CN116947794B - 一种四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物及其制备方法和应用、药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物及其制备方法和应用、药物组合物及其应用。本发明提供的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物（Artemilavanin F）抗肿瘤活性高，可抑制胃癌AGS、结肠癌HCT‑116、胰腺癌PANC‑1细胞增殖，诱导G2/M期细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡，具有抗胃癌、结肠癌、胰腺癌增殖的活性；化合物Artemilavanin F还可抑制胃癌AGS、结肠癌HCT‑116、胰腺癌PANC‑1细胞划痕融合和细胞迁移，具有抑制胰腺癌侵袭转移的活性，在制备治疗消化道肿瘤、预防和治疗消化道肿瘤侵袭转移的药物和药物组合物中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物及其制备方法和应用、药物组合物及其应用。
背景技术
消化道肿瘤是指食管癌、胃癌、肝癌、肠癌、胰腺癌、胆管癌等与消化相关的器官癌症，也可以见于其他组织器官肿瘤转移到消化道，并在局部生长。消化道肿瘤与高脂等饮食习惯和现代生活节奏改变有关，而且随着人口老龄化加剧，消化道肿瘤的患病人数将持续增加。因此，针对消化道肿瘤治疗的新型肿瘤抑制剂研发已成为肿瘤治疗领域迫切需要解决的问题。
天然产物具有化学结构多样性和生物活性多样性的特点，是抗肿瘤药物先导化合物的重要来源。在1981~2019年间上市的小分子药物中，有1/3直接或间接来源于天然产物（Journal of Natural Products,2020,83,770-803)。大量研究证实，中药和传统药用植物具有抗肿瘤作用，其中天然产物抗肿瘤活性成分的发掘具有重要意义。蒿属（ArternisiaL.）隶属于菊科（Compositae）春黄菊族（Anthemideae），全球有350种以上，我国有186种（胡厚才等，现代药物与临床，2012）。该属药用植物多具有清热解毒、抗菌消炎、祛风除湿、通经活络、活血、止血等功效，在国内外民间药方中广泛应用于疟疾、肝炎、癌症、炎症及感染（含真菌、细菌、病毒感染）等疾病的治疗及预防。迄今为止，从蒿属植物中分离得到的与胃病治疗有关的药理成分包括黄酮类化合物（异泽兰黄素、棕矢车菊素等）及倍半萜内酯类化合物（dehydroleucodine、蒿甲醚、二氢表脱氧青蒿乙素B及去氧青蒿素等）。研究表明，蒿属植物中异泽兰黄素具有显著促胃癌细胞凋亡的活性，通过上调肿瘤抑制蛋白p53和p21的表达水平，抑制与癌细胞增殖分化相关的信号通路中ERK1/2、Akt活性。蒿甲醚对胃癌细胞株SGC-7901和MKN-45以及胰腺癌细胞株BXPC-3和SW-1990均具有体外杀伤作用，其作用机制与阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡有关。倍半萜类化合物是蒿属植物中的重要活性成分，如最具代表性的青蒿素（Artemisinin）不仅是公认的疟疾治疗药物，而且还具有显著抗肿瘤活性。
目前，报道的桉烷型倍半萜类化合物主要有：Acetyltabarin（参见Phytochemistry. 1999. 51: 995-997）、Vulgarin(Helv. Chim. Acta. 2010. 93: 1344-1349）、8α-hydroxy-11β,13-dihydrobalchanin（参见Phytochemistry. 1999. 51: 995-997）、11β,13-dihydrosantamarin（参见Phytochemistry. 2013, 9: 90-94）、anthemidin（参见Epstein and Jenkins, 1979）、11α,13-dihydroyomogin（参见Phytochemistry. 27:1113-1120）、8α-acetoxy-1β-hydroxyeudesm-3-en-5α,6β,7α,11βH-12,6-olide（参见Phytochemistry. 1999. 51: 995-997）、Acetylartemisin（参见Serkerov, 1982)和8-acetylartapshin（参见Mustakerova et al., 2002）。然而，上述化合物对于消化道肿瘤的抗肿瘤活性低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物及其制备方法和应用、药物组合物及其应用。本发明提供的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物对消化道肿瘤的抗肿瘤活性高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。
本发明提供了一种四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物，具有式I所示的结构：
式I。
本发明提供了上述技术方案所述四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
利用乙醇水溶液对野艾蒿进行醇提，得到醇提物；所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为40~100%；
将所述醇提物溶解于水中，进行乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取物；
将所述乙酸乙酯提取物进行第一硅胶柱层析，得到Fr2组分；所述第一硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-丙酮混合溶液，所述洗脱剂中石油醚和丙酮的体积比为9:1~5:5；
将所述Fr2组分进行MCI-gel色谱柱分级，得到Fr2.3组分；所述MCI-gel色谱柱分级采用的洗脱剂为40~100v/v%甲醇水溶液；
将所述Fr2.3组分进行第二硅胶柱层析，得到Fr2.3.3组分；所述第二硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂，所述洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为20:1~7:3；
将所述Fr2.3.3组分进行第三硅胶柱层析，得到Fr2.3.3.3组分；所述第三硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂，所述洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为35:1~9:1；
将所述Fr2.3.3.3组分进行重结晶，得到四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物。
优选的，所述醇提的温度为20~80℃，所述醇提的次数为2~4次，单次醇提的时间为24~72h；
所述野艾蒿的干重与单次醇提用乙醇水溶液的体积比为1kg：2~5L。
优选的，所述乙酸乙酯提取的次数为2~4次；
所述醇提物的质量与单次提取用乙酸乙酯的体积之比为1kg：4~10L。
优选的，所述第一硅胶柱层析为梯度洗脱，所述梯度洗脱过程中石油醚和丙酮的体积比依次为9:1、8:2、7:3、6:4和5:5。
优选的，所述重结晶采用的溶剂包括甲醇。
本发明提供了一种药物组合物，包括活性组分以及药学上可接受的载体和/或辅料；所述活性组分为上述技术方案所述的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物或上述技术方案所述制备方法制得的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物。
优选的，所述药物组合物的剂型包括注射剂、片剂、胶囊、丸剂或颗粒剂。
本发明提供了上述技术方案所述的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物、上述技术方案所述制备方法制得的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物或上述技术方案所述药物组合物在制备预防肿瘤的药物或治疗肿瘤的药物中的应用。
优选的，所述肿瘤包括消化道肿瘤中的应用。
本发明提供的具有式I所示结构的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物（5/3/6/5四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物，Artemilavanin F）抗肿瘤活性高，在制备治疗消化道肿瘤、预防和治疗消化道肿瘤侵袭转移的药物和药物组合物中具有很好的应用前景。
药理活性实验证明，本发明提供的具有式I所示结构的化合物Artemilavanin F可抑制胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞增殖，诱导G2/M期细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡，具有抗胃癌、结肠癌、胰腺癌增殖的活性；化合物Artemilavanin F还可抑制胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞划痕融合和细胞迁移，具有抑制胰腺癌侵袭转移的活性，可用于制备预防肿瘤术后复发和转移药物或药物组合物。
本发明提供的化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞具有肿瘤细胞毒活性，半数抑制率分别为23.58μM、15.31μM和7.30μM。化合物Artemilavanin F可抑制AGS、PANC-1、HCT-116细胞的克隆形成，在0.625~1.25μM剂量下即可显著减少肿瘤细胞克隆形成数量。
本发明提供的化合物Artemilavanin F还可引起AGS、PANC-1、HCT-116细胞周期阻滞并进一步诱导细胞凋亡。该实验结果提示，化合物Artemilavanin F具有抑制胃癌、结肠癌、胰腺癌增殖，引起癌细胞周期阻滞和凋亡的抗肿瘤活性。
本发明提供的化合物Artemilavanin F还对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞迁移抑制活性，在24h时间点时1.25~2.5μM剂量下化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、胰腺癌PANC-1和结肠癌HCT-116细胞划痕愈合即有明显抑制作用，在48h时间点时仍可观察到10μM剂量下化合物Artemilavanin F具有划痕愈合抑制作用。该结果提示，Artemilavanin F具有抑制消化道肿瘤侵袭和转移的作用，可用于预防肿瘤术后复发和转移药物或药物组合物。
本发明首次从野艾蒿中分离获得一种新型桉烷型倍半萜类化合物ArtemilavaninF，并首次鉴定了Artemilavanin F的化学结构并对其抗消化道肿瘤的药理学活性进行研究，证明该化合物Artemilavanin F为结构重排的桉烷型倍半萜类化合物。而且，本发明以野艾蒿为原料进行提取得到四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物，原料来源广泛、成本低，避免使用大量的有机原料以及复杂的制备过程，四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物的收率高，纯度高。
附图说明
图1为化合物Artemilavanin F的单晶X衍射图；
图2为化合物Artemilavanin F及其桉烷型倍半萜类似物对胰腺癌PANC-1细胞的肿瘤细胞毒活性图；
图3为化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞的肿瘤细胞毒活性图；
图4为化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞克隆形成的抑制活图；
图5为化合物Artemilavanin F对胃癌AGS细胞周期的调控作用图；
图6为化合物Artemilavanin F对结肠癌HCT-116细胞周期的调控作用图；
图7为化合物Artemilavanin F对胰腺癌PANC-1细胞周期的调控作用图；
图8为化合物Artemilavanin F对胃癌AGS细胞凋亡的诱导活性图；
图9为化合物Artemilavanin F对结肠癌HCT-116细胞凋亡的诱导活性图；
图10为化合物Artemilavanin F对胰腺癌PANC-1细胞凋亡的诱导活性图；
图11为化合物Artemilavanin F抑制胃癌AGS细胞迁移活性图；
图12为化合物Artemilavanin F抑制结肠癌HCT-116细胞迁移活性图；
图13为化合物Artemilavanin F抑制胰腺癌PANC-1细胞迁移活性图。
具体实施方式
本发明提供了一种四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物，具有式I所示的结构：
式I。
本发明提供了上述技术方案所述四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
利用乙醇水溶液对野艾蒿进行醇提，得到醇提物；所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为40~100%；
将所述醇提物溶解于水中，进行乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取物；
将所述乙酸乙酯提取物进行第一硅胶柱层析，得到Fr2组分；所述第一硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-丙酮混合溶液，所述洗脱剂中石油醚和丙酮的体积比为9:1~5:5；
将所述Fr2组分进行MCI-gel色谱柱分级，得到Fr2.3组分；所述MCI-gel色谱柱分级采用的洗脱剂为40~100v/v%甲醇水溶液；
将所述Fr2.3组分进行第二硅胶柱层析，得到Fr2.3.3组分；所述第二硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂，所述洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为20:1~7:3；
将所述Fr2.3.3组分进行第三硅胶柱层析，得到Fr2.3.3.3组分；所述第三硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂，所述洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为35:1~9:1；
将所述Fr2.3.3.3组分进行重结晶，得到四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物。
在本发明中，若无特殊说明，使用的材料和设备均为本领域市售商品。
本发明利用乙醇水溶液对野艾蒿进行醇提，得到醇提物。在本发明中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为40~100%，优选为60~100%，更优选为80~95%。在本发明中，所述野艾蒿的干重与单次醇提用乙醇水溶液的体积比优选为1kg：2~5L，更优选为1kg：2.5~4L，进一步优选为1kg：3~3.5L。在本发明中，所述醇提的温度优选为20~80℃，更优选为20~40℃，进一步优选为20~30℃；所述醇提的次数优选为2~4次，更优选为3次；单次醇提的时间优选为24~72h，更优选为30~60h，进一步优选为40~50h。
所述醇提后，本发明优选还包括将所得醇提液进行浓缩，得到醇提物。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。
得到醇提物后，本发明将所述醇提物溶解于水中，进行乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取物。在本发明中，所述醇提物与水的质量比优选为1：2~8，更优选为1：3~5。在本发明中，所述乙酸乙酯提取的次数优选为2~4次，更优选为3次。在本发明中，所述醇提物的质量与单次提取用乙酸乙酯的体积之比优选为1kg：4~10L，更优选为1kg：5~9L，进一步优选为1kg：6~7L。在本发明中，所述乙酸乙酯提取的温度优选为10~40℃，更优选为15~30℃；单次乙酸乙酯提取的时间优选为0.1~2h，更优选为0.2~1h。
得到乙酸乙酯提取物后，本发明将所述乙酸乙酯提取物进行第一硅胶柱层析，得到Fr2组分；所述第一硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-丙酮混合溶液，所述洗脱剂中石油醚（PE）和丙酮的体积比为9:1~5:5。在本发明中，所述第一硅胶柱层析优选为梯度洗脱，所述第一硅胶柱层过程中石油醚和丙酮的体积比具体优选依次为9:1、8:2、7:3、6:4和5:5；所述第一硅胶柱层析得到7个组分，记为Fr7组分~Fr7组分。
得到Fr2组分后，本发明将所述Fr2组分进行MCI-gel色谱柱分级，得到Fr2.3组分。在本发明中，所述MCI-gel色谱柱分级采用的洗脱剂为40~100v/v%甲醇水溶液，优选为50~90v/v%甲醇水溶液；所述MCI-gel色谱柱分级的洗脱方式优选为梯度洗脱，所述MCI-gel色谱柱分级采用的甲醇水溶液中甲醇的体积分数具体优选依次为40%、 50%、60%、70%、80%、90%和 100%；所述MCI-gel色谱柱分级得到9个组分，记为Fr2.1组分~Fr2.9组分。
得到Fr2.3组分后，本发明将所述Fr2.3组分进行第二硅胶柱层析，得到Fr2.3.3组分。在本发明中，所述第二硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂，所述洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为20:1~7:3；所述第二硅胶柱层析的洗脱方式优选为梯度洗脱，所述梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、15:1、9:1、8.5:1.5、8:2、7.5:2.5和7:3；所述第二硅胶柱层析得到11个组分，记为Fr2.3.1组分~Fr2.3.11组分。
得到Fr2.3.3组分后，本发明将所述Fr2.3.3组分进行第三硅胶柱层析，得到Fr2.3.3.3组分。在本发明中，所述第三硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂，所述洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为35:1~9:1。在本发明中，所述第三硅胶柱层析的洗脱方式优选为梯度洗脱，所述第三硅胶柱层析过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比具体优选依次为20:1、15:1、9:1、8.5:1.5、8:2、7.5:2.5和7:3；所述第三硅胶柱层析得到4个组分，记为Fr2.3.3.1组分~Fr2.3.3.4组分。
得到Fr2.3.3.3组分后，本发明将所述Fr2.3.3.3组分进行重结晶，得到四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物。在本发明中，所述重结晶采用的溶剂优选包括甲醇。在本发明中，所述Fr2.3.3.3组分的质量与重结晶用甲醇的体积之比优选为1g：10~100mL，更优选为1g：30~80mL，进一步优选为1g：40~50mL。在本发明中，重结晶的温度优选为0~30℃，更优选为10~25℃，进一步优选为20~25℃；所述重结晶的时间优选为0.5~96h，更优选为10~80h，进一步优选为30~72h。
本发明提供了一种药物组合物，包括活性组分以及药学上可接受的载体和/或辅料；所述活性组分为上述技术方案所述的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物或上述技术方案所述制备方法制得的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物。
在本发明中，所述载体优选包括卵磷脂、维生素E、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、吐温、表面活性剂、氧化铝、硬脂酸铝、离子交换材料、缓冲物质、山梨酸、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、羊毛脂和环糊精中的一种或几种；所述缓冲物质优选包括磷酸盐。
在本发明中，所述辅料优选包括崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、抗氧化剂、包衣剂、芳香剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种；所述崩解剂优选包括羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和海藻酸钠中的一种或几种；所述粘合剂优选包括聚维酮K30、微晶纤维素和褐藻酸钠中的一种或几种；所述填充剂优选包括无水乳糖、淀粉、葡萄糖和乳糖珠粒中的一种或几种；所述润滑剂优选包括十二烷基硫酸镁和/或硬脂酸镁。本发明对于所述赋形剂、抗氧化剂、包衣剂、芳香剂、增溶剂、香味剂、着色剂和稳定剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的赋形剂、抗氧化剂、包衣剂、芳香剂、增溶剂、香味剂、着色剂和稳定剂即可。
在本发明中，所述药物组合物的剂型优选包括注射剂、片剂、胶囊、丸剂工艺颗粒剂。在本发明中，所述药物组合物优选包括缓释制剂或控释制剂。在本发明中，所述药物组合物的给药量优选为1~100mg/天，更优选为10~50mg/天。
本发明提供的药物组合物可经口或不经过口给药，经口服给药时，首先使化合物与常规的药用辅料如赋形剂、解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式给药；非经口给药时可以注射剂、栓剂、经皮吸收制剂等形式给药。
本发明对于所述药物组合物的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的药物组合物的制备方法即可。
本发明提供了上述技术方案所述的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物、上述技术方案所述制备方法制得的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物或上述技术方案所述药物组合物在制备预防和/或治疗消化道肿瘤的药物中的应用。在本发明中，所述消化道肿瘤优选包括胃癌、结肠癌和胰腺癌中的一种或几种，更优选包括胃癌AGS、结肠癌HCT-116和胰腺癌PANC-1中的一种或几种。在本发明中，所述治疗和/或预防消化道肿瘤的药物，更优选包括预防和/或治疗消化道肿瘤侵袭转移的药物。在本发明中，所述消化道肿瘤优选包括胃癌、结肠癌和胰腺癌中的一种或几种，更优选包括胃癌AGS、结肠癌HCT-116和胰腺癌PANC-1中的一种或几种。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物及其制备方法和应用、药物组合物及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将干燥野艾蒿地上部分（6 kg）用95v/v%乙醇（单次用量20 L）在室温下醇提3次，单次醇提时间为48h，将所得提取液减压蒸馏至恒重，得到醇提物（500g）。
在醇提物（500g）中加1.5L水溶解，乙酸乙酯（单次用量3L）提取3次，将所得乙酸乙酯提取液减压蒸馏至恒重，得到乙酸乙酯提取物（250g）。
将所述乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析（石油醚:丙酮体积比依次为9:1、8:2、7:3、6:4和5:5），得到7个组分，记为Fr1组分~Fr7组分。
将所述Fr2组分(13g）进行MCI-gel色谱柱分级（甲醇体积分数依次为40%、 50%、60%、70%、80%、 90%和100%的甲醇水溶液），得到9个亚组分，记为Fr2.1组分~Fr2.9组分。
将所述Fr2.3组分(996mg)进行硅胶柱层析（梯度洗脱，PE/EtOAc体积比依次为20:1、15:1、9:1、8.5:1.5、8:2、7.5:2.5和7:3），得到11个亚组分，记为Fr2.3.1组分~Fr2.3.11组分。
将所述Fr2.3.3组分(119mg）进行硅胶柱层析（石油醚:丙酮体积比=35:1~9:1）进行，得到4个亚组分，记为Fr2.3.3.1组分~Fr2.3.3.4组分。
将所述Fr2.3.3.3组分置于甲醇中，在25℃条件下重结晶72h，得到式I所示结构的5/3/6/5四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物（Artemilavanin F）。其中，Fr2.3.3.3组分的质量与重结晶用甲醇的体积之比为1g：50mL。
结构鉴定：化合物Artemilavanin F的1H和13C NMR数据见表1，Artemilavanin F的单晶X衍射图如图1所示；无色晶体；根据HR-ESI-MS at m/z 269.1152 [M + Na]+ (calcd269.1154)，分子式为C15H18O3，不饱和度为7。红外光谱中1763 cm−1和1696 cm−1有吸收峰，表明存在羰基和烯烃官能团。1H和13C核磁共振信号显示三个甲基 [δH 1.17 (3H, d, J =7.4 Hz, H3-13), 0.96 (3H, s, H3-14), 1.21 (3H, s, H3-15); δC 10.7 (C-13), 14.6(C-14), 8.4 (C-15)]，两个亚甲基，三个次甲基括一个被氧化的次甲基 [δH 4.69 (1H,m, H-8); δC 75.6 (C-8)]，一个α，β-不饱和酮基团[δH 7.42 (1H, d, J = 5.6 Hz, H-1),5.98 (1H, d, J = 5.6 Hz, H-2); δC 162.8 (C-1), 129.6 (C-2), 206.9 (C-3)], 一个酯羰基[δC 179.0 (C-12)]，以及三个季碳。核磁共振数据表明，Artemilavanin F是一个重排的桉烷型倍半萜。ROESY谱中，H-1与H-7和H-6α，H-8与H-11和H3-14，H-6β与H-9β和H3-15的相关，表明H-7，H-8，H-11和H3-14的α构型，H3-13和H3-15的β构型，以及C-5的S*构型。利用甲醇对该化合物进行晶体培养，最终通过单晶X衍射实验确定其绝对构型为4R,5S,7R,8R,10S,11S (图1)，Flack系数为0.1(5)。经检索确定Artemilavanin F为首次分离获得的式I所示结构的新化合物。
表1 Artemilavanin F的1H (400 MHz）和13C (100 MHz) NMR数据(CDCl3)
| Position | 1H | 13C |
| 1 | 7.42 (d, 5.6) | 162.8 |
| 2 | 5.98 (d, 5.6) | 129.6 |
| 3 | 206.9 | |
| 5 | 48.0 | |
| 6α | 1.83 (dd, 14.0, 4.5) | 41.6 |
| 6β | 1.16 (overlap) | 18.2 |
| 7 | 2.56 (m) | 37.5 |
| 8 | 4.69 (m) | 75.6 |
| 9α | 2.25 (dd, 14.0, 7.5) | 33.3 |
| 9β | 1.36 (dd, 14.0, 9.2) | 40.3 |
| 11 | 2.97 (m) | 37.1 |
| 13 | 1.17 (d, 7.4) | 179.0 |
| 14 | 0.96 (s) | 10.7 |
| 15a | 1.21 (s) | 14.6 |
| 15b | 8.4 |
实施例2
野艾蒿中Artemilavanin F结构类似物的分离：
在野艾蒿中分离获得9个具有与Artemilavanin F类似结构已知化合物：
11α,13-dihydroyomogin (Phytochemistry. 27: 1113-1120)；
Acetyltabarin(Phytochemistry. 1999. 51: 995-997)；
Vulgarin (Helv. Chim. Acta. 2010. 93: 1344-1349)；
8α-acetoxy-1β-hydroxyeudesm-3-en-5α,6β,7α,11βH-12,6-olide(Phytochemistry. 1999. 51: 995-997)；
8α-hydroxy-11β,13-dihydrobalchanin(Phytochemistry. 1999. 51: 995-997)；
11β,13-dihydrosantamarin (Phytochemistry. 2013，90： 90-94)；
Anthemidin(Epstein and Jenkins, 1979)；
8-acetylartapshin(Mustakerova et al., 2002)；
Acetylartemisin(Serkerov, 1982)。
Acetyltabarin：将所述Fr2.5.3组分(202mg）依次进行硅胶柱层析（PE/EtOAc，30:1~8:2，v/v）和Sephadex LH-20凝胶柱分离（CHCl3/MeOH，1:1，v/v），得到Acetyltabarin（9mg）。
Acetyltabarin
11β,13-dihydrosantamarin：将所述Fr3.2组分(125mg）依次进行硅胶柱层析（PE/EtOAc，8:2，v/v）和Sephadex LH-20凝胶柱分离（CHCl3/MeOHH，1:1，v/v），得到11β,13-dihydrosantamarin(12.3mg)。
11β,13-dihydrosantamarin
8α-hydroxy-11β,13-dihydrobalchanin和8-acetylartapshin：将所述Fr3.4.3.2组分(283mg）进行Sephadex LH-20凝胶柱分离（CHCl3/MeOH，1:1，v/v），分别得到8α-hydroxy-11β,13-dihydrobalchanin8α-hydroxy-11β,13-dihydrobalchanin (13mg）和8-acetylartapshin(2.8mg)。
8α-hydroxy-11β,13-dihydrobalchanin
8-acetylartapshin
11α,13-dihydroyomogin和Anthemidin：将所述Fr4组分(65g）进行MCI-gel色谱柱分级（40~100v/v%甲醇水溶液），得到7个亚组分Fr4.1组分~Fr4.7组分。将所述Fr4.1组分(3.4g）进行硅胶柱层析（PE/EtOAc，30:1~6:4，v/v），得到7个亚组分，记为Fr4.1.1组分~Fr4.1.7组分。将所述Fr4.1.3组分(1.4g)依次进行Sephadex LH-20凝胶柱分离（CHCl3/MeOH，1:1，v/v）和硅胶柱层析，分别得到11α,13-dihydroyomogin(8.8mg)和Anthemidin（6.2mg）。
11α,13-dihydroyomogin
Anthemidin
Vulgarin和acetylartemisin：将所述Fr4.2组分(12g)进行色谱柱梯度洗脱（CHCl3/丙酮，100:1~6:4，v/v），得到6个组分，记为Fr4.2.1组分~Fr4.2.6组分。将所述Fr4.2.5组分(134mg）进行Sephadex LH-20凝胶层析分离（CHCl3/MeOH，1:1，v/v），得到Vulgarin (6mg）和Acetylartemisin (2.3mg)。
Vulgarin
Acetylartemisin
8α-acetoxy-1β-hydroxyeudesm-3-en-5α,6β,7α,11βH-12,6-olide：将Fr5组分(8.3g)进行MCI-gel色谱柱分级（30~100v/v%甲醇水溶液），得到8个组分，记为Fr5.1组分~Fr5.8组分。将所述Fr5.2组分(4.1g)进行RP-C18柱分离（梯度洗脱，MeOH/H2O，甲醇体积分数由20%增加到100%），得到10个亚组分，记为Fr5.2.1组分~Fr5.2.10组分。将所述Fr5.2.1组分(207mg）进行Sephadex LH-20凝胶层析（CHCl3:MeOH，1:1，v/v），得到8α-acetoxy- 1β-hydroxyeudesm-3-en-5α,6β,7α,11βH-12,6-olide(7.8mg)。
8α-acetoxy-1β-hydroxyeudesm-3-en-5α,6β,7α,11βH-12,6-olide
测试例1
实施例1~2制备的化合物对胰腺癌PANC-1细胞的肿瘤细胞毒活性：
1. 材料和方法
1.1 实验材料：PANC-1（人胰腺癌细胞）；细胞培养于高糖DMEM完全培养基中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱，细胞贴壁后密度达到80~90%，胰酶消化传代。MTT溶液：将250mgMTT粉末溶解于50mL的PBS中，配置为5mg/mL的MTT溶液，待用。
1.2 实验步骤
1）对数生长期细胞接种于96孔培养板中，每孔接种5×103个细胞，细胞悬液体积为100μL，置于二氧化碳细胞培养箱中培养。
2）设紫杉醇组、待测样品组：①紫杉醇给药浓度：单浓度筛选为500nM；②待测样品最高给药浓度：单浓度筛选时为20μM。细胞贴壁后（悬浮细胞接种于96孔板中），分别加入100μL待测样品工作液，设空白对照组和阴性对照组；
3）给药处理48h后，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，放入培养箱中孵育4h；移除孔中液体，每孔中加入150μL DMSO溶解，于酶标仪490nm波长下测定OD值；采用两点法（Reedand Muench法）、Graphpad Prism 9进行数据分析并作图。
2. 实验结果
图2为化合物Artemilavanin F及其桉烷型倍半萜类似物对胰腺癌PANC-1细胞的肿瘤细胞毒活性图，从图2可知，在胰腺癌PANC-1细胞中，与对照组相比较，实施例1~2制备的化合物处理组后，具有式I所示结构的化合物Artemilavanin F可明显抑制胰腺癌肿瘤细胞的增殖能力，对胰腺癌肿瘤细胞具有显著的抑制活性，而其他结构类似物均IC50>20µM，证明化合物Artemilavanin F的化学结构重排不仅是Artemilavanin F与其他桉烷型倍半萜类似物的结构上的重要区别，也是其具有抗肿瘤活性的关键。
测试例2
实施例1制备的化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞的肿瘤细胞毒活性：
2. 材料和方法
2.1 实验材料：AGS（人胃癌细胞）；HCT-116（人结肠癌细胞）；PANC-1（人胰腺癌细胞）；细胞培养于高糖DMEM完全培养基中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱，细胞贴壁后密度达到80-90%，胰酶消化传代。MTT溶液：将250mg MTT粉末溶解于50mL的PBS中，配置为5mg/mL的MTT溶液，待用。
2.2 实验步骤
1）对数生长期细胞接种于96孔培养板中，每孔接种5×103个细胞，细胞悬液体积为100μL，置于二氧化碳细胞培养箱中培养。
2）设紫杉醇组、待测样品组：①紫杉醇给药浓度：最高浓度筛选为500nM，5倍梯度稀释；②待测样品最高给药浓度为50μM，5倍梯度稀释。细胞贴壁后（悬浮细胞接种于96孔板中），分别加入100μL待测样品工作液，设空白对照组和阴性对照组；
3）给药处理48h后，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，放入培养箱中孵育4h；移除孔中液体，每孔中加入150μL DMSO溶解，于酶标仪490nm波长下测定OD值；采用两点法（Reedand Muench法）、Graphpad Prism 9进行数据分析并作图。
2. 实验结果
图3为化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞的肿瘤细胞毒活性图，从图3可知，在胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞中，与对照组相比较，实施例1制备的化合物处理组后3种肿瘤细胞的增殖能力明显下降，对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞的半数抑制率（IC50）分别为23.58μM、15.31μM和7.30μM，且增殖抑制活性呈剂量依赖性，说明化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞均具有肿瘤细胞毒活性。
测试例3
实施例1制备的化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞克隆形成的抑制活性。
1. 材料和方法
1.1 实验材料：AGS（人胃癌细胞）；HCT-116（人结肠癌细胞）；PANC-1（人胰腺癌细胞），细胞培养于高糖DMEM完全培养基中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱，细胞贴壁后密度达到80-90%，胰酶消化传代。4%多聚甲醛固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司），结晶紫（生工生物股份有限公司）。
1.2 实验步骤
1）将对数生长期的PANC-1细胞接种于6孔培养板中，每孔接种1000个，于二氧化碳细胞培养箱中培养。待细胞贴壁后，每孔分别加入0、0.625、1.25、2.5、5、10μM浓度的化合物Artemilavanin F处理细胞。处理24h后，去除含药培养基，更换2mL完全培养基继续培养。
2）细胞培养14d后，去除各孔培养基，用PBS润洗，后加入4%多聚甲醛固定液，静置30min。移除固定液，用PBS润洗后加入0.5%结晶紫染色液，静置15min。弃染液，缓慢冲洗去除多余染料。晾干并拍照，并使用Image J分析每孔形成的克隆数。
2. 实验结果
图4为化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞克隆形成的抑制活性图，从图4可知，实施例1制备的化合物Artemilavanin F可有效地抑制胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞克隆形成，且在较低剂量下即可发挥抑制作用，在0.625~1.25μM的浓度下剂量下即可显著减少肿瘤细胞克隆形成数量，证明化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞均具有增殖抑制活性，可抑制以上消化道肿瘤的增殖和侵袭。
测试例4
实施例1制备的化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞周期的调控作用。
1. 材料和方法
1.1 实验材料：AGS（人胃癌细胞）；HCT-116（人结肠癌细胞）；PANC-1（人胰腺癌细胞），细胞培养于高糖DMEM完全培养基中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱，细胞贴壁后密度达到80-90%，胰酶消化传代。RNAse A（Beyotime）；碘化丙啶（PI，生工工生物股份有限公司）
1.2 实验步骤
1）将对数生长期的AGS、HCT-116、PANC-1细胞接种于6孔培养板中，2.5×105个/孔，于二氧化碳细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，每孔分别加入0、2.5、5、10μM浓度的结构式I所示化合物处理细胞，并设置浓度为500nM的紫杉醇作为阳性对照组，继续于二氧化碳细胞培养箱中培养处理；
2）处理18h后，收集细胞沉淀，加入适量70%无水乙醇固定细胞，4℃固定30min后，1000rpm离心5min，移上清，加入500μL PBS，混匀后加入25μL 1mg/mL RNAse A，上下颠倒混匀后37℃孵育30min，后加入30μL 1mg/mL PI溶液，室温避光孵育20min后，流式细胞仪进行细胞周期检测。
2. 实验结果
图5为化合物Artemilavanin F对胃癌AGS细胞周期的调控作用图，图6为化合物Artemilavanin F对结肠癌HCT-116细胞周期的调控作用图，图7为化合物Artemilavanin F对胰腺癌PANC-1细胞周期的调控作用图，从图5~7可知，化合物Artemilavanin F可有效地阻滞AGS、HCT-116、PANC-1细胞周期于G2/M期，与阴性对照组相比，当作用浓度为5 μM时，即具显著性差异，且呈剂量依赖性，证明实施例1制备的化合物可以调控AGS、HCT-116、PANC-1细胞周期，提示化合物Artemilavanin F可通过影响细胞周期以抑制以上消化道肿瘤细胞的增殖。
测试例5
实施例1制备的化合物Artemilavanin F对胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞凋亡的诱导作用。
1. 材料和方法
1.1 实验材料：AGS（人胃癌细胞）；HCT-116（人结肠癌细胞）；PANC-1（人胰腺癌细胞），细胞培养于高糖DMEM完全培养基中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱，细胞贴壁后密度达到80-90%，胰酶消化传代。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（Proteintech）
1.2 实验步骤：
1）将对数生长期的AGS、HCT-116、PANC-1细胞接种于6孔培养板中，2.5×105个细胞/孔，于二氧化碳细胞培养箱中培养，细胞贴壁后，每孔分别加入0、2.5、5、10 μM浓度的结构式 (I) 所示化合物处理细胞，并设置浓度为500 nM的紫杉醇作为阳性对照组。
2）细胞处理24h后，收集细胞沉淀，每个处理孔细胞别加入200μL 1×BindingBuffer 重悬细胞，转移至流式管中，分别加入5μL Annexin V-FITC溶液和5μL PI溶液，混匀后室温避光孵育15min，流式细胞仪进行细胞凋亡检测。
2 实验结果
图8为化合物Artemilavanin F对胃癌AGS细胞凋亡的诱导活性图，图9为化合物Artemilavanin F对结肠癌HCT-116细胞凋亡的诱导活性图，图10为化合物ArtemilavaninF对胰腺癌PANC-1细胞凋亡的诱导活性图，从图8~10可知，与阴性对照组相比，化合物Artemilavanin F可诱导AGS、HCT-116、PANC-1细凋亡率增加，且作用浓度在5 μM时就具有显著性差异，证明化合物Artemilavanin F可以诱导消化道肿瘤细胞AGS、HCT-116、PANC-1细胞发生凋亡，进而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。
测试例6
实施例1制备的化合物Artemilavanin F抑制胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞迁移活性。
1. 材料和方法
1.1 实验材料：AGS（人胃癌细胞）；HCT-116（人结肠癌细胞）；PANC-1（人胰腺癌细胞），细胞培养于高糖DMEM完全培养基中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱，细胞贴壁后密度达到80-90%，胰酶消化传代。划痕插件（规格：2孔，ibidi）。
1.2 实验步骤
1）将划痕插件置于6孔培养皿中，标准划痕宽度为500 μM，配制1.25×105个/mL细胞混悬液，插件每孔接种100 μL 细胞混悬液，于二氧化碳细胞培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，用0、1.25、2.5、5、10 μM浓度的化合物Artemilavanin F处理细胞。
2）处理24h后，移除划痕插件，PBS润洗一次去除漂浮细胞，加入2mL完全培养基继续培养，并于0、24、48h在显微镜下观察划痕融合情况。拍照并采用Image J定量划痕宽度，GraphPad Prism 9作图并采用SPSS软件进行统计分析。
2 实验结果
图11为化合物Artemilavanin F抑制胃癌AGS细胞迁移活性图，图12为化合物Artemilavanin F抑制结肠癌HCT-116细胞迁移活性图，图13为化合物Artemilavanin F抑制胰腺癌PANC-1细胞迁移活性图，从图11~13可知，在24h时间点，胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞对照组划痕基本完全融合，而化合物Artemilavanin F处理组细胞划痕融合受到明显抑制，在48h时间点，10 μM化合物Artemilavanin F处理的胃癌AGS、结肠癌HCT-116、胰腺癌PANC-1细胞划痕仍不能完全融合，提示化合物Artemilavanin F可明显抑制肿瘤细胞迁移，具有抑制消化道肿瘤侵袭转移的活性。
应用例1
将实施例1制备的化合物Artemilavanin F与赋形剂按照质量比分别为1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10和3:1的比例混合均匀，制粒压片，得到药物组合物片剂。
其中，赋形剂包括粘合剂（聚维酮K30、微晶纤维素和褐藻酸钠中的一种或几种）、填充剂（无水乳糖、淀粉、葡萄糖和乳糖珠粒中的一种或几种）、崩解剂（羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和海藻酸钠中的一种或几种）和润滑剂（十二烷基硫酸镁和/或硬脂酸镁），黏合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂的质量比为1:0.5:0.4:0.06。
应用例2
将实施例1制备的化合物Artemilavanin F与赋形剂按照质量比为3:1的比例混合均匀，制成胶囊。
其中，赋形剂包括粘合剂（聚维酮K30、微晶纤维素和褐藻酸钠中的一种或几种）、填充剂（无水乳糖、淀粉、葡萄糖和乳糖珠粒中的一种或几种）、崩解剂（羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和海藻酸钠中的一种或几种）、润滑剂（十二烷基硫酸镁和/或硬脂酸镁）和湿润剂（蒸馏水），黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂和湿润剂的质量比为1:2:2:2:1。
应用例3
将实施例1制备的化合物Artemilavanin F与赋形剂按照质量比为3:1的比例混合均匀，制成颗粒剂。
其中，赋形剂包括粘合剂（聚维酮K30、微晶纤维素和褐藻酸钠中的一种或几种）、填充剂（无水乳糖、淀粉、葡萄糖和乳糖珠粒中的一种或几种）、崩解剂（羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和海藻酸钠中的一种或几种）和润滑剂（十二烷基硫酸镁和/或硬脂酸镁），黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂和湿润剂的质量比为1:0.25:1:0.8。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本发明实施例在不经创造性劳动前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物，具有式I所示的结构：
式I。
2.权利要求1所述四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
利用乙醇水溶液对野艾蒿进行醇提，得到醇提物；所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为40~100%；
将所述醇提物溶解于水中，进行乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取物；
将所述乙酸乙酯提取物进行第一硅胶柱层析，得到Fr2组分；所述第一硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-丙酮混合溶液，所述洗脱剂中石油醚和丙酮的体积比为9:1~5:5；
将所述Fr2组分进行MCI-gel色谱柱分级，得到Fr2.3组分；所述MCI-gel色谱柱分级采用的洗脱剂为40~100v/v%甲醇水溶液；
将所述Fr2.3组分进行第二硅胶柱层析，得到Fr2.3.3组分；所述第二硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂，所述洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为20:1~7:3；
将所述Fr2.3.3组分进行第三硅胶柱层析，得到Fr2.3.3.3组分；所述第三硅胶柱层析采用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂，所述洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为35:1~9:1；
将所述Fr2.3.3.3组分进行重结晶，得到四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述醇提的温度为20~80℃，所述醇提的次数为2~4次，单次醇提的时间为24~72h；
所述野艾蒿的干重与单次醇提用乙醇水溶液的体积比为1kg：2~5L。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸乙酯提取的次数为2~4次；
所述醇提物的质量与单次提取用乙酸乙酯的体积之比为1kg：4~10L。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一硅胶柱层析为梯度洗脱，所述梯度洗脱过程中石油醚和丙酮的体积比依次为9:1、8:2、7:3、6:4和5:5。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述重结晶采用的溶剂包括甲醇。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的载体和/或辅料；所述活性组分为权利要求1所述的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物或权利要求2~6任一项所述制备方法制得的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括注射剂、片剂、胶囊、丸剂或颗粒剂。
9.权利要求1所述的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物、权利要求2~6任一项所述制备方法制得的四环环系重排桉烷型倍半萜类化合物或权利要求7~8任一项所述药物组合物在制备预防肿瘤的药物或治疗肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括消化道肿瘤。
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| GR01 | Patent grant | ||
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