KR102346724B1 - 바늘꽃 추출물을 이용한 천식 또는 만성폐쇄성폐질환 개선용 조성물 - Google Patents
바늘꽃 추출물을 이용한 천식 또는 만성폐쇄성폐질환 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 PMA(phorbol myristate acetate)에 의해 유도된 네토시스(NETosis)를 억제하고, CSE(cigarette smoke extract), PPE(porcine pancreas elastase), PM2.5(직경 2.5 마이크로미터 이하의 초미세먼지)에 의해 자극된 기관지 상피세포주인 H292 세포에서 의한 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8의 발현을 억제하며, CES에 의해 활성된 마우스 폐포 대식세포인 MH-S 세포에서도 염증성 사이토카인인 MIP2(IL-8)의 발현을 억제할 뿐만 아니라, CES와 PPE로 유도한 COPD 동물모델 실험에서 BALF의 호중구 등의 수를 낮추고 BALF 또는 폐 조직의 MIP-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, KC, MCP-1, IFN-γ 등의 염증성 사이토카인의 농도를 낮추며 기타 MDC, GM-CSF, IL-17 등의 농도를 낮추는 바늘꽃 추출물을 이용한 천식 또는 만성폐쇄성폐질환 개선용 조성물을 개시한다.
Description
본 발명은 바늘꽃(Epilobium pyrricholophum) 추출물을 이용한 천식 또는 만성폐쇄성폐질환 개선용 조성물에 관한 것이다.
만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 기침, 객담, 호흡 곤란, 호기 유속의 감소, 가스 교환의 장애 등 비가역적 기도 폐쇄를 보이는 만성 기도 질환으로서, 해마다 전세계적으로 그 발병 인구가 증가하고 있으며, 2020년에는 인류의 사망원인 중 3번째 원인이 될 것으로 예측된 바 있다(Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187:347-365; Am J Respir Crit Care Med, 2009, 180:396-406). 과거 COPD를 만성기관지염과 폐기종으로 구분하였으나 만성기관지염은 임상증상을 기준으로 정의되고 폐기종은 해부학적 기준에 의하여 구분되어, 같은 환자에서 두 가지를 동시에 가지고 있는 경우가 많고 임상적으로 구분이 어렵기 때문에 COPD로 총괄하여 진단하고 있다(Eur Respir J, 2007, 30:993-1013; Respirology 1997, 2 Suppl 1:S1-4). 기관지 천식의 경우에도 천식의 지속 기간이 오래되어 기도 폐쇄가 비가역적 변화를 나타낸 경우에는 COPD에 포함시켜 이에 준하여 치료한다(Eur Respir J, 2007, 30:993-1013; Respirology 1997, 2 Suppl 1:S1-4).
COPD는 흡연, 대기오염, 화학물질, 직업성 인자, 유전적 소인 등 다양한 원인에 의해서 발병하는데, 이중 흡연이 주요한 원인으로 지목되고 있으며, 실제 COPD 환자의 80% 이상이 흡연자로 밝혀진 바 있다(Biol Pharm Bull, 2012, 35:1752-1760). COPD의 발병 기전에는 기관지와 폐 조직 등에서의 만성 염증, 폐에서의 단백분해효소 활성화, 산화적 스트레스(oxidative stress) 등이 관여하며, 염증에 관여하는 세포는 주로 호중구와 대식세포, T 림프구 등이다. 이러한 염증세포들은 TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18 등의 다양한 염증성 사이토카인, 조직 손상을 야기하는 여러 단백분해효소들을 생성한다(대한결핵 및 호흡기학회 호흡기학 서울: 군자출판사; 2007, p 301-5;Am J Respir Crit Care Med, 1997 155, 1441-1447; Am J Physiol Lung CellMol Physiol, 2010, 298:L262-L269). 담배연기로 유발된 COPD 동물 모델에서는 호중구의 유입, KC(keratinocyte chemoattractant), TNF-α(tumour necrosis factorα), MIP-2(macropage inflammatory protein 2), MIP-1α 및 MCP-1(monocyte chemoattractant protein), MMP12(matrix metalloproteinase 12)와 GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor)이 증가함이 관찰되었다(Clin. Sci. 2014, 126(3):207).
COPD는 아토피, 천식 등의 TH2 유형의 질병으로 보고 있지 않지만, COPD 환자에서 TH1 세포와 TH2 세포가 활성화되어 있음이 보고된 바 있다(Eur J Immunol 2007, 37:2779-86). 케모카인(chemokine) TARC(CCL17) 및 MDC(CCL22)는 TH2 세포에서 발현되는 케모카인 수용체 CCR4의 리간드로( Curr. Opin. Immunol. 2002. 14: 129-135), 천식과 COPD에서 TSLP(thymic stromal lymphopoietin)와 함께 TARC(CCL17) 및 MDC(CCL22)가 증가하고, 또 임상시험에서 금연군에 비해 흡연군에서 TARC(CCL17) 및 MDC(CCL22)가 유의하게 증가한다(J Immunol 2008, 181:2790-8; Clin Exp Allergy 2012, 42:994-1005). 따라서 COPD 개선에 있어 TARC(CCL17) 및 MDC(CCL22)의 감소가 중요 평가 지표가 될 수 있다.
또 천식 환자에서와 같이 COPD의 환자에서 IL-17의 객담(sputum)과 혈청에서의 농도가 증가함이 관찰되어 IL-17이 COPD에서 일정한 역할을 할 것으로 시사된 바 있으며, COPD 동물모델에서도 IL-17이 기도 섬유화에 결정적인 역할을 함으로써 COPD의 기도 섬유화 억제의 중요한 표적으로 제안된 바 있다(Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2017; 12:1247-1254; Chest. 2010 Nov;138(5):1140-7).
한편 호중구는 세포 외로 엘라스타아제, 콜라게나아제, MPO(myeloperoxidase)와 같은 단백분해효소(proteases), 아라키돈산 대사물(arachidonate), 활성산소종(reactive oxygen free radical) 등의 물질을 분비하여 폐손상을 야기하고 기도 침윤을 통해 만성 기도 염증을 일으킴으로써 COPD가 발병하는데 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2017, 312(1):L122-L130; Am J Respir Cell Mol Biol, 2013, 48:531-539; Eur Respir J, 1998, 12:1200-1208).
최근 호중구 세포외 트랩(Neutrophil extracellular traps, NET)의 과도한 형성이 COPD를 비롯한 폐질환과 관련되어 있음이 보고된 바 있는데(PLoS One. 2014 May 15;9(5):e97784.; Respir Res. 2015 May 22;16:59.; J Immunol Res. 2017;2017:6710278; Respirology. 2016 Apr;21(3):467-75), NET은 서로 얽혀있는 크로마틴에 세포질 단백질과 과립 단백질 등이 결합한 그물 형태의 구조물이다. NET은 박테리아, 균류, 바이러스 등을 포획하여 중화하며 이들의 전파, 감염을 막는 역할을 하지만(Nat Immunol 15, 1017-1025, 2014), 과도한 NET의 분비는 다양한 감염성, 비감염성 질병과 관련성을 가진다. 특히 NET이 폐포에서 쉽게 팽창하여 폐 손상을 유발하기 때문에 폐질환과의 관련성이 주목되어 왔다(Nat Rev Microbiol. 2007, 5:577-82; Front Immunol. 2013, 4:1). 과도한 NET 형성(NETosis)은 COPD 뿐만 아니라 천식(asthma), 낭성섬유증(cystic fibrosis), RSV성 모세기관지염(respiratory syncytial virus bronchiolitis), 인플루엔자 바이러스 감염증(influenza virus infection), 세균성폐렴(bacterial pneumonia), 결핵(tuberculosis), 수혈관련급성폐장애(transfusion-related acute lung injury) 등의 폐질환에서 보고되어 있으며, 따라서 네토시스(NETosis) 억제는 이들 폐질환 치료제 개발의 중요한 표적으로 인식되어 있다(Front Immunol. 2016, 7:311)
현재 COPD, 천식 등 질환의 진단, 경과 등을 보기 위한 수단으로 기관지폐포세척술(bronchoalveolar lavage : BAL)이 이용되는데, 이들 환자의 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid : BALF) 내에는 염증성 사이토카인, 활성 산소종, 류코트리엔, 활성화 보체 등 염증 매개 물질들이 증가하고, 정상 폐에서 5% 미만을 차지하는 호중구가 전체 세포의 80%를 차지할 정도로 증가한다(Am J Respir Crit Care Med 154(1):76-81, 1996).
이제까지 COPD나 천식을 직접적으로 개선시키는 약물은 보고된 바 없으며, 현재의 COPD나 천식 치료제로는 증상과 합병증을 감소시키기 위한 것으로 기관지확장제(β2-작용제, 항콜린제, methylxanthines)와 스테로이드제(흡입, 경구) 등이 주로 사용되고 있다.
본 발명은 바늘꽃 추출물의 천식 또는 만성폐쇄성폐질환 개선 효과가 있음을 개시한다.
본 발명의 목적은 바늘꽃 추출물을 이용한 천식 또는 만성폐쇄성폐질환 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 바늘꽃 추출물이 PMA(phorbol myristate acetate)에 의해 유도된 네토시스(NETosis)를 억제하고, CSE(cigarette smoke extract), PPE(porcine pancreas elastase), PM2.5(직경 2.5 마이크로미터 이하의 초미세먼지)에 의해 자극된 기관지 상피세포주인 H292 세포에서 의한 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8의 발현을 억제하며, CES에 의해 활성화된 마우스 폐포 대식세포인 MH-S 세포에서도 염증성 사이토카인인 MIP2(IL-8)의 발현을 억제할 뿐만 아니라, CES와 PPE로 COPD를 유도한 동물모델 실험에서 BALF의 호중구 등의 수를 낮추고 BALF 또는 폐 조직의 MIP-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, KC, MCP-1, IFN-γ 등의 염증성 사이토카인의 농도를 낮추며 기타 TARC(CCL17), MDC(CCL22), GM-CSF, IL-17 등의 농도를 낮춤을 확인할 수 있었다.
본 발명은 전술한 바의 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명은, 일 측면에 있어서, 바늘꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 천식 개선용 조성물로 파악할 수 있고, 다른 측면에 있어서는 바늘꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 COPD 개선용 조성물로 파악할 수 있다, 또 다른 측면에 있어서는 바늘꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환 개선용 조성물로 파악할 수 있다. 또한 본 발명은 또 다른 측면에 있어서는 바늘꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐기능 또는 호흡 기능 개선용 조성물로 파악할 수 있고, 또 다른 측면에 있어서는 바늘꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 흡연 또는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 개선용 조성물로 파악할 수 있으며, 또 다른 측면에 있어서는 바늘꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐 손상 개선용 조성물로 파악할 수 있다. 또한 본 발명은 또 다른 측면에 있어서 바늘꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 NET 과도한 형성 즉 네토시스를 수반하는 폐 질환 개선용 조성물로 파악할 수 있다.
본 명세서에서, "추출물"이란 추출 대상인 식물의 줄기, 잎, 열매, 꽃, 뿌리, 전초, 이들의 혼합물 등을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.
또 본 명세서에서, "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서, "염증성 폐질환"은 염증 반응을 수반하는 폐 질환으로서 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기관염(tracheitis), 기관지염(bronchitis)을 포함하는 의미이다.
또 본 명세서에서, "폐기능 또는 호흡 기능 개선"은 비질환자인 정상인의 호흡 기능 향상, 만성폐쇄성폐질환이나 천식, 기관지염, 기관염 등에 의한 질환자의 호흡기능 부전(不全)의 회복 또는 질환자의 호흡 기능의 향상을 의미한다.
또 본 명세서에서, "흡연 또는 미세먼지에 의한 호흡기 질환"은 천식, COPD를 포함하는 이외에, 미만성 간질성 폐질환, 급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 급성 폐손상을 포함하는 의미이다. 검댕, 생물체 유기탄소 등 탄소성분과 염소, 질산, 암모늄, 나트륨, 칼슘 등의 이온성분, 납, 비소, 수은과 같은 금속성분, 벤조피렌 등과 같은 다환방향족 탄화수소 등 다양한 성분을 포함하고 있는 미세먼지는 상기도, 기관지, 소기도, 폐포 등에 침착하여 천식, COPD 등 다양한 폐질환을 일으키는 것으로 알려져 있다(J Korean Med Assoc, 2014;57:763-768).
또 본 명세서에서, "폐 손상 개선"은 미세먼지 등에 의한 폐세포 또는 폐조직 손상의 회복 또는 폐세포 또는 폐조직 손상에 따른 폐기능 저하의 회복을 의미한다.
또 본 명세서에서, "네토시스를 수반하는 폐 질환"은 앞서 예시한 COPD 뿐만 아니라 천식(asthma), 낭성섬유증(cystic fibrosis), RSV성 모세기관지염(respiratory syncytial virus bronchiolitis), 인플루엔자 바이러스 감염증(influenza virus infection), 세균성폐렴(bacterial pneumonia), 결핵(tuberculosis), 수혈관련급성폐장애(transfusion-related acute lung injury)을 포함하는 의미이다.
또 본 명세서에서, "개선"은 질병 또는 증상의 경감, 치료 또는 예방을 포함하는 의미이다.
본 발명의 조성물에서 그 유효성분은 천식 개선, COPD 개선, 폐 기능 또는 호흡 기능 개선 효과 등을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 천식 개선, COPD 개선, 폐 기능 또는 호흡 기능 개선 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로써 바늘꽃 추출물 이외에 천식 개선, COPD 개선, 폐 기능 또는 호흡 기능 개선의 효과의 상승을 위하여, 이미 천식 개선, COPD 개선, 폐 기능 또는 호흡 기능 개선의 효과가 있다고 알려진 강황(Curcuma longa) 추출물, 황금(Scutellaria baicalensis) 추출물, 마름(Trapa japonica) 추출물, 소엽( Perilla frutescens) 추출물, 마디풀(Polygonum avivulare) 추출물, 영실(Rosae multiflorea) 추출물, 호로파(Trigonella foenum) 추출물, 후추(Piper nigrum) 추출물 또는 이들의 2 이상의 혼합물을 유효성분으로 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 식품 조성물로서 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 건강기능식품이거나, 한국 "식품위생법"의 식품공전(식약처 고시 "식품의 기준 및 규격"임)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조?유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 "식품위생법"임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 "식품첨가물 기준 및 규격)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.
감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 식품 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위한 용도로 사용되는 것으로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충·보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 법률에 따른 식품공전이나 식품첨가물공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코오스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 점안제, 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제, 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 점안제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 식염수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있으며 필요에 따라 염화벤잘코늄, 메필파라벤, 에틸파라벤 등을 방부 목적으로 첨가할 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.
약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 바늘꽃 추출물을 이용한 천식 또는 COPD 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품, 특히 건강기능식품 또는 약품으로 제품화되어, 천식 개선 효과 또는 COPD 개선 효과를 위하여, 나아가 폐 기능 또는 호흡 기능 개선 효과를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 바늘꽃 추출물의 NETosis 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 2 내지 4는 바늘꽃 추출물이 CSE 등에 의해 자극된 H292 세포에서 염증성 사이토카인(IL-6 & IL-8) 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 5는 바늘꽃 추출물이 CSE에 의해 자극된 MH-S 세포를 이용한 MIP-2 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 6은 바늘꽃 추출물이 CSE와 PPE에 의해 COPD를 유도한 동물모델 실험에서 BALF 내 침윤 총 세포수를 감소시킴을 보여주는 결과이다.
도 7은 바늘꽃 추출물이 CSE와 PPE에 의해 COPD를 유도한 동물모델 실험에서 BALF 내 침윤 면역세포수를 감소시킴을 보여주는 결과이다.
도 8 내지 도 13은 바늘꽃 추출물이 CSE와 PPE에 의해 COPD를 유도한 동물모델 실험에서 BALF와 폐 조직의 MIP-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, KC, MCP-1, IFN-γ 등의 염증성 사이토카인 등의 농도를 낮춤을 보여주는 결과이다.
도 2 내지 4는 바늘꽃 추출물이 CSE 등에 의해 자극된 H292 세포에서 염증성 사이토카인(IL-6 & IL-8) 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 5는 바늘꽃 추출물이 CSE에 의해 자극된 MH-S 세포를 이용한 MIP-2 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 6은 바늘꽃 추출물이 CSE와 PPE에 의해 COPD를 유도한 동물모델 실험에서 BALF 내 침윤 총 세포수를 감소시킴을 보여주는 결과이다.
도 7은 바늘꽃 추출물이 CSE와 PPE에 의해 COPD를 유도한 동물모델 실험에서 BALF 내 침윤 면역세포수를 감소시킴을 보여주는 결과이다.
도 8 내지 도 13은 바늘꽃 추출물이 CSE와 PPE에 의해 COPD를 유도한 동물모델 실험에서 BALF와 폐 조직의 MIP-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, KC, MCP-1, IFN-γ 등의 염증성 사이토카인 등의 농도를 낮춤을 보여주는 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 바늘꽃 추출물의 천식, COPD 등의 개선 활성
1. 시료 준비
바늘꽃 추출물은 바늘꽃(추출 부위: 전초) 건조 분말에 10배 중량의 70% 에탄올을 가하여 50℃에서 6시간씩 2회 반복 추출하여 여과한 후 감압농축 및 동결건조하여 분말상으로 얻었다.
2. 실험 방법
2.1 In vitro 실험
2.1.1 NETosis 억제 활성 실험
한국세포주은행에서 분양받은 HL-60 세포(Human promyelocytic leukemia cells)를 1% DMSO가 처리된 RPMI (10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin) 배지에 2×105 cell/mL로 seeding하고 세포배양기 37℃, 5% CO2에서 5일간 배양하여 성숙된 호중구 표현형 (mature neutrophil phenotype)으로 분화시켰다. 5일후 1,300 rpm에서 5분간 원심분리 한 후, HBSS (with Mg+, Ca+, Hanks' balanced salt solution)를 10 mL 처리하고 1,300 rpm에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 회수한 세포는 HBSS에 1×106 cell/mL 농도로 희석하여 96 well plate에 100 μL씩 분주하고 각각의 농도로 준비된 시료를 50 μL씩 처리하였다. 그 후 400 nM로 준비된 PMA (phorbol myristate acetate, Sigma) 또는 CSE (cigarette smoke extract)를 50 μL씩 각각의 well에 처리한 후 3시간 배양하였다. 이때 CSE는 켄터키 대학에서 생산한 연구목적 표준담배 3R4F를 이용하여 제조하였다. 자체 제작한 담배연기 포집기에 3R4F 5개피를 수평으로 장착한 후 연소시키며 aspirator로 1분 30초 동안 담배연기를 50 mL PBS에 포집시킨 후 OD320 에서 0.9-1.0 되도록 조절한 후 이를 100% CSE로 사용하였다. 3시간 후 사이톡스 그린 (Cytox green) 500 nM을 처리하고 형광 플레이트 리더기 (plate reader)를 이용하여 485/520 nm(excitation/emission maxima) 파장에서 형광도를 측정하였다.
2.1.2 H292 세포를 이용한 염증성 사이토카인(IL-6 & IL-8) 억제활성 평가
기관지 상피세포주인 H292 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 24 well plate에 2×105 cells/mL 농도로 준비한 H292 세포를 500 μL/well로 계대하여 배양한 후 세포가 80% 이상 confluent 되었을 때, serum-free RPMI1640 배지로 교환하여 24시간 starvation 하였다. 그 후 Serum-free RPMI1640 배지를 이용하여 자극물질 (CSE; 최종 2% 또는 PPE(porcine pancreas elastase, Sigma); 최종 0.01U/mL 또는 PM2.5(Fine particulate matter than 2.5 ㎛, Sigma); 최종 10 μg/mL)과 시료를 원하는 최종농도를 반영하여 희석한 후, well당 500 μL 씩 처리하였다. 이때 PPE는 PBS에 녹여서 냉동 보관하여 사용하였으며, PM2.5는 DMSO에 녹여서 냉동 보관(2주 이하)하여 사용하였다. 하룻밤 배양 후 상징액을 회수하여 IL-8, IL-6 측정에 사용하였으며, 남아있는 세포는 WST 법((water-soluble tetrazolium salt assay)으로 생존율을 확인하였다. Human IL-8, IL-6 는 ELISA법으로 측정하였으며, 제조사(BD社)의 프로토콜에 따라 진행하였다. 이때, IL-8 측정용 상징액은 5배, IL-6 측정용 상징액은 40배로 희석하여 분석하였다. 상징액을 회수 후, 남은 세포에는 RPMI1640 + 10% FBS + 1% P/S 배지로 1/10 희석한 WST(Water soluble tetrazolium salt) 시약을 500 μL/well 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 50 분간 반응 시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율 (WST)을 확인하였으며, 대조군보다 생존율이 떨어지는 농도는 사이토카인 분석에서 제외하였다.
2.1.3 MH-S 세포를 이용한 MIP-2 억제활성 평가
마우스 폐포 대식세포주인 MH-S 세포는 ATCC 사에서 구매하였으며, 배양에 사용한 배지 조성은 RMPI-1640 (WELGENE, cat. LM 011-01), 10% FBS (WELGENE, cat. S 001-07), 1% Penicillin-Streptomycin (WELGENE, cat. LS 202-02), 14.3 mM 2-Mercptoethanol (SIGMA)였다. MH-S 세포를 5×104/well 농도로 96 well plate에 seeding 하여 24시간 배양 하였다. 그 후 MH-S 세포 배양 배지로 자극물질 (CSE; 최종 1% 및 LPS; 최종 10 ng/mL )과 시료를 원하는 최종농도를 반영하여 희석하고 well당 250 uL 씩 처리하였다. 24 시간 배양 후, 상징액을 회수하여 MIP-2 측정에 사용하였으며, 남아있는 세포는 WST 법으로 생존율을 확인하였다. MIP-2는 ELISA법으로 측정하였으며, 제조사(BD社)의 프로토콜에 따라 진행하였다. 상징액을 회수 후, 남은 세포에는 MH-S 배지로 1/10 희석한 WST (Water soluble tetrazolium salt) 시약을 200 μL/well 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 20 분간 반응 시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율 (WST)을 확인하였으며, 대조군보다 생존율이 떨어지는 농도는 사이토카인 분석에서 제외하였다.
2.2 동물실험에서의 COPD 개선 활성 평가
오리엔트 바이오사에서 BALB/C 마우스(male, 5주령)를 구입하여 1주일간 순화하였으며, n=10로 group화 하였다. 시료 처리군은 COPD 유도 시작 일주일 전부터 해부전까지 24일간 200 mg/kg의 샘플을 경구투여하였으며, 시료 무처리군(control)와 COPD 군은 동량의 PBS를 투여하였다. 기허가 COPD 치료제인 Roflumilast 투여군을 Positive control로 하였으며, Roflumilast 투여군은 COPD 유도 시작 후 매일 10 mg/kg 농로 경구투여 하였다. COPD 유도에는 PPE(Porcine Pancreatic Elastase) 1.2 unit과 100% CSE(Cigarette Smoke Extraction)를 사용하였다. PPE 1.2 unit은 7일에 한번씩 intra nasal을 통해 총 3회 투입하였으며, CSE는 PPE 처리 다음날부터 3일간 intra nasal을 통해 20 ㎕ 처리하되, 마지막 PPE 처리 후에는 CSE를 처리하지 않고 다음 날 해부를 진행하였다. 해부는 흡입 마취기를 이용하여 isoflurane으로 마취시킨 후 진행하였다. 실험기간 동안 사료와 음용수는 자율급식 형태로 제공하였으며, 24 ℃, 습도 60% 환경에서 사육하였다.
2.2.1 BALF 내 침윤 총 세포수
마우스의 기도를 통해 PBS 1 mL을 주입한 후 가볍게 마사지하여 700 μL의 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid; BALF)을 회수하였다. 회수한 BALF 10 uL를 Accustain T solution과 동량 혼합하여 Accuchip channel에 12 uL 주입 한 후 cell counter (ADAM-MC, NANOENTEK. INC, Korea)로 total cell을 자동 계수하였다
2.2.2 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석
마우스의 기도를 통해 PBS 1 mL을 주입한 후 가볍게 마사지하여 700 μL의 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid; BALF)을 회수하였다. 회수한 BALF는 300×g, 5분 조건에서 원심분리를 통해 상층액과 세포 pellet으로 분리하였다. cell pellet은 PBS 700 μL를 첨가하여 재현탁하였으며, 이 BALF 현탁액 150 μL를 Cytospin device (Centrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg, Germany)로 1000 rpm, 10 min, 4℃ 조건에서 원심분리하여 slide에 BALF 세포를 부착시켰다. 이 후 Diff-Quick staining reagent를 사용하여 제조사 (1-5-1 Wakinohama kaigandori, chuo-ku, Kobe, Japan)의 프로토콜에 준하여 세포를 염색한 후 현미경 관찰을 통해 Macrophages, Lympocytes, Neutrophils, Eosinophils의 수를 계수하였다.
2.2.3 BALF 내 Cytokines 분석
마우스의 기도를 통해 PBS 1 mL을 주입한 후 가볍게 마사지하여 700 μL의 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid; BALF)을 회수하였다. 회수한 BALF는 300×g, 5분 조건에서 원심분리하여 상층액을 분리 한 후 cytokines 및 chemokines 분석(TARC, KC, MCP-1, MDC, GM-CSF, MIP-2, TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-17, IL-10, IFN-γ)에 사용하였다. cytokines 및 chemokines 분석을 위해 상층액 30 uL를 취한 후 Q-plex ELISA array kit의 제조사(Quansis biosciences 社) 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다.
2.2.4 폐조직의 Cytokines 분석
폐 조직 무게의 10배에 해당하는 PBS를 첨가하고 homogenizer로 분쇄한 후 12,000 rpm, 20 min 조건에서 원심분리하였다. 회수한 상등액은 cytokines 및 chemokines 분석 (TARC, KC, MCP-1, MDC, GM-CSF, MIP-2, TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-17, IL-10, IFN-γ)에 사용하였다. cytokines 및 chemokines 분석을 위해 상층액 30 uL를 취한 후 Q-plex ELISA array kit의 제조사(Quansis biosciences 社) 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다.
3. 실험 결과
3.1 In vitro 실험 결과
3.1.1 NETosis 억제 활성 평가 결과
NETosis 억제 활성 평가 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하여 보면, 바늘꽃 추출물이 그 처리 농도에 비례하여 Netosis를 억제함을 알 수 있다.
3.1.2 H292 세포를 이용한 염증성 사이토카인(IL-6 & IL-8) 억제 활성 평가 결과
결과를 도 2 내지 4에 나타내었다. 이들 결과를 참조하여 보면, 바늘꽃 추출물은 H292 세포에서 염증성 사이토카인인 IL-6과 IL-8을 대체로 농도 의존적으로 뚜렷하게 억제함을 알 수 있다.
3.1.3 MH-S 세포를 이용한 MIP-2 억제 활성 평가 결과
결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 바늘꽃 추출물이 농도 의존적으로 MH-S 세포에서 MIP-2 억제 활성을 보임을 보여준다.
3.2 동물실험에서의 COPD 개선 활성 평가 결과
3.2.1 BALF 내 침윤 총 세포수 측정 결과
BALF 내 침윤 총세포수의 결과를 도 6에 나타내었다. 바늘꽃 추출물은 뚜렷하게 BALF 내 침윤 총 세포수를 감소시켰다.
3.2.2 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석 결과
BALF 내 면역세포 분석 결과를 도 7에 나타내었다. 바늘꽃 추출물은 4 가지 면역세포(Eosinophil, Neutrophil, Lympocyte, Macrophasge) 모두 뚜렷하게 감소시켰다. 도 7 하단에는 BALF 내 침윤 호중구 세포수를 현미경으로 촬영한 사진을 나타나 있는데 이 현미경 사진에서도 호중구 세포가 뚜렷하게 감소하였음을 알 수 있다.
3.2.3 BALF 내 Cytokines 분석 결과
BALF 내 사이토카인의 분석 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다. 바늘꽃 추출물은 BALF의 MIP-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, KC, MCP-1, IFN-γ 등의 염증성 사이토카인의 농도를 낮추고 IL-17, MDC, GM-CSF 등의 농도를 낮춤을 보여준다.
3.2.4 폐 조직의 Cytokines 분석 결과
폐 조직 사아토카인의 분석 결과를 도 11 내지 도 13에 나타내었다. 바늘꽃 추출물은 폐 조직에서도 상기 BALF에서와 마찬가지로 MIP-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, KC, MCP-1, IFN-γ 등의 염증성 사이토카인의 농도를 낮춤을 보여준다.
Claims (37)
- 바늘꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환 개선용 식품 조성물로서,
상기 호흡기 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 미만성 간질성 폐질환, 급성호흡곤란증후군, 급성 폐손상, 낭성섬유증(cystic fibrosis), 세균성폐렴(bacterial pneumonia), 결핵(tuberculosis) 또는 수혈관련급성폐장애(transfusion-related acute lung injury)인 것인, 식품 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 호흡기 질환은 천식 또는 COPD인 것을 특징으로 하는, 조성물. - 바늘꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
상기 호흡기 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 미만성 간질성 폐질환, 급성호흡곤란증후군, 급성 폐손상, 낭성섬유증(cystic fibrosis), 세균성폐렴(bacterial pneumonia), 결핵(tuberculosis) 또는 수혈관련급성폐장애(transfusion-related acute lung injury)인 것인, 약제학적 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제9항에 있어서,
상기 호흡기 질환은 천식 또는 COPD인 것을 특징으로 하는, 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항, 제3항 또는 제8항에 있어서, 상기 식품은 건강기능식품인, 식품 조성물.
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| Journal of Ethnopharmacology, Volume 156, 28, Pages 316-346(2014.10.) 1부.* |
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