CN112691114B - 苦瓜多糖在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的应用及其药物制剂 - Google Patents
苦瓜多糖在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的应用及其药物制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了苦瓜多糖在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的应用及其药物制剂,属于生物医药领域。所述溃疡性结肠炎是由葡聚糖硫酸钠诱导的。经实验表明,苦瓜多糖通过恢复体重和粪便粘稠度及减少出血,以降低疾病活动指数而改善临床症状;通过修复结肠组织的黏膜屏障功能,保护炎症损伤的肠道;通过减弱结肠中炎症细胞因子的表达以及减少CD4+T细胞的募集而改善溃疡性结肠炎的免疫系统紊乱。本发明拓宽了苦瓜多糖的应用领域,为苦瓜多糖在制备溃疡性结肠炎治疗药物方面的临床应用提供了实验依据,具有良好的应用前景和巨大的潜在价值和社会意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及苦瓜多糖在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的应用及其药物制剂。
背景技术
溃疡性结肠炎是结肠黏膜层与黏膜下层的连续性炎症,可以通过改变肠道菌群的组成、削弱肠道黏膜的屏障功能并增殖毒性细菌来产生,该炎症甚至导致结肠癌。溃疡性结肠炎的发病与环境、遗传和免疫因素有关,其发病率及患病率在全球范围内逐年上升。尽管致死率不高,但是数以百万计的患者遭受着溃疡性结肠炎反复发作的折磨,对医疗系统造成极大的负担。
葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)诱导的溃疡性结肠炎模型是一种简单且重复性好的动物模型,如今被广泛应用于溃疡性结肠炎的基础研究中。DSS诱导的结肠炎症与溃疡性结肠炎在人体中的表现十分类似,都是通过肠上皮细胞损伤和黏膜层的破坏,导致肠腔内细菌及促炎物质进入黏膜或黏膜下层,从而引发炎症反应。
目前,常见的溃疡性结肠炎治疗药物,例如氨基水杨酸制剂、糖皮质激素和免疫调节剂等,这些药物已经显示出了严重的副作用,如会产生骨髓抑制、骨质疏松、代谢障碍、影响肾功能和肝功能等。因此,治疗溃疡性结肠炎需要将疗效与安全性相结合,寻找毒副作用更小的替代药物。
苦瓜是中药中常用的药材,具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、降血脂和抗糖尿病等作用,是一种拥有巨大开发潜力的食物。苦瓜的多糖提取物——苦瓜多糖(Momordica CharantiaPolysaccharid,MCP)具有抗菌、抗氧化、调节和提高机体免疫力、激活或促进抗体补体的生成、诱生干扰素、促进胃溃疡愈合和修复等多种功效,作为生物活性成分而成为近年来天然药物的研究热点之一,但是关于苦瓜多糖在改善溃疡性结肠炎方面的应用并未有文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供苦瓜多糖在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的应用及其药物制剂,为进一步开发针对溃疡性结肠炎的药物提供重要的数据。
为实现上述目的,一方面本发明提供苦瓜多糖在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
其中,所述溃疡性结肠炎是由葡聚糖硫酸钠诱导的。
进一步的,所述苦瓜多糖的具体应用方式为:(1)通过恢复体重和粪便粘稠度及减少出血,降低疾病活动指数而改善肠炎;(2)通过修复结肠组织的黏膜屏障功能,保护被炎症损伤的肠道;(3)通过减弱结肠中炎症细胞因子的表达以及CD4+T细胞和中性粒细胞的募集,改善溃疡性结肠炎的免疫系统紊乱。
优选的,所述苦瓜多糖的用量为100mg苦瓜多糖/kg体重。
另一方面本发明还提供一种治疗溃疡性结肠炎的药物制剂,包括(1)有效量的作为活性成分的苦瓜多糖,(2)选择性的药学上可接受的载体。
优选的,所述药物剂型为胶囊剂、片剂、散剂、口服液、丸剂、酊剂、糖浆剂或注射剂。
动物实验说明,MCP能够有效改善由于结肠炎导致的体重减轻、腹泻和血便,改善结肠炎造成的结肠损伤;通过H&E染色,MCP可以保护肠黏膜上皮组织,有效缓解DSS诱导引起的严重结肠炎;通过检测小鼠血清中FITC-葡聚糖的荧光强度,MCP可以改善结肠粘膜屏障功能;通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和RT-qPCR分析可知,MCP具有降低肠道内炎性细胞因子表达的作用,从而改善结肠炎的病情;MCP治疗减少了CD4+T细胞的募集,对DSS引起的结肠免疫系统紊乱有明显的改善作用。
本发明采用H&E染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、RT-qPCR及流式细胞术分析等手段分别探讨苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠结肠炎模型肠道组织、黏膜屏障、免疫系统的影响。实验结果表明,苦瓜多糖具有恢复结肠组织上皮细胞完整性、愈合黏膜屏障、保护肠道等功效,从而减轻DSS诱导的小鼠结肠炎的作用。本发明拓宽了苦瓜多糖的应用领域,为苦瓜多糖在制备溃疡性结肠炎治疗药物方面的临床应用提供了实验依据,具有良好的应用前景和巨大的潜在价值和社会意义。
附图说明
图1为小鼠结肠炎模型的建立过程流程图;
图2为苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠的体重对比图;
图3为苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠的结肠组织黏膜宏观对比图;
图4为苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠的结肠长度对比图;
图5为苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠的血清中FITC-葡聚糖含量对比图;
图6为苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠的结肠组织切片的H&E染色对比图;
图7为苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠的结肠组织病理学评分比较图;
图8为苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠结肠内炎性因子的蛋白水平对比图;(A)TNF-α,(B)IL-1β;
图9为苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠结肠内炎性因子的mRNA水平对比图;(A)TNF-α,(B)IL-1β;
图10是苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠体内免疫紊乱的影响示意图(其中,A:CD4+T细胞百分比比较图,B:CD4+T细胞计数比较图,C:中性粒细胞百分比比较图,D:中性粒细胞计数比较图,E:巨噬细胞百分比比较图,F:巨噬细胞计数比较图)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备,以下实施例所用试剂盒材料均为市购。
以下实施例中所涉及的苦瓜多糖,均通过以下方法提取得到:
将新鲜苦瓜片放入温度控制在50℃的干燥箱内进行干燥脱水处理,干燥后的苦瓜片再用研磨器粉碎,过0.38mm筛网得到苦瓜粉。苦瓜粉末用纯度为80%的乙醇热水浴回流浸提,料液比(g/ml)为1:3,反应温度为80℃,反应时间为2h。将浸提后的苦瓜粉再抽滤、真空干燥后加水浸泡。随后将加水浸泡后的苦瓜粉末在水浴中浸提,离心取上清液。将上清液浓缩后用酒精沉淀,冷冻离心,用丙醇和乙醇洗涤,再次干燥后溶解、透析。最后冻干,得到纯度99%的苦瓜多糖。
一、实验步骤
以下实施例中所涉及的小鼠结肠炎模型的建立均采用以下过程:
实验动物:年龄为6-8周的雄性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2007-0001。
如图1所示,将小鼠随机分为三组:正常组(NC)、DSS组和给药组(DSS+MCP);DSS+MCP组的小鼠口服灌胃苦瓜多糖治疗16天(100 mg/kg/天),NC组和DSS组的小鼠只口服无菌水(100 μL/天);从第8天开始,在DSS组和DSS+MCP组小鼠的饮水中加入2%的DSS(36~50kDa,加拿大MP生物医学公司),诱导实验小鼠发生结肠炎,持续8天。第16天,牺牲所有小鼠,收集所有小鼠的结肠组织和血清。将结肠中间部分用4%甲醛固定,进行组织学观察。血清和剩余的结肠组织在-80℃下保存,为后续实验分析提供材料。
以下实施例中所涉及的数据处理均按以下方法统计:
使用GraphPad Prism(GraphPad软件)进行统计分析。数据以平均值±SEM表示。根据数据是否为正态分布,使用学生t检验或Mann-Whitney检验评估两组之间的比较。多组间的统计学意义采用单因素多重方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis检验。统计学意义水平设定为p<0.05。
二、实验结果
1、苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠体重及DAI评分的影响
用于评估溃疡性严重程度的DAI是基于体重下降百分比(0:不下降,1:1-5%,2:5-10%,3:10-20%,4:>20%)、大便稠度(0:正常,2:大便稀度,4:腹泻)和大便出血(0:无血,2:隐血,4:出血)的综合评分。
从图2可以看出,在16天的实验过程中,DSS+MCP组小鼠的体重下降比例较低,粪便稀度和出血量较少,DAI评分也相应低于未进行苦瓜多糖治疗的DSS组小鼠。一般认为,DSS诱发的结肠炎最突出的特征是体重减轻和腹泻、血便,而我们实验中经过DSS+MCP组的小鼠这些症状明显缓解,说明MCP有效改善了DSS诱发的结肠炎。
2、苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠结肠组织黏膜屏障功能的影响
(1)结肠长度的影响
如图3-4所示,与NC组相比,DSS组和DSS+MCP组的结肠长度均有所缩短, DSS+MCP组的结肠长度比DSS组长,与NC组接近,这表明MCP可有效改善结肠炎造成的结肠损伤。
(2)结肠组织切片染色结果影响
组织切片准备:将上述固定在4%甲醛中的结肠用石蜡包埋处理,然后切开,用苏木精和伊红(H&E)染色。在光学显微镜下观察结肠的组织学损伤。我们根据炎症浸润程度(0-5)、隐窝损伤(0-4)、溃疡(0-3)和是否存在水肿(0或1)对这些染色切片进行评分。
通过光镜下结肠组织切片的H&E染色,染色结果如图6所示,NC组的结肠组织没有损伤和炎症的迹象;DSS组的结肠标本则表现为明显的结肠隐窝消失,上皮细胞不完整,黏膜下层和肌层水肿,炎症细胞浸润;在DSS+MCP组的切片中,标本表现出较少的结肠隐窝消失和炎症细胞浸润,包括黏膜层和肌肉层的水肿也明显低于DSS组。
从图7的组织病理评分中也可以看出,DSS+MCP组的评分较DSS组有所降低。因此,MCP可以保护肠黏膜上皮组织,有效缓解DSS诱导引起的严重结肠炎。
(3)肠黏膜通透性的影响
在实验的最后一天(第16天),我们给三组小鼠口服FITC-葡聚糖,检测小鼠血清中FITC-葡聚糖的荧光强度,以评价小鼠的肠黏膜通透性。
从图5中我们可以发现,与DSS组相比,DSS+MCP组的小鼠血清中FITC-葡聚糖含量明显降低,这意味着较少的FITC-葡聚糖从肠黏膜扩散到血液中,这是MCP治疗可以改善DSS损伤的结肠粘膜屏障功能的证据之一。
3、苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠结肠内炎性因子的影响
酶联免疫吸附测定(ELISA):称取上结肠组织,用缓冲液均质,然后以10000 rpm/min离心10分钟。根据厂家说明,用ELISA试剂盒(Neobioscience,中国天津)收集上清液中提取的总蛋白,测定TNF-α和IL-1β的表达,用450nm微孔板读数仪(Bio-Rad iMARK,美国)读取结果,结果如图8所示。
RT-qPCR分析:根据厂家协议,用总RNA提取试剂盒(Solarbio,中国北京)提取下结肠样品中的总RNA,采用氯化锂法纯化。根据厂家方案,用UltraSYBR混合物(Cwbio,中国北京)和特异性引物进行qPCR(Roche Light Cycler 480 II,USA)定量分析mRNA,结果如图9所示。
如图8-9所示,与正常组相比,DSS组的促炎性细胞因子(TNF-α和IL-1β)的蛋白水平和mRNA水平明显增加,而DSS+MCP组中这些观察到的细胞因子的蛋白水平和mRNA水平明显降低,由此这表明MCP具有降低肠道内炎性细胞因子表达的作用,从而改善结肠炎的病情。
4、苦瓜多糖对DSS诱导的小鼠体内免疫紊乱的作用
CD4+T细胞在溃疡性结肠炎的免疫发病机制中起着关键作用,与溃疡性结肠炎的发展密切相关。CD4+T细胞会诱导各种促炎因子如IFN-γ和TNF-α的产生,从而促进溃疡性结肠炎的进一步进展和加重。溃疡性结肠炎患者会释放大量的炎症因子,TNF-α、IL-1β等促炎症因子的高表达又会促进中性粒细胞的产生,进而产生中性粒细胞胞外陷阱(NETs)。过多的NETs会导致炎症因子的募集,从而使体内炎症程度增加,扰乱免疫系统,形成恶性循环。同时,巨噬细胞是机体免疫反应中具有强大的抗菌、抗炎和组织修复功能的重要细胞群,对溃疡性结肠炎患者的康复极为重要。因此,我们在实验中采用流式细胞仪分析大肠固有层中CD4+T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的比例和数量,研究苦瓜多糖对小鼠免疫系统的影响。
如图10(A和B)所示,DSS+MCP组中CD和CD双阳性结果比例仅比正常组高4.6%,而DSS组比NC组高36.2%。DSS+MCP组的CD3+CD4+T细胞计数结果明显低于DSS组,苦瓜多糖能明显降低DSS诱导的溃疡性结肠炎中CD4+T细胞的异常增加。
如图10(C和D)所示,DSS+MCP组中Ly6G和CD11b双阳性率比正常组高0.32%,DSS组比NC组高0.67%。计数结果显示,DSS+MCP组的中性粒细胞计数低于DSS组,但中性粒细胞的下降不如CD4+T细胞明显。由此可知,苦瓜多糖主要通过抑制CD4+T细胞增殖和分化的途径来调节小鼠免疫系统紊乱。
如图10(E和F)所示,与DSS组相比,DSS+MCP组的F4/80和CD11b双阳性率增加了0.012%,巨噬细胞计数结果较DSS组增加。
由上分析可知,MCP治疗减少了CD4+T细胞,对DSS引起的结肠免疫系统紊乱有明显的改善作用。
动物实验说明,MCP能够有效改善由于结肠炎导致的体重减轻、腹泻和血便,改善结肠炎造成的结肠损伤;通过H&E染色,MCP可以保护肠黏膜上皮组织,有效缓解DSS诱导引起的严重结肠炎;通过检测小鼠血清中FITC-葡聚糖的荧光强度,MCP可以改善结肠粘膜屏障功能;通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和RT-qPCR分析可知,MCP具有降低肠道内炎性细胞因子表达的作用,从而改善结肠炎的病情;MCP治疗减少了CD4+T细胞,对DSS引起的结肠免疫系统紊乱有明显的改善作用。综上所述,苦瓜多糖可以用于制备治疗溃疡性结肠炎药物。
Claims (3)
1.苦瓜多糖在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的应用,所述苦瓜多糖的具体应用方式为:(1)通过恢复体重和粪便粘稠度及减少出血,降低疾病活动指数;(2)通过修复结肠组织的黏膜屏障功能,保护炎症损伤的肠道;(3)通过减弱结肠中炎症细胞因子的表达以及CD4+T细胞的募集,改善溃疡性结肠炎的免疫系统紊乱。
2.根据权利要求1所述的苦瓜多糖在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的应用,其特征在于,所述溃疡性结肠炎是由葡聚糖硫酸钠诱导的。
3.根据权利要求1所述的苦瓜多糖在制备用于治疗溃疡性结肠炎药物中的应用,其特征在于,所述苦瓜多糖的用量为100mg苦瓜多糖/kg体重。
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