물과 열매 추출물의 처리 시 IL-8 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 13 및 14는 H292 세포에 대해 각각 화살나무 잎 추출물과 가지 추출물의 처리 시 IL-8 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 MH-S 세포에 대해 갯대추나무 추출물의 처리 시 MIP-2 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 MH-S 세포에 대해 생열귀나무 추출물의 처리 시 MIP-2 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 MH-S 세포에 대해 소태나무 추출물의 처리 시 MIP-2 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 MH-S 세포에 대해 차나무 추출물의 처리 시 MIP-2 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 MH-S 세포에 대해 괭이눈 추출물의 처리 시 MIP-2 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 MH-S 세포에 대해 모과나무 열매 추출물의 처리 시 MIP-2 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 MH-S 세포에 대해 화살나무 추출물의 처리 시 MIP-2 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 22 내지 30은 각각 순서대로 PPE/CSE로 유도된 만성폐쇄성폐질환(또는 호흡기 질환)마우스 모델에 대해 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 호장근, 모과나무 가지/잎, 모과나무 열매, 화살나무 추출물을 투여한 후 기관지폐포세척액(BALF)로부터 계수된 총 세포수를 나타낸 것이다.
도 31은 PPE/CSE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에 대해 갯대추나무 추출물을 투여한 후 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 PPE/CSE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에 대해 생열귀나무 추출물을 투여한 후 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 PPE/CSE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에 대해 소태나무 추출물을 투여한 후 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 34 및 35는 PPE/CSE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에 대해 차나무 추출물을 투여한 후 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 PPE/CSE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에 대해 호장근 추출물을 투여한 후 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 37 및 38은 PPE/CSE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에 대해 각각 모과나무 가지, 잎 추출물과 모과나무 열매 추출물을 투여한 후 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 PPE/CSE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에 대해 산수국 추출물을 투여한 후 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 40 및 41은 PPE/CSE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에 대해 화살나무 추출물을 투여한 후 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 42 내지 44는 각각 순서대로 차나무, 모과나무 열매, 화살나무 추출물을 투여한 마우스 모델로부터 적출된 폐 조직을 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 45 내지 50은 각각 순서대로 소태나무, 차나무, 호장근, 모과나무, 산수국, 화살나무 추출물을 투여한 마우스 모델에 대해 BALF 내 Cytokine을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 51은 화살나무 추출물을 투여한 마우스 모델의 폐 조직으로부터 Cytokine(KC, MCP-1, MDC, TARC, GM-CSF, MIP-2, IL-6, TNF-alpha, IL-1beta, INF-gamma, IL-10 및 IL-17)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예] 시료 준비
갯대추나무(추출 부위: 잎), 생열귀나무(추출 부위: 잎, 줄기), 소태나무(추출 부위: 잎), 차나무(추출 부위: 잎, 줄기), 괭이눈(추출 부위: 전초), 호장근(추출 부위: 뿌리), 산수국 (추출 부위: 지상부), 화살나무(추출 부위: 잎, 가지), 모과나무(추출 부위: 잎, 가지, 열매)의 추출물을 제조하여 폐질환 개선 활성을 확인하였다. 추출물은 각 소재의 건조 분말에 10배 중량의 70% 에탄올을 가하여 50℃에서 6시간씩 2회 반복 추출하여 여과한 후 감압농축 및 동결건조하여 분말상으로 얻었다.
[실험예] 폐질환 개선 활성
실험예 1: 호중구 세포의 Netosis 억제 활성
1-1: 갯대추나무, 생열귀나무, 괭이눈, 산수국 추출물
호중구 세포외 트랩(Neutrophil extracellular traps; Netosis)은 만성폐쇄성폐질환을 비롯한 만성 폐/호흡기 질환 환자의 발병 기전에 관여하는 것으로 알려져 있다(PLoS One. 2014 May 15; 9(5): e97784.; Respir Res. 2015 May 22;16:59.; J Immunol Res. 2017;2017:6710278; Respirology. 2016 Apr; 21(3):467-75.). 이에 따라 호중구 세포에 PMA(phorbol myristate acetate)를 처리한 모델에서 각 추출물들의 Netosis 활성을 확인하였다.
호중구의 Netosis 활성을 측정하기 위하여 한국 세포주 은행에서 분양받은 HL-60(Human promyelocytic leukemia cells)세포를 실험에 사용하였다. HL-60 세포를 1% DMSO가 처리된 RPMI(10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin) 배지에 2×105 cell/mL로 처리하고 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 5일간 배양하여 성숙된 호중구 표현형(mature neutrophil phenotype)이 나타나도록 분화시켰다. 5일후 1,300 rpm에서 5분간 원심분리 한 후, HBSS(with Mg+, Ca+, Hanks' balanced salt solution)를 10 mL 처리하고 1,300 rpm에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 다음으로, 2×106 cell/mL로 HBSS에 희석하여 50 μL씩 분주하고 각각의 농도로 준비된 상기 실시예의 시료를 50 μL씩 처리하였으며, 200 nM로 준비된 PMA(in HBSS)를 100 μL씩 각각의 well에 처리한 후 3시간 배양하였다(최종 PMA 농도 100nM). 3시간 후 사이톡스 그린(Cytox green)을 500 nM로 처리하고 형광 플레이트 리더기를 이용하여 485/520 nm(excitation/emission maxima) 파장에서 측정하였다. 여기서, PMA는 일반적으로 호중구 세포의 Netosis 활성을 이끌어내는 데 이용된다.
PMA 처리 대조군(실험대조군) 대비 갯대추나무, 괭이눈, 산수국 추출물의 Netosis 억제 활성을 백분율로 측정하여 그 평균값을 각각 표 1 내지 표 3에 %로 나타내었다(n>3). 한편, 생열귀나무 추출물은 50 ㎍/ml 농도에서 약 71.1%의 억제 활성을 나타냄을 확인하였다.
갯대추나무 처리 농도 6.25 ㎍/ml 12.5 ㎍/ml 25 ㎍/ml 50 ㎍/ml
Netosis 억제 활성 (%) 97.9 136.8 143.0 264.3
괭이눈 처리 농도 25 μg/mL 50 μg/mL
Netosis 억제 활성 (%) 0.9 9.5
산수국 처리 농도 12.5 μg/mL 25 μg/mL
Netosis 억제 활성 (%) 24.8 58.6
1-2: 소태나무, 차나무, 호장근, 모과나무, 화살나무
HL-60 세포를 1% DMSO가 처리된 RPMI (10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin) 배지에 2×105 cell/mL로 seeding하고 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 5일간 배양하여 mature neutrophil phenotype으로 분화시켰다. 5일후 1,300 rpm에서 5분간 원심분리 한 후, HBSS (with Mg+, Ca+)를 10 mL 처리하고 1,300 rpm에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 회수한 세포는 HBSS에 1×106 cell/mL 농도로 희석하여 96 well plate에 100 μL씩 분주하고 각각의 농도로 준비된 시료를 50 μL씩 처리하였다. 그 후 400 nM로 준비된 PMA 를 50 μL씩 각각의 well에 처리한 후 3시간 배양하였다. 3시간 후 Cytox green (500 nM)을 처리하고 형광 plate reader기를 이용하여 excitation/emission maxima: 485/520 nm에서 형광도를 측정하였다.
그 결과, Netosis 수준(%)은 처리된 소태나무, 차나무, 호장근, 모과나무(가지, 잎), 화살나무 추출물의 농도에 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 1 내지 5).
실험예 2: H292 세포를 이용한 염증성 사이토카인(IL-8) 억제활성 평가
2-1: 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 화살나무 추출물
24 well plate에 2×105 cells/mL 농도로 준비한 H292 세포를 500 μL/well로 계대하여 배양한 후 세포가 80% 이상 confluent 되었을 때, serum-free RPMI1640 배지로 교환하여 24시간 starvation 하였다. 그 후 Serum-free RPMI1640 배지를 이용하여 자극물질(CSE; 최종 2%)과 각각의 샘플을 원하는 최종 농도를 반영하여 희석한 후, well당 500 uL씩 처리하였다. 하룻밤 배양 후 상징액을 회수하여 IL-8 측정에 사용하였다. Human IL-8는 ELISA법으로 측정하였으며, 제조사(BD社)의 프로토콜에 따라 진행하였다. 이때, IL-8 측정용 상징액은 5배로 희석하여 분석하였다.
그 결과, IL-8 농도는 처리된 갯대추나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무(가지/잎, 열매), 화살나무(잎, 가지) 추출물 농도에 각각 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 6 내지 14). 한편, 생열귀나무 추출물은 100 ㎍/ml 농도에서 약 60.1 %의 IL-8 억제 활성을 나타냄을 확인하였다.
2-2: 산수국 추출물
기관지 상피세포주인 NCI-H292 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 배양액으로는 10% 우태아혈청(WELGENE, cat. S001-07)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(WELGENE, cat. LS202-02)이 포함된 RPMI1640(WELGENE, cat. LM011-51)을 사용하였으며 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
5×104 cell/㎖ 농도의 NCI-H292 세포를 96웰 플레이트의 각 웰당 200㎕씩 분주하여 배양하였으며 80% 가량 가득 찬 경우 무혈청 RPMI 배지로 교환하였다. 하루 뒤 다시 CSE(최종 1%)와 시료가 첨가된 무혈청 RPMI 배지 200㎕로 교환하였으며 24시간 뒤 상층액 150㎕를 회수하여 사이토카인 측정(ELISA)에 사용하였다.
실험을 수행하기 하루 전 IL-8에 대한 캡쳐 항체(Capture antibody)를 PBS에 알맞은 농도로 희석하여 96웰 면역 플레이트(96 well immune plate; SPL)의 웰당 100㎕씩 분주하여 하룻밤 두었다. 그 후 웰당 350㎕씩 세척용액을 사용하여 3회 세척한 후 희석 용액(Reagent Diluent)을 300㎕ 첨가하고 1시간 동안 상온에 두었으며 이후 2회 세척하였다. 그후 희석 용액에 스탠다드(standard)와 상층액 시료를 적절한 농도로 희석하여, 웰 당 100㎕씩 처리 후 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하고 2회 세척을 수행하였다. 희석 용액을 이용하여 IL-8 검출 항체(Detection Antibody)를 적절한 농도로 희석하였으며 웰당 100㎕씩 처리하고 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 2회 세척하고 스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP이 포함된 희석 용액을 100㎕씩 처리하고 상온에서 20분간 인큐베이션, 2회 세척을 수행하였다. 마지막으로, 기질 용액(Substrate Solution)을 웰당 50㎕ 처리하고 플레이트를 가볍게 두드린 후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로는 어떤 물질도 처리하지 않은 군을 사용하였으며, 실험대조군(sham control)으로는 CSE를 처리한 군(최종 농도 1%)을 사용하였으며, 이에 따라 측정된 IL-8의 생성 억제 결과를 실험 대조군 대비 평균 %로 계산하였다.
그 결과, 산수국 추출물은 100 μg/mL 농도에서 83.8 %의 IL-8 억제활성을 나타내었다.
실험예 3: MH-S 세포를 이용한 MIP-2 억제활성 평가
3-1: 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 화살나무 추출물
MH-S cell line은 ATCC 사에서 구매하였으며, 배양에 사용한 배지 조성은 RMPI-1640 (WELGENE, cat. LM 011-01), 10% FBS (WELGENE, cat. S 001-07), 1% Penicillin-Streptomycin (WELGENE, cat. LS 202-02), 14.3 mM 2-Mercptoethanol (SIGMA)였다. MH-S 세포를 5x104/well 농도로 cell culture 96 well plate (SPL, cat. 30096)에 seeding 하여 24시간 배양 하였다. 그 후 MH-S 세포 배양 배지로 자극물질 (CSE; 최종 1% 및 LPS; 최종 10 ng/mL )과 각각의 샘플을 원하는 최종농도를 반영하여 희석하고 well당 250 uL씩 처리하였다. 24 시간 배양 후, 상징액을 회수하여 MIP-2 측정에 사용하였다. MIP-2는 ELISA법으로 측정하였으며, 제조사(R&D, DY452)의 프로토콜에 따라 진행하였다. 측정된 MIP-2의 발현 억제 결과를 실험 대조군(CSE를 처리한 군) 대비 평균 %로 하여 계산하였다(도 15 내지 21). 한편, 호장근 추출물을 25 ㎍/ml 농도로 처리 시 MIP-2 분비가 억제(11.5 %)되는 것을 확인하였다.
3-2: 산수국 추출물
MH-S 세포는 10% 우태아 혈청(WELGENE, cat. S 001-07)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(WELGENE, cat. LS 202-02) 및 0.05mM 2-Mercaptoethanol (SIGMA) 포함된 RPMI-1640(WELGENE, cat. LM 011-01) 배지를 이용하여 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
MH-S 배양 디쉬에 존재하는 배지를 제거한 후 DPBS 5㎖을 이용하여 2회 세척하였다. DPBS를 모두 제거한 후 MH-S 배양 배지를 10㎖씩 디쉬에 분주하였으며 스크랩퍼를 이용하여 세포를 모았다. 세포를 15㎖ 튜브에 옮긴 후 1000rpm, 24℃, 10분 조건에서 원심분리하여 상층액을 제거하고 배지 1㎖씩 분주하였다. 세포 계수기를 이용하여 세포 수를 측정한 후 2×105cell/㎖로 희석하였으며 96 웰 플레이트(SPL, cat. 30096)에 250㎕씩 분주하였다. 24시간 동안 세포를 배양한 후 1% CSE, 10ng/㎖ LPS 및 각 시료가 포함된 배양배지 250 μL로 교체하고 24시간 더 배양하였다. 24시간 후, 96 웰에 존재하는 상층액을 사이토카인 측정(ELISA)을 위하여 따로 걷어내었다.
상기 실험을 통하여 획득한 상층액을 이용하여 ELISA 방법으로 폐포 대식세포에서 MIP-2의 발현 정도를 실험예 2의 방법과 동일한 방법으로 측정하였다. 측정된 MIP-2의 발현 억제 결과를 실험 대조군 대비 평균 %로 계산하였다.
그 결과, 산수국 추출물은 각각 25 μg/mL 농도에서 85.9 %, 50 μg/mL 농도에서 97.4 %, 100 μg/mL 농도에서 99.5 %의 우수한 MIP-2 발현 억제 활성을 나타내었다(표 4).
산수국 처리 농도 25 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL
MIP-2 발현 억제 (%) 85.9 97.4 99.5
실험예 4: 동물 모델에서 BALF 세포 수 측정
4-1: PPE+CSE-유도된 호흡기 질환 마우스 모델
오리엔트 바이오사에서 BALB/C 마우스(male, 5주령)를 구입하여 1주일간 순화하였으며, n=10로 group화 하였다. 샘플처리군은 COPD 유도 시작 일주일 전부터 해부전까지 24일간 200 mg/kg의 샘플을 경구투여하였으며, Naive와 COPD 군은 동량의 PBS를 투여하였다. 이 때 Positive control인 Roflumilast 군은 유도 시작 후 매일 10 mg/kg 농로 경구투여 하였다. COPD 유도에는 Porcine Pancreatic Elastase (PPE) 1.2 unit과 100% Cigarette Smoke Extraction (CSE)를 사용하였다. PPE 1.2 unit은 7일에 한번씩 intra nasal을 통해 총 3회 투입하였으며, CSE는 PPE 처리 다음날부터 3일간 intra nasal을 통해 20 ㎕ 처리하되, 마지막 PPE 처리 후에는 CSE를 처리하지 않고 다음 날 해부를 진행하였다. 해부는 흡입 마취기를 이용하여 isoflurane으로 마취시킨 후 진행하였다. 실험기간 동안 사료와 음용수는 자율급식 형태로 제공하였으며, 24 ℃, 습도 60% 환경에서 사육하였다.
4-2: BALF 내 침투된 총 세포수
마우스의 기도를 통해 PBS 1 mL을 주입한 후 가볍게 마사지하여 700 μL의 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid; BALF)을 회수하였다. 회수한 BALF액 10 uL를 Accustain T solution과 동량 혼합하여 Accuchip channel에 12 uL 주입 한 후 cell counter (ADAM-MC, NANOENTEK. INC, Korea)로 total cell을 자동 계수하였다. 각 추출물 투여에 따른 결과는 도 22 내지 30에 나타내었다.
4-3: Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석
회수한 BALF는 300×g, 5분 조건에서 원심분리를 통해 상층액과 세포 pellet으로 분리하였다. cell pellet은 PBS 700 μL를 첨가하여 재현탁하였으며, 이 BALF 현탁액 150 μL를 Cytospin device(Centrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg, Germany)로 1000 rpm, 10 min, 4℃ 조건에서 원심분리하여 slide에 BALF 세포를 부착시켰다. 이 후 Diff-Quick staining reagent를 사용하여 제조사 (1-5-1 Wakinohamakaigandori, chuo-ku, Kobe, Japan)의 프로토콜에 준하여 세포를 염색한 후 현미경 관찰을 통해 Macrophages, Lympocytes, Neutrophils, Eosinophils의 수를 계수하였다. 각 추출물 투여에 따른 결과는 도 31 내지 41에 나타내었다.
4-4: 조직 분석 (Histological examination)
해부한 마우스로부터 폐 조직을 적출하여 폐의 중간엽을 제거한 후 10% neutral buffered formalin에 3일간 고정하였다. 고정한 조직을 ethyl alcohol과 xylene으로 탈수 시킨 후 파라핀으로 포매 한 후 삭정하고 5 um 두께로 박절하였다. 준비한 절편을 슬라이드에 부착시킨 후, 일반적인 형태를 확인하기 위해 H&E로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 각 추출물 투여에 따른 결과는 도 42 내지 44에 나타내었다.
4-5: BALF 내 Cytokines 분석
마우스의 기도를 통해 PBS 1 mL을 주입한 후 가볍게 마사지하여 700 μL의 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid; BALF)을 회수하였다. 회수한 BALF는 300×g, 5분 조건에서 원심분리하여 상층액을 분리 한 후 cytokines 및 chemokines 분석(TARC, KC, MCP-1, MDC, GM-CSF, MIP-2, TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-17, IL-10, IFN-γ)에 사용하였다. cytokines 및 chemokines 분석을 위해 상층액 30 uL를 취한 후 Q-plex ELISA array kit의 제조사(Quansis biosciences 社) 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다. 각 추출물 투여에 따른 결과는 도 45 내지 50에 나타내었다.
4-6: 폐 조직의 Cytokines 분석
폐 조직 무게의 10배에 해당하는 PBS를 첨가하고 homogenizer로 분쇄한 후 12,000 rpm, 20 min 조건에서 원심분리하였다. 회수한 상등액은 cytokines 및 chemokines 분석 (TARC, KC, MCP-1, MDC, GM-CSF, MIP-2, TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-17, IL-10, IFN-γ)에 사용하였다. cytokines 및 chemokines 분석을 위해 상층액 30 uL를 취한 후 Q-plex ELISA array kit의 제조사(Quansis biosciences 社) 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다(도 51).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및 화살나무 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 기침, 객담, 호흡 곤란, 기도 과민성, 기도 폐쇄, 점액 과분비, 호기 유속의 감소 및/또는 가스 교환의 장애 증상을 수반하는 폐질환인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, COPD, 미만성 간질성 폐질환, 급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS) 또는 급성 폐손상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식 또는 COPD인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 식품 조성물을 포함하는, 건강기능식품.
  7. 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및 화살나무 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, COPD, 미만성 간질성 폐질환, 급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS) 또는 급성 폐손상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식 또는 COPD인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 갯대추나무, 생열귀나무, 소태나무, 차나무, 괭이눈, 호장근, 모과나무, 산수국 및 화살나무 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 항알러지용 식품 조성물.
  12. 제11항의 식품 조성물을 포함하는, 건강기능식품.
PCT/KR2019/011432 2018-09-04 2019-09-04 갯대추나무 추출물 등을 포함하는 호흡기 질환 개선용 조성물 WO2020050633A1 (ko)

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