KR101967318B1 - 삼백초의 수용성 추출물을 포함하는 Th-1 매개 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 Th-1 매개 자가면역성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및, 건조된 삼백초의 줄기 및 잎을 분쇄하고; 90℃ 내지 150℃의 수성 용매 내에서 상기 분쇄된 삼백초의 줄기 및 잎을 추출하는 것을 포함하는 삼백초의 수용성 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

삼백초의 수용성 추출물을 포함하는 Th-1 매개 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 이의 제조 방법{Pharmaceutical composition containing water-soluble extract from Saururus chinenesis for treatment or prevention of Th-1 mediated disorders and preparation method thereof}

본원은 삼백초(Saururus chinenesis )의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 Th-1 매개 자가면역성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

삼백초(Saururus chinensis Baill)는 삼백초과(Saururaceae)에 속하는 여러해살이풀로 제주도에 자생하고 있으며, 남해안지역에서도 재배되고 있다. 전통적으로 삼백초의 지상부는 민간에서 풍독, 이뇨, 수종, 간염, 폐렴과 같은 질병의 치료에 사용되어 왔으며, 식용으로도 사용되는 식물이다.

삼백초의 생리 활성에 대한 연구 중에는 알러지억제효과, 혈관생성억제효과, 항산화효과 및 염증억제효과, 항암효과, 간기능보호효과 등이 있다. 삼백초에는 리그난(lignans), 알칼로이드(alkaloids), 디터펜(diterpenes), 플라보노이드(flavonoids), 스테로이드(steroids) 등의 지용성 화합물들이 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 폴리페놀(polyphenols)과 같은 수용성 분자나 케르세틴(quercetin) 배당체(rutin) 등과 같은 당결합 성분들도 존재하는 것으로 알려져 있다.

삼백초의 약제학적 활성에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 제2001-010506호에서는 삼백초로부터 항암제용 약학적 조성물을 유기용매를 이용해 추출하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 대부분의 연구들이 유기용매를 이용해 삼백초로부터 추출한 지용성 추출물들의 염증억제 작용에 대한 연구들이며, 삼백초의 지상부를 물만으로 추출하여 얻은 수용성 분자들에 대한 연구는 전혀 이루어지고 있지 않다. 또한 기존의 삼백초의 염증억제작용에 대한 연구들은 대부분 활성산소(reactive oxygen species, ROS)나 산화질소(nitric oxide, NO) 등에 의한 염증반응을 억제해주는 연구 결과로서, 삼백초 수용성 추출물 성분이 IL-4, IL-13, IL-10 등의 활성화를 유도하여 조력 T 세포(helper T cell)가 Th-2 세포로 활성화되도록 유도하여, 염증을 멈추고 조직치유과정을 촉진하는 활성을 가진다는 연구결과는 전무한 실정이다.

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본원은, 삼백초의 지상부를 수성 용매를 이용하여 추출함으로써 삼백초의 수용성 추출물을 수득하고, 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공함으로써, T 세포의 활성화 과정을 조절하는 면역기능성 삼백초 수용성 추출물을 제공하고자 한다.

특히, 상기 삼백초의 수용성 추출물은 Th2 세포 활성화 및 Th2형 사이토카인인 IL-4, IL-10, IL-13의 발현을 크게 증가시킴으로써, 염증반응을 촉진하는 Th1 세포의 활성을 억제하고 조직치유반응을 유도할 수 있다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은 삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는, Th-1 매개 자가면역성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 IL-4, IL-10, IL-13 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 세포 매개성 면역반응, IgG급 항체 반응, 염증 반응, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역반응을 억제하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 알츠하이머, 크론병, 인슐린 저항성(insulin resistance), 다발성 신경염, 제1형 당뇨병, 류마치스 관절염, 소양증, 루푸스, 하시모토갑상선염 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 자가면역성 질환의 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 삼백초의 수용성 추출물은 평균 분자량이 300 Da 내지 10,000 Da인 친수성 화합물을 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 경구 투여용일 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 건조된 삼백초의 줄기 및 잎을 분쇄하고; 90℃ 내지 150℃의 수성 용매 내에서 상기 분쇄된 삼백초의 줄기 및 잎을 추출하는 것을 포함하는, 삼백초의 수용성 추출물의 제조 방법을 제공할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 추출은 1 시간 내지 5 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 수성 용매는 물을 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 추출 후에, 평균 분자량이 300 Da 내지 10,000 Da인 분획을 분리하여 수득하는 것을 더 포함할 수 있다.

삼백초의 수용성 추출물 분획의 Th2형 사이토카인 활성화 기능성은 면역조절 기능의 이상으로 Th1형 T세포가 과도하게 활성화되어 나타나는 자가면역성 질환 또는 만성염증성 질환을 억제, 치료 또는 예방하는 목적으로 활용될 수 있다. 예를 들어, 삼백초 수용성 추출물 분획은 Th1 세포의 과도한 활성화 결과 발생하는 IBD 질환, 비만환자의 인슐린저항성, 알츠하이머 등과 같은 만성 질환의 치료나 예방 또는 증세 개선 등에 활용될 수 있다. 또한 IL-4, IL-10, IL-13 등의 사이토카인이 피부 외상에서 상처치유과정에 중요한 역할을 하기 때문에, 삼백초 수용성 추출물은 상처 조직의 치유를 위한 의약품에도 활용될 수 있다. 삼백초가 식용 원료인점을 감안한다면, 삼백초 수용성 추출물을 함유하는 약학적 조성물은 상기와 같은 증세의 출현을 억제하고자 하는 기능성 식품으로도 응용이 가능하다.

도 1은 본원의 삼백초의 수용성 추출물의 분획 범위를 나타내는 그래프이다.
도 2a 내지 도 2c는 생쥐에 대한 삼백초 수용성 추출물의 경구 투여에 따른 말초혈액 백혈구에서의 IL-4 (도 2a), IL-10 (도 2b), IL-13 (도 2c) 유전자 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 3c는 삼백초 수용성 추출물 분획의 TNBS에 의한 장염 유도 억제효과를 나타내는 도면이다. 도 3a는 각 실험군의 대장벽의 두께를 나타내는 그래프, 도 3b는 각 실험군의 대장 표면의 충혈 정도를 보여주는 이미지, 및 도 3c는 각 실험군의 장점막조직의 파괴 정도를 보여주는 이미지이다.
도 4는 삼백초 수용성 추출물 분획의 TNF-α 발현 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B” 의 기재는, “A, B, 또는, A 및 B” 를 의미한다.

이하, 본원의 Th-1 매개 자가면역성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 상기 삼백초의 수용성 추출물의 제조 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

면역체계는 적절한 면역반응을 나타내면서 건강한 상태를 유지하기 위하여 다양한 세포들이 서로 협동적으로 작용하여야 하는 복잡한 체계이다. T 세포는 면역반응에서 중심적인 역할을 하는 세포로 다양한 세포들과 상호작용하여 그들의 기능을 조절한다. 조력 T 세포(helper T cell, Th)는 B 세포와 반응하여 항체 생산을 도와주며, 대식세포와 반응하여 대식세포의 기능을 조절할 수도 있다. 조절 T 세포 (regulatory T cell, Tr)는 면역반응을 억제하는 역할을 수행하며, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell, CTL)는 직접 세포를 살해하는 역할을 수행하는 등 T 세포는 면역반응에서 매우 중요한 세포이다. 이러한 다양한 T 세포들은 모두 흉선에서 성숙되어 만들어지며, 말초혈액에서 항원과 반응하여 적절한 면역반응을 유도하는 T 세포로 활성화되어 면역반응을 수행한다. 조력 T 세포는 항원과 반응하여 활성화되는데, 이때 항원과 어떻게 반응하느냐에 따라 하나의 조력 T 세포는 Th-1 세포나 Th-2 세포 등의 전혀 다른 기능을 가진 세포로 활성화된다. 조력 T 세포가 Th-1 세포 또는 Th-2 세포로 활성화되는 과정은 조력 T 세포가 항원제시세포(antigen presenting cell)와 반응할 때 어떤 종류의 사이토카인이 작용하느냐에 의하여 결정된다. Th-1 세포는 IFN-γ와 IL-2 등의 사이토카인에 의하여 활성화되고, Th-2 세포는 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 등의 사이토카인에 의하여 활성화되는 것으로 알려져 있으며, 이들 두 세포는 서로 억제적으로 활성화되어 서로 상반되는 작용을 나타낸다. Th-1 세포는 세포매개성면역반응이나 IgG급 항체 반응을 촉진하고 염증반응을 활성화 하여, 세균이나 바이러스 감염을 막아주는 데 중요한 역할을 하는 반면에, Th-2 세포는 IgE급 항체를 만들게 하며, 호산구(eosinophil)를 활성화하여 기생충을 죽이는 면역반응을 수행한다. 특히, Th-2 세포들은 기생충과 같은 커다란 원생동물들이 우리 몸에 들어왔을 때 이들을 우리 몸에서 내보내거나 고립시키며, 이들에 의하여 나타난 조직손상을 치유하는 데 중요한 역할을 한다. 즉, Th-1 세포는 염증반응을 유도하여 항원 제거에 주력하지만 결과적으로 조직에 염증성 손상을 주게되나, Th-2 세포는 상대적으로 위험스러운 염증반응을 억제하고 조직손상을 최소화하는 면역반응을 유도한다.

면역체계를 구성하는 다양한 세포들의 상호작용은 세포들 간의 직접적인 결합에 의해서도 나타나지만, 많은 경우 사이토카인 단백질에 의하여 나타난다. 사이토카인은 면역반응을 조절하는데 핵심적인 역할을 하는 호르몬과 유사한 단백질인자이며, 일부 사이토카인은 조력 T 세포의 활성화나 대식세포의 면역조절 기능에 중요한 역할을 한다. 인터루킨 4 (IL-4)는 B 세포나 T 세포의 분화 및 활성화를 조절하는 사이토카인으로 인터루킨 5 (IL-5), 인터루킨 13 (IL-13) 등과 같이 B 세포에 작용하여 IgE 급 항체의 생산을 촉진하며, 호염구(basophil)와 비만세포를 활성화하는 사이토카인으로 알려져 있다. 이러한 IL-4는 IL-13 등과 함께 항원과 반응하지 않은 성숙된 조력 T 세포(Th0 cells)를 Th-2 세포로 분화성숙되게 하며, Th-1 세포로의 활성화를 억제하는 작용을 보여준다. Th-2 세포가 만들어내는 IL-4와 IL-13은 또한 대식세포에도 작용하여 대식세포를 특정한 집단으로 활성화시킨다. 대식세포는 조력 T 세포가 만들어내는 사이토카인에 의하여 기능이 다른 두 그룹으로 활성화된다. Th-1 세포가 분비하는 IFN-γ에 의하여 활성화되는 대식세포는 산화질소 (NO) 등과 같은 독성 화합물을 생산하고 조직괴사를 촉진하며 IL-6, TNF-α와 같은 염증반응 사이토카인을 분비하여 염증반응을 촉진한다. 이렇게 활성화된 대식세포를 고전적으로 활성화된 대식세포 또는 M1 대식세포라고 부르는데, 이들은 NO와 같은 독성이 높은 래디칼화합물을 만들어내고 TNF-α와 같은 사이토카인을 분비하여 세균이나 바이러스와 같은 미생물을 파괴하기도 하지만, 염증반응을 유도하여 조직에 대한 상처 반응 (injury response)을 통하여 조직손상을 유도하기 때문에 염증성질환의 원인이 되기도 한다. 반면에 Th-2 세포가 분비한 IL-4와 IL-13 등의 사이토카인에 의하여 활성화되는 대식세포는 염증반응은 억제하면서 콜라겐 등을 분비하여 조직상처를 치유하는 기능을 수행한다. 이렇게 활성화된 대식세포를 대체적으로 활성화된 대식세포 또는 M2 대식세포라고 부르는데, 이들은 IL-10을 분비하여 염증을 멈추게하고 조직치유과정을 시작하게 만든다. M2 형 대식세포가 분비하는 IL-10은 TNF-α와 같은 염증성사이토카인의 활성을 억제하여 자가면역질환이나 만성염증질환의 발병과정을 억제하고 손상된 조직을 복구하는 데 중요한 역할을 수행한다. 또한, IL-4와 IL-13은 조직 손상 치유에 중요한 아르기나제(arginase), MMP12, TREM-2 등의 단백질이 활성화하며, 콜라겐 합성을 촉진하여 조직손상 치유과정을 활성화한다.

조력 T 세포가 Th-1 세포와 Th-2 세포 중 어느 한쪽으로 활성화되고, 그에 따라 전혀 다른 기능의 대식세포가 활성화되어, 면역반응도 염증반응이 진행되느냐 아니면 염증반응을 멈추고 조직치유 반응으로 진행되느냐로 달라지기 때문에, 조력 T 세포의 활성화가 한쪽으로 나타나는 불균형상태는 다양한 질병의 발생이나 증세에 커다란 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. Th-1 세포는 염증반응을 통하여 조직손상을 초래하기 때문에, Th-1형으로 조력 T 세포가 과도하게 활성화되면 자가면역반응에 따른 만성염증성 질환의 증세가 나타나게 된다. 이러한 Th-1 세포의 과도한 활성화와 연관된 자가면역성 질환에는 염증성장질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD), 다발성신경염(multiple sclerosis, MS), 제1형당뇨(type 1 insulin-dependent diabetes mellitus: IDDM), 류마치스관절염 (rheumatoir Athritis, RA) 등이 있다. 염증반응은 항원을 제거하는 중요한 면역반응중 하나이지만, 염증반응 결과 조직손상이라는 위험한 결과가 초래된다. 특히, 자가면역성 질환의 경우 자가항원의 노출이 지속적으로 이루어지기 때문에 염증반응은 지속적으로 유지되며, 그에 따라 환자에게 심각한 조직손상과 질병악화의 과정이 되풀이되는 것이다. IL-10은 주로 염증을 억제하는 M2 형 대식세포에 의하여 분비되는 사이토카인으로, IL-6, TNF-α 등의 염증반응을 촉진하는 사이토카인의 활성을 억제하며, 염증세포의 이동을 촉진하는 케모카인(chemokine)의 합성도 방해하여, 염증반응을 강하게 억제한다. IL-10은 TNF-α의 합성을 억제할 뿐 아니라, TNF-α 수용체의 발현도 억제하며, TNF-α 수용체를 세포막에서 제거하는 기능도 나타내는 대표적인 항 TNF-α 사이토카인이기도 하다. TNF-α는 염증반응의 진행에서 핵심적인 역할을 하는 사이토카인으로, 세포의 자살을 유도하며 염증반응을 유도하여 항원을 제거하는데 중요한 역할을 하지만, 과도하게 만들어지면 치명적인 결과를 초래할 수 있는 사이토카인이다. TNF-α의 과도한 활성화는 염증성장질환 (IBD), 알츠하이머병나 다발성신경염과 같은 뇌질환 및 소양증 등과 같은 자가면역증에서 조직손상과 직접적인 관련이 있다. Th-2형의 T 세포 활성화는 염증반응을 억제하고 조직치유를 유도하는 면역반응을 활성화하며, Th-1형의 T 세포 활성화를 억제하기 때문에, Th-2형 반응을 촉진하는 방법은 만성염증질환이나 자가면역증을 막아주거나 증세를 완화하고, 조직치유를 유도하는 방법으로 활용된다. Th-2형 T 세포 활성화 및 조직치유반응을 유도하는데 IL-4, IL-13, IL-10 등의 사이토카인이 중요하므로, 이들 사이토카인의 활성을 증가시켜주는 물질은 다양한 만성질환을 치료하거나 질병이 악화되는 것을 막아주는데 이용될 수 있다.

최근에 잘못된 사이토카인의 활성을 정상으로 복구하는 기능을 가진 면역조절작용을 나타내는 작은 분자들에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. Th-1형과 Th-2 형 T 세포의 균형에 호르몬이나 식물스테롤 등 다양한 생체분자가 영향을 미치는 것으로 알려진 바 있다. 특히, EPA나 DHA 와 같은 어류 오일은 Th-2 형의 반응을 활성화하고 Th-1 형 반응은 억제하여 관절염과 같은 자가면역증 치료에 활용되기도 한다. 이러한 연구결과들은 삼백초와 같은 식물에도 T 임프구의 활성화를 조절하는 물질이 존재하는 것을 보여주는 것으로, 본원의 삼백초 수용성 추출물의 IL-4, IL-10, IL-13 사이토카인의 발현증가 효과는 이 추출물이나 분획을 Th-1 반응이 강하고 Th-2 반응이 약하여 나타나는 다양한 질환의 치료나 증세 완화를 위하여 활용될 수 있다. 예를 들어 크론병은 염증성장질환이라는 자가면역증의 일종으로 장조직의 자가항원에대한 염증성 조직손상이 나타나 장조직이 파괴되는 질병으로, IL-4, IL-10, IL-13 사이토카인이 장조직의 염증반응을 억제해 줄 수 있다는 연구 결과가 보고된 바 있다. 비만환자의 인슐린저항성(insulin resistance)은 지방세포에 모이는 대식세포가 TNF-α를 분비하여 조직손상과 염증반응을 촉진하여 나타나는데, IL-4와 IL-13은 지방조직에서 대식세포가 M2형으로 활성화되도록 조절하여 염증반응을 억제하고 비만에 의해 유도되는 인슐린저항성을 감소시키는 것으로 보고된 바 있다. 알츠하이머질병(Alzheimer's disease, AD)의 발병과정에서 질병의 원인이 되는 베타아밀로이드 플라크 형성이 뇌조직의 미세아교세포(microglia) 세포 등이 유도하는 염증반응 때문인 것으로 조사되었는데, IL-4, IL-10, IL-13은 미세아교세포의 반응을 조절하여 염증을 억제해주는 것으로 알려진 바 있다. 또한, IL-4, IL-10, IL-13 등의 사이토카인은 상처치유와 섬유화과정에서도 중요한 역할을 할 수 있다. 상처가 난 조직에는 일차적으로 염증반응을 촉진하는 M1 형의 대식세포들이 상처부위에 모여 염증반응이 나타나고, 이들 세포들에서 유도적인산화질소합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)가 활성화되어 근육세포들의 괴사가 나타난다. 그 후, IL-4, IL-13 등의 Th-2형 사이토카인의 작용으로 대식세포들이 M2형으로 전환되면서 IL-10이 합성되고 염증반응이 멈춰지고 조직재생과정이 시작된다. 즉, 삼백초 수용성 추출물의 IL-4, IL-10, IL-13 사이토카인 활성화 효능은 상기 질환들을 포함하는 질환의 치료, 증세 개선, 완화 및/또는 예방에 활용될 수 있다.

본원의 제 1 측면은 삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는, Th-1 매개 자가면역성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

예를 들어, 상기 삼백초의 수용성 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본원에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 삼백초로부터 추출한 것을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 삼백초의 열수추출물 또는 극성용매 가용 추출물을 포함할 수 있다.

삼백초의 수용성 추출물을 수득하기 위핸 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 수성 용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올 등을 포함하는 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본원의 삼백초 추출물의 제조방법은 특별히 제한되지 않을 수 있으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본원의 조성물에 포함되는 삼백초 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

따라서 본원에 있어서 삼백초 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본원의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 당업계에서 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함할 수 있다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 IL-4, IL-10, IL-13 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 세포 매개성 면역반응, IgG급 항체 반응, 염증 반응, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역반응을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 만성 염증성 질환, 알츠하이머, 크론병, 인슐린 저항성(insulin resistance), 다발성 신경염, 제1형 당뇨병, 류마치스 관절염, 소양증, 루푸스, 하시모토갑상선염 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 자가면역성 질환의 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 삼백초의 수용성 추출물은 평균 분자량이 300 Da 내지 10,000 Da인 친수성 화합물을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 삼백초의 수용성 추출물의 평균 분자량은 약 300 내지 5,000 Da, 약 300 내지 4,000 Da, 약 300 내지 3,000 Da, 약 300 내지 2,000 Da, 약 300 내지 1,000 Da, 약 300 내지 500 Da, 약 500 내지 5,000 Da, 약 1,000 내지 5,000 Da, 약 2,000 내지 5,000 Da, 약 3,000 내지 5,000 Da, 약 4,000 내지 5,000 Da, 약 500 내지 10,000 Da, 약 1,000 내지 10,000 Da, 또는 약 5,000 Da 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 경구 투여용일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 건조된 삼백초의 줄기 및 잎을 분쇄하고; 90℃ 내지 150℃의 수성 용매 내에서 상기 분쇄된 삼백초의 줄기 및 잎을 추출하는 것을 포함하는, 삼백초의 수용성 추출물의 제조 방법을 제공할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 추출은 1 시간 내지 5 시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 추출은 1 시간 내지 4 시간, 1 시간 내지 3 시간, 1 시간 내지 2 시간, 2 시간 내지 5 시간, 3 시간 내지 5 시간, 4 시간 내지 5 시간, 또는 약 2 시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 수성 용매는 물을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 추출 후에, 평균 분자량이 300 Da 내지 10,000 Da인 분획을 분리하여 수득하는 것을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본원을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

1. 삼백초 수용성추출물과 그 분획의 제조

건조된 삼백초 줄기와 잎을 분쇄하고, 증류수를 첨가한 후, 125℃에서 2 시간 동안 반응시켜 추출물을 수득하고, 수득된 추출물을 상온에서 식힌 후 원심분리하여 상등액을 모아 삼백초 수용성 추출물을 분리하였다. 얻어진 삼백초 수용성 추출물로부터 폴리페놀, 배당체 등과 같은 기능성 저분자량 수용성 유기물질을 정제하기 위하여, 상기 삼백초 수용성 추출물을 세파덱스(Sephadex) G50 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 물로 분획하였다. 얻어진 분획 중에서 260 nm 파장의 자외선 흡광도가 높은 부분만을 모아 삼백초 수용성 추출물 분획으로 사용하였다.

도 1은 삼백초 수용성 추출물 정제 분획을 나타낸 그래프이다. 삼백초 수용성 추출문 분획의 평균분자량은 1000 달톤 정도였으며, 5000 달톤이하 크기의 수용성 유기물질을 포함하였다.

2. 삼백초 수용성 추출물 식이의 말초혈액 백혈구의 면역 조절 기능성

5-6 주령의 ICR 생쥐에 하루에 한 번씩 한 마리 당 삼백초 수용성 추출물을 2 mg씩 3 일간 경구 투여하였다. 생쥐는 각 3 마리씩 그룹으로 나누어, 삼백초 수용성 추출물 투여군 (실험군)과 증류수 투여 대조군 두 그룹으로 나누어 진행하였다. 3 일간 시료를 경구 투여한 후, 생쥐를 희생하여 혈액을 채취하고, 혈액의 세포(PBMC)로부터 RNA를 분리하였다. 혈액세포로부터의 RNA 분리는 QIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 분리하였다. Doctor Protein cDNA Synthesis Kit (엠지메드, Korea)을 이용하여 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성한 후, Real-time PCR을 이용하여 IL-4, IL-10 및 IL-13 각각의 유전자의 발현정도를 비교하였다. Real-time PCR은 Quanti Mix SYBR Kit (PhileKorea Technology, Korea)을 이용하여 ABI PRISM 7300 실시간 DNA 증폭기(Applied Biosystems, USA)로 증폭하여 RNA 양을 정량적으로 비교하였다. β-actin 유전자 증폭을 위해서는 GGCACCAGGGTGTGATGG/ ACGGTTGGCCTTAGGGTTC 프라이머 세트를 사용하였으며, IL-4 유전자의 증폭을 위하여 GGTCTCAACCCCCAGCTAGT/ GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT 프라이머 세트를, IL-10 유전자의 증폭을 위하여 GCTCTTACTGACTGGCATGAG/ CGCAGCTCTAGGAGCATGTG 프라이머 세트를, IL-13 유전자의 증폭을 위하여 CCTGGCTCTTGCTTGCCTT / GGTCTTGTGTGATGTTGCTCA 프라이머 세트를 이용하였다. 실시간 PCR 반응은 모두 50℃에서 2 분, 95℃에서 10 분동안 1 사이클 반응시키고, 변성(denaturation)은 95℃에서 15초, 결합(annealing)과 신장(extension)을 60℃에서 1 분씩 총 40 사이클로 증폭하였다. 각각의 증폭결과는 2^-△△CT 방법으로 β-actin 유전자의 증폭결과로 보정하여 정량적으로 비교하였다 (Livak and Schmittgen, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^-△△CT Method. Methods, 2001, 25 : 402 - 408). 도 2a 내지 도 2c는 생쥐에 대한 삼백초 수용성 추출물의 경구 투여에 따른 말초혈액 백혈구에서의 IL-4, IL-10, 및 IL-13 유전자 발현 증가 효과를 나타낸 그래프이다. 도 2a 내지 도 2c 모두에서 1)번 시험군은 증류수를 식이한 대조군 생쥐에서의 유전자 발현량이며, 2)번 시험군은 삼백초 수용성추출물을 식이한 생쥐에서의 유전자 발현량을 표시한 것이다. “Fold Change”는 증류수를 식이하였을 때의 발현량을 1로 정하여 상대 비교한 것이다. 대조군과 비교한 각각의 유전자의 발현양의 유의성은 모두 P<0.01이다. 그 결과 삼백초 수용성 추출물을 식이한 생쥐의 말초혈액 백혈구에서는 대조군에 비하여 IL-4 유전자는 평균 6 배 (도 2a)가, IL-10 유전자는 평균 9 배(도 2b), IL-13 유전자는 평균 12 배 (도 2c)가 증가하여 유의성을 나타내었다. 이러한 결과로부터, 삼백초 수용성 추출물을 섭취시 소화관에서 체내로 흡수되어 혈액의 백혈구에 작용하여 IL-4, IL-10 및 IL-13의 발현을 증가시킨다는 점이 확인되었다.

삼백초 수용성 추출물이 말초혈액 백혈구 (PBMC)에서의 IL-4, IL-10, IL-13 유전자의 발현을 증가시키는 효과는 상기 추출물이 T 세포 면역반응을 Th2 형으로 활성화 시킬 수 있다는 것을 보여주는 결과이며, 동시에 Th1형으로의 T세포 활성화를 억제할 수 있음을 보여주는 결과이다. 즉, 삼백초 수용성 추출물은 Th1 세포의 과도한 활성화로 발생하는 자가면역질환 및 만성염증성질환 등의 치료 및 예방에 유용하게 활용될 수 있다는 것을 유추할 수 있다. 또한, 삼백초 수용성 추출물은 염증반응을 억제하고 조직손상을 최소화하며 상처를 치유하는 Th2형 면역반응으로 전환하게 하는 목적으로도 활용할 수 있다는 점을 알 수 있다..

3. 크론병 동물모델에서의 삼백초 수용성 추출물 분획의 조직손상 억제효과

삼백초 수용성 추출물의 Th2형 사이토카인의 활성화효과가 실제로 질병모델에서도 나타나는지 확인하기 위하여, 자가면역성 질환인 크론병 (Crohn’s disease)의 동물모델인 TNBS (trinitrobenzene sulfonic acid) 유도 장염모델을 이용하여 그 효과를 검증하였다.

크론병은 염증성장질환(inflammatory Bowel disease, IBD)의 일종으로 장조직에서 비정상적인 면역반응이 유도되어 발생하는 질환 즉, 면역반응 조절의 실패로 나타나는 자가면역증이다. 이 병은 자가항원과 반응하는 Th1형 T세포와 M1형 대식세포들이 비정상적으로 활성화되어 장조직에 모이게 되고, 이들 세포들이 분비하는 IFN-γ나 TNF-α와 같은 사이토카인에 의하여 염증반응이 나타나 조직손상이 나타나면서 장상피조직에 대한 손상이 나타나는 질병이다. 즉, 크론병과 같은 만성장손상질환에서 장손상은 염증 때문에 나타나긴 하지만, 질병의 발생과정은 대장조직에서 자가항원에 대한 면역내성(immune tolerance)이 깨어지면서 나타나는 면역조절의 실패때문이다.

따라서, 크론병은 장조직에서 염증을 유발하고 조직손상을 초래하는 Th1 세포들이 과도하게 활성화되고 염증성 대식세포 (M1형 대식세포)들이 활성화되면서 점막조직의 파괴과정이 유도되는 자가면역반응으로 인한 것이다.

또한, 여러 연구에서 Th1 세포의 활성화를 억제하는 IL-4, IL-13, IL-10 등과 같은 Th2 형 사이토카인의 활성화가 장조직에대한 염증반응을 줄이고, 장조직의 손상을 막아주며, 장상피세포의 교체 및 점액질생산의 증가 등과 같은 손상 조직을 치유과정이 활성화시켜 크론병의 발생을 억제하거나 증세를 완화한다는 보고들을 볼 수 있다. 이러한 연구결과들을 바탕으로 생쥐의 직장에 TNBS를 주입하여 장손상을 유도하는 동물모델을 이용하여 삼백초 수용성 추출물 분획이 장조직 손상을 막아주는 지를 조사하였다.

TNBS는 생쥐의 단백질과 결합하여 마치 자가항원과 같이 작용하며, 대장조직에서 자가면역성 염증반응을 유도하여 조직손상을 초래한다. TNBS에 의한 조절되지 않는 면역반응은 Th1 형의 T 세포나 M1 형 대식세포에 의하여 대장조직에서 IFN-γ나 TNF-α를 증가시키고, 그 결과 대장조직에 염증성 손상을 유도한다는 점에서 크론병의 병리과정과 매우 유사하다. 이런 점에서 TNBS에 의하여 유도된 대장염 동물모델은 삼백초 수용성 추출물의 Th2 형 사이토카인 활성화 기능의 효과를 검증할 수 있는 좋은 모델이되었다.

생쥐에서 대장조직 손상을 유도하기 위하여, 5-6주령의 ICR 생쥐의 직장에 플라스틱튜브를 이용하여 100㎕의 2% TNBS (50%의 에탄올에 녹인 용액)를 주입하였으며, TNBS를 주입하고 2 일정도 지나 주입한 지역의 대장조직에 조직손상이 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 삼백초 수용성 추출물 분획이 TNBS에 의한 장조직 손상을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 삼백초 수용성 추출물 분획을 2% TNBS와 섞어서 직장에 투여하였다. 각각 3 마리의 생쥐를 5 개의 실험군으로 나누어 1 번 실험군에는 50% 에탄올만 주입하였고, 2 번 실험군은 0.2% TNBS만을, 3, 4, 5 번 실험군은 각각 10mg, 1mg, 0.1mg의 삼백초 수용성 추출물 분획을 0.2% TNBS와 혼합하여 투여하였다.

TNBS를 주입한 후 2 일째 되는 날에 생쥐를 희생하여 TNBS가 투여된 위치의 대장을 잘라내고 절개하여 펼친 후, 대장 점막 표면에 조직괴사에 따른 충혈 여부를 확인하였으며, 대장의 두께를 현미경을 이용하여 측정하였다. 대장 조직의 일부는 10% 포르말린으로 고정한 후, 저온유지장치(cryostat)로 조직절편을 얻어 HE 염색법으로 염색하여 장 상피의 파괴정도 및 점막조직으로의 염증세포의 침투여부를 확인하였다 (도 3a 내지 3c).

그 결과 TNBS만으로 처리한 생쥐에서는 직장벽의 두께가 50% 에탄올로 처리한 대조군 생쥐의 직장벽 두께 보다 0.2 ㎛정도 두꺼워진 것이 확인되었다 (도 1a). 도 1a에서는 TNBS 만으로 처리한 생쥐의 대장과 비교한 대장두께 변화의 유의성이 P<0.01인 결과를 *로 표시하였다. 반면, TNBS를 10 mg 과 1 mg의 삼백초 수용성 추출물 분획과 혼합하여 주입한 생쥐에서는 직장벽의 두께가 TNBS만을 주입한 생쥐의 대장벽보다 얇게 나타나 에탄올로 처리한 대조군 생쥐의 직장벽 두께와 유사하게 관찰되었다 (도 3a의 3 번 및 4 번 실험군). 이러한 결과는 삼백초 수용성 추출물 분획을 1 mg 이상 TNBS와 혼합하여 사용하면 TNBS에 의한 장염증반응이 나타나지 않아 대장의 두께가 정상적으로 유지되는 것을 보여주는 것이다.

또한, 대장 표면의 충혈 정도를 비교한 결과에서도 TNBS만으로 처리한 대장에서는 검붉게 충혈된 지역을 확인할 수 있었으나, TNBS를 10 mg과 1 mg의 삼백초 수용성 추출물 분획과 혼합하여 주입한 생쥐에서는 대장 조직의 충혈이 없는 것을 확인할 수 있었다 (도 3b의 3 번 및 4 번 실험군). 또한 HE염색을 통해 대장 표면의 손상정도를 비교하였을 때도 TNBS를 10 mg 과 1 mg의 삼백초 수용성 추출물 분획과 혼합하여 주입한 생쥐에서는 TNBS에 의한 대장 점막조직의 파괴현상이 타나나지 않았음을 확인할 수 있었다 (도 3c의 3 번 및 4 번 실험군). 이러한 결과들은 삼백초 수용성 추출물 분획의 성분이 TNBS 주입으로 인해 발생하는 자가면역성 염증반응을 억제한다는 것을 증명하는 것으로서, 삼백초 수용성 추출물이 Th2 형 사이토카인을 활성화 하여 Th1 형 T 세포에 의한 조직손상과 염증반응의 발생을 억제해 준 것으로 해석된다.

4. 삼백초 수용성 추출물 분획의 TNF-α 발현 억제 효과

TNBS에 의한 크론병 동물모델에서 TNBS의 주입은 조직내에서 TNF-α의 발현을 과도하게 증가시키며, 그러한 변화가 대장조직의 손상과 직접적으로 관련이 있다고 알려져 있다. 본원에서도 TNBS의 대장내 주입이 대장조직에서 TNF-α의 발현을 크게 증가시킨다는 것을 확인하였다. 생쥐에서 TNBS 주입으로 인해 대장조직에서 T 세포와 대식세포에 대한 면역내성조절반응에 결함이 생기고, 그 결과 TNF-α의 합성이 증가되면서 대장조직의 염증성손상이 나타나므로, 이러한 모델을 이용하여 Th2형 사이토카인을 활성화하는 삼백초 수용성 추출물 분획이 TNBS로 처리한 대장조직에서 TNF-α의 발현을 억제하는지 여부를 조사하였다. 각 3 마리로 구성된 3 그룹의 생쥐들을 대상으로 하여 1 번 그룹에는 50% 에탄올을 주입하고, 2 번 그룹에는 2% TNBS (50% 에탄올에 녹임)을, 3 번 그룹에는 2% TNBS와 1 mg의 삼백초 수용성 추출물 분획을 혼합하여 생쥐의 대장에 주입하였다. 2 일 후 TNBS를 주입한 부분의 대장조직을 적출하여 RNA와 cDNA를 준비한 후, 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 TNF-α의 발현정도를 상대비교 하였다. 생쥐의 대장 조직으로부터 MGTM Total RNA Extraction kit(Macrogen, Korea)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA로부터 Doctor Protein cDNA Synthesis Kit(엠지메드, Korea)을 이용하여 cDNA를 합성한 후, Real-time PCR을 이용하여 3 그룹의 대장조직에서 TNF-α의 발현 정도를 정량적으로 비교하였다. Real-time PCR은 Quanti Mix SYBR Kit(PhileKorea Technology, Korea)을 이용하여 ABI PRISM 7300 실시간DNA증폭기(Applied Biosystems, USA)로 증폭하여 RNA 양을 정량적으로 비교하였다. β-actin 유전자 증폭을 위하여 GGCACCAGGGTGTGATGG/ ACGGTTGGCCTTAGGGTTC 프라이머 세트를 사용하였으며, TNF-α 유전자의 증폭을 위하여 ATGAGCACAGAAAGCATGATC/ TACAGGCTTGTCCGAATT 프라이머 세트를 사용하였다. 실시간 PCR 반응은 모두 50℃에서 2 분, 95℃에서 10 분 동안 1 사이클 반응시키고, 변성(denaturation) 95℃에서 15초, 결합(annealing)과 신장(extension)을 60℃에서 1 분씩 총 40 사이클 증폭하였다. 각각의 증폭결과는 2^-△△CT 방법으로 β-actin 유전자의 증폭결과로 보정하여 정량적으로 비교하였다. 도 4는 삼백초 수용성 추출물 분획의 TNF-α 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다. 1 번 실험군은 50% 에탄올을 주입한 대장조직이고, 2 번 실험군은 2% TNBS 만을 주입한 대장조직이며, 3 번 실험군은 2% TNBS와 1 mg의 삼백초 수용성 추출물 분획을 혼합하여 주입한 대장조직이다. “Fold Change”는 에탄올을 주입하였을 때의 발현량을 1로 정하여 상대 비교한 것이다. TNBS 만을 주입한 대장조직에서의 발현양과 2% TNBS와 1mg의 삼백초 수용성 추출물 분획을 혼합하여 주입한 대장조직에서의 TNF-α 발현양을 비교한 결과의 유의성 P<0.01이다. 그 결과 TNBS 만을 주입한 생쥐의 대장에서 TNF-α의 발현이 에탄올만 주입한 대조군 생쥐에 비하여 150 배 이상 증가되는 것으로 확인되었다 (도 4의 1 번 및 2 번 실험군). 그러나 삼백초 수용성 추출물 분획과 TNBS를 혼합하여 주입한 생쥐의 대장에서는 이와 같이 증가된 TNF-α의 발현이 거의 대조군과 유사한 수준으로 감소되는 것을 확인하였다 (도 4의 3 번 실험군). 이러한 결과는 삼백초 수용성 추출물이나 그 분획에는 TNF-α의 발현을 억제하는 효과가 있음을 보여주는 것으로, 그러한 효과는 삼백초 수용성 추출물이 IL-4, IL-13, IL-10 등과 같은 Th2 형 사이토카인을 활성화시켜 TNBS에 의한 비정상적인 Th1형 T 세포의 활성화를 억제하여 주었기 때문인 것으로 생각된다. 또한 이러한 결과는 삼백초 수용성 추출물이나 그 분획에는 Th-2형 사이토카인의 활성화를 촉진하여 염증반응을 중지시키고 조직손상의 치유를 촉진하는 면역조절기능을 가진 물질이 포함되어 있으며, 그 결과 TNBS에 의한 대장 조직의 손상이 나타나지 않게 하였다고 해석된다.

본원에서는 건조된 삼백초 지상부로부터 열수를 이용하여 얻은 삼백초의 수용성 추출물을 생쥐에 식이한 결과, 이 수용성 추출물이 생쥐의 소화관에서 흡수되어 혈액의 백혈구에 작용하여 이들 세포에서 IL-4, IL-10, IL-13 등의 Th2형 사이토카인의 발현이 크게 증가되는 것을 보여주었다. 이들 사이토카인은 항원과 반응하여 T 세포가 활성화될 때 Th-2형 T 세포로 활성화되도록 만드는 사이토카인으로, 이들 사이토카인은 염증반응을 멈추게 하며, 손상된 조직을 복구하는 조직치유반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 또한 이들 Th-2형 사이토카인은 염증반응을 촉진하는 Th-1형 T 세포의 활성화를 억제하는 기능을 나타내기 때문에 이들 사이토카인을 활성화시키는 삼백초 수용성 추출물은 Th-1형의 T 세포가 활성화되어 나타나는 여러 자가면역성 질환이나 만성염증성 질환을 억제하거나 그 증세를 완화시키는 기능을 나타낸다. 이와 같은 효과가 삼백초 수용성 추출물에 있는 지를 확인하기 위하여, 자가면역질환의 일종인 크론병 생쥐모델을 이용하여 조사하였다. 이를 위하여 생쥐의 대장에 TNBS를 투여하여 크론병과 유사한 과정으로 생쥐에서 장조직손상을 유도하였다. 이 모델에서 삼백초 수용성 추출물 분획은 TNBS에 의한 장점막조직의 손상을 억제하는 효과가 있는 것으로 확인되었으며, 또한 TNBS로 처리한 장조직에서 크게 증가되는 TNF-α의 발현을 현저하게 낮추어주는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 삼백초 수용성 추출물이 체내 T 세포의 활성화를 조절할 수 있으며, 염증억제 및 조직손상을 치유하는 면역 기능을 가진 물질이 포함되어 있음을 증명하는 것이다. 이러한 삼백초 수용성 추출물이나 그 분획의 Th-2형 T세포 활성화 기능성은 면역조절 이상으로 발생하는 크론병과 같은 IBD 질환이나 비만환자의 인슐린저항성, 알츠하이머질병 등과 같은 면역조절기능 이상으로 발생하는 만성 질환의 치료나 예방 또는 증세 개선 등에 활용될 수 있다. 또한 IL-4, IL-10, IL-13 등의 Th-2형 사이토카인이 피부 외상에서 상처치유과정에 중요한 역할을 할 수 있다는 점에 비추어, 상처 조직의 치유를 위한 의약품에도 활용될 수 있을 것이다.

이제까지 본원에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본원이 본원의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본원의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본원에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (4)

1. 삼백초를 물로 추출한 추출물을, 물로 정제한 후, 260 nm 파장의 자외선 흡광도가 높은 부분을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
   크론병의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   IL-4, IL-10, IL-13 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키는 것 또는 TNF-α의 활성을 억제하는 것인, 크론병의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   세포 매개성 면역반응, IgG급 항체 반응 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역반응을 억제하는, 크론병의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
   
4. 제1 항에 있어서,
   경구 투여용인, 크론병의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.

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