CN112898357B

CN112898357B - 金莲花中一种二萜苷类新化合物及其分离纯化方法和应用

Info

Publication number: CN112898357B
Application number: CN202110127997.7A
Authority: CN
Inventors: 侴桂新; 王永丽; 郭美丽
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112898357A

Abstract

本发明公开了金莲花(Trollius chinensis Bunge)中一种二萜苷类新化合物Chinenoside G及其分离纯化方法和应用。本发明采用各种1D和2D核磁谱及高分辨质谱HR‑ESI‑MS对此新化合物进行结构鉴定，推导出其分子式及结构式。进一步经体外细胞活性研究表明，从金莲花中分离得到的二萜苷类新化合物Chinenoside G对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO的释放具有较好的抑制活性，具有抗炎作用。本发明有助于金莲花天然化合物的开发利用。

Description

金莲花中一种二萜苷类新化合物及其分离纯化方法和应用

技术领域

本发明涉及一种天然产物的分离纯化和应用领域，具体涉及一种金莲花二萜苷新化合物及其分离纯化方法和应用。

背景技术

金莲花(Trollius chinensis Bunge)是毛茛科(Ranunculaceae)金莲花属(Trollius L.)植物金莲花的干燥花。其作药用最早记载于《本草纲目拾遗》，性寒，味苦，具有明目、清热解毒的功效。现代临床主要用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎、中耳炎等。

现代药学研究表明，金莲花的主要活性成分为黄酮类等，多具有消炎、抗病毒、抗氧化等作用，且对多种细菌有抑制作用，毒副作用小，是很有价值的植物抗菌药来源。

目前，金莲花在市场上已有许多制剂，但其在1977年版《中国药典》后各版药典再无收载，在个别省市的地方标准中的记载也较为简单。而且也有研究显示其抗炎活性与总黄酮含量不成正比。金莲花作为应用已久的药食同源的药用植物，为提高其质量标准及发现更多具有抗炎活性的指标性成分，对其进行系统的化学分离具有重要意义。

期刊文献(师帅,张建培,刘婷,等.金莲花化学成分的分离与结构鉴定[J].沈阳药科大学学报,2017(4):297-301.)研究了金莲花中的化学成分。方法：采用大孔吸附树脂，正相硅胶，ODS，Sephadex LH-20等柱色谱法和制备型高效液相色谱法等分离技术对金莲花体积分数为60％的乙醇溶液提取物进行分离、纯化，并通过化合物的理化性质与波谱特征鉴定其结构。结果：从体积分数为60％的乙醇溶液提取物中分离并鉴定了10个化合物，分别为cirsimarin(1)、icariside B₆(2)、(+)-(R)-腈甲基-3-羟基氧吲哚[(+)-(R)-cyanomethyl-3-hydroxyoxindole,3]、黑麦草内酯(loliolide,4)、腺嘌呤(adenine,5)、3,4-二羟基苯甲醛(3,4-dihydroxybenzaldehyde,6)、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷(acacetin-7-O-β-D-glucoside,7)、2"-O-(3″′,4″′-二甲氧基苯甲酰基)牡荆苷[2"-O-(3″′,4″′-dimethoxybenzoyl)vitexin,8]、pinoresinol-β-D-glucopyranoside(9)、芹菜素-8-C-(2"-O-阿魏酰基)-β-D-葡萄糖苷[apigenin-8-C-(2"-O-feruloyl)-β-D-glucoside,10]。结论：化合物1-6为首次从金莲花属植物中分离得到。而目前未见如本申请的从金莲花中分离得到的二萜苷类新化合物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供金莲花中一种二萜苷类新化合物及其分离纯化方法和应用。

第一方面，本发明提供了一种二萜苷类化合物或其药学上可接受的盐，所述二萜苷类化合物其结构如式(Ⅰ)所示：

第二方面，本发明提供了所述的二萜苷类化合物的制备方法，包括以下步骤：对金莲花使用乙醇进行提取，得到提取物后，再分离纯化得到所述二萜苷类化合物。

作为一种优选的实施方式，所述制备方法包括以下步骤：

①取金莲花的干燥花，经粉碎后用80％-98％乙醇浸泡、回流提取，提取1-5次，每次0.1-5小时，合并提取液，减压浓缩得到乙醇总浸膏，将上述总浸膏溶于蒸馏水后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，减压浓缩后得到各部位浸膏；

②取步骤①得到的二氯甲烷部位浸膏经过硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯和乙酸乙酯-甲醇溶剂体系进行梯度洗脱；

③取步骤②得到的石油醚-乙酸乙酯(1:1，v/v)洗脱下来的流份，先通过MPLC柱色谱分离，分离体系为甲醇:水(4:6-1:0，v/v)，其中甲醇:水(1:0，v/v)洗脱下来的流份通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析分离，洗脱溶剂体系依次为石油醚:二氯甲烷:甲醇(5:5:1，v/v/v)和甲醇(100％)，得到的流份再通过PTLC制备方法，展开剂体系为二氯甲烷:丙酮(5:1，v/v)，从距离制备板上边缘三分之一处的条带，分离得到所述二萜苷类化合物。

第三方面，本发明提供了所述的二萜苷类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。

作为一种优选的实施方式，所述抗炎药物用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎或中耳炎。

第四方面，本发明提供了一种提取物，含有如上所述的二萜苷类化合物。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物，含有如上所述的二萜苷类化合物或其药学上可接受的盐。

作为一种优选的实施方式，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体选自稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调控剂、促渗透剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、增甜剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。

根据本发明，本发明化合物、提取物可单独或以药物组合物的形式使用，给药方式可根据具体情况而定，并可根据需要按照药剂学领域的常规方法制成适合口服、直肠给药、肌肉注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、膏剂、贴剂、注射剂等。

本发明化合物或其药学上可接受的盐或提取物的用量取决于使用对象的年龄、体重和疾病的类型及严重程度等因素。

本发明优点在于：

本发明从金莲花中分离得到一种二萜苷类新化合物Chinenoside G，该化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO的释放具有较好的抑制活性，具有较强的抗炎作用。本发明为金莲花天然化合物的开发利用奠定了基础。

附图说明

图1为本发明的二萜苷类新化合物的¹H-NMR谱图。

图2为本发明的二萜苷类新化合物的¹³C-NMR谱图。

图3为本发明的二萜苷类新化合物的HSQC谱图。

图4为本发明的二萜苷类新化合物的HMBC谱图。

图5为本发明的二萜苷类新化合物的¹H-¹H COSY谱图。

图6为本发明的二萜苷类新化合物的¹H-¹H NOESY谱图。

图7为本发明的二萜苷类新化合物的HR-ESI-MS图。

图8为Chinenoside G对NO释放的影响。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明所述的分离纯化方法进行进一步说明，但本发明所保护的范围并不限于此。

实施例1本发明二萜苷类新化合物的制备

本实施例的二萜苷类新化合物的结构式如下：

1、该二萜苷类化合物的制备方法，包括以下步骤：

①取金莲花的干燥花18kg，经粉碎后用95％乙醇浸泡、回流提取，温度82℃，提取3次，每次2.5小时，合并提取液，减压浓缩，待浓缩液挥至无醇味得到乙醇总浸膏。将上述总浸膏分散于9L蒸馏水后，依次石油醚(60–90℃)、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，每个部位萃取3-5次，每次10L，减压回收溶剂得到各部位浸膏。

②取步骤①得到的二氯甲烷部位浸膏(63.5g)经过硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯(1:0-0:1，v/v)和乙酸乙酯-甲醇(10:0-0:1，v/v)溶剂体系进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3-5个柱体积，减压回收溶剂，合并相同流份，得到10个组分，Fr.1-10。

③取步骤②得到的组分Fr.5(3g)(石油醚-乙酸乙酯，1:1，v/v，洗脱下来的流份)，先通过MPLC柱色谱分离，分离体系为甲醇:水(4:6-1:0，v/v)，每个梯度洗脱3-5个柱体积；其中甲醇:水(1:0，v/v)洗脱下来的流份通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析进行分离，洗脱溶剂体系依次为石油醚:二氯甲烷:甲醇(5:5:1，v/v/v)和甲醇(100％)；得到的流份再通过PTLC制备方法，展开剂体系为二氯甲烷:丙酮(5:1，v/v)，从距离制备板上边缘三分之一处的条带，分离得到目标化合物二萜苷类新化合物Chinenoside G(30mg)，化学名称为2″-O-butyryl-7-O-β-D-fucosyl-6β,7β,8αtrihydroxylabda-13(16),14-diene。

2、运用现代核磁谱技术1D和2D NMR及高分辨质谱HR-ESI-MS对该单体化合物进行结构鉴定

如图1至7及表1所示，化合物Chinenoside G为白色固体，根据HR-ESI-MS m/z561.3392[M+Na]⁺(计算值561.3403)，结合NMR谱确定其分子式为C₃₀H₅₀O₈。经鉴定，化合物结构为式(Ⅰ)。

表1化合物Chinenoside G的¹H和¹³C-NMR(400/100MHz,CDCl₃)数据(ppm)

^eOverlapped signals.

实施例2本发明二萜苷类新化合物的对NO生成的抑制活性

1、药物配制

Chinenoside G用DMSO溶解，配成0.1mol/L的母液。用PBS稀释，测试浓度为25μmol/l，15μmol/l，10μmol/l，5μmol/l，2.5μmol/l，1μmol/l。

2、细胞培养

小鼠巨噬细胞RAW264.7生长于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，并在5％CO₂、饱和湿度和37℃的培养箱中悬浮培养，取对数生长期细胞用于实验。

3、CCK-8测试药物对细胞增殖的影响

RAW264.7细胞以2×10⁵个/mL的密度接种于96孔板，贴壁后用不同浓度的Chinenoside G和25μmol/l的氨基胍盐酸盐(Ag，阳性对照药)处理24h后，取出，弃上清，每孔加入10μL CCK-8溶液和90μL完全培养基，将培养板在培养箱内孵育45min后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)。只有CCK-8溶液和完全培养基的孔记为完全空白组，所有组别均至少有三个复孔。以此确定Chinenoside G的安全作用浓度。

4、NO含量测定

RAW264.7细胞以2×10⁵个/mL的密度接种于96孔板，贴壁后先用不同浓度的Chinenoside G和25μmol/l的氨基胍盐酸盐(Ag，阳性对照药)预作用2h后再加入100ng/mLLPS与药物共同作用24h，取细胞培养液上清80μl，加入等体积的Griess试剂，在室温条件下反应10min，用酶标仪测定在540nm处的吸光度(OD值)。空白组为只有培养基，对照组为培养基+细胞，模型组为LPS，给药组为LPS+25μmol/l，15μmol/l，10μmol/l，5μmol/l，2.5μmol/l，1μmol/l的Chinenoside G及25μmol/l的氨基胍盐酸盐，所有组别均至少有三个复孔。

Inhibition(％)＝(A_{LPS treated}-A_{LPS+sample trested})/(A_{LPS treated}-A_untreated)*100％

5、结果

Chinenoside G对NO释放的影响见图8，结果表明Chinenoside G能显著抑制NO生成，并呈现浓度依赖性，IC50为1.64μM。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种二萜苷类化合物或其药学上可接受的盐，所述二萜苷类化合物其结构如式（Ⅰ）所示：

。

2.权利要求1所述的二萜苷类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：对金莲花使用乙醇进行提取，得到提取物后，再分离纯化得到所述二萜苷类化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

①取金莲花的干燥花，经粉碎后用80%-98%乙醇浸泡、回流提取，提取1-5次，每次0.1-5小时，合并提取液，减压浓缩得到乙醇总浸膏，将上述总浸膏溶于蒸馏水后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，减压浓缩后得到各部位浸膏；

③取步骤②得到的石油醚-乙酸乙酯1:1，v/v洗脱下来的流份，先通过MPLC柱色谱分离，分离体系为甲醇:水4:6-1:0，v/v，其中甲醇:水1:0，v/v洗脱下来的流份通过SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱层析分离，洗脱溶剂体系依次为石油醚:二氯甲烷:甲醇5:5:1，v/v/v和甲醇100%，得到的流份再通过PTLC制备方法，展开剂体系为二氯甲烷:丙酮5:1，v/v，从距离制备板上边缘三分之一处的条带，分离得到所述二萜苷类化合物。

4.权利要求1所述的二萜苷类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎或中耳炎。

6.一种药物组合物，其特征在于，含有如权利要求1所述的二萜苷类化合物或其药学上可接受的盐。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调控剂、促渗透剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、增甜剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。