KR100748364B1 - 화살나무 추출물에서 분리된 3-오르토-메틸우르소산화합물을 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈당강하 효과가 있는 화살나무 추출물로부터 분리된 3-오르토-메틸우르소산 화합물을 함유한 조성물에 관한 것으로, 인슐린분비 촉진 활성 및 인슐린 저항성 개선 활성이 우수하여 당뇨병 및 당뇨성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

화살나무 추출물, 3-오르토-메틸우르소산, 당뇨병

Description

화살나무 추출물에서 분리된 3-오르토-메틸우르소산 화합물을 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising 3-O-methylursolic acid isolated from Euonymus alatus for the prevention and treatment of diabetes mellitus}

도 1은 3-오르토-메틸우르소산과 글리피자이드(glipizide)의 인슐린 분비능을 비교한 도이고,

도 2는 3-오르토-메틸우르소산의 인슐린분비 촉진활성기전을 나타낸 도이며,

도 3은 3-오르토-메틸우르소산의 각 농도별 PEPCK mRNA 발현 억제활성을 나타낸 도이고,

도 4는 3-오르토-메틸우르소산의 PPAR-γ 유전자 발현 활성을 나타낸 도이다.

본 발명은 현저한 혈당강하 효과를 갖는 화살나무 추출물로부터 분리된 화합 물인 3-오르토-메틸우르소산(3-O-methylursolic acid)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 및 당뇨성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

당뇨병은 대표적인 만성 성인병의 하나로, 우리나라의 당뇨병 환자는 전체 인구의 약 5 % 정도, 최소 250만 명으로 추정되고 있다. 선진국의 경우에 당뇨병 환자 수가 매년 격증하고 있으며, 우리나라도 생활수준의 향상과 더불어 생활양식이 서구화되면서 점차 환자의 수가 증가 될 것으로 생각된다. 당뇨병은 신체 세포들이 포도당을 정상적으로 사용할 수 있는 능력에 장애가 생겨 혈당치가 증가하여, 포도당이 혈액 속에 점점 많이 쌓이게 됨에 따라 과량의 당분이 소변으로 배설되는 대사성 질환이다. 당뇨병은 인슐린의 부족으로 인하며 인슐린의 부족은 인슐린의 절대량이 부족하거나, 인슐린 이외의 다른 호르몬이 많이 분비되어 상대적으로 부족되었을 때 발병한다. 폴리펩티드성 호르몬인 인슐린은 췌장에 있는 랑게르한스섬의 베타세포에서 만들어지며, 췌장 호르몬인 인슐린이 뇌하수체, 부신, 갑상선 등에서 분비되는 인슐린에 대항 작용을 하는 호르몬과 체내에서 균형이 이루어졌을 때 당조절 기능이 정상으로 유지된다.

진성 당뇨병(Diabetes mellitus)은 두 가지 유형으로 특징 지워지는데, 인슐린 의존형인 I형 당뇨병(insulin dependent diabetes, IDDM)은 혈액 내의 글루코스 조절 호르몬인 인슐린(Insulin)의 분비 결핍으로 야기되며, 주로 10 내지 20대의 젊은 연령층에서 발병되기 때문에 소아당뇨병(juvenile diabetes)이라 불리기도 한다. Ⅱ형 당뇨병(non-insulin dependent diabetes, NIDDM)은 주로 40대 이후에 발병되며, 우리나라 당뇨병 환자의 대부분을 차지한다. 제 Ⅰ형과는 달리 성인형 당 뇨병이라 불리며 발병 원인은 아직 명확히 밝혀져 있지 않으나, 유전적인 요인과 환경적 요소가 함께 관여되어 발생하는 것으로 알려졌다. 제 Ⅱ형 당뇨병의 병인으로 췌장베타세포에서 인슐린 분비의 장애와 표적세포에서 인슐린 작용의 결함(인슐린 저항성)이 모두 관찰되는데, 이중 어떠한 변화가 일차적 중요성을 갖는지는 아직 확실하지 않다.

현재 제 Ⅱ형 당뇨병 및 인슐린 저항성 같은 합병증에 사용되는 제제로는 5 종류의 화합물군, 즉 비구아니드(biguanides), 티아졸리딘디온(thiazolidinediones), 설포닐우레아(sulfonylureas), 벤조산(benzoic acid) 유도체 화합물 및 α-글루코시다제 저해제(α-glucosidase inhibitor) 등이 사용되고 있으며, 이중 메트포민(metformin)과 같은 비구아니드 화합물은 과도한 혈액내 글루코네오제네시스(gluconeogenesis)를 예방하는 것으로 알려져 있다. 티아졸리딘디온 화합물은 말초 신경의 글루코스 소비율을 증가시키는 작용을 하는 것으로 생각되며, 콜부타미드(tolbutamide) 및 글리부리드(glyburide)와 같은 설포닐우레아, 레파글리니드(repaglinide) 화합물과 같은 벤조산 유도체 및 아카보스(acarbose)와 같은 α-글루코시다제 저해제는 인슐린 분비를 자극하여 혈장 글루코스를 낮추는 작용을 한다.

상기의 설포닐우레아 화합물은 인슐린 의존형인 제 Ⅰ형 당뇨병 환자에게는 투여할 수 없으며, 비인슐린 의존형인 제 Ⅱ형 당뇨병 환자는 인슐린 분비를 감소하게 되고, 여성 환자에게 비정상적인 태아 출생, 유산(abortion) 및 사산(stillbirth)과 같은 부작용을 야기할 수 있다. 추가적으로, 대부분의 설포닐우레 아 화합물은 설포닐우레아의 대사작용으로 인해 간 및 신장 기능에 장애가 있는 환자에게는 조심스럽게 투여해야 한다.

메트포민과 같은 비구아니드 함유 제제의 메카니즘은 확실하게 규명되지는 않았으나, 비구아니드 화합물은 췌장의 인슐린 분비를 증가시킬 수 없음에도 불구하고 설포닐우레아보다 더 효과적으로 혈당을 강하하고 저혈당 유발의 빈도도 낮다. 그러나 투여 초기에 구역질, 구토, 설사 및 발진 등을 야기할 수 있으며, 치명적인 락트산증(lactic acidosis)과 같은 부작용을 야기할 수 있으므로, 미국 내에서는 임상실험용 시약으로만 사용가능하다.

설포닐우레아 및 비구아니드 함유 제제들은 상기와 같은 결점 및 부작용을 가지고 있으므로, 낮은 부작용 및 높은 안전성을 갖는 탁월한 혈당강하제가 필요한 실정이다. 현재까지 당뇨병의 완치법은 확립되어 있지 않고, 약물치료의 부작용 때문에 약물사용에 제한점이 많아 천연물로부터 당뇨병치료제를 탐색하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, WHO(1990)에서도 당뇨병에 효과가 있으며 부작용이 적은 천연물의 이용을 적극 추천하였다(Grover J.K., Vats. V., Rathi. S.S., Journal of Ethnopharmacology, 73, pp 461-470, 2000).

본 발명에 사용된 화살나무(참빗나무, Euonymus alatus (THUNB.) SIEB.)는 무환자나무목 노박덩굴과의 낙엽관목으로, 한국, 일본, 사할린, 중국 지역에 분포한다. 어린잎은 나물로 하고 가지의 날개를 귀전우(鬼剪羽)라고 한다. 잎에는 에피프리에델라놀(epifriedelanol), 프리에델린(friedelin), 퀘르세틴(quercetin), 둘시톨(dulcitol)이 함유되어있다. 종자유에는 포화지방산(20%), 올레인산, 리놀산, 리놀렌산, 카프릭산 및 안식향산 등이 함유되어 있다. 한방에서는 지혈, 구어혈, 통경에 사용한다.

이에 본 발명자들은 생체에 부작용이 없으면서 혈당 상승을 억제하는 작용이 우수한 물질을 찾고자 고지방식이로 유도된 고혈당, 고지혈증 동물모델에서 인슐린 저항성과 고지혈증 개선에 탁월한 효과가 있는 화살나무 추출물로부터 3-오르토-메틸우르소산을 분리하여 동정하고, 그 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 현저한 혈당강하 효과를 갖는 화살나무추출물에서 분리된 3-오르토-메틸우르소산을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 및 당뇨성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 현저한 혈당강하 효과를 갖는 화살나무 추출물에서 분리된 하기 구조식(Ⅰ)의 3-오르토-메틸우르소산 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 및 당뇨성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함하는 약학조성물을 제공한다.

상기 당뇨성 질환은 당뇨병이 만성적으로 진행되면서 당뇨병으로부터 유발되는 퇴행성 합병증인 당뇨성 망막증, 당뇨성 신경증, 신장병, 죽상 동맥경화증, 심근 장해, 피부 장해, 당뇨성 발 증후군 및 말초혈관 질병 등의 합병증을 포함한다.

이하, 본 발명의 화합물을 분리하는 공정을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 화살나무의 조추출물은 건조하여 파쇄한 화살나무 무게(㎏)의 약 1 내지 20배의 부피, 바람직하게는 5 내지 10배의 물, 메탄올, 에탄올, 바람직하게는 에탄올과 같은 극성용매 또는 이들의 혼합용매를 가한 후, 20 내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 60℃, 약 1시간 내지 3일, 바람직하게는 1시간 내지 1일 동안, 1회 내지 5회 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각추출 등의 추출 방법에 의하여 추출 후 여과하고 감압건조 또는 동결 건조하여, 본 발명의 화살나무 조추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 화살나무 극성용매 가용추출물은, 상기의 조추출물을 물, 메탄올, 에탄올과 같은 극성용매 또는 이들의 혼합용매에 용해시켜, 동량의 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름, 헥산과 같은 비극성용매를 가한 후, 1시간 내지 48시간동안 분획을 하여 극성용매 가용층 및 비극성 용매 가용층을 각각 수득하여 감압 건조 후 동결 건조하여 수득될 수 있다.

본 발명의 화합물은 상기 공정에서 얻은 극성용매 가용추출물을 100% 에테르로 분획하여 에테르층을 헥산/에틸아세테이트 혼합용매 10:1 내지 1:10(w/w)비를 갖는 용매조건에서 박층 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 다시 헥산/에틸아세테이트 혼합용매 1:1(w/w)비를 갖는 용매조건에서 다섯 번째 얻은 분획에서 가장 큰 활성을 가진 상기 구조식 Ⅰ의 3-오르토-메틸우르소산 화합물을 분리할 수 있다.

상기 전개용매로 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 증류수 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 수행할 수도 있다.

본 발명의 3-오르토-메틸우르소산 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔 술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레익산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트)및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트)염이 있으며, 당 업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제 조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 3-오르토-메틸우르소산 화합물을 0.01 ~ 99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 3-오르토-메틸우르소산 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물 의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명은 당뇨병 및 당뇨성 질환의 예방 및 치료 효과를 나타내는 화살나무 추출물에서 분리한 3-오르토-메틸우르소산 화합물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물은 염증, 알러지성 질환 및 천식질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 화합물은 당뇨병 및 당뇨성 질환의 예방 및 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예 에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 화살나무 조추출물 제조

화살나무 샘플을 한국 토종약초연구소에서 공급 받아 사용하였다. 음건하여 잘 말린 화살나무 가루 15 kg을 50% 에탄올 3시간씩 2회에 걸쳐 냉각기가 달린 수욕상에서 추출한 후, 추출액을 여과지(Whatman type 2)로 여과하고, 감압 건조한 후 동결 건조하여 863.7g의 분말의 수득하였으며, 이를 하기 실험에 사용하였다.

실시예 2. 화살나무 극성용매 가용추출물의 제조

상기 에탄올 추출물 863 g을 동량의 물과 에테르에 용해시킨 후 12시간 분획여두에 방치하여 얻은 물 분획과 에테르 분획을 동결 건조하여 각각을 물 분획물 792 g, 에테르 분획물 84 g 얻었다. 모든 시료는 4℃에 보관하였으며 실험시 증류수에 녹여 바로 실험에 사용하였다.

실시예 3. 3-오르토-메틸우르소산의 분리

상기 실시예 2의 화살나무 에테르 분획물 84g을 헥산:에틸 아세테이트비율을 10:1에서 1:10으로 변화시키며 용출시켜 실리카겔 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리한 7가지 분획물들 가운데 가장 큰 활성을 갖는 다섯 번째 분획물에서 하기 물성치를 갖는 3-오르토-메틸우르소산 화합물 10 mg 을 수득하였다.

IRυ

: 3417(OH), 2933(CH), 1740(COOH), 1649(C=C), 1466, 1396(CH₃)

Negative-FAB-MS: 469[M-H]^-, 455[(M-H)-CH₃]^-

¹H-NMR(피리딘-d₅, δppm): 5.50(1H, brs, 올레핀 H), 3.61(3H, s, OCH₃), 1.25, 1.24, 1.05, 1.04, 1.01, 0.98, 0.89(each 3H, s, angular CH₃)

¹³C-NMR(피리딘-d₅, δppm): 38.0(C-1), 28.6(C-2), 78.9(C-3), 38.1(C-4), 54.2(C-5), 18.1(C-6), 34.2(C-7), 39.8(C-8), 48.7(C-9), 37.9(C-10), 24.3(C-11), 126.3(C-12), 139.9(C-13), 43.1(C-14), 28.4(C-15), 24.4(C-16), 48.7(C-17), 51.4(C-18), 39.7(C-19), 38.1(C-20), 30.6(C-21), 36.4(C-22), 28.4(C-23), 16.2(C-24), 17.2(C-25), 18.1(C-26), 24.3(C-27), 180.8(C-28), 18.2(C-29), 22.1(C-30), 56.5(-OCH₃)

실험예 1. 3-오르토-메틸우르소산의 인슐린 분비에 미치는 영향

1-1. 글리피자이드와의 인슐린 분비능 비교

흰쥐(Sprague-Dawley rat)로부터 췌장 소도세포를 분리하기 위해 흰쥐에 콜라게나아제(collagenase)가 포함된 HBSS(Hanks' Balanced Salt Soultion)을 주입하여 분리하고 37℃ 욕조(water bath)에서 10분 동안 배양(incubation) 시켜준 후 차가운 5%의 FBS가 포함된 HBSS에 옮겨 아이슬릿(islets)을 잘 풀어주었다. 피콜(Ficoll)을 농도 기울기(1.037, 1.069, 1.085, 1.10)로 아이슬릿에 가하여 2000 rpm 에서 20분 동안 원심분리를 하고 1.069와 1.085 층을 HBSS에 옮겨 1500 rpm에서 3분 동안 원심분리를 하여 최종적으로 아이슬릿을 얻었다. 얻어진 아이슬릿에 10% FBS(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640 배지를 처리하여 37℃, 5% CO₂/O₂ 의 조건으로 1-2일 동안 배양시켰다. 췌장 아이슬릿(Pancreatic islets)에 KRB(Krebs-Ringer buffer)로 두 번 수세한 후 37℃에서 30분 동안 전배양(preincubation) 하고 KRB를 제거하였다. 11.1 mM 글루코스와 농도별 3OMU (11.1 mM 글루코스를 포함한 KRB로 희석)를 함께 가하여 37℃에서 60분 동안 배양시키고 4℃에서 5분간 3000 rpm에서 원심분리 하여 얻은 상등액을 에펜도르프 튜브에 옮겨 흰쥐 인슐린 측정 키트 (Shibayagi, Japan)를 이용하여 ELISA 리더 (450 nm)로 인슐린 농도를 측정하였다.

실험결과, 3-오르토-메틸우르소산을 11.1 mM 글루코스 존재하에 인슐린 분비능을 기존의 인슐린 분비촉진제인 글리피자이드와 비교한 결과 도 1에 나타낸것 처럼 5ug/ml 농도에서 대조군과 비교시 6배 가량 인슐린 분비를 촉진시킴을 알 수 있었으며, 20uM의 글리피자이드보다 3배 가량 큰 것임을 확인할 수 있었다.

1-2. 3-오르토-메틸우르소산의 인슐린 분비기전

3-오르토-메틸우르소산의 인슐린 분비 기전을 알아보기 위한 실험에서는 K_ATP(ATP sensitive K⁺ channel) 개방제(opener)인 디아조사이드(diazoxide, 0.5 mM), 칼륨 채널 차단제(K⁺ channel blocker)인 KCl (25 mM) 또는 Ca²⁺ 제거제(scavenger)인 EGTA (0.25 mM)를 함께 가하여 3OMU의 인슐린 분비에 미치는 영향을 살펴보았다.

실험결과 도 2에 나타낸 것처럼 3-오르토-메틸우르소산에 의해 10배 이상 인슐린분비가 증가되었던 것이 칼륨채널 개방제(K⁺ channel opener)인 디아조사이드 존재 하에서는 거의 대조군 수준으로 인슐린 분비가 억제되는 것으로 보아 3-오르토-메틸우르소산의 인슐린 분비 촉진 기전은 K_ATP(ATP sensitive K⁺ channel)을 차단함으로써 일어나는 효과인 것을 알 수 있었다.

실험예 2. 간세포에서 당신생 관련 효소의 전사에 미치는 영향

2-1. 실험준비

간세포인 H4IIE 세포주는 2.5% FCS(fetal calf serum), 2.5% NCS(newborn calf serum)과 100 U/㎖의 항생제가 포함되어 있는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)배지에서 37℃ 온도 유지와 5% CO₂공급 조건하에 배양하였다. 세포는 24 웰 플레이트(well plate)에 웰 당 4x10⁴씩 분주하며 약물을 처리하기 16시간 전부터 혈청(serum)이 들어있지 않은 배지에서 배양하였다. PEPCK(Phosphoenolpyruvate carboxykinase)와 G6Pase(glucose 6-phosphatase) 유전자(gene)의 발현을 유도하기 위하여 0.1 mM cAMP와 500 nM 덱사메타손(dexamethasone)을 처리하며 이때 시료인3-오르토-메틸우르소산을 각각 다른 농도로 첨가하였다. 상기 방법으로 3-오르토-메틸우르소산을 처리한 후 총 RNA는 포화 된 구아니딘 티오시아네이트-물 포화 페놀/클로로포름(guanidine thiocyanate-water saturated phenol/chroloform) 분리방법을 이용하였다 (Chomczynski and Sacchi, 1987). 물 층에 있는 총 RNA는 이소프로판올을 이용하여 침전시켜 분리한 RNA는 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 총 RNA 1 ㎍을 M-MLV 전사효소(Moloney murine leukemia virus transcrptase)와 랜덤 헥사머(random hexamer)를 이용하여 역전사하였다.

PCR에 사용된 프라이머의 염기서열

명칭	정위	프라이머
PEPCK	주형사	ATG CCT CCT CAG CTG CAT A
	비주형사	TTA CAT CTG GCT GAT TCT CTG TT
G6Pase	주형사	ACC CTG GTA GCC CTG TCT TT
	비주형사	GGG CTT TCT CTT CTG TGT CG
CPN(Cyclophilin)	주형사	ATG GTC AAC CCC ACC GTG
	비주형사	TTA GAG TTG TCC ACA GTC GGA GA

프라이머는 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.5 mM 각각 dNTP, 5 ㎕ cDNA 및 2.5 유닛(unit)의 Taq DNA 폴리머라제가 포함되어 있는 25 ㎕의 반응 용액에 최종 농도가 0.5 uM이 되도록 첨가하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 1분 동안 변성, 55℃에서 1분 동안 붙임 그리고 72℃에서 2분 동안연장을 하여 총 30 회 하였다. RT-PCR은 0.5 ㎍/㎖ Et-Br(ethidium bromide)로 염색된 1% 아가로스 겔을 이용하여 100V에서 전기영동 하였다. CPN은 증폭된 유전자들의 대조군으로써 사용되었다. PCR 산물은 GS-700 이미지 농도계를 이용하여 발현 정도를 수치화하여 CPN과의 비로 표현하였다.

2-2. 실험결과

도 3에서 나타낸 바와 같이, 간세포의 당신생 경로중 율속 단계(rate-limiting step)에 관여하는 효소인 PEPCK의 mRNA 레벨을 대조군과 비교한 결과 3OMU는 1, 5, 10 ug/ml의 농도에서 PEPCK mRNA 발현을 각각 60%, 48%, 93% 억제하는 활성을 나타내었다. 특히 10 ug/ml의 3OMU는 그 억제 활성이 인슐린과 거의 같은 탁월한 활성을 보여주고 있다. 상기 결과로부터 3OMU는 간 세포내에서 당신생 과정을 억제하여 간세포 밖으로 포도당의 유리를 억제시켜 공복시 혈당을 낮출 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 3. 3T3-L1 지방 세포 분화에 미치는 영향

3-1. 실험준비

세포는 항생제인 100 U/㎖ 페니실린 A와 스트렙토마이신을 첨가하고 10 % 열 비활성화시킨 우태혈청(heat-inactivated calf serum)을 포함한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 5% CO₂와 37℃ 조건하에 배양을 하였다. 분화를 유도시키기 위해서, 3T3-L1 지방세포(preadipocyte)는 80% 정도 자라면 분화 유도 배지 (5% fetal bovine serum (FBS), 0.5 mM IBMX(isobutylmethylxanthine), 1 mM 덱사메타손 및 10 ㎍/㎖ 인슐린이 포함된 DMEM)로 교환하여 2일 간격으로 교환하고 총 4일 동안 배양한 후 10 ㎍/㎖ 인슐린이 포함된 DMEM으로 교환하여 2일을 더 배양하였다. 이후 FBS만 포함된 DMEM으로 2일 배양하여 총 8일 동안 분화를 유도하였다.

분화 유도는 상기 방법과 동일하며 처음 2일 동안 1, 5 그리고 10 ㎍/㎖의 3OMU를 첨가시켜 6 웰 플레이트에서 분화를 유도 시켜 총 8일 동안 배양한 세포를 PBS로 두 번 세척한 후 10% 포르말린을 포함한 PBS로 1시간 동안 실온에서 세포를 고정시킨 후 0.3% 오일 레드 Ο(Oil red Ο)가 포함된 60% 이소프로판올을 2 시간 동안 실온에서 착색시켰다. 착색 후 3차 증류수로 남은 오일 레드 Ο 용액을 제거한 후 37℃에서 20 분 동안 남아 있는 물기를 제거 한 후 100% 이소프로판올로 탈 염색하여 540 nm에서 트리아실글리세라이드(triacylglyceride)를 측정하였다.

분화 유도는 상기 방법과 동일하며 처음 2일 동안 1, 5 그리고 10 ㎍/㎖의 3OMU를 첨가시켜 분화 후 총 RNA는 포화된 구아니딘 티오시아네이트-물 포화 페놀/클로로포름(guanidine thiocyanate-water saturated phenol/chroloform) 분리 방법을 이용하였다.

명칭	정위	프라이머
PPAR-γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ)	주형사	CCC TGG CAA ACG ATT TGT AT
	비주형사	AAT CCT TGG CCC TCT GAG AT
베타-액틴(β-actin)	주형사	GTC GTA CCA CTG GCA TTG TG
	비주형사	GCC ATC TCC TGC TCA AAG TC

PCR 조건 및 실험방법은 상기 실험예 2와 동일하게 수행하였고, PCR 산물은 GS-700 이미지 농도계를 이용하여 발현 정도를 수치화하여 베타-액틴과의 비로 표현하였다.

3-2. 실험결과

도 4에 나타낸 바와 같이 분화된 3T3-L1 지방세포에서 3-오르토-메틸우르소산이 농도에 의존적이지는 않지만, TG 축적을 증가시키고 이는 PPAR-γ 유전자의 발현을 증가시킨 결과이다. 3-오르토-메틸우르소산 고농도에서는 PPAR-γ 유전자의 발현을 1.4배 정도 증가시키는 활성을 나타내며, 이로인해 aP2, GLUT4, LPL 유전자 발현이 증가되어 혈중 유리지방산과 포도당의 농도가 떨어져 인슐린 저항성을 개선시킬 수 있음을 알 수 있었다.

제제예 1. 산제의 제조

3-오르토-메틸우르소산....................... .20 mg

유당.........................................100 mg

탈크..........................................10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 주사제의 제조

3-오르토-메틸우르소산........................ 10 mg

만니톨.......................................180 mg

주사용 멸균 증류수..........................2974 mg

Na₂HPO₄·12H₂O.................................26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 3. 정제의 제조

3-오르토-메틸우르소산.........................10 mg

유당..........................................100 mg

전분..........................................100 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 4. 캡슐제의 제조

3-오르토-메틸우르소산..........................10 mg

결정성 셀룰로오스...............................3 mg

락토오스 ....................................14.8 mg

마그네슘 스테아레이트.........................0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

3-오르토-메틸우르소산.........................20 mg

이성화당.......................................10 g

만니톨......................................... 5 g

정제수.........................................적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강식품의 제조

3-오르토-메틸우르소산........................1000 mg

비타민 혼합물....................................적량

비타민 A 아세테이트.............................70 ㎍

비타민 E.......................................1.0 mg

비타민 B1.....................................0.13 mg

비타민 B2.....................................0.15 mg

비타민 B6......................................0.5 mg

비타민 B12.....................................0.2 ㎍

비타민 C........................................10 mg

비오틴..........................................10 ㎍

니코틴산아미드.................................1.7 mg

엽산............................................50 ㎍

판토텐산 칼슘 .............................0.5 mg

무기질 혼합물....................................적량

황산제1철.....................................1.75 mg

산화아연......................................0.82 mg

탄산마그네슘..................................25.3 mg

제1인산칼륨.....................................15 mg

제2인산칼슘.....................................55 mg

구연산칼륨......................................90 mg

탄산칼슘.......................................100 mg

염화마그네슘..................................24.8 mg

제제예 7. 건강 음료의 제조

3-오르토-메틸우르소산........................ 100 mg

비타민 C...................................... .15 g

비타민 E (분말)................................100 g

젖산철 ......................................19.75 g

산화아연...................................... 3.5 g

니코틴산아미드.................................3.5 g

비타민 A............................... .......0.2 g

비타민 B₁.................................... 0.25 g

비타민 B₂ ......................................0.3g

물 .............................................정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 3-오르토-메틸우르소산은 화살나무로부터 분리한 것으로, 인슐린저항성과 고지혈증 개선에 탁월한 효과를 나타내어 당뇨병 및 당뇨성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

Claims (5)

1. 혈당강하 효과를 갖는 화살나무 추출물로부터 분리된 하기 구조식(Ⅰ)의 3-오르토-메틸우르소산 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 및 당뇨성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물:

   
2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함하는 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 당뇨성 질환은 당뇨병이 만성적으로 진행되면서 당뇨병으로부터 유발되는 퇴행성 합병증인 당뇨성 망막증, 당뇨성 신경증, 신장병, 죽상 동맥경화증, 심근 장해, 피부 장해, 당뇨성 발 증후군 또는 말초혈관 질병의 합병증인 약학조성물.
4. 화살나무 추출물에서 분리한 3-오르토-메틸우르소산 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 증상을 개선하는 건강기능식품.
5. 삭제

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