KR101269208B1

KR101269208B1 - 사우치논을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101269208B1
Application number: KR1020100051458A
Authority: KR
Inventors: 김상건; 김영우; 양윤미; 이찬규
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-05-31
Filing date: 2010-05-31
Publication date: 2013-05-30
Also published as: KR20110131821A

Abstract

본 발명은 사우치논 또는 사우치논이 풍부한 삼백초 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 인슐린저항성을 개선하여 간세포에서 당생성을 억제하고 근육세포 및 지방세포의 당이용율을 높이며, 혈당감소 및 체중감소효과가 있어, 인슐린저항성, 인슐린저항성 관련 질병, 인슐린저항성 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이를 포함하는 의약 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

사우치논을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising sauchinone as an active ingredient for preventing or treating insulin resistance}

본 발명은 사우치논(Sauchinone) 또는 사우치논-풍부 삼백초 추출분획물의 인슐린저항성, 인슐린저항성 관련 질병, 인슐린저항성 증후군의 예방 및 치료 용도에 관한 것이다.

본 발명을 위한 연구는 우수연구센터 (ERC) [과제고유번호: 20100001706 과제명: 대사 및 염증 질환 신약 개발 센터] 에 의하여 일부 지원되었다.

인슐린저항성(insulin resistance)은 간, 지방 및 근육 조직이 정상적인 농도의 인슐린에 대해서 제대로 반응하지 않아 인슐린에 의한 포도당 및 영양분 대사조절에 이상이 나타나는 상태이다. 인슐린은 근육으로 포도당섭취를 촉진하거나 간에서 포도당생성을 억제함으로써 혈당을 조절하는데, 인슐린저항성은 인슐린이 부족하지 않은 상태에서 이러한 인슐린 작용이 감소된 상태를 의미한다(Schulman GI, J. Clin. Invest. 106, 171-176, 2000).

인슐린저항성의 발병원인으로 인슐린 신호전달과정의 비정상적인 저해가 제시되고 있다. 인슐린 신호전달은, 타이로신 키나제 활성을 갖는 인슐린수용체가 insulin receptor substrate(IRS) 단백질의 타이로신 잔기들을 인산화하여 활성화시킴으로써 시작된다. 그리고 Akt와 GSK3-beta와 같은 그 하위에 위치하는 신호전달 분자들이 동원되고 활성화 되면서 상호작용이 이어진다. 이들은 세포의 성장과 대사에 관계되는 주요 조절 효소들을 활성화하여 포도당 운반에 필수적인 포도당 수송체(glucose transporter-4, GLUT 4)가 세포막으로 이동하는 과정을 비롯하여 세포내로 이동한 포도당이 글리코겐으로 합성되는 과정, 단백합성 촉진, 항세포사멸, 지질분해 억제, 성장촉진, 유전자발현 등 다양한 인슐린효과가 나타나도록 한다. IRS 의 비활성화가 인슐린 신호전달의 저해, 즉 인슐린 저항성의 주요 원인일 것으로 생각되고 있다 (Lee, YH 등, Arch. Pharm. Res. 27, 361 (2004)).

인슐린저항성으로 인한 고인슐린혈증은 제2형 당뇨병, 비만, 고혈압, 고중성지방혈증, 저HDL콜레스테롤혈증, 관상동맥질환, 죽상동맥경화증 등의 심혈관질환을 일으키는 위험인자들의 중심적인 병인으로 알려져 있다. 또한 수면성무호흡(Punjabi NM 등, Respiratory Physiology & Neurobiology, 136, 167-178, 2003), 전립선암(Barnard RJ 등, Obesity Reviews, 3, 303-308, 2002), 제1당뇨병(Greenbaum, Diabetes Metab. Res. Rev, 18, 192-200, 2003), 정동(기분)장애(Rason N 등, J. Gerontol. A Biol.Sci. Med. Sci. 59, 178-183, 2004), 알츠하이머병(Watson GS 등, CNS Drugs 17, 27-45, 2003), 중풍(Kernan WN 등, Neurology 59, 809-815, 2002), 유방암(Stoll BA, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 26, 747-753, 2002), 염증(Perseghin G 등, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 27 Suppl.3, S6-11, 2003), 류마치스성 관절염(Dessen PH 등, J. Rheumatol. 30, 1403-1405, 2003) 등의 질환의 발생도 인슐린저항성에 기인한다고 제시되고 있다.

Reaven은 당불내성(impaired glucose tolerance), 고혈압, 이상지혈증 등 심혈관계 위험인자들이 한 사람에게서 함께 잘 나타나는 현상의 원인이 인슐린저항성임을 주장하며 이를 인슐린 저항성 증후군이라고 명명하였다 (Reaven GM, Diabetes 1988, 37, 1595-1607, 1988). 또한, 흑색극세포증, 다낭성 난소증후군, 혈중 뇨산농도의 증가(hyperuricemia), PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)의 증가, 혈전용해의 장애, 혈관 내피 및 평활근의 기능장애, 미세단백뇨 등도 인슐린 저항성 증후군에 포함된다(Peter P. 등, J. Clinical Pharmacy and Therapeutics, 28, 167-174, 2003).

인슐린저항성을 개선하는 약제로는 메트포르민과 티아졸리디네디온(TZD; thiazolidinedione)계의 약물이 알려져 있는데, 메트포르민은 AMPK 활성화를 통해 주로 간에서 포도당 생성을 억제하는 작용을 하며, TZD계열의 약물은 peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) γ의 활성화를 통해 말초조직의 포도당 대사를 증가시키는 것이 주된 작용으로 알려져 있다. 하지만 메트포르민은 유산증의 위험이 있으며 PPARγ 효능제인 글리타존계 약물은 혈당을 낮추는 작용을 하고 인슐린 저항성을 감소시키지만, 지방세포분화와 관련된 유전자 발현에 관여하여 지방을 축적시키는 부작용을 나타내기도 한다(Singh S 등, JAMA, 298, 1189-1195, 2007). 따라서 당대사 이상을 정상화할 뿐 아니라 지질대사와 당대사 교란을 동시에 교정하고, 나아가 단백질대사를 정상화시키는 약물이 요구되며, 또한 약물을 반복적으로 사용할 때에도 약물내성이 생기지 않는 이상적인 치료제의 개발이 절실히 요구된다.

한편, 삼백초(三白草)는 삼백초과의 여러해살이풀로 항산화작용, 노화방지작용, 해독작용, 항암작용, 항당뇨병 작용이 있다고 알려져 있다. 삼백초에는 플라보노이드류, 알칼로이드류, 아미노산류, 지방산류, 퀴논류, 정유성분 등을 포함하는 것으로 보고되었다. 삼백초의 정유성분으로는 메틸-n-노닐-케톤(methyl-n-nonyl-ketone), 알파피넨(α-pinene), 캄펜(campene), 리날룰(linalool), 사프롤(safrol), 베타-카리오필렌(β-caryophyllene), 휴믈렌(humulene) 등이 보고되었으며, 플라보노이드류로는 하이페린(hyperin), 퀘세틴(quercetin), 퀘시트린(quercitrin), 이소퀘시트린(isoquercitrin) 등이, 퀴논류로는 에모딘(emodin), 피시온(physcion) 등이, 카르파논(carpanone)계열의 리그난(lignan) 성분인 사우치논(sauchinone) 등이 보고되었다. 그러나 삼백초의 특정 생리활성효과가 어느 성분에 의하여 발휘되는 것인지에 대하여는 잘 알려져 있지 않다.

본 발명의 목적은 인슐린저항성 및 이와 관련된 질병, 인슐린저항성 증후군의 예방, 개선 및 치료에 유용한 방법 및 신규한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 위하여 본 발명은 사우치논 또는 사우치논이 풍부한 삼백초 추출분획물을 포함하는 의약조성물 또는 식품조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 사우치논 또는 사우치논이 풍부한 삼백초 추출분획물의 투여는 인슐린저항성을 개선하여 인슐린저항성, 인슐린저항성과 관련된 질병, 인슐린저항성 증후군의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 간세포에서 TNFα에 의해 유도된 IRS1의 세린 인산화에 대한 사우치논(Sau)의 효과를 관찰한 결과이다.
도 2는 간세포에서 TNFα에 의해 방해된 IRS1의 타이로신 인산화에 대한 사우치논(Sau)의 효과를 관찰한 결과이다.
도 3은 간세포주인 HepG2 세포의 포도당 생성에 대한 사우치논(Sau)의 효과를 나타낸 것이다. (**는 대조군(Control)과 비교하여 유의성 (p<0.01)있는 포도당 생성의 감소를 의미한다.)
도 4는 근육세포주인 C2C12 세포와 지방세포주인 3T3-L1 세포에서의 포도당 이용율에 대한 사우치논(Sau)의 효과를 나타낸 것이다. (**는 대조군과 비교하여 통계적으로 유의성이 있음(p<0.01)을 의미하고, ##는 인슐린 처치 군과 비교하여 통계적으로 유의성이 있음(p<0.01)을 의미한다.)
도 5는 고지질식이로 유도된 동물모델에서 사우치논의 혈당강하효과를 평가한 결과이다. (**는 정상식이 군과 비교하여 통계적으로 유의성이 있음(p<0.01)을 의미하고, # 및 ##는 고지질식이 군과 비교하여 통계적으로 유의성이 있음(p<0.05 및 p<0.01)을 의미한다.)
도 6은 고지질식이로 유도된 동물의 체중변화에 대한 사우치논의 영향을 나타낸 것이다. (**는 정상식이 군과 비교하여 통계적으로 유의성이 있음(p<0.01)을 의미하고, #는 고지질식이 군과 비교하여 통계적으로 유의성이 있음(p<0.05)을 의미한다.)

본 발명자들은 인슐린저항성을 효과적으로 예방, 개선 및 치료하기에 유용한 약물을 스크리닝 하던 중, 삼백초의 성분 중의 하나인 사우치논의 투여에 의해 인슐린 저항성이 개선되는 것을 밝혔다.

TNF-α는 인슐린 신호전달을 방해한다는 것이 잘 알려져 있으며 그 기전으로 인슐린에 의해 활성화되는 IRS-1의 세린기를 인산화하여 인슐린에 의한 IRS의 타이로신 인산화를 방해하여 인슐린 신호를 억제한다. 본 발명의 발명자들은 사우치논이 TNF-α에 의하여 활성화되는 IRS-1의 세린의 인산화를 억제한다는 것을 밝혔다(도1). 인슐린은 세포막에 존재하는 인슐린 수용체와 결합하여 인슐린 수용체의 타겟인 IRS의 타이로신 인산화를 통해 인슐린 신호를 세포 내로 전달한다. 타이로신 인산화된 IRS는 PI3K를 활성하여 Akt와 GSK3-beta를 거쳐 신호를 전달한다. 본 발명의 발명자들은 인슐린 신호전달을 방해하는 것으로 알려진 TNFα가 인슐린에 의해 일어나는 GSK3-베타 및 IRS1의 타이로신의 인산화를 감소시켜 인슐린 신호를 억제하나, 사우치논을 처리한 경우 TNFα에 의하여 억제된 인슐린 신호가 현저하게 개선된다는 것을 밝혔다(도2). 이러한 결과들은 사우치논이 인슐린저항성을 예방하거나 개선 또는 치료효과가 있음을 시사한다.

인슐린 저항성은 당생성억제능 및 당수송능이 떨어진 상태이므로 어떤 물질이 당생성을 억제하거나 당흡수를 증가시킨다면 인슐린저항성 치료제로 사용될 가능성이 높아진다. 본 발명의 발명자들은 간세포주인 HepG2 세포에서 사우치논 처치군은 대조군과 비교하여 당생성을 유의하게 억제시키며(도3), 지방세포주 및 근세포주에서 TNFα처치군에서 억제되었던 당흡수능을 유의하게 증가시킨다는 것을 밝혔(도4). 또한 본 발명의 발명자들은 사우치논이 비만 및 당뇨 모델로서 고지질식이를 한 마우스에서 고지질식이로 유도된 혈당을 감소시키며(도5), 체중을 유의하게 감소시킨다는 것을 확인하였다(도6).

이와 같은 실험결과를 기초로 본 발명은 화학식 (1)로 표기되는 사우치논 또는 사우치논이 풍부한 삼백초 가공 추출 분획물을 유효성분으로 포함하는 인슐린저항성, 인슐린 저항성 관련 질병 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 또는 이를 포함하는 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 사우치논 또는 사우치논이 풍부한 삼백초 가공 추출 분획물을 투여하여 인슐린저항성, 인슐린 저항성 관련 질병 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 사우치논 및 사우치논이 풍부한 삼백초 추출분획물은 예를 들어, 하기 공정과 같은 제조공정을 통하여 수득할 수 있으며, 이 기술 분야의 당업자가 사용가능한 방법은 어느 것이라도 사용할 수 있다. 음건 세절한 삼백초에 n-헥산을 가하여 1시간 내지 7일, 바람직하게는 24시간 내지 72시간 동안, 10 내지 100℃ 로 추출하여 n-헥산 가용성분이 함유된 추출물을 제거한 후에, 클로로포름, 디클로로메탄, 또는 에틸아세테이트와 같은 저극성용매, 바람직하게는 디클로로메탄을 가하여 1시간 내지 7일, 바람직하게는 24시간 내지 72시간 동안, 10 내지 100℃ 로 상온에서 환류 냉각추출법, 냉침추출법, 초음파 추출법, 온침 추출법, 초임계 추출법 등의 추출법, 바람직하게는, 초음파 추출법을 이용하여 삼백초를 추출하는 공정을 수행하여 본 발명의 사우치논 [Rf=0.8, CHCl₃-메탄올(9:1)]을 다량 함유하는 샘백초 추출물을 제조할 수 있다. 상기 추출물은 n-헥산-에틸아세테이트를 사용하여 분획하는 공정을 더 포함할 수 있다. 사우치논이 풍부한 추출분획물을 재결정시켜 순수한 사우치논을 획득가능하다.

본 발명의 분획물 또는 사우치논은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수 혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산 , 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산 , 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산, 베실산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금 속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또 는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명은 사우치논 또는 사우치논이 풍부한 삼백초 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 인슐린저항성, 인슐린저항성 관련 질병, 또는 인슐린저항성증후군의 예방, 개선, 치료용 약학조성물 또는 식품조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 사우치논 또는 사우치논이 풍부한 삼백초 추출분획물을 0.01 ~ 99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 분획물 또는 사우치논을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 분획물 또는 사우치논을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 분획물 또는 사우치논을 유효성분으로 포함하는 조성물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐 , 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물에 의하여 예방, 개선, 치료가 가능한 인슐린저항성 관련 질병에는 고인슐린혈증, 제2형 당뇨병, 비만, 고혈압, 고중성지방혈증, 저HDL콜레스테롤혈증, 관상동맥질환, 죽상동맥경화증, 심혈관질환, 수면성무호흡, 전립선암, 제1당뇨병, 정동(기분)장애, 알츠하이머병, 중풍, 유방암, 염증, 류마치스성 관절염을 들 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니고 당업자가 인슐린저항성 질병으로 인지하는 것이면 모두 이에 포함된다.

또한 본 발명은 사우치논 또는 사우치논이 풍부한 삼백초 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 인슐린저항성, 인슐린저항성 관련 질병, 인슐린저항성증후군의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 식품 또는 음료 중의 사우치논 또는 사우치논이 풍부한 삼백초 추출분획물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있으나, 목적에 따라 조절이 얼마든지 가능하다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명은 실시예, 실험예, 참고예 및 제제예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 예들은 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 사우치논 및 사우치논이 풍부한 삼백초 가공추출 분획물의 제조

사우치논 및 사우치논이 풍부한 삼백초 가공추출 분획물은 Br J Pharmacol. 2003 May;139(1):11-20에 기재된 방법을 약간 변형하여 제조하였다.

음건한 삼백초 1.2㎏(대원약업사, 대구)에 15ℓ의 100 % n-헥산을 가하여 48시간 추출하여 추출물을 버리고, 다시 15ℓ의 100 % 클로로포름을 가하고 상온에서 72시간 동안 추출하고 여과지로 여과한 후, 여과한 여액을 감압농축기(N-21NS, ELYA)로 가온 감압 농축하여 갈색 젤 형태의 삼백초 클로로포름추출물 80 g(이하, SBC-1 이라 함)을 얻었다.

삼백초 클로로포름추출물(SBC-1)을 실리카겔 칼럼크로마토그래피(70-230 mesh, 700 g)에 로딩(loading)하고, 2 L의 n-헥산을 흘린 후, n-헥산-에틸아세테이트(n-hexane-EtOAc[50:1 (3L), 30:1 (5L), 15:1 (5L)]) 경사로 분리 하였다. n-헥산-에틸아세테이트 30:1 (2L) 분획을 감압농축하여 옅은 갈색의 소분획물 13 g을 얻었다. 이 분획물은 다시 n-헥산-에틸아세테이트(n-hexane-Ether[50:1 (2L), 25:1 (3 L), 9:1 (2 L), 그런 후 1: 1 (1 L)]) 경사의 용매조합을 이용하여, 2차 실리카 겔 칼럼크로마토그래피(230-400 mesh, 200 g)를 실시하여 다시 소분획물로 나누었다. 2차 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로부터 분리된 소분획물들 중 18-25 번 분획물들은 사우치논이 [Rf=0.8, CHCl₃-메탄올(9:1)] 풍부한 분획물들로 확인 되어 이들을 농축하여 사우치논이 더욱 더 풍부한 옅은 갈색의 소분획물 5g을 얻었다(SBC-2). 소분획물을 에테르에 재결정시켜, 순수한 사우치논 2.5 g을 획득하였다.

실험예 1: TNF -α에 의한 IRS -1 세린인산화에 대한 사우치논의 효과

렙틴(leptin), 인터류킨(interleukin), 종양괴사인자(TNF-α)와 같은 사이토카인들이 인슐린저항성과 밀접한 관련이 있다는 것이 알려져 있다. 특히 TNF-α는 인슐린 신호전달을 방해하는 것이 잘 알려져 있으며 그 기전으로 인슐린에 의해 활성화되는 IRS-1의 세린기를 인산화하여 인슐린에 의한 IRS의 타이로신 인산화를 방해하여 인슐린 신호를 억제한다. 본 실험예에서는 간세포에서 TNF-α에 의하여 유도된 IRS-1의 세린 인산화가 사우치논의 전처리에 의하여 억제되는지를 평가하였다.

H4IIE (ATCC로부터 구입) 간세포를 플레이트에 분주(1×10⁶cell/well)하여 2~3일 배양(80% confluency)한 후, 12시간 동안 혈청을 고갈시키고, 사우치논(Sau) 30 μM과 vehicle(DMSO)로 각각 1시간 전 처리한 후 10μg/ml TNFα를 0.25시간, 0.5시간, 1시간 및 3시간 동안 처리하여 IRS-1의 세린 인산화를 유도하였다. TNFα처리 후 IRS-1의 세린 인산화 변화를 웨스턴브롯으로 관찰하였다.

사우치논은 간세포에서 TNF-α에 의한 IRS-1의 세린 인산화를 현저하게 억제하였다(도1). 이러한 결과는 사우치논이 인슐린저항성을 예방하거나 개선 또는 치료효과가 있음을 시사한다.

실험예 2: TNF -α에 의한 GSK3 베타 및 IRS1 의 타이로신의 인산화 억제에 대한 사우치논의 개선효과

TNFα에 의하여 억제된 인슐린 신호가 사우치논에 의해 개선되는지 평가하기 위하여 간세포에서 TNF-α에 의한 GSK3베타 및 IRS1의 타이로신의 인산화 억제에 대한 사우치논의 영향을 관찰하였다.

H4IIE (ATCC로부터 구입) 간세포를 플레이트에 분주(1×10⁶cell/well)하여 2~3일 배양(80% confluency)한 후, 12시간 동안 혈청을 고갈시키고, 사우치논(Sau) 30 μM과 vehicle(DMSO)로 각각 1시간 전 처리한 후 10μg/ml TNFα를 6시간 동안 처리하여 인슐린신호를 억제하였다. TNFα처리 후 10 nM 인슐린을 10분간 처리하고, 인슐린 신호 분자들의 변화를 웨스턴브롯으로 관찰하였다.

인슐린에 의해 일어나는 GSK3베타 및 IRS1의 타이로신의 인산화(pGSK3β, pTyr-IRS1)는 TNFα를 함께 처리하면 감소하여 인슐린 신호를 억제하나, 사우치논을 처리한 경우 TNFα에 의하여 억제된 인슐린 신호를 현저하게 개선시켰다(도2). 이러한 결과는 사우치논이 인슐린저항성을 예방하거나 개선 또는 치료효과가 있음을 시사한다.

실험예 3: 사우치논에 의한 간세포 당생성 억제효과

간세포는 인슐린과 글루카곤 등 호르몬에 반응하여 포도당을 글리코겐으로 변환시켜 혈당을 낮추고 글리코겐을 포도당으로 전환 또는 비탄수화물을 포도당으로 전환하여 혈당을 올린다. 따라서 간세포의 당생성 조절은 혈당조절에 있어 필수조건이 된다. 인슐린은 간에서 포도당생성을 억제하는데, 인슐린 저항성은 이러한 당생성억제능이 떨어진 상태이다. 따라서 어떤 물질이 간세포내에서의 당생성을 억제한다면 인슐린저항성 치료제로 사용될 가능성이 높아진다.

본 실험예에서는 간세포주인 HepG2 세포(ATCC로부터 구입)를 이용하여 사우치논에 의한 세포 내 당생성의 변화를 평가하였다. 간세포를 플레이트에 분주(1×10⁶cell/well)하여 2~3일 배양(80% confluency)한 후, 24시간 동안 혈청을 고갈시키고, 사우치논 30 μM 또는 인슐린 100 μM 을 처치하였다. 당생성을 평가하기 위하여 처치 6시간 후부터 포도당 비함유 DMEM 배지으로 갈아주고 다시 3시간 후에 배지를 채취하여 배지 내 당을 측정하였다(Amplex Red glucose/glucose oxidase assay, Invitrogen).

대조군(DMSO 처치군)의 당생성양(100%)과 비교하여 사우치논 처치군은 39.6± 5.6%, 인슐린 처치군은 68.8± 1.5%의 당을 생성하였다(도3). 사우치논은 대조군과 비교하여 당생성을 유의하게 억제시켰다(p<0.01).

실험예 4: 사우치논에 의한 근육 및 지방 세포 당수송효능 증가

체내 혈당 항상성 조절기능의 약 90%을 담당하고 있는 근육과 지방조직에서는 혈중 당을 GLUT4라는 당수송기(glucose transporter)를 통해 세포내로 흡수한다. 따라서 GLUT4의 발현과 활성, 인슐린 자극에 의한 세포질에서 세포막으로의 원활한 당의 이동은 혈당조절에 있어 필수조건이 된다. 인슐린 저항성은 이러한 당의 이동능력이 감소하게 된 상태이다. 따라서 어떤 물질이 세포내로의 당의 이동성을 증가시킨다면 인슐린저항성 치료제로 사용될 가능성이 높아진다.

본 실험예에서는 전구지방세포주인 3T3-L1 preadipocytes을 여러 가지 호르몬 존재 하에 약 10일간 세포배양기에서 배양하여 얻은 지방세포를 사용하여 사우치논에 의한 세포내 당흡수의 변화를 평가하였다. 지방전구세포로부터 분화시킨 3T3-L1 지방세포를 플레이트에 분주(1×10⁶cell/well)하여 2~3일 배양(80% confluency)한 후, 12시간 동안 혈청을 고갈시키고, 37℃의 Krebs-Ringer Hepes Buffer에서 배양하면서 사우치논 30 μM을 처치하였다. 당흡수능을 평가하기 위하여 사우치논 처치 1시간 후부터 2-[3H]데옥시글루코스 (2-DOG) 0.5μCi를 가해주고 다시 15분 후부터 2시간 후까지 각 시간별로 반응을 정지시킨 후 세포내로 흡수된 2-DOG의 방사능을 liquid scintillation counter로 측정하였다.

C2C12 (마우스 근아세포; mouse myoblast cell line)도 3T3-L1 지방세포와 동일하게 처치하여 당흡수능을 측정하였다.

3T3-L1 세포주에서 대조군(DMSO 처치군)과 비교하여 당흡수능이 인슐린 처치군은 2.23± 0.17 배로 증가하였으며, 인슐린과 TNFα를 처치한 군은 1.02± 0.01 배로 대조군과 차이가 없었다. 인슐린과 TNFα과 함께 사우치논을 처치하면 당흡수능이 2.05± 0.05 배로 되어 인슐린 및 TNFα처치군에서 억제되었던 당흡수능이 유의하게 증가되었다(p<0.01).

C2C12 세포주에서 대조군(DMSO 처치군)과 비교하여 당흡수능이 인슐린 처치군은 2.77± 0.18 배로 증가하였으며, 인슐린과 TNFα를 처치한 군은 1.12± 0.08 배로 대조군과 차이가 없었다. 인슐린과 TNFα와 함께 사우치논을 처치하면 당흡수능이 2.45± 0.05 배로 되어 인슐린 및 TNFα처치군에서 억제되었던 당흡수능이 유의하게 증가되었다(p<0.01).

근육세포 및 지방세포에서 사우치논은 당수송효능(2-[3H]데옥시글루코스 흡수)을 초기시간부터 증가시켜 1-2시간 동안 세포내로 당유입을 유의하게 증가시켰다.

실험예 5: 고지질식이를 한 마우스에서 공복시 혈당 및 글루코즈 투여에 의한 혈당에 대한 사우치논 투여의 효과

비만 및 당뇨 모델로서 고지질식이를 한 마우스를 사용하여 사우치논의 혈당강하효능을 평가하였다. 정상 식이 및 고지질 식이를 마우스에 11주간 실시하고 마지막 5주간 사우치논을 주당 5회 10-30 mg/kg를 경구 투여하였다. 각 그룹은 총 10마리의 마우스로 구성되었다.

실험 마지막날 10시간 동안 절식시킨 마우스의 기저 글루코스 수준(basal glucose level(mg/dl))을 측정하고(공복시 혈당 측정), 사우치논을 투여하였다. 1시간 후에 BGL(blood glucose level)을 측정(0시간)하고, 글루코스 용액을 2g/kg의 양으로 경구 투여한 후 시간별로 혈당을 측정하였다. 글루코스 농도는 Accu-Check Active(Roche, Germany)를 사용하여 측정하였다.

절식시킨 후 측정한 공복시 혈당은 정상식이를 시킨 군은 115.0 mg/dl, 고질식이를 시킨 군은 194.5 mg/dl이었으며 고지질식이와 함께 사우치논을 10mg/kg 투여한 군은 167.0 mg/dl, 사우치논을 30mg/kg 투여한 군은 171.0 mg/dl으로, 사우치논 투여는 공복시 혈당을 유의하게 감소시켰다(p<0.05).

사우치논은 글루코스 용액을 투여로 인한 혈당의 증가에도 영향을 미쳤다. 도5에서 나타난 바와 같이 지질 식이로 유도된 혈당치는 약물을 투여하기 전과 비교하여 사우치논 30mg/kg를 투여한 후에 통계적으로 유의성 있게 감소하였다.

실험예 6: 고지질식이를 한 마우스의 체중변화에 대한 사우치논의 영향

비만 및 당뇨 모델로서 고지질식이를 한 마우스의 체중변화에 대한 사우치논영향을 관찰하였다. 정상 식이 및 고지질 식이를 마우스에 11주간 실시하고 마지막 5주간 사우치논을 주당 5회 10-30 mg/kg를 투여하였다. 각 그룹은 총 10마리의 마우스로 구성되었다. 고지질식이군은 정상식이군보다 유의하게 체중이 더 높았으며, 고지질식이군에 사우치논을 투여하면 체중이 유의하게 감소하였다(도6).

참고예 1: 실험 동물 및 식이

실험동물로 사용된 male C57BL/6 마우스 (평균 체중 25 내지 30 g)는 Charles River Orient (Seoul. Korea)에서 구입하였다. 실험에 사용하기 전 1주 이상 55± 5%의 습도, 22± 2℃의 온도 및 환기가 조절된 서울대 약대 동물실험 연구동에서 동물을 적응시켰으며, 오전 7시와 오후 7시를 기준으로 하여 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었다. 실험이 진행되는 기간 동안 식이량 및 식수량에는 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 동물의 무게와 상태를 매주 1회 검사하였다.

참고예 2: 시료 준비

지방간 유발을 위한 고지질 식이는 미국 다이엣사(Dyet Co.)에서 구입하였으며, 원하는 농도의 사우치논은 40% PEG 400 에 희석하여 제조하였다.

참고예 3: 웨스턴 브롯 ( Western blot )

Laemmli UK 방법 (1970)에 따라 Mighty Small II SE 250장치를 사용하여 sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 하였다. 간 시료의 용해분획을 샘플희석완충액 [63mM Tris (pH.6.8), 10% glycerol, 2% SDS, 0.0013% bromophenol blue, 5% b-mercaptoethanol]에 희석하여 7.5%, 9% 젤을 사용하여 전극 완충액 (1L 용액 중 Tris 15g, glycine 72g, SDS 5g 포함)내에서 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤은 전이용 전기영동장치를 이용하여 전이완충액 [25mM Tris, 192mM glycine, 20% v/v methanol (pH.8.3)]내에서 190mAmps로 1시간 동안 니트로셀룰로오즈지에 단백질을 전이시켰다. Anti-Ser-phospho-IRS1 (cell signal), anti-IRS1 (santacruz), anti-Tyrosine (cell signal), anti-GSK3β (cell signal), anti-GSK3β (cell signal), anti-β-actin (sigma) 를 1차 항체로서 반응시킨 후 2차 항체로 Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG를 1시간 반응시키고 ECL chemiluminecence system (Amersham, Gaithesberg, MA)을 사용하여 발색하였다. 시료 중 단백질 함량의 동질성은 anti-β-actin 항체(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 확인하였다.

참고예 4: 분석 방법

하기 실시예에서 제시한 자료는 약물학적 계산 프로그램을 이용하여 분석한 것으로, 다양한 실험군 간의 유의성을 일방향 평방편차 분석법 (Fisher, R.A., Statistical Methods for Research Workers, Edinburgh : Oliver & Boyd ,1925) 으로 검정한 후 뉴먼-켈스 검사(Norman GR 등., Biostatistics: The Bare Essentials,20000로 판정하였다(*p<0.5, **p<0.01) (1925).

본 발명의 사우치논을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

사우치논 20mg / 유당 100 mg/ 탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

사우치논 10mg/ 옥수수전분 100mg/ 유당 100mg/ 스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

사우치논 10 mg/ 결정성 셀룰로오스 3 mg /락토오스 14.8 mg / 마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

사우치논 10mg/ 만니톨 180mg/ 주사용 멸균증류수 2974mg/Na₂HPO₄·12H₂O 26mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

사우치논 20 mg/ 이성화당 10 g/ 만니톨 5 g/ 정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진 후 멸균시켜 제조한다.

제제예 6. 건강 기능 식품의 제조

SBC-1 1000 ㎎/

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍/ 비타민 E 1.0 ㎎/ 비타민 B₁ 0.13 ㎎/비타민 B₂ 0.15 ㎎/ 비타민 B₆ 0.5 ㎎/ 비타민 B₁₂ 0.2 ㎍/비타민 C 10 ㎎/ 비오틴 10 ㎍/ 니코틴산아미드 1.7 ㎎/엽산 50 ㎍/ 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎/

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎/ 산화아연 0.82 ㎎/ 탄산마그네슘 25.3 ㎎/제1인산칼륨 15 ㎎/ 제2인산칼슘 55 ㎎/ 구연산칼륨 90 ㎎/탄산칼슘 100 ㎎/ 염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

SBC-2 100 ㎎/ 비타민 C 15 g/ 비타민 E(분말) 100 g/젖산철 19.75 g/ 산화아연 3.5 g/ 니코틴산아미드 3.5 g/비타민 A 0.2 g/ 비타민 B₁ 0.25 g/ 비타민 B₂0.3g/ 물 적량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

사우치논 또는 사우치논을 포함하는 삼백초 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 인슐린저항성 또는 인슐린저항성증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 사우치논을 포함하는 삼백초 추출 분획물은 삼백초를 비극성용매로 추출하여 비극성 성분을 제거하는 단계, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸에세테이트 중에서 선택된 용매로 추출하는 단계, n-헥산-에틸아세테이트를 사용하여 분획하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 것인 인슐린저항성 또는 인슐린저항성증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
사우치논 또는 사우치논을 포함하는 삼백초 추출분획물을 유효성분으로 포함하는, 고인슐린혈증, 제2형 당뇨병, 비만, 고혈압, 고중성지방혈증, 저HDL콜레스테롤혈증, 관상동맥질환, 죽상동맥경화증, 심혈관질환, 수면성무호흡, 전립선암, 제1당뇨병, 정동(기분)장애, 알츠하이머병, 중풍, 유방암, 염증 및 류마티스성 관절염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
사우치논 또는 사우치논을 포함하는 삼백초 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 인슐린저항성 또는 인슐린저항성증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제 4항에 있어서, 상기 사우치논을 포함하는 삼백초 추출 분획물은 삼백초를 비극성용매로 추출하여 비극성 성분을 제거하는 단계, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸에세테이트 중에서 선택된 용매로 추출하는 단계, n-헥산-에틸아세테이트를 사용하여 분획하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 것인 인슐린저항성 또는 인슐린저항성증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
사우치논 또는 사우치논을 포함하는 삼백초 추출분획물을 유효성분으로 포함하는, 고인슐린혈증, 제2형 당뇨병, 비만, 고혈압, 고중성지방혈증, 저HDL콜레스테롤혈증, 관상동맥질환, 죽상동맥경화증, 심혈관질환, 수면성무호흡, 전립선암, 제1당뇨병, 정동(기분)장애, 알츠하이머병, 중풍, 유방암, 염증 및 류마티스성 관절염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품.