CN116354811B - 一种半日花烷型二萜化合物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学医药领域，具体涉及一种半日花烷型二萜化合物、制备方法及应用。其制备方法包括如下步骤：先将裸花紫珠加水提取，将提取物依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；其次将乙酸乙酯萃取液部分，经硅胶柱层析，收集洗脱液得9个组分，计为Fr.1‑Fr.9；再将Fr.3经小孔树脂柱层析，洗脱溶剂为甲醇‑水溶液，收集洗脱液得Fr.3.C；再将Fr.3.C经葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液得Fr.3.A.1‑Fr.3.A.6；最后将Fr.3.A.1经反相色谱柱分离纯化，收集25‑30min的洗脱液即得。本发明化合物能降低LPS刺激的BV‑2细胞中促炎细胞因子的表达，用于制备预防或治疗神经炎症性疾病药物。
Description
技术领域
本发明属于生物化学医药领域，具体涉及一种半日花烷型二萜化合物、制备方法及应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD) 也称为发生在中枢神经系统 (CNS) 中的退行性疾病。AD的发病机制复杂，基于β淀粉样蛋白（Aβ）级联理论和Tau蛋白理论的神经炎症学说受到更多关注。 神经炎症是大脑中的一种慢性炎症，可导致神经退行性疾病，如营养不良的神经元生长。小胶质细胞是大脑的主要免疫细胞，是中枢神经系统天然免疫应答和组织修复的第一道防线，在中枢神经系统的自然免疫应答中发挥着重要作用。小胶质细胞介导的神经炎症对中枢神经系统具有保护和破坏作用。通常，这些细胞响应环境压力而被激活，并产生多种生物活性分子，通过去除受损细胞和碎片来恢复 CNS 稳态。
然而，不受控制和持续的炎症可以通过触发损害神经组织的神经毒性因子的产生来加剧神经退行性疾病的进展。这是几种神经退行性疾病的共同特征。因此，尽管适当程度的神经炎症有助于组织稳态的恢复和维持，但不受控制的神经炎症可使神经元损伤永久化，并被认为是许多神经退行性疾病的罪魁祸首之一。 因此，控制小胶质细胞活化和随后抑制神经毒性促炎分子的产生将是设计用于治疗神经系统疾病的有效神经保护策略的重要组成部分。
脂多糖 (LPS) 是内毒素的主要成分，可引发一些主要的细胞效应，在炎症反应的发病机制中起关键作用，在LPS模拟的炎症过程中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和核因子-κB（NF-κB）被认为是调节免疫和炎症反应的两个重要信号通路。 LPS诱导三种主要的MAPK通路 p38、JNK和ERK的磷酸化，从而激活促炎细胞因子的产生。
裸花紫珠（C. nudiflora）的干燥地上部分被用作传统中药之一，中医认为裸花草具有抗炎、抗抑郁、抗溃疡、收敛止血、治疗烧烫伤等作用。从药用植物中分离出的天然化合物来治疗人类疾病，与化学合成药物相比，通常被认为毒性较低且副作用较少。 因此，植物来源的材料作为生化活性剂在治疗许多疾病（包括神经炎症性疾病）中已有研究，但是具有确切多靶点多角度来治疗神经性炎症的化合物仍有待开发，且药效也有待进一步提高，以来适应临床的需求。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种半日花烷型二萜化合物，该化合物抑制 NO 释放的作用显著优于其他相似化合物和地塞米松阳性药。
为了实现本发明目的，采用的技术方案如下：
一种半日花烷型二萜化合物，所述化合物的结构如式Ⅰ所示：
Ⅰ。
本发明将该化合物命名为Callicapene M8，简称CM。
本发明再一目的是提供上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将裸花紫珠加水提取，得提取物；
（2）将提取物依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取液部分；
（3）将乙酸乙酯萃取液部分，经硅胶柱层析，洗脱溶剂为二氯甲烷-甲醇，洗脱梯度为500:1～50:1（v/v），收集洗脱液得9个组分，计为Fr.1-Fr.9；
（4）将 Fr.3 经小孔树脂柱层析，洗脱溶剂为甲醇-水溶液，洗脱梯度为20:80～80:20（v/v），收集洗脱液得Fr.3.C；
（5）将Fr.3.C经葡聚糖凝胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液得Fr.3.A.1-Fr. 3.A.6；
（6）将Fr.3.A.1经反相色谱柱分离纯化，洗脱液为15-25%乙腈水溶液，流速为2-4mL/min，收集25-30min的洗脱液即得。
优选地，步骤（1）中所述裸花紫珠与水的质量比为1：180-220；所述提取前浸泡10-14h，所述提取为煎煮2-4次，每次0.5-1.5h。
优选地，步骤（2）操作为将提取物制成浓度为1.35g/ml的水溶液，然后先用二氯甲烷萃取，将二氯甲烷萃取的有机溶液萃余液再用乙酸乙酯萃取，最后用正丁醇对乙酸乙酯萃取的有机溶液萃余液进行萃取，取乙酸乙酯萃取液部分。
优选地，步骤（2）操作为将提取物先用二氯甲烷（400ml）萃取，将二氯甲烷萃取的有机溶液萃余液再用乙酸乙酯（400ml）萃取，最后用正丁醇（400ml）对乙酸乙酯萃取的有机溶液萃余液进行萃取，取乙酸乙酯萃取液部分。进一步，将乙酸乙酯萃取液部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取液部分浸膏。
优选地，步骤（3）中所述梯度洗脱为依次用体积比为500:1，400:1，300:1，200:1，100:1，50:1的洗脱溶剂进行洗脱，共用洗脱液的体积为2-4BV，优选为3BV。
优选地，步骤（4）中所述小孔树脂柱为MCI柱，所述梯度洗脱为依次用20:80，30:70，40:60，50:50，60:40，70:30，80:20进行洗脱，共用洗脱液的体积为2-4BV，优选为3BV；上样量与柱填料体积比为1：10；优选每个浓度所用的溶剂体积为500-600ml，优选550ml。
优选地，步骤（5）中所述葡聚糖凝胶柱为Sephadex LH-20 CC柱，共用洗脱液的体积为2-4BV，优选为3BV；上样量与柱填料体积比为1：10；所述洗脱的体积为500-600ml，优选550ml。
优选地，步骤（6）中所述反相色谱柱为C18色谱柱，洗脱液为20%乙腈水溶液，流速为3mL/min，收集27-28min的洗脱液,优选27.7min的洗脱液。
本发明还有一个目的是提供上述化合物或上述制备方法制备得到的化合物在制备预防或治疗神经炎症性疾病药物中的应用。
优选地，所述化合物抑制脂多糖诱导的小胶质细胞中的促炎细胞因子，和/或抑制MAPKs信号通路，和/或抑制NF-κB信号通路，和/或增加M2型基因的表达，和/或降低小胶质细胞凋亡。
优选地，所述神经炎症性疾病选自阿尔茨海默病。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
（1）本发明通过特定的提取纯化，分离出一种新型的拉丹烷型二萜类化合物Callicapene M8（简称CM），并对其结构进行了确证，其通过一维和二维核磁共振光谱、质谱和圆二色性明确确定。该化合物为黄色油状物，[α][20]D+4.5（c = 0.2，MeOH）。其分子式通过正高分辨率电喷雾电离质谱 (HRESIMS) 确定为C19H32O4。
（2）本发明进一步对该化合物的药效、作用机制进行了研究，结果发现，本发明化合物在12.5-50μM浓度下可以维持细胞活力，对BV2细胞没有任何细胞毒作用。且本发明化合物能显著降低LPS干预的细胞凋亡率；还能降低LPS刺激的BV-2细胞中促炎细胞因子的表达；且可以上调M2型相关基因的表达；且可抑制NF-κB信号通路的激活和NF-κB-p65的核转位，抑制LPS刺激的BV-2细胞中MAPKs信号通路的激活。且分子对接实验结果表明，化合物中的酚羟基和醛基对抗炎活性具有协同作用。
（3）本发明通过对现有抗炎物质与CM化合物的抗炎效果（一氧化氮测定实验）进行比较，结果发现，本发明CM化合物抑制 NO 释放的作用显著优于其他化合物和地塞米松阳性药。
附图说明
图1为本发明Ⅰ式化合物的1H-1H-COSY谱；
图2为本发明Ⅰ式化合物的DEPT谱；
图3为本发明Ⅰ式化合物的氢谱；
图4为本发明Ⅰ式化合物的碳谱；
图5为本发明Ⅰ式化合物的HMBC图；
图6为本发明Ⅰ式化合物的HSQC图；
图7为本发明Ⅰ式化合物的NOESY图；
图8为本发明Ⅰ式化合物对细胞活力的影响；
图9为本发明Ⅰ式化合物与LPS共培养对细胞活力的影响；
图10为本发明Ⅰ式化合物对细胞生长形态的影响；
图11为本发明Ⅰ式化合物对NO产生的影响；
图12为本发明Ⅰ式化合物对细胞凋亡抑制作用的影响；
图13为本发明Ⅰ式化合物对细胞炎症因子TNF-α和IL-6的影响；
图14为本发明Ⅰ式化合物对细胞炎症因子iNOS、COX-2、IL-6和TNF-αmRNA的影响；
图15为本发明Ⅰ式化合物对NF-κB P65核转位的影响；
图16为本发明Ⅰ式化合物对MAPKs信号通路蛋白表达的分析；
图17为本发明Ⅰ式化合物对MAPKs信号通路蛋白表达的定量分析。
注：图片中不太清晰之处不影响本发明技术方案的公开和理解。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明的原料均为市售常规材料。其中，裸花紫珠C. nudiflora 的地上部分于 2020 年 6 月购自海南白沙恒生园种植合作社（东经 109°62′29″，北纬19°18′92″），经江西科技大学药学院范翠生教授鉴定为裸花紫珠。 凭证标本（编号Y202101G）保存于江中药谷研究中心。
制备高效液相色谱系统（大连精英分析仪器有限公司，中国）； C18柱为YMC-Triart C18 半制备柱（250×10 mm, 5 μm, YMC Co, Ltd., Kyoto, Japan）； 色谱柱硅胶（200-300目，青岛海洋化工，中国青岛）和色谱柱Sephadex LH-20（25-100 mm，GEHealthcare Bio-Sciences AB，瑞典）；MCI CHP-20（75-150μm，三菱化学公司，日本东京）。
实施例1
本发明的拉丹烷型二萜类化合物（Callicapene M8，简称CM）的制备方法如下：
（1）将裸花紫珠的地上部分3.0kg在室温下浸泡在水中12 h，然后加热煎煮3次，每次煎煮1h；过滤，合并提取液，在旋转蒸发器（Buchi，瑞士）中减压蒸发溶剂，得提取物1.2kg；
（2）将上述提取物溶解在蒸馏水中，先用二氯甲烷（400ml）萃取，将二氯甲烷萃取的有机溶液萃余液再用乙酸乙酯（400ml）萃取，最后用正丁醇（400ml）对乙酸乙酯萃取的有机溶液萃余液进行萃取，取乙酸乙酯萃取液部分；
（3）将乙酸乙酯萃取液部分 (314 g) 进行硅胶 CC 柱层析，上样量与柱填料体积比为1：10，依次用体积比为500:1，400:1，300:1，200:1，100:1，50:1的二氯甲烷-甲醇溶液洗脱溶剂进行梯度洗脱，共用洗脱液的体积为3BV（40L），每个梯度的洗脱溶剂为550ml；得到9 个组分（Fr.1-Fr.9）。
（4）将组分Fr.3 (30.14 g)在MCI柱上纯化，上样量与柱填料体积比为1：10，洗脱溶剂为甲醇-水溶液，梯度洗脱为依次用体积比20:80，30:70，40:60，50:50，60:40，70:30，80:20的甲醇-水水溶液进行洗脱，共用洗脱液的体积为3BV，每个浓度所用的溶剂体积为550ml；得Fr.3.C (9.2 g) ；
（5）将组分Fr.3.C过Sephadex LH-20 CC层析柱，上样量与柱填料体积比为1：10，用二氯甲烷-甲醇 (1:1，v/v)溶液洗脱，共用洗脱液的体积为3BV，洗脱体积为550ml，得到六个组分 (Fr.3.A.1-Fr.3.A.6)。
（6）将Fr.3.A.1 (350.3 mg) 在C18柱上用流动相乙腈-水溶液中 (20:80，v/v）洗脱，流速3 ml/min，收集洗脱液，得到Callicapene M8 (1.2 mg，tR= 27.7min）。
实施例2 结构鉴定
运用紫外、红外、核磁共振等对实施例1化合物结构鉴定如下：
Callicapene M8：黄色油状；
[α][20]D +4.5 (c = 0.2, MeOH)；
UV(MeOH) λmax (logε) 238 nm；
IR(KBr) νmax 3441, 2820, 2720, 1675 cm[-1]; CD (MeOH) λmax 236 (Δε+3.17) nm；
[1]H NMR（甲醇-d4，600 MHz）和[13]C NMR（甲醇-d4，150 MHz）数据如表 1 -2所示；
阳性HRESIMS [M+Na][+]m/z 347.2230（C19H32NaO4的计算值，347.2220）。
综合采用核磁共振氢谱、碳谱，HSQC，HMBC，1H-1HCOSY，质谱方法鉴定结构，结果见图1-7。
表1 化合物1的1H-NMR（600 MHz）数据（δ in ppm，Jin Hz）
溶剂为CD3OD. 信号部分被遮挡用b标记。
表2 化合物1的13C-NMR（150 MHz）数据（δ in ppm）
实施例3 化合物的药效研究试验
3.1细胞活力测定
（1）小胶质细胞 BV2 细胞培养
BV2 细胞在补充有10% FBS和1% 青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养，并在37℃和5% CO2的潮湿空气中培养。将LPS溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中作为储备液(1mg/ml)并储存在-20℃。将BV2 细胞分别接种到96孔板或6孔板中，然后在 LPS 处理前24小时使用或不使用不同浓度的CM（1μg/ml）预处理3.5小时。
（2）细胞活力测定
通过 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 测定法（Beyotime，中国）评估细胞活力。
将对数生长期的BV2细胞以9×10[3]/孔、100μL/孔的密度接种于96孔板，细胞包被后，实验分为空白组；各剂量CM组（0、3.125、6.25、12.5、25、50和100μM），每组重复5次，空白组用新鲜培养基，给药组用或不用LPS预处理3.5h刺激。孵育24小时后，加入10%CCK-8培养基，37℃孵育2小时。之后，在450nm处测试吸光度。
结果分析：采用CCK-8法检测不同浓度CM对BV2细胞存活率的影响，结果表明在3.125-50 μM浓度范围内对BV2细胞无明显毒性（图8）。此外，CM在3.125-50 μM 与终浓度为1 μg/m LPS 共孵育时的存活率与空白组无显著差异（图9）。还在显微镜下观察了细胞的形态（图10）。结果表明，CM (12.5-50 μM)维持细胞活力，对 BV2细胞没有任何细胞毒作用。因此，选择此安全浓度范围内的 CM 浓度用于后续实验。
3.2一氧化氮（NO）测定
BV2 细胞以9×10[3]个细胞/孔的密度在96孔板中培养。 孵育24小时（37℃/5%CO2）后，细胞在培养基中分别用化合物1-8（其中化合物1为本发明化合物CM）预处理3.5小时，然后加入 LPS（1μg/ml）。24小时后，用Griess试剂评估上清液中的NO产量。然后将条件培养基(100μL)与等体积的Griess试剂(S0021)I和II混合，并分别孵育15分钟。使用VICTORNivo多模式读板器（PerkinElmer，芬兰）测量混合物在540 nm 处的吸光度。参考由已知浓度的亚硝酸钠生成的标准曲线计算亚硝酸盐浓度。本实验使用地塞米松（DXMS）作为阳性对照药物，并设置空白对照和模型对照。
结果分析：NO 也是一种值得注意的炎症介质，中枢神经系统中过量的 NO 通过激活小胶质细胞并引起炎症反应而具有神经毒性。 因此，抑制 NO 释放有望用于治疗炎症和相关的神经退行性疾病。这些化合物对 BV2 细胞中 LPS 诱导的 NO 产生的抑制活性通过Griess 试剂评估。 结果表明，Callicapene M8是最重要的 NO 释放抑制剂， 结果见图11，其中化合物1-8的化学结构式如下所示：
3.3凋亡细胞测定
BV2细胞的凋亡率通过膜联蛋白V-FITC测定法评估。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞并用胰蛋白酶消化。接下来，将它们（1×10 [6]个细胞）悬浮在 1×结合缓冲液中，并与5 μL结合蛋白Annexin V-FITC 和10μL PI溶液在室温下孵育15分钟并避光。立即通过流式细胞术（Beckman Coulte，美国）评估凋亡细胞，并在488nm激发下测量它们的荧光。通过CytExpert2.4软件分析凋亡BV2细胞的百分比。
结果分析：采用流式细胞术检测BV2细胞凋亡率。如图12所示，与对照组相比，LPS干预组的细胞凋亡率显着增加。同时，与LPS干预组相比，LPS+CM干预组的细胞凋亡率显着降低。
3.3 ELISA 法测定细胞上清液中促炎因子
BV2 细胞以9×10[3]个细胞/孔的密度在96孔板中培养。 孵育24小时（37℃/5%CO2）后，首先用不同浓度（0、6.25、12.5 和 25 μM）的CM预处理细胞3.5小时，然后用LPS（1μg/ml）刺激。 将细胞进一步孵育24小时，并使用ELISA 试剂盒测定培养基中TNF-α 和IL-6的浓度。本实验采用地塞米松（DXMS）作为阳性对照药物。
结果分析：活化的小胶质细胞释放炎症细胞因子，加剧细胞损伤，LPS 可能激活BV2 小胶质细胞，BV2 小胶质细胞是各种炎症细胞因子如 IL-6、TNF-α的主要来源。 为了研究 CM 的抗炎活性，对BV2小胶质细胞进行不同浓度的CM预处理3.5小时，然后用1μg/mlLPS刺激24小时。
通过酶联免疫测定法在LPS刺激的BV2细胞上清液中测量CM处理对两种促炎介质TNF-α和IL-6产生的影响（图13）。与空白组相比，当细胞用CM预处理3.5小时时，化合物CM以浓度依赖性方式减少了 TNF-α和 IL-6 的过量产生。
为了进一步阐明CM对BV2小胶质细胞中LPS诱导的炎症因子表达的影响，使用 RT-qPCR 检测iNOS、COX-2、IL-6和TNF-αmRNA表达水平（图14）。
与正常对照相比，BV2 小胶质细胞在 LPS 刺激后显示出显著更高水平的 iNOS、COX-2、IL-6 和 TNF-α、mRNA 表达。与CM共同处理以浓度依赖性方式抑制LPS诱导的炎性细胞因子mRNA表达水平，其中50μmol/L CM处理组的炎性因子mRNA表达降低最明显，具有显著差异。
3.4 免疫细胞化学
将BV2 细胞(5x10[6])接种到12孔板中过夜，并在加入LPS之前用或不用CM预处理细胞3.5小时。24小时后，吸出上清液，并在37℃下用4%多聚甲醛(PFA)固定细胞30分钟。 然后，将细胞用0.2% Triton X-100在37℃下透化20分钟。细胞与单克隆兔NF-κB p65 (1:500) 在4℃下孵育过夜，然后与二抗Alexa Fluor[®]594偶联的山羊抗兔二抗(1:500)在37℃孵育2小时℃避光。然后在37℃下用含有荧光淬灭的DAPI对细胞核染色10分钟。用荧光显微镜（放大倍数，x40；Leica）捕获荧光图像。
结果分析：NF-κB 是由 LPS 或促炎细胞因子介导的炎症反应的主要调节成分。iNOS 和 COX-2 启动子区域包含 NF-κB 位点，这些位点是诱导这些基因表达所必需的。因此，本发明进一步研究了复方 CM 是否可以调节 NF-κB 通路。 NF-κB信号通路的激活和NF-κB p65的核转位参与调节促炎细胞因子的产生，因此通过免疫印迹检测NF-κB信号通路中p65磷酸化和总蛋白的表达水平. 结果表明，LPS 增强了被 CM 抑制的 p65 磷酸化表达（图15），表明 CM 可能通过抑制 NF-kB 信号传导发挥其抗炎作用。 此外，为了清楚地了解CM 对 NF-κB p65 核易位的影响，使用免疫荧光染色观察分析了 BV2 细胞中 NF-κB 向细胞核的易位。 结果表明，NF-κB p65 通常被隔离在细胞质中，但在 LPS 刺激 BV2 小胶质细胞后，NF-κB p65 的核积累被强烈诱导（图15，B，LPS 面板）。 用 CM 预处理细胞后，LPS诱导的 NF-κB p65易位逐渐消除（图15，B，LPS +不同浓度的 CM 面板）。这些结果表明CM可能通过抑制 NF-κB 的核转位来抑制 BV2 小胶质细胞中NFκB的活化。
3.5 蛋白质印迹分析
在 LPS 处理前3.5小时用不同浓度的CM处理后，用PBS洗涤BV2细胞并在指定的时间点收获。细胞在200μLRIPA 裂解缓冲液中裂解，然后加1%蛋白水解酶抑制剂和1%磷酸化蛋白水解酶抑制剂。在冰上孵育10分钟后，将样品以14,000rpm的转速离心15分钟，收集上清液用于蛋白质印迹分析。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific) 测定细胞裂解物的蛋白质浓度。将蛋白质样品（50μg/通道）加载到10-12%十二烷基硫酸钠-PAGE上，湿转移至PVDF膜，然后在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜2小时。然后将膜与每种一抗在4℃下孵育过夜。 用TBST洗涤后，将膜在含有辣根过氧化物酶偶联二抗的封闭液中室温孵育 1 小时。洗涤后，用增强化学发光（ECL）试剂盒（Thermo Scientific）检测蛋白质条带。使用的主要抗体和稀释比例如下：抗 p-NF-κB p65 (1:1,000)、NF-κB p65 (1:1,000)、p38 (1:1,000)、p-p38 (1:1,000) 、p-JNK (1:1,000)、JNK (1:1,000)、p-ERK (1:1,000)、ERK (1:1,0000) 和 β-肌动蛋白 (1:10,000)。 使用 Image J 软件（美国国立卫生研究院）计算条带的密度值。
抗炎药物的重要靶标：为了测试CM对炎症的抑制是否通过MAPK通路进行调节，使用蛋白质印迹分析检查了CM对BV2小胶质细胞中LPS诱导的ERK-1/2、JNK和p38激酶磷酸化的影响。结果见图16-17，CM以浓度依赖性方式减弱LPS刺激的p38、ERK-1/2和JNK磷酸化。相反，MAPK总数不受LPS或CM处理的影响。表明MAPK通路参与了LPS介导的炎症介质表达。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种半日花烷型二萜化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式Ⅰ所示：
Ⅰ。
2.一种如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将裸花紫珠加水提取，得提取物；
（2）将提取物依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；
（3）将乙酸乙酯萃取液部分，经硅胶柱层析，洗脱溶剂为二氯甲烷-甲醇，洗脱梯度为二氯甲烷-甲醇的体积比500:1～50:1，收集洗脱液得9个组分，计为Fr.1-Fr.9；
（4）将 Fr.3 经小孔树脂柱层析，洗脱溶剂为甲醇-水溶液，洗脱梯度为甲醇-水的体积比20:80～80:20，收集洗脱液得Fr.3.C；
（5）将Fr.3.C经葡聚糖凝胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液得Fr.3.A.1-Fr. 3.A.6；
（6）将Fr.3.A.1经反相色谱柱分离纯化，洗脱液为15-25%乙腈水溶液，流速为2-4 mL/min，收集25-30min的洗脱液即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述裸花紫珠与水的质量比为1：180-220；所述提取前浸泡10-14h，所述提取为煎煮2-4次，每次0.5-1.5h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中依次用体积比为500:1，400:1，300:1，200:1，100:1，50:1的二氯甲烷-甲醇洗脱溶剂进行洗脱，共用洗脱液的体积为2-4BV。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述小孔树脂柱为MCI柱，依次用体积比为20:80，30:70，40:60，50:50，60:40，70:30，80:20的甲醇-水洗脱溶剂进行洗脱，共用洗脱液的体积为2-4BV，上样量与柱填料体积比为1：9-11。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述葡聚糖凝胶柱为Sephadex LH-20 CC柱，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1，共用洗脱液的体积为2-4BV。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）中所述反相色谱柱为C18色谱柱，洗脱液为20%乙腈水溶液，流速为3mL/min，收集27.7min的洗脱液。
8.一种如权利要求1所述的化合物或权利要求2-7任一项所述的制备方法制备得到的化合物在制备预防或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述化合物抑制脂多糖诱导的小胶质细胞中的促炎细胞因子，和/或抑制 MAPK信号通路，和/或抑制NF-κB信号通路，和/或增加M2型基因的表达，和/或降低小胶质细胞凋亡。
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