CN111704544B - 一种半日花烷型二萜类化合物及其分离方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物化学技术领域，公开了一种半日花烷型二萜类化合物及其分离方法和应用。本发明从裸花紫珠叶子中提取分离出新骨架半日花烷型二萜类化合物A1和A2，两者为一对差向异构体，为首次发现此类碳骨架结构。药物活性实验表明本发明化合物具有明显的抗炎活性，说明其在制备预防或治疗炎症药物方面具有良好的应用前景。

Description

一种半日花烷型二萜类化合物及其分离方法和应用

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种半日花烷型二萜类化合物及其分离方法和应用。

背景技术

裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.)又名赶风柴、节节红，是马鞭草科(Verbenacase)紫珠属(Callicarpa)植物，为海南省道地药材，也是黎族地区常用药材之一。其地上部位均可入药，有消炎解毒，散瘀消肿，抗菌止血等功效，主治化脓性炎症、创伤性出血、消化道和呼吸道感染、烧烫伤等症。临床辅助用于皮肤科、妇科、五官科、外科等各类术后出血型疾病。现已被2015年版《中国药典》新增中药品种收录。

裸花紫珠的化学成分研究报道主要为黄酮(苷)类、苯丙素(苷)类、二萜、三萜、环烯醚萜类、酚酸类等多种类的化合物，且都具有较好的生物活性。部分半日花烷型二萜类化合物具有抗炎作用，但效果欠佳。裸花紫珠中含有大量具有生活活性的化合物，本发明旨在对裸花紫珠化学成分进一步分离研究，以期得到新结构的具有显著抗炎作用的半日花烷型二萜类化合物，充分发挥裸花紫珠的药用价值。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供一种新结构的高度修饰半日花烷型二萜类化合物，具有显著的抗炎作用，并提供目标化合物的分离方法。

本发明技术方案如下：

本发明提供一种高度修饰半日花烷型二萜类化合物，A环经过裂环、降碳、C2-C18环合而成，分别为化合物A1和A2，其结构分别为：

本发明还提供了化合物A1和A2的分离方法，包括以下步骤：

(1)将干燥裸花紫珠叶子粉碎，将裸花紫珠粉末使用乙醇溶液加热50～60℃提取，得到提取液，减压浓缩得粗提物；

(2)将粗提物用水稀释制成悬浮液后，用二氯甲烷萃取，合并有机相，减压浓缩得浸膏；

(3)取步骤(2)二氯甲烷萃取得到的浸膏，先经硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度为(30:1)～(1:1)，根据极性大小共得到5个组分，即Fr.1～Fr.5；

(4)将Fr.3先经正相硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度为(20:1)～(1:1)，减压浓缩后再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为MeOH，洗脱3～6个柱体积，减压浓缩后再经高效液相色谱HPLC制备，依次得到化合物A1和A2。

优选的，步骤(1)中，所述提取次数为2次以上，每次提取1～3h，合并提取液；步骤(2)中，用二氯甲烷萃取3次以上。

优选的，步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积分数75～95％，其用量为每千克裸花紫珠粉末用2～3L乙醇溶液。

优选的，步骤(2)中，水的用量为每100克粗提物加水300～400mL，每次萃取的有机溶剂的体积用量是水体积的1.2-1.3倍。

优选的，步骤(3)中，石油醚-乙酸乙酯混合溶剂的洗脱梯度为30:1、20:1、10:1、5:1、1:1，每个梯度收集三个柱体积，每个梯度得到一个组分，共得到5个组分，即Fr.1～Fr.5。

优选的，步骤(4)中，石油醚-乙酸乙酯混合溶剂的洗脱梯度为20:1、10:1、5:1、1:1，每个梯度洗脱2～5个柱体积；高效液相色谱的条件为：色谱柱Waters C₁₈，流速为2mL/min，流动相为体积比60:40的MeCN:H₂O。

优选的，裸花紫珠采集于海南五指山。

本发明还通过药理活性实验，确认所得化合物A1和A2具有良好的抗炎效果，提示化合物A1和A2在制备预防或治疗炎症的药物中具有良好的应用前景。所述炎症为系统性炎症反应综合症、支气管炎、肺炎、胃炎、肠炎或肝炎。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明从裸花紫珠叶子中提取分离出新骨架半日花烷型二萜类化合物A1和A2，两者为一对差向异构体，为首次发现此类碳骨架结构。药物活性实验表明本发明化合物具有明显的抗炎活性，说明其在制备预防或治疗炎症药物方面具有良好的应用前景。具体地，本发明通过溶剂浸提、蒸馏水溶解分散、极性溶剂萃取、溶剂梯度洗脱和液相色谱分离等多级分离提取方法，从裸花紫珠浸膏中得到经过开环、降碳、C2-C18环合特征的新骨架半日花烷型二萜类化合物。

附图说明

图1：本发明化合物A1的¹H-NMR谱(MeOD-d₄)；

图2：本发明化合物A1的¹³C-NMR谱(MeOD-d₄)；

图3：本发明化合物A1的DEPT(135°)谱(MeOD-d₄)；

图4：本发明化合物A1的¹H-¹H COSY谱(MeOD-d₄)；

图5：本发明化合物A1的HSQC谱(MeOD-d₄)；

图6：本发明化合物A1的HMBC谱(MeOD-d₄)；

图7：本发明化合物A1的NOESY谱(MeOD-d₄)；

图8：本发明化合物A1的HRESIMS谱；

图9：本发明化合物A2的¹H-NMR谱(MeOD-d₄)；

图10：本发明化合物A2的¹³C-NMR谱(MeOD-d₄)；

图11：本发明化合物A2的DEPT(135°)谱(MeOD-d₄)；

图12：本发明化合物A2的¹H-¹H COSY谱(MeOD-d₄)；

图13：本发明化合物A2的HSQC谱(MeOD-d₄)；

图14：本发明化合物A2的HMBC谱(MeOD-d₄)；

图15：本发明化合物A2的NOESY谱(MeOD-d₄)；

图16：本发明化合物A2的HRESIMS谱。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实验材料裸花紫珠采集于海南五指山，所用部位为叶子。

实施例1高度修饰半日花烷型二萜类化合物的制备

包括以下步骤：

(1)将干燥裸花紫珠叶子粉碎，取1500g裸花紫珠粉末，按每千克裸花紫珠粉末用2L乙醇溶液(体积分数75％)加热50～60℃提取3次，每次提取3h，合并提取液，减压浓缩得粗提物(约300g)；

(2)取每100克粗提物加蒸馏水300mL稀释制成悬浮液后，用二氯甲烷萃取4次，合并有机相，减压浓缩得浸膏；每次萃取的有机溶剂的体积用量是水体积的1.2倍。

(3)取步骤(2)二氯甲烷萃取得到的浸膏(约55g)，先经硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度为30:1、20:1、10:1、5:1、1:1，每个梯度收集3个柱体积，每个梯度得到一个组分，共得到5个组分，5个组分依次为Fr.1～Fr.5。

(4)将Fr.3先经正相硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度为20:1、10:1、5:1、1:1，每个梯度洗脱2个柱体积，产物减压浓缩后再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为MeOH，洗脱3个柱体积，减压浓缩后再经高效液相色谱HPLC制备，得到化合物A1和A2；高效液相色谱的条件为：色谱柱Waters C₁₈，流速为2mL/min，流动相为体积比60:40的MeCN:H₂O。

实施例2高度修饰半日花烷型二萜类化合物的制备

包括以下步骤：

(1)将干燥裸花紫珠叶子粉碎，取1600g裸花紫珠粉末，按每千克裸花紫珠粉末用2L乙醇溶液(体积分数95％)加热50～60℃提取4次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩得粗提物(约330g)；

(2)将每100克粗提物加水400mL稀释制成悬浮液后，用二氯甲烷萃取5次，合并有机相，减压浓缩得浸膏；每次萃取的有机溶剂的体积用量是水体积的1.3倍。

(3)取步骤(2)二氯甲烷萃取得到的浸膏(约60g)，先经硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度为30:1、20:1、10:1、5:1、1:1，每个梯度收集3个柱体积，每个梯度得到一个组分，共得到5个组分，即Fr.1～Fr.5。

(4)将Fr.2先经正相硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度为20:1、10:1、5:1、1:1，每个梯度洗脱5个柱体积，产物减压浓缩后再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为MeOH，洗脱6个柱体积，减压浓缩后再经高效液相色谱HPLC制备，得到化合物A1和A2；高效液相色谱的条件为：色谱柱Waters C₁₈，流速为2mL/min，流动相为体积比60:40的MeCN:H₂O。

实施例3高度修饰半日花烷型二萜类化合物的结构鉴定

运用波谱(¹H NMR，¹³C NMR，HSQC，HMBC，NOESY)和MS等现代结构鉴定技术，确定实施例1和实施例2所得化合物A1和A2的化学结构。

结构鉴定数据如下：

化合物A1：为无色油状物，易溶于甲醇。经高分辩质谱HRESI(-)MS(m/z 251.1653[M-H]^□，理论值251.1659)确定其分子式为C₁₅H₂₄O₃；根据¹H，¹³C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为高度修饰半日花烷型二萜，将其命名为callnudoid A，其¹H和¹³C NMR数据归属见表1。[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，溶剂：MeOD-d₄]。

化合物A2：为无色晶状物，易溶于甲醇。经高分辩质谱HRESI(-)MS(m/z 251.1653[M-H]^□，理论值251.1644)确定其分子式为C₁₅H₂₄O₃；根据¹H，¹³C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为高度修饰半日花烷型二萜，将其命名为callnudoid B。其¹H和¹³C NMR数据归属见表1。[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

表1.化合物A1和A2的¹H-NMR和¹³C-NMR(400,100MHz)数据

^a测量试剂为MeOD-d₄.

经以上分析，确定化合物A1和A2结构为：

实施例4 药理活性实验

实验材料：

细胞：小鼠单核巨噬细胞Raw264.7。

细胞培养液：含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，脂多糖(LPS)碳水化合物。

NO检测试剂盒：普利莱(APPLYGEN)，货号：E1030。

实验方法：

诱导：Raw264.7细胞用含10％FBS的DMEM培养液于37℃、5％CO₂培养箱中常规培养。细胞按1×10⁵/mL、200μL/孔接种于96孔板中，分别设置空白对照组、LPS诱导组、受试药物高、中、低(50,25,12.5μM)剂量组，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中贴壁24h后。

检测：吸取50μL上清作为待测液于96孔板中，根据试剂盒说明书的检测方法，依次加入50μL试剂A，50μL试剂B，采用酶标仪在540nm处测OD值。

化合物的抗炎活性结果如表2所示：

表2化合物A1和A2对RAW264.7细胞抗炎活性

注：与空白比，^***P<0.001，与LPS比，^###P<0.001,^##P<0.01,^#P<0.05；

从上述结果可知，化合物A1和A2在25μM和12.5μM都表现出明显的抗炎效果，IC₅₀分别为7.46和9.49μM。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (7)

1.一种半日花烷型二萜类化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如式A1或A2所示：

（A1）或

（A2）。

2.权利要求1所述半日花烷型二萜类化合物的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将干燥裸花紫珠叶子粉碎，将裸花紫珠粉末使用乙醇溶液加热50~60℃提取，得到提取液，减压浓缩得粗提物；

所述乙醇溶液的体积分数为75~95%，其用量为每千克裸花紫珠粉末用2~3 L乙醇溶液；

（2）将步骤（1）的粗提物用水稀释制成悬浮液后，用二氯甲烷萃取，合并有机相，减压浓缩得浸膏；

（3）取步骤（2）二氯甲烷萃取得到的浸膏，先经硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度为30:1、20:1、10:1、5:1、1:1，每个梯度收集3个柱体积，每个梯度得到一个组分，根据极性大小共得到5个组分，即Fr.1~Fr.5；

（4）将Fr.3先经正相硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度为20:1、10:1、5:1、1:1，每个梯度洗脱2~5个柱体积，减压浓缩后再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为MeOH，洗脱3~6个柱体积，减压浓缩后再经高效液相色谱HPLC制备，依次得到化合物A1和A2；

所述高效液相色谱的条件为：色谱柱Waters C₁₈，流速为2 mL/min，流动相为体积比60:40的MeCN:H₂O。

3.根据权利要求2所述的半日花烷型二萜类化合物的分离方法，其特征在于，步骤（1）中，所述提取次数为2次以上，每次提取1~3 h，合并提取液；步骤（2）中，用二氯甲烷萃取3次以上。

4.根据权利要求2所述的半日花烷型二萜类化合物的分离方法，其特征在于，步骤（2）中，水的用量为每100克粗提物加水300~400 mL，每次萃取的有机溶剂的体积用量是水体积的1.2~1.3倍。

5.根据权利要求2所述的半日花烷型二萜类化合物的分离方法，其特征在于，所述裸花紫珠为采集于海南五指山的裸花紫珠。

6.权利要求1所述的半日花烷型二萜类化合物在制备预防或治疗炎症的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述炎症为支气管炎、肺炎、胃炎、肠炎或肝炎。

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