CN109731007B - 菟丝子多糖在制备治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及菟丝子多糖在制备治疗5‑氟尿嘧啶所致肠炎的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明的菟丝子多糖能改善5‑氟尿嘧啶所致的体重减轻、腹泻、绒毛高度降低、隐窝损伤，降低TNF‑α、IL‑1β、IL‑6炎症因子水平，降低细胞凋亡率，降低凋亡蛋白casapse‑3、Bax的表达水平，升高抗凋亡蛋白Bcl‑2的表达水平，对修复5‑氟尿嘧啶所致的肠黏膜损伤有显著疗效，能用于制备治疗5‑氟尿嘧啶所致肠炎的药物。

Description

菟丝子多糖在制备治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物中的应用

技术领域

本发明涉及菟丝子多糖在制备治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

5-氟尿嘧啶(5-FU)是临床上治疗胃肠道肿瘤常用的化疗药物，它通过阻断尿嘧啶向胸腺嘧啶的转化来发挥其细胞毒性作用，从而影响DNA的合成和修复；除了作用肿瘤细胞外，5-FU对正常细胞也产生了影响，使其结构和功能受损，进而扰乱机体正常的免疫系统。肠黏膜炎(IM)即是5-FU的主要副作用之一。据报道，约40％接受5-FU化疗的癌症患者中有IM；在接受高剂量5-FU方案进行干细胞移植治疗的患者中，有超过60％的患者出现了IM的临床表现。所以，IM作为化疗的主要副作用，不仅限制了5-FU在癌症治疗方面的疗效，也严重影响了患者的生活质量。很多研究发现凋亡及炎症因子是5-FU所致黏膜炎发病机制中的关键部分，同时，使用对肠道黏膜有毒性作用的药物治疗可能会打乱凋亡家族中促凋亡因子(如Bax)和抗凋亡因子(如Bcl-2)之间的正常平衡，而我们认为凋亡则是IM早期病理阶段的中心环节，从而导致肠道黏膜受损；此外，由化疗激活的转录因子会进一步增加促炎症因子的产生，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素(IL-1β、IL-6)，进而加剧5-FU化疗所致的小肠黏膜损伤。

已有研究表明，与目前在用的治疗药物相比，一些特殊的中药或食物对5-FU引起的肠黏膜炎具有较好的缓解作用。中药菟丝子(Cuscuta chinensis Lam,CCL)一直被用来改善肝肾疾病和性功能，也被用来治疗衰老和流产，经药物分析，菟丝子含有黄酮类、生物碱、木质素和苷类化合物等多种化学成分，可用于治疗多种疾病；目前已对菟丝子的一些化学成分进行了药物研究，但关于从菟丝子中分离出的一种多糖(PCCL)对5-FU诱导IM疗效的研究还较为有限。已有实验表明，从传统中药五倍子中提取的多糖可以通过激活抗炎症因子进而有效治疗小鼠模型中5-FU所致的肠黏膜炎。而关于菟丝子多糖对肠道黏膜炎的疗效还尚未明确。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供菟丝子多糖在制备治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物中的应用，本发明的菟丝子多糖对修复5-氟尿嘧啶所致的肠黏膜损伤有显著疗效。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：菟丝子多糖在制备治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物为改善5-氟尿嘧啶所致的体重减轻、腹泻、绒毛高度降低、隐窝损伤的药物。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物为降低TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-1β(白细胞介素1β)、IL-6(白细胞介素6)炎症因子水平，降低细胞凋亡率的药物。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物为降低凋亡蛋白casapse-3、Bax的表达水平，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平的药物。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述菟丝子多糖的单糖组成成分包括甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述菟丝子多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)将菟丝子干粉置于蒸馏水中混匀提取，得提取物；

(2)将步骤(1)所得的提取物过滤离心，浓缩上清液，加入乙醇沉淀，将沉淀溶解于蒸馏水中，冷冻干燥，得菟丝子多糖。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述菟丝子多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)将菟丝子干粉(200g)置于1.6L的蒸馏水中混匀，在98～100℃下提取4小时，重复2次，得提取物；

(2)将步骤(1)所得的提取物置于1000xg(30min,4℃)下过滤离心，室温下将上清液浓缩为100ml，加入95％乙醇，按1:4.3的比例沉淀；沉淀24小时后，即得离心样品，将沉淀溶解于100ml蒸馏水中，沉淀过程重复三次；然后用sevage试剂(异戊醇:氯仿＝1:4)，经冷冻干燥，得菟丝子多糖。

第二方面，本发明提供了一种治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物，所述药物含有菟丝子多糖。

作为本发明所述治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物的优选实施方式，所述药物还含有药学上可接受的载体。

作为本发明所述治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物的优选实施方式，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、粉剂或注射剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的菟丝子多糖能改善5-氟尿嘧啶所致的体重减轻、腹泻、绒毛高度降低、隐窝损伤，降低TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子水平，降低细胞凋亡率，降低凋亡蛋白casapse-3、Bax的表达水平，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，对修复5-氟尿嘧啶所致的肠黏膜损伤有显著疗效，能用于制备治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物。

附图说明

图1为菟丝子多糖的高效液相色谱分析图。

图2为菟丝子多糖对5-氟尿嘧啶干预后小鼠体重和腹泻影响的统计图；其中，A为菟丝子多糖对小鼠体重影响的统计图，B为菟丝子多糖对小鼠腹泻影响的统计图。

图3为菟丝子多糖对小鼠空肠绒毛高度及隐窝长度缩短影响的统计图；其中，A为H&E染色图，B为绒毛高度的统计图，C为隐窝长度的统计图，D为绒毛高度与隐窝长度比的统计图。

图4为菟丝子多糖对空肠TNF-α、IL-6和IL-1β生成影响的统计图；其中，A为菟丝子多糖对空肠TNF-α生成影响的统计图，B为菟丝子多糖对空肠IL-6生成影响的统计图，C为菟丝子多糖对空肠IL-1β生成影响的统计图。

图5为菟丝子多糖对5-氟尿嘧啶诱导肠隐窝细胞凋亡影响的统计图；其中，A为TUNEL检测图，B为菟丝子多糖对凋亡细胞影响的统计图。

图6为菟丝子多糖对凋亡蛋白casapse-3、Bax、Bcl-2蛋表达的影响；其中，A为caspase-3表达的图像，B为caspase-3半定量表达的数据统计图，C为Bax表达的图像，D为Bax表达的数据统计图，E为Bcl-2表达的图像，F为Bcl-2表达的数据统计图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

注射用药品5-氟尿嘧啶(5-FU)，购自上海徐东海普制药有限公司，使用前用生理盐水稀释至5mg/mL。本发明实施例中使用的试剂，若无特别说明，均通过商业渠道采购而得。本发明实施例中使用的测试方法，若无特别说明，均为本领域的常用方法。

本发明实施例使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，将计量数据表示为平均值±标准差，统计学方法采用使用单因素方差分析(ANOVA)。使用Levene检验进行方差一致性检验。当方差齐时，Bonferroni的测试用于各两组间比较；而当方差不齐时，使用Dunnett T3方法进行检验。P<0.05，P<0.01或P<0.001表示统计学上显著差异。

实施例1菟丝子多糖(PCCL)的制备

菟丝子(CCL)由广东和翔制药有限公司提供。将菟丝子干粉(200g)置于1.6L的蒸馏水中混匀，在温度约98～100℃下提取4小时，重复2次。后将整个提取物置于1000xg(30min，4℃)下过滤离心。在室温下，将上清液浓缩为100ml，加入95％乙醇，按1：4.3的比例沉淀。沉淀24小时后，即得到如前所述的离心样品，且将沉淀溶解于100ml蒸馏水中，此沉淀过程需重复三次。然后用sevage试剂(异戊醇:氯仿＝1:4)，经冷冻干燥，制得菟丝子多糖。从原始原料中得到的PCCL约占17.6％。采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准，测定PCCL粗糖含量为92.34％。最后将提取的粉末在无菌蒸馏水溶解，过滤(0.22-μm-mesh滤波器)，待用。

实施例2菟丝子多糖的成分测定

在进行高效液相色谱分析前，将1ml 4mol/L三氟乙酸与1ml 1g/L PCCL在110℃下水解2h，冷却至室温。将溶液放置在70℃蒸发干燥。加入甲醇三次，除去三氟乙酸的残留量。干燥后，用1ml水溶解溶液。再将氢氧化钠(200μL；0.3mol/L)和PMP甲醇溶液(200μL；0.5mol/L)添加到200μL的溶液中。然后将其放置在一个70℃的水槽中冷却30分钟，冷却到室温，加入200μL 0.3mol/L的盐酸溶液、1.2mL水和2mL氯仿。将混合物涡旋60s、离心(1500xg；5min)。上清液置于0.45μm过滤膜中过滤。

本试验用Luna C18柱进行高效液相色谱分析。流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.8)：乙腈(82:18)，流速1.0mL/min，检测波长254nm，注射量是5μL，运行温度是30℃。高效液相色谱分析图如图1所示。

由图1可知，与混合的单糖参考样品比较证实，PCCL水解产物测定的三个特征峰分别对应于下列单糖：甘露糖、葡萄糖和半乳糖；经测量，其浓度分别为0.5668mg/mL，0.077mg/mL和0.1678mg/mL。其中，1为PMP(PubChem CID:4021)；MW:174.203g/mol.MF:C₁₀H₁₀N₂O；2为甘露糖(PubChem CID:18950)；MW:180.156g/mol.MF:C₆H₁₂O₆；3为葡萄糖(PubChem CID:107526)；MW:180.156g/mol.MF:C₆H₁₂O₆；4为半乳糖(PubChem CID:6036)；.MW:180.156g/mol MF:C₆H₁₂O₆。

实施例3菟丝子多糖对5-FU治疗期间体重减轻和腹泻评分的影响

本实验动物为SPF级C57BL/6小鼠、7周、雄性、体重18～22g，购自广东省医学实验动物中心。在实验之前，让所有小鼠适应性喂养7天。将小鼠安置在笼子中，给予食物和水，温度保持在22±1℃，且在12小时光照/黑暗循环的条件下饲养。所有方法均通过广州体育科学研究所动物伦理标准认可。同时，将动物随机分成三组：对照组(control，PBS)、5-FU组(5-FU)、5-FU+PCCL组(5-FU+PCCL)。给予对照组的PBS的体积等于给予5-FU+PCCL组的PCCL的体积。除对照组外，其余2组均腹腔内注射5-FU(50mg/kg)，每日1次，连续5日。每天灌胃给于PCCL(20mg/kg)，每日2次，持续6天(第0～5天)。体重以初始体重的百分比示出，并使用四级进行评定(0，1，2，3)。对腹泻的严重程度进行评分。对每个实验组8～10只小鼠进行Mean±SD分析；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001(与5-FU组相比)。

从实验第0天开始每天记录腹泻分数和实际体重。腹泻严重程度评分采用：0表示正常(大便浓度正常)；1表示轻度(稀便)；2表示中度(明显腹泻伴肛周污渍)；3表示严重(严重腹泻或血便，伴尾巴污渍)。体重变化是通过计算当天实际体重占第0天体重的百分比来评判。试验结果如图2所示，其中，A为对小鼠体重的影响，B为对小鼠腹泻的影响。

由图2可知，与对照组相比，5-FU组小鼠的体重明显减轻，从第1日到第5天每日体重有明显的下降(P<0.05，图2A)；同时，从第4天开始，与5-FU组相比，在5-FU基础上给于PCCL治疗组的小鼠体重有显著上涨(P<0.001，图2A)。此外，在腹泻评分方面，5-FU干预后第2日即发现小鼠的腹泻率较对照组有显著上升(P<0.05，图2B)，且到给药第5日均具有逐日增加趋势；然而，5-FU+PCCL组小鼠的腹泻评分却明显低于5-FU组(P<0.01，图2B)，但其评分却仍然高于对照组。

实施例4菟丝子多糖对5-FU诱导小鼠小肠组织病理学改变的影响

除对照组外，其余2组对小鼠每天腹腔注射5-FU(50mg/kg)，每日1次。5-FU+PCCL组灌胃PCCL(20mg/kg)，每日2次，连续6天(0～5天)。最后一次给药处理后，将小鼠禁食12小时。实验时，用1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，打开腹腔，自空肠开始3cm的距离处开始取出约2cm的组织。将取出的组织固定，并用苏木精和伊红(H&E)染色进行组织病理学评估(放大倍数×200)。通过测量空肠绒毛的高度，隐窝的深度以及绒毛高度与隐窝深度的比率来评估形态学变化。对每个实验组8～10只小鼠进行Mean±SD分析；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001(与5-FU组相比)。试验结果如图3所示。

由图3可知，通过显微镜观察不同实验组小肠病理学变化，对照组肠绒毛排列整齐，小肠隐窝深度均匀，黏膜表层上皮分布连续且完整；连续给予5-FU干预后，小鼠小肠绒毛的形态发生显著变化，表现为萎缩、脱落甚至严重损伤，此外肠绒毛排列较为紊乱；然而，与5-FU组相比，5-FU+PCCL组的小肠绒毛却表现为排列有序，且通过PCCL治疗后，隐窝损伤也得到修复，空肠绒毛长度/隐窝深度比值同样有所升高，且差异具有显著性(P<0.05)。

实施例5菟丝子多糖对炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

有研究发现，促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的失调可能是发病炎症性肠病机制中的一个重要环节，其中，促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6在肠道炎症发病中起着及其重要的作用。

将空肠组织(50mg)置于2ml PBS中匀浆并离心(1500xg，15min)，保留上清液用于生化分析。使用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(购自R&D Systems，Minneapolis，USA)通过测量540nm处的OD值来测定细胞因子(TNF-α，IL-6和IL-1β)浓度。

试验结果如图4所示，其中，A为TNF-α浓度，B为IL-6浓度，C为IL-1β浓度。对每个实验组8～10只小鼠进行Mean±SD分析；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001(与5-FU组相比)。

由图4可知，与对照组相比，5-FU组小鼠空肠黏膜组织中检测到TNF-α、IL-1β、IL-6浓度明显升高(P<0.001)，而通过PCCL治疗后，与5-FU组相比，5-FU+PCCL组各炎症因子水平均有显著下降：TNF-α(P<0.001，图4A)、IL-6(P<0.001，图4B)、IL-1β(P<0.01，图4C)，这说明PCCL能显著抑制5-FU引起的小肠空肠组织各炎症因子含量水平升高。

实施例6菟丝子多糖对5-FU诱导的小肠组织凋亡的影响

为了探索PCCL对小鼠小肠黏膜的保护作用机制是否与细胞凋亡有关，本试验运用TUNEL法来检测空肠组织细胞凋亡水平。

TUNEL检测方法：使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche，Basel，Switzerland)进行TUNEL检测，实验步骤根据试剂盒的说明书进行。将石蜡包埋的组织切片在二甲苯中洗涤(2×15min)，之后用梯度乙醇溶液(100％，95％，85％和75％)及ddH₂O(2×5min)水合。将载玻片与蛋白酶K一起温育(30min，37℃)。用PBS(x3)洗涤后，将载玻片与50TUNEL反应混合物(1h，3℃)在潮湿黑暗的载玻片盒中孵育。最后，用PBS洗涤载玻片(每次3×5min)。在四个随机选择的视野中计数阳性染色的细胞，在荧光显微镜下测定凋亡细胞与健康细胞的比例。计算阳性细胞数/总细胞数，即为细胞凋亡率。

对小鼠腹腔注射5-FU(50mg/kg)，注射前30分钟及注射后8h进行PCCL灌胃(20mg/kg)2次。在最后一次5-FU注射24小时后对小鼠进行解剖，切除空肠，切片，并进行TUNEL分析(TUNEL后×400的切片)。计数凋亡细胞数，对每个实验组8～10只小鼠进行Mean±SD分析；*，P<0.01；#，P<0.001(与5-FU组相比)。试验结果如图5所示。

由图5可知，对照组中，很少检测到TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞；而在5-FU组，发现大量TUNEL阳性细胞(P<0.01，图5A)，通过PCCL治疗后，5-FU+PCCL组与5-FU组相比，凋亡细胞数量显著减少，且差异具有统计学意义(P<0.001，图5B)。

实施例7菟丝子多糖对凋亡蛋白casapse-3、Bcl-2、Bax表达的影响

免疫组化法：将石蜡包埋的组织切片(4μm厚)脱蜡并通过一系列二甲苯和梯度乙醇溶液再水合。在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中实现抗原修复。将缓冲液置于微波炉中20min，然后与3％H₂O₂一起温育以阻断内源性过氧化物酶活性。将载玻片在4℃下与原代兔单克隆抗caspase-3抗体(1:500；Asp175；Cell Signaling Technology，Beverly，USA)，兔单克隆抗Bax抗体(1：200；E63；Epitomics，Burlingame，USA)和兔单克隆抗Bcl-2(1：200；50E3；Cell Signaling Technology，Beverly，USA)，将其放置在一抗稀释缓冲液(P0103；Beyotime，China)中稀释。与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔免疫球蛋白G(074-1506；KPL，Beijing，China)在室温下孵育50分钟后，用过氧化物酶/DAB ChemMate DAKO EnVision检测试剂盒(Dako Citomation，USA)对玻片进行处理。染色后，每个载玻片随机选择6个高倍视野(×400)，使用专业图像分析软件(Image-Pro Plus；Media Cybernetics，Rockville，USA)对每个视野中caspase-3，Bcl-2-和Bax阳性细胞的平均比率进行计数。

为了进一步探讨PCCL对5-FU介导的细胞凋亡的保护机制，本实验运用免疫组化法对几个关键的凋亡蛋白进行检测：casapse-3、Bcl-2、Bax。用免疫荧光染色法检测空肠caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平。阳性细胞的数量和染色强度用半定量方法评估，如方法部分所述。试验结果如图6所示，其中，A显示各实验组caspase-3表达的图像；B显示caspase-3半定量表达的数据(mean±SD)；C显示各实验组Bax表达实例的图像；D显示Bax表达的数据(mean±SD)；E显示各实验组Bcl-2表达的图像；F显示Bcl-2表达的数据(mean±SD)。与5-FU组相比，数据通过方差分析及Bonferroni’s检验、*，P<0.05、**，P<0.01、***，P<0.001。

由图6可知，与对照组相比，5-FU组中凋亡蛋白casapse-3、Bax表达水平显著上升，而Bcl-2表达有所下降(P<0.001)；然而，与5-FU组相比，加入PCCL治疗后的小鼠小肠组织中凋亡蛋白casapse-3、Bax表达水平明显下调，伴随Bcl-2表达上调，其差异有统计学意义(P<0.01)。充分说明PCCL对5-FU所致的肠炎修复作用是通过抑制黏膜细胞凋亡来实现的。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.菟丝子多糖作为唯一活性成分在制备治疗5-氟尿嘧啶所致肠炎的药物中的应用，其特征在于，所述菟丝子多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)将200g菟丝子干粉置于1.6L的蒸馏水中混匀，在98～100℃下提取4小时，重复2次，得提取物；

(2)将步骤(1)所得的提取物置于1000×g下过滤离心，室温下将上清液浓缩为100ml，加入95％乙醇，按1:4.3的比例沉淀；沉淀24小时后，即得离心样品，将沉淀溶解于100ml蒸馏水中，沉淀过程重复三次；然后用sevage试剂，经冷冻干燥，得菟丝子多糖；

其中，所述提取物过滤离心的温度为4℃，过滤离心的时间为30min；

所述sevage试剂为异戊醇：氯仿＝1:4。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为改善5-氟尿嘧啶所致的体重减轻、腹泻、绒毛高度降低、隐窝损伤的药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为降低TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子水平，降低细胞凋亡率的药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为降低凋亡蛋白casapse-3、Bax的表达水平，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平的药物。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述菟丝子多糖的单糖组成成分包括甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

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