CN111690023B - 马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物及其提取方法和应用 - Google Patents

马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物及其提取方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及活性成分提取技术领域，具体涉及一种马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物及其提取方法和应用。本发明提供的马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物，主要结构特征为马钱苷β‑D‑吡喃葡萄糖上的羟基不同程度被乙酰化。以抑制乙酰胆碱酯酶活性和抑制β‑淀粉样蛋白(Aβ)产生为靶标进行抗阿尔茨海默病药的活性筛选，结果表明，本发明提供的马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物能有效抑制乙酰胆碱酯酶活性以及减少Aβ40和Aβ42的产生，表明这些化合物具有明显的预防和治疗阿尔茨海默病的作用和良好的研究开发前景。

Description

马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及活性成分提取技术领域，具体涉及一种马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物及其提取方法和应用。
背景技术
龙胆属植物全世界约400种，我国有247种、41个变种。云南共有125种，包括6个变种，其中绝大部分分布在云南西北部地区。龙胆属植物中主要含有环烯醚萜苷和裂环烯醚萜苷类、黄酮类和三萜类化合物等成分，具有明显的抗炎、抗氧化、抗真菌、抗肿瘤、保肝、降血糖及创伤愈合等多种生理活性。微籽龙胆(Gentiana delavayi Franch)为龙胆科龙胆属植物，主要分布于云南昆明、鹤庆、剑川、洱源和四川南部等地。目前关于微籽龙胆的研究较少，且均是对其提取物的活性进行研究，尚未有从微籽龙胆中提取分离出马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物并进一步对其药物活性进行研究的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物及其提取方法和应用，本发明从微籽龙胆中首次提取分离出马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物，为其药用研究提供了基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物，具有式I所示结构：
式I中R1～R5的组合如下所示：
本发明提供了上述技术方案所述马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)用乙醇水溶液对微籽龙胆的花进行提取，得到总提取液；
(2)将所述总提取液减压浓缩至无醇味，将所得浸膏水混悬液依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取，减压浓缩收集氯仿部位萃取物和正丁醇部位萃取物；
(3)以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述氯仿部位萃取物进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D1-5；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D3.1-3.5；以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D3.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D3.2.1-3.2.3；以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D3.2.3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到3个组分，记为D3.2.3.1-3.2.3.3；将D3.2.3.2组分进行柱层析分离，得到化合物3；将D3.2.3.3组分进行柱层析分离，得到化合物8；
以水-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4组分进行MCI柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.1-4.5；将D4.3组分进行柱层析分离，得到化合物4；将D4.4组分进行柱层析分离，得到化合物2；以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.5组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.5.1-4.5.5；将D4.5.3组分进行柱层析分离，得到化合物1；
(4)以水-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述正丁醇部位萃取物进行AB-8大孔吸附树脂柱层析分离，依次得到4个组分，记为E1-4；
将E1组分进行柱层析分离，得到化合物5；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将E2组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为E2.1-2.5；将E2.2组分进行柱层析分离，得到化合物6；将E2.3组分进行柱层析分离，得到化合物7；
所述步骤(3)和步骤(4)无时间顺序限定。
优选地，将所述D4.3组分进行柱层析分离的方法包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.3.1-4.3.5；
以甲醇为洗脱剂将D4.3.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D4.3.2.1-4.3.2.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D4.3.2.2组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物4。
优选地，将所述D4.4组分进行柱层析分离的方法包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.4组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.4.1-4.4.5；
以甲醇为洗脱剂将D4.4.4组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D4.4.4.1-4.4.4.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D4.4.4.2组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物2。
优选地，将所述D4.5.3组分进行柱层析分离的方法包括以下步骤：
以甲醇为洗脱剂将D4.5.3组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D4.5.3.1-4.5.3.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D4.5.3.1组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物1。
优选地，将所述E1组分进行柱层析分离的方法包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将E1组分进行硅胶柱层析分离，依次得到6个组分，记为E1.1-1.6；
以甲醇为洗脱剂将E1.3组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，得到化合物5。
优选地，将所述E2.2组分进行柱层析分离的方法包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将E2.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为E2.2.1-2.2.3；
以甲醇为洗脱剂将E2.2.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，得到化合物6。
优选地，将所述E2.3组分进行柱层析分离的方法包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将E2.3组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为E2.3.1-2.3.3；
以甲醇为洗脱剂将E2.3.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为E2.3.2.1-2.3.2.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将E2.3.2.1组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物7。
本发明提供了马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物或其药学上可接受的盐在制备抗阿尔茨海默病药物中的应用，其中，所述马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物为上述技术方案所述马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物或上述技术方案所述提取方法提取得到的马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物。
优选地，所述抗阿尔茨海默病药物中含有化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物8、化合物1药学上可接受的盐、化合物2药学上可接受的盐、化合物3药学上可接受的盐、化合物4药学上可接受的盐、化合物5药学上可接受的盐和化合物8药学上可接受的盐中的至少一种。
本发明提供了一种马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物，主要结构特征为马钱苷β-D-吡喃葡萄糖上的羟基不同程度被乙酰化。以抑制乙酰胆碱酯酶活性和抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)产生为靶标进行抗阿尔茨海默病药的活性筛选，结果表明，本发明提供的马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物能有效抑制乙酰胆碱酯酶活性以及减少Aβ40和Aβ42的产生，表明这些化合物具有明显的预防和治疗阿尔茨海默病的作用和良好的研究开发前景。
本发明提供了马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物的提取方法，本发明以微籽龙胆的花为原料，通过多种分离方法得到一系列马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物，为其药用研究提供了基础。
附图说明
图1为化合物1抑制细胞外Aβ40和Aβ42的产生结果图(LL-47代表化合物1)；
图2为化合物3抑制细胞外Aβ40和Aβ42的产生结果图(LL-46代表化合物3)；
图3为化合物4抑制细胞外Aβ40和Aβ42的产生结果图；
图4为化合物5抑制细胞外Aβ40和Aβ42的产生结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物，具有式I所示结构：
式I中R1～R5的组合如下所示：
在本发明中，所述化合物1～8的结构式具体如下所示：
本发明提供了上述技术方案所述马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)用乙醇水溶液对微籽龙胆的花进行提取，得到总提取液；
(2)将所述总提取液减压浓缩至无醇味，将所得浸膏水混悬液依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取，减压浓缩收集氯仿部位萃取物和正丁醇部位萃取物；
(3)以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述氯仿部位萃取物进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D1-5；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D3.1-3.5；以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D3.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D3.2.1-3.2.3；以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D3.2.3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到3个组分，记为D3.2.3.1-3.2.3.3；将D3.2.3.2组分进行柱层析分离，得到化合物3；将D3.2.3.3组分进行柱层析分离，得到化合物8；
以水-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4组分进行MCI柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.1-4.5；将D4.3组分进行柱层析分离，得到化合物4；将D4.4组分进行柱层析分离，得到化合物2；以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.5组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.5.1-4.5.5；将D4.5.3组分进行柱层析分离，得到化合物1；
(4)以水-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述正丁醇部位萃取物进行AB-8大孔吸附树脂柱层析分离，依次得到4个组分，记为E1-4；
将E1组分进行柱层析分离，得到化合物5；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将E2组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为E2.1-2.5；将E2.2组分进行柱层析分离，得到化合物6；将E2.3组分进行柱层析分离，得到化合物7；
所述步骤(3)和步骤(4)无时间顺序限定。
本发明用乙醇水溶液对微籽龙胆的花进行提取，得到总提取液。在本发明中，所述微籽龙胆的花在使用前优选进行干燥和粉碎；本发明对于所述干燥和粉碎的具体操作方法没有特殊的限定，能够保证后续提取顺利进行即可。在本发明中，对所述微籽龙胆的花进行提取的方法优选包括以下步骤：
采用第一乙醇水溶液对微籽龙胆的花进行第一提取，得到提取液A和药渣；采用第二乙醇水溶液对药渣进行第二提取，得到提取液B；将所述提取液A和提取液B合并作为总提取液。
在本发明中，所述第一乙醇水溶液的质量浓度优选为93～97％，更优选为94～96％；所述第一乙醇水溶液与微籽龙胆的花的用量比优选为(1～3)L：1kg，更优选为(2～3)L：1kg。在本发明中，所述第二乙醇水溶液的质量浓度优选为40～70％，更优选为50～60％；所述第二乙醇水溶液与药渣的用量比优选为(1～3)L：1kg，更优选为(2～3)L：1kg。在本发明中，所述第一提取和第二提取的次数优选独立地为2～3次，每次提取的时间优选独立地为12～24h，所述第一提取和第二提取优选在室温条件下进行。
得到总提取液后，本发明将所述总提取液减压浓缩至无醇味，将所得浸膏水混悬液依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取，减压浓缩收集氯仿部位萃取物和正丁醇部位萃取物。在本发明中，所述萃取用石油醚、氯仿和正丁醇的体积与待萃取物料的体积比优选独立地为(2～6)：1，更优选为(3～5)：1。在本发明中，在萃取过程中，还会收集到石油醚部位萃取物和水部位萃取物，在后续进一步分离过程中不涉及该两部分萃取物，在此不作过多介绍。
在本发明中，对所述氯仿部位萃取物进一步分离，会得到化合物1～4和化合物8，具体包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述氯仿部位萃取物进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D1-5。在本发明中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为80～100目；所述梯度洗脱包括依次进行的五个梯度，按氯仿与甲醇体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选为1:0、3:4、2:1、1:4和0:1；本发明优选通过薄层层析监测，将Rf值相似或相同的组分合并，最终依次得到5个组分(D1-5)。本发明在后续柱层析分离过程中，均是采用薄层层析监测，后续相关步骤中不再具体限定。
本发明将上述得到的D3组分进行柱层析分离，得到化合物3和化合物8；具体包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D3.1-3.5；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；所述梯度洗脱包括依次进行的五个梯度，按氯仿与甲醇体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选为100:1、80:1、60:1、40:1和20:1；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D3.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D3.2.1-3.2.3；其中，氯仿与甲醇的体积比优选为1:1；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D3.2.3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到3个组分，记为D3.2.3.1-3.2.3.3；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；氯仿与甲醇的体积比优选为25:1；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D3.2.3.2组分进行柱层析分离，得到化合物3；其中，所述柱层析分离优选为Sephadex LH-20柱层析分离；氯仿与甲醇的体积比优选为1:1；
以甲醇为洗脱剂将D3.2.3.3组分进行柱层析分离，得到化合物8；其中，所述柱层析分离优选为Sephadex LH-20柱层析分离。
本发明将上述得到的D4组分进行柱层析分离，会得到化合物1、化合物2和化合物4；具体包括以下步骤：
以水-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4组分进行MCI柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.1-4.5；所述梯度洗脱包括依次进行的五个梯度，按水与甲醇体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选为1:0、3:4、2:1、1:4和0:1。
本发明将上述得到的D4.3组分进行柱层析分离，具体是得到化合物4；包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.3.1-4.3.5；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；所述梯度洗脱包括依次进行的五个梯度，按氯仿与甲醇体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选为50:1、40:1、30:1、15:1和0:1；
以甲醇为洗脱剂将D4.3.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D4.3.2.1-4.3.2.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D4.3.2.2组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物4；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；氯仿与甲醇的体积比优选为15:1。
本发明将上述得到的D4.4组分进行柱层析分离，具体是得到化合物2；包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.4组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.4.1-4.4.5；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；所述梯度洗脱包括依次进行的五个梯度，按氯仿与甲醇体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选为50:1、40:1、30:1、15:1和0:1；
以甲醇为洗脱剂将D4.4.4组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D4.4.4.1-4.4.4.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D4.4.4.2组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物2；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；氯仿与甲醇的体积比优选为18:1。
本发明将上述得到的D4.5组分进行柱层析分离，具体是得到化合物1；包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.5组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.5.1-4.5.5；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；所述梯度洗脱包括依次进行的五个梯度，按氯仿与甲醇体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选为50:1、40:1、30:1、15:1和0:1；
以甲醇为洗脱剂将D4.5.3组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D4.5.3.1-4.5.3.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D4.5.3.1组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物1；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；氯仿与甲醇的体积比优选为20:1。
在本发明中，对所述正丁醇部位萃取物进一步分离，会得到化合物5～7，具体包括以下步骤：
以水-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述正丁醇部位萃取物进行AB-8大孔吸附树脂柱层析分离，依次得到4个组分，记为E1-4；其中，所述梯度洗脱包括依次进行的五个梯度，按水与甲醇体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选为1:0、3:4、2:1、1:4和0:1。
本发明将上述得到的E1组分进行柱层析分离，具体是得到化合物5；包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将E1组分进行硅胶柱层析分离，依次得到6个组分，记为E1.1-1.6；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；所述梯度洗脱包括依次进行的六个梯度，按氯仿与甲醇体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选为10:1、8:1、6:1、4:1、2:1和0:1；
以甲醇为洗脱剂将E1.3组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，得到化合物5。
本发明将上述得到的E2组分进行柱层析分离，具体是得到化合物6和7；包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将E2组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为E2.1-2.5；其中，所述硅胶柱层析分离所用硅胶的粒度优选为300～400目；所述梯度洗脱包括依次进行的五个梯度，按氯仿与甲醇体积比，每个梯度中洗脱剂的组成优选为20:1、15:1、10:1、5:1和0:1；
以氯仿-甲醇为洗脱剂(氯仿与甲醇的体积比优选为1:1)，在等梯度洗脱条件下将E2.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为E2.2.1-2.2.3；以甲醇为洗脱剂将E2.2.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，得到化合物6；
以氯仿-甲醇为洗脱剂(氯仿与甲醇的体积比优选为1:1)，在等梯度洗脱条件下将E2.3组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为E2.3.1-2.3.3；以甲醇为洗脱剂将E2.3.2组分进行Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为E2.3.2.1-2.3.2.3；以氯仿-甲醇为洗脱剂(氯仿与甲醇的体积比优选为10:1)，在等梯度洗脱条件下将E2.3.2.1组分进行硅胶柱层析分离(所用硅胶的粒度优选为300～400目)，得到化合物7。
本发明提供了马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物或其药学上可接受的盐在制备抗阿尔茨海默病药物中的应用，其中，所述马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物为上述技术方案所述马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物或上述技术方案所述提取方法提取得到的马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物。
在本发明中，所述抗阿尔茨海默病药物中含有化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物8、化合物1药学上可接受的盐、化合物2药学上可接受的盐、化合物3药学上可接受的盐、化合物4药学上可接受的盐、化合物5药学上可接受的盐和化合物8药学上可接受的盐中的至少一种。
在本发明中，所述抗阿尔茨海默病药物以所述马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，还包括药用辅料。在本发明中，马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物药学上可接受的盐，优选是将马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属或碱性氨基酸生成的盐；其中，所述无机酸优选包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸或氢溴酸，所述有机酸优选包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、己二酸、棕榈酸或单宁酸，所述碱金属优选包括锂、钠或钾，所述碱土金属优选包括钙或镁，所述碱性氨基酸优选包括赖氨酸。在本发明中，所述药用辅料根据作用优选包括以下物质中的至少一种：
稀释剂或赋形剂：水；
填充剂：淀粉或蔗糖；
勃合剂：纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮；
湿润剂：甘油；
崩解剂：琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠；
钠吸收促进剂：季铵化合物；
表面活性剂：十六烷醇；
吸附载体：高岭土或皂勃土；
润滑剂：滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇；
还可以有其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明对于所述抗阿尔茨海默病药物的剂型没有特殊的限定，具体可以为片剂、颗粒、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等，且片剂、颗粒、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识，即由马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物或其药学上可接受的盐与相应的药用辅料制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员实现。
在本发明中，所述抗阿尔茨海默病药物中活性成分的含量优选为0.1～99.5％，更优选为0.5～95％，进一步优选为5～85％，更进一步优选为25～75％。
本发明中抗阿尔茨海默病药物施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5mg/kg体重；可以一次或多次施用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
提取化合物1～8，包括以下步骤：
将微籽龙胆植物的花干燥，粉碎，按粉碎后微籽龙胆的花与95wt％乙醇水溶液的用量比为2L：1kg，用95wt％乙醇水溶液室温浸泡提取3次，每次20小时，合并得到提取液(A)；按药渣与70wt％乙醇水溶液的用量比为2L：1kg，将药渣再用70wt％乙醇水溶液室温浸泡提取2次，每次20小时，合并得到提取液(B)；将提取液(A)和提取液(B)合并减压浓缩至无醇味，得到浸膏水混悬液，依次用4倍(体积比)的石油醚、氯仿和正丁醇充分萃取，减压浓缩回收各萃取部分，分别得到无水浸膏石油醚部位萃取物(C)、氯仿部位萃取物(D)、正丁醇部位萃取物(E)和水部位萃取物(F)；
将氯仿部位萃取物(D)用硅胶(80～100目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比1:0、3:4、2:1、1:4和0:1梯度洗脱)，通过薄层层析监测，将监测结果相似或相同的组分合并，最终依次得到5个组分(D1-5)；将D3组分用硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比100:1、80:1、60:1、40:1和20:1梯度洗脱)，最终依次得到5个组分(D3.1-3.5)；将D3.2组分用Sephadex LH-20柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比1:1等梯度洗脱)，最终依次得到3个组分(D3.2.1-3.2.3)；将D3.2.3组分用硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比25:1等梯度洗脱)，最终依次得到3个组分(D3.2.3.1-3.2.3.3)；将D3.2.3.2组分用Sephadex LH-20柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比1:1等梯度洗脱)，得到化合物3；将D3.2.3.3组分用Sephadex LH-20柱层析分离(洗脱剂为甲醇)，得到化合物8；
将D4组分用MCI柱层析分离(洗脱剂水-甲醇按体积比1:0、3:4、2:1、1:4和0:1梯度洗脱)，最终依次得到5个组分(D4.1-4.5)；将D4.5组分用硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比50:1、40:1、30:1、15:1和0:1梯度洗脱)，最终依次得到5个组分(D4.5.1-4.5.5)；将D4.5.3组分用Sephadex LH-20柱层析分离(洗脱剂为甲醇)，最终依次得到3个组分(D4.5.3.1-4.5.3.3)；将D4.5.3.1组分经硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比20:1等梯度洗脱)，得到化合物1；
将D4.4组分用硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比50:1、40:1、30:1、15:1和0:1梯度洗脱)，最终依次得到5个组分(D4.4.1-4.4.5)；将D4.4.4组分用SephadexLH-20柱层析分离(洗脱剂为甲醇)，最终依次得到3个组分(D4.4.4.1-4.4.4.3)；将D4.4.4.2组分用硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比18:1等梯度洗脱)，得到化合物2；
将D4.3组分用硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比50:1、40:1、30:1、15:1和0:1梯度洗脱)，最终依次得到5个组分(D4.3.1-4.3.5)；将D4.3.2组分用SephadexLH-20柱层析分离(洗脱剂为甲醇)，最终依次得到3个组分(D4.3.2.1-4.3.2.3)；将D4.3.2.2组分用硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比15:1等梯度洗脱)，得到化合物4；
将正丁醇部位萃取物(E)用AB-8大孔吸附树脂柱层析分离(洗脱剂水-甲醇按体积比1:0、3:4、2:1、1:4和0:1梯度洗脱)，通过薄层层析监测，将监测结果相似或相同的组分合并，最终依次得到4个组分(E1-4)；将E1组分用硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比10:1、8:1、6:1、4:1、2:1和0:1梯度洗脱)，最终依次得到6个组分(E1.1-1.6)；将E1.3组分用Sephadex LH-20柱层析分离(洗脱剂为甲醇)，得到化合物5；
将E2组分用硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比20:1、15:1、10:1、5:1和0:1梯度洗脱)，最终依次得到5个组分(E2.1-2.5)；将E2.2组分用Sephadex LH-20柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比1:1等梯度洗脱)，最终依次得到3个组分(E2.2.1-2.2.3)；将E2.2.2组分用Sephadex LH-20柱层析分离(洗脱剂为甲醇)，得到化合物6；
将E2.3组分用Sephadex LH-20柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比1:1等梯度洗脱)，最终依次得到3个组分(E2.3.1-2.3.3)；将E2.3.2组分用Sephadex LH-20柱层析分离(洗脱剂为甲醇)，最终依次得到3个组分(E2.3.2.1-2.3.2.3)；将E2.3.2.1组分经硅胶(300～400目)柱层析分离(洗脱剂氯仿-甲醇按体积比10:1等梯度洗脱)，得到化合物7。
化合物1～8的波谱数据等具体如下：
化合物1，3',6'-diacetylloganin，白色粉末，分子式：C21H30O12。HREIMS m/z497.1630[M+Na]+(calcd497.1629)。
-201(c 0.1,CH3OH),IR(KBr)νmax 3431,2959,2429,1740,1707,1639,1381,1227,1080,1037cm-1；UV(CH3OH)λmax214nm。
化合物2，2',6'-diacetylloganin，黄色油状物，分子式：C21H30O12。HREIMS m/z497.1630[M+Na]+(calcd497.1629)。
-163(c 0.36,CH3OH),IR(KBr)νmax 3431,2928,1631,1402,1116,1044cm-1；UV(CH3OH)λmax216nm。
化合物3，7,2',3',6'-tetracetylloganin，黄色油状物，分子式：C25H34O14。HREIMSm/z 581.1848[M+Na]+(calcd 581.1846)。
化合物4，2',3',6'-triacetylloganin，黄色油状物，分子式：C23H32O13。HREIMS m/z 539.1737[M+Na]+(calcd 539.1735)。
-44.7(c 0.6,CHCl3),IR(KBr)νmax 3455,2923,1753,1637,1373,1239,1081cm-1；UV(CHCl3)λmax243nm。
化合物5，Loganin；白色粉末；分子式：C17H26O10。
化合物6，4',6'-diacetylloganin，白色无定型粉末；分子式：C21H30O12。HREIMS m/z 497.1630[M+Na]+(calcd for497.1629)。
-201(c 0.2,CH3OH)；IR(KBr)νmax 3431,2959,2429,1740,1707,1639,1432,12271080,1037cm-1；UV(CH3OH)λmax(logε)214(3.75)nm。
化合物7，2',3',4',6',7-tetra-acetylloganin，白色无定型粉末；分子式：C27H36O15。HREIMS m/z 623.1954[M+Na]+(calcd for 623.1952)。
化合物8，3',4',6'-diacetylloganin，黄色油状物，分子式：C23H32O13。HREIMS m/z539.1736[M+Na]+(calcd 539.1735)。
-40(c 1.2,CHCl3),IR(KBr)νmax 3456,2935,1741,1725,1638,1378,1240,1079cm-1；UV(CHCl3)λmax243nm。
化合物1～8的13C-NMR和1H-NMR数据见表1～2：
表1化合物1～8的13C-NMR数据
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aRecorded at 400MHz in CD3OD.bRecorded at 400MHz in CDCl3。
表2化合物1～8的1H-NMR数据
/>
aRecorded at 400MHz in CD3OD.bRecorded at 400MHz in CDCl3。
实施例2
将实施例1中化合物1～5和8对APP/PS1双转CHO细胞进行细胞活力实验，其中，相关实验原理、方法和结果如下：
一、实验原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
Ellman法是利用底物碘化硫代胆碱被胆碱酯酶水解后生成游离的巯基，巯基存在下无色的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)被还原成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在415nm处具有最大吸收，可通过检测415nm处的吸光度，以此来筛选化合物抑制乙酰胆碱酯酶(AchE)活性。
二、实验方法：
1、受试样品：实施例1中化合物1～5和8
2、细胞：APP/PS1双转CHO细胞系于上海赛琪生物有限公司
3、实验试剂和仪器见表3～4
表3实验试剂
表4实验仪器
4、药物配制：
分别取各化合物，加入DMSO溶解，使其药物浓度为50mmol/L，再用培养基稀释，得到药物溶液(其中，高剂量为100μmol/L，中剂量为10μmol/L，低剂量为1μmol/L)，最后用0.22μm微孔滤膜过滤药液除菌待用。
5、细胞复苏及培养：
于液氮中取出冻存的APP/PS1双转CHO细胞系于37℃水浴中轻摇1min使其溶解，75％酒精消毒冻存管外壁后置于超净台中，用1000μL移液枪转移到15mL离心管中1000r/min离心5min，弃去上清液，用完全培养基反复吹打悬浮细胞，将细胞悬液移至9cm培养皿中，置于恒温培养箱(5％CO2、37℃)中培养，待细胞汇合到80％时传代。
6、具体操作步骤：
取对数生长期的APP/PS1双转CHO细胞，0.25％胰酶消化，制成单细胞悬液，用细胞完全培养基调整细胞数为1×105L-1。12孔圆底细胞培养板每孔加入细胞悬液1mL。培养12h后，吸出培养液，用DMEM培养液冲洗1次，再加入DMEM完全培养基1mL以及高、中、低剂量的药物溶液1μL(使化合物1的终浓度为0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L，化合物3的终浓度为1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L，化合物2、4、5、8的终浓度为1μmol/L、10μmol/L)。另设空白对照组，每组3个复孔。继续培养24h后，每孔取培养液500μL，离心，取上清液。依照ELISA试剂盒说明书的步骤测定细胞外Aβ40、Aβ42含量。
7、选用Tacrine和HuperineA为阳性对照药，用Ellman法检测化合物在体外对乙酰胆碱酯酶活性的直接抑制作用。
阳性对照：(1)Tacrine：Acetylcholinesterase:IC50＝42.3nM(Electrophoruselectricus)(Santa Cruz)，IC50＝193.6nM(electric eel,Acta Pharmaceutica Sinica2012,47(7):916-921)，IC50＝333nM(rat brain AChE,J.Med.Chem.2002,45,2277-2282),IC50＝125nM(rat brain AChE,Neuropharmacology 38(1999)181–193),IC50＝220nM(electric eel,神经药理学报,Vol.1No.3June.2011)。
(2)Huperine A(较Tacrine强)：Acetylcholinesterase(G4 form)，IC50：7nM(Ki),IC50＝220nM(electric eel,神经药理学报,Vol.1No.3June.2011)。
三、实验结果：
1、化合物1和化合物3抑制Aβ40、Aβ42以及抑制AchE活性结果(见表5)：
表5化合物1和化合物3抑制Aβ40、Aβ42及抑制AchE活性结果
备注：+∞代表抑制Aβ40、Aβ42产生与给药浓度无剂量依赖性，但是在本研究给药浓度范围内表现出了一定的抑制活性。
2、化合物2、化合物4、化合物5和化合物8抑制Aβ40、Aβ42以及抑制AchE活性结果(见表6)：
表6化合物2、4、5和8抑制Aβ40、Aβ42以及抑制AchE活性结果
图1为化合物1抑制细胞外Aβ40和Aβ42的产生结果图(LL-47代表化合物1)，图2为化合物3抑制细胞外Aβ40和Aβ42的产生结果图(LL-46代表化合物3)，图3为化合物4抑制细胞外Aβ40和Aβ42的产生结果图，图4为化合物5抑制细胞外Aβ40和Aβ42的产生结果图。
由图1～4和表5～6可知，通过化合物1～5和8对APP/PS1双转CHO细胞进行细胞实验，化合物1抑制APP/PS1双转CHO细胞产生Aβ40的IC50值为1.09±0.50nM；抑制APP/PS1双转CHO细胞产生Aβ42的IC50值为5.77±2.29nM。化合物3抑制APP/PS1双转CHO细胞产生Aβ42的IC50值为74.14±19.80nM。其中，AZD3293为阳性药，其抑制APP/PS1双转CHO细胞产生Aβ40和Aβ42的IC50值分别为204±0.67nM和102.88±9.33nM。因此，化合物1有抑制细胞外Aβ40和Aβ42产生的作用，化合物3有抑制细胞外Aβ42产生的作用，这两种化合物作用均优于阳性药，可用于制备减少Aβ40和Aβ42的药物，说明它们具有潜在的预防和治疗阿尔茨海默病作用。
此外，在浓度为1μM和10μM下，化合物4和5抑制APP/PS1双转CHO细胞产生Aβ40的抑制率分别为31.69±9.22％和77.89±21.07％、89.64±0.68％和88.32±1.72％；对Aβ42的抑制率分别为88.77±9.50％和80.32±18.55％、71.22±13.57％和74.56±9.65％，说明它们具有潜在的预防和治疗阿尔茨海默病作用。
用Ellman法测定化合物2、5和8的乙酰胆碱酯酶活性，结果显示化合物2、5和8具有明显的抑制乙酰胆碱酯酶活性，它们的IC50值分别为11.8±5.6μM、21.6±2.4μM、69.9±17.4μM(其中，阳性药为Huperzine A：223.2±6.1nM；Tacrine：388.2±2.3nM)，说明它们具有潜在的抗阿尔茨海默病作用。
实施例3
片剂的制备：按实施例1方法提取得到化合物1，按其与赋形剂重量比为1:3加入赋形剂，按常规方法制成片剂。
实施例4
片剂的制备：按实施例1方法提取得到化合物2，按其与赋形剂重量比为1:5加入赋形剂，按常规方法制成片剂。
实施例5
口服液的制备：按实施例1方法提取得到化合物3，按常规方法制成口服液。
实施例6
口服液的制备：按实施例1方法提取得到化合物4，按常规方法制成口服液。
实施例7
胶囊剂的制备：按实施例1方法提取得到化合物5，按其与赋形剂重量比为8:1加入赋形剂，按常规方法制成胶囊剂。
实施例8
颗粒剂的制备：按实施例1方法提取得到化合物8，按其与赋形剂重量比为5:1加入赋形剂，按常规方法制成颗粒剂。
实施例9
注射液的制备：按实施例1方法提取得到化合物1～5、8，按常规方法加注射用水、精滤、灌封灭菌，制成注射液。
实施例10
无菌粉针剂的制备：按实施例1方法提取得到化合物1～5、8，利用无机酸制成相应的盐，按常规方法将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓶中，低温冷冻干燥后无菌熔封，制成无菌粉针剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)用乙醇水溶液对微籽龙胆的花进行提取，得到总提取液；
(2)将所述总提取液减压浓缩至无醇味，将所得浸膏水混悬液依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取，减压浓缩收集氯仿部位萃取物和正丁醇部位萃取物；
(3)以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述氯仿部位萃取物进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D1-5；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D3.1-3.5；以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D3.2组分进行SephadexLH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D3.2.1-3.2.3；以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D3.2.3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到3个组分，记为D3.2.3.1-3.2.3.3；将D3.2.3.2组分进行柱层析分离，得到化合物3；将D3.2.3.3组分进行柱层析分离，得到化合物8；
以水-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4组分进行MCI柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.1-4.5；将D4.3组分进行柱层析分离，得到化合物4；将D4.4组分进行柱层析分离，得到化合物2；以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.5组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.5.1-4.5.5；将D4.5.3组分进行柱层析分离，得到化合物1；
所述马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物，具有式I所示结构：
式I；
式I中R1~R5的组合如下所示：
化合物1 R5＝H R1＝H R2＝Ac R3＝H R4＝Ac
化合物2 R5＝H R1＝Ac R2＝H R3＝H R4＝Ac
化合物3 R5＝Ac R1＝Ac R2＝Ac R3＝H R4＝Ac
化合物4 R5＝H R1＝Ac R2＝Ac R3＝H R4＝Ac
化合物8 R5＝H R1＝H R2＝Ac R3＝Ac R4＝Ac。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，将所述D4.3组分进行柱层析分离的方法包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.3组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.3.1-4.3.5；
以甲醇为洗脱剂将D4.3.2组分进行SephadexLH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D4.3.2.1-4.3.2.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D4.3.2.2组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物4。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，将所述D4.4组分进行柱层析分离的方法包括以下步骤：
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将D4.4组分进行硅胶柱层析分离，依次得到5个组分，记为D4.4.1-4.4.5；
以甲醇为洗脱剂将D4.4.4组分进行SephadexLH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D4.4.4.1-4.4.4.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D4.4.4.2组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物2。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，将所述D4.5.3组分进行柱层析分离的方法包括以下步骤：
以甲醇为洗脱剂将D4.5.3组分进行SephadexLH-20柱层析分离，依次得到3个组分，记为D4.5.3.1-4.5.3.3；
以氯仿-甲醇为洗脱剂，在等梯度洗脱条件下将D4.5.3.1组分进行硅胶柱层析分离，得到化合物1。
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