CN115368212B - 一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法 - Google Patents
一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法,包括:活化菌株,初级培养,次级培养,菌体研磨,乙酸乙酯萃取,浓缩得粗提物,将粗提物进行反相硅胶柱层析,以甲醇:水梯度洗脱,再通过200‑300目硅胶柱层析纯化,收集洗脱液浓缩,得到目标产物。经1H NMR、13C NMR、COSY、HMBC、HSQC谱图分析证明半日花烷型二萜类化合物首次在该菌种代谢物中提取到。
Description
技术领域
本发明涉及一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法。
背景技术
Raffaelea lauricola是食菌小蠹(Ambrosia beetle)携带的高致病性伴生真菌,是引起树木枯萎病的病原真菌,人们一直在研究其致病机制,随着研究的不断深入,在该属其他菌株中已分离到一些抑制植物生长、抗菌等活性物质。这预示该菌在生物农药或医药上存在很大应用价值。
ent-13-epi-manool是半日花烷型二萜类物质,而半日花烷型二萜类物质多具有抗肿瘤、抗炎和抗菌等活性。可以通过对ent-13-epi-manool的结构修饰衍生成多种新的活性物质。目前,尚未见在Raffaelea lauricola中发现ent-13-epi-manool的报道。
发明内容
本发明的目的是公开一种从Raffaelea lauricola中提取ent-13-epi-manool(半日花烷型二萜类化合物)的方法,以促进其进一步在医药领域的研究和开发,为人类造福。
本发明采取的技术方案如下:
一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法,包括以下步骤:
1)将Raffaelea lauricola活化后,取菌块接种到PDB培养基中,在160~180 r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天即初级培养,按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中,继续在20~28℃条件下静置培养28~40天即次级培养。
2)将步骤1)得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状,用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时,超声40~60分钟,收集萃取液,残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯,超声40~60分钟,收集萃取液,重复以上步骤,共得到3份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏;
3)将浸膏用尽可能少的氯仿或二氯甲烷溶解(可适当超声,以促进其溶解),然后用反相硅胶C18进行拌样,干法装柱,以甲醇:水自体积比1:9→9:1梯度洗脱,收集甲醇:水体积比为9:1部位洗脱液,旋蒸浓缩得组分A;
4)用1倍体积的氯仿溶解组分A,上200-300目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱,收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1 部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比8:1开始梯度洗脱,收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状半日花烷型二萜类化合物;
所述步骤1)中改良的大米培养基:大米100g,木屑10g,加入纯水120mL,121℃高压灭菌20min。
所述步骤1)中接种菌块的大小为0.5×0.5cm,接种量为4 块。
所述步骤2)中超声的功率为400W,频率为35KHz。
所述步骤3)中使用的反相硅胶C18粒径40-60μm,孔径120Å。
所述步骤3)中梯度洗脱比例为甲醇:水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3,8:2,9:1。
所述步骤4)中洗脱比例为石油醚:乙酸乙酯体积比30:1,20:1,15:1,石油醚:氯仿体积比8:1,6:1,4:1。
所述半日花烷型二萜类化合物的结构如下所示:
。
本发明的显著优点:
(1)分离纯化简单,成本低;
(2)过程简便,易操作;
(3)制得的化合物纯度高,且重复性好。
附图说明
图1半日花烷型二萜类化合物的1H NMR谱(CD3OD);
图2半日花烷型二萜类化合物的13C NMR谱(CD3OD);
图3半日花烷型二萜类化合物的DEPT135谱(CD3OD);
图4半日花烷型二萜类化合物的COSY谱(CD3OD);
图5半日花烷型二萜类化合物的HMBC谱(CD3OD);
图6半日花烷型二萜类化合物的HSQC谱(CD3OD)。
具体实施方式
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂,下文特举实施例,作详细说明。本发明的方法如无特殊说明,均为本领域常规方法。
本发明所使用的Raffaelea lauricola菌株编号为Hulcr7161。
实施例1
1)取Raffaelea lauricola(本实验室保存菌株)为材料,无菌条件下挑取大小为0.5×0.5cm的菌块4块接种到PDB培养基(马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100mL,装入250mL锥形瓶,在121℃高压下灭菌20min)中,在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养,按10wt%接种量转接到改良的大米培养基(大米100g,木屑10g,加入纯水120mL,121℃高压灭菌,20min)中,继续在25℃条件下静置培养35天即次级培养。
2)收集培养35天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎,加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时,超声40分钟,过滤得萃取液,残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯,超声40分钟,收集萃取液,再次重复上述步骤,共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
3)将浸膏溶解于氯仿,使用40-60μm粒径反相C18硅胶拌样,干法装柱,以甲醇:水自1:9体积比开始梯度洗脱(甲醇:水比例为1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1),收集甲醇:水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
粗品用1倍体积的氯仿溶解,上200-300目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为30:1, 20:1, 15:1),收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1 部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比8:1开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为8:1, 6:1, 4:1),收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状产物半日花烷型二萜类化合物。经计算其提取率为0.18%(提取率%=重量/菌丝体浸膏总量×100%)。
本实施例中,步骤2)中超声的功率为400 W,频率为35 KHz。
实施例2
1)取Raffaelea lauricola(本实验室保存菌株)为材料,无菌条件下挑取大小为0.5×0.5cm的菌块4 块接种到PDB培养基(马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100 mL,装入250mL锥形瓶,在121℃高压下灭菌20min)中,在140r/min、20℃条件下连续培养5天即初级培养,按20wt%接种量转接到改良的大米培养基(大米100g,木屑10g,加入纯水120 mL,121℃高压灭菌,20min)中,继续在20℃条件下静置培养25天即次级培养。
2) 收集培养25天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎,加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时,超声40分钟,过滤得萃取液,残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯,超声40分钟,收集萃取液,再次重复上述步骤,共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
3) 将浸膏溶解于氯仿,使用40-60μm粒径反相C18硅胶拌样,干法装柱,以甲醇:水自1:9体积比开始梯度洗脱(甲醇:水比例为1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1),收集甲醇:水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
4) 粗品用1倍体积的氯仿溶解,上200-300目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为30:1, 20:1, 15:1),收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比8:1开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为8:1, 6:1, 4:1),收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状产物半日花烷型二萜类化合物。
经计算其提取率为0.16%(提取率%=重量/菌丝体浸膏总量×100%)。
本实施例中,步骤2)中超声的功率为400 W,频率为35 KHz。
实施例3
1)取Raffaelea lauricola(本实验室保存菌株)为材料,无菌条件下挑取大小为0.5×0.5cm的菌块4 块接种到PDB 培养基(马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100mL,装入250mL锥形瓶,在121℃高压下灭菌20min)中,在180r/min、28℃条件下连续培养10天即初级培养,按25wt%接种量转接到改良的大米培养基(大米100g,木屑10g,加入纯水120mL,121℃高压灭菌,20min)中,继续在28℃条件下静置培养40天即次级培养。
2) 收集培养40天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎,加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时,超声90分钟,过滤得萃取液,残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯,超声90分钟,收集萃取液,再次重复上述步骤,共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
3) 将浸膏溶解于氯仿,使用40-60μm粒径反相C18硅胶拌样,干法装柱,以甲醇:水自1:9体积比开始梯度洗脱(甲醇:水比例为1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1),收集甲醇:水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
4) 粗品用1倍体积的氯仿溶解,上200-300目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1 开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为30:1, 20:1, 15:1),收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比8:1开始梯度洗脱(梯度洗脱比例为8:1, 6:1, 4:1),收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状产物半日花烷型二萜类化合物。
经计算其提取率为0.159%(提取率%=重量/菌丝体浸膏总量×100%)。
本实施例中,步骤2)中超声的功率为400 W,频率为35 KHz。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
1)将Raffaelea lauricola活化后,取菌块接种到PDB培养基中,在160~180r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天,按15%~20%接种量转接到改良的大米培养基中,继续在20~28℃条件下静置培养28~40天;
2)将步骤1)得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状,用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时,超声40~60分钟,收集萃取液,残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯,超声40~60分钟,收集萃取液,重复以上步骤,共得到3份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏;
3)将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解,然后用反相硅胶C18进行拌样,干法装柱,以甲醇:水自体积比1:9梯度洗脱,收集甲醇:水体积比为9:1部位洗脱液,旋蒸浓缩得组分A;
4)用1倍体积的氯仿溶解组分A,上200-300目硅胶柱,石油醚:乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱,收集石油醚:乙酸乙酯体积比15:1 部分洗脱液,旋蒸浓缩得浸膏,再过200-300目硅胶柱,以石油醚:氯仿体积比8:1开始梯度洗脱,收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液,旋蒸得到白色粉末状半日花烷型二萜类化合物;
所述步骤1)中改良的大米培养基:大米100g,木屑10g,加入纯水120mL,121℃高压灭菌,20min;
所述半日花烷型二萜类化合物的结构如下所示:
。
2.根据权利要求1所述的一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法,其特征在于:所述步骤1)中接种菌块的大小为0.5×0.5cm,接种量为4 块。
3.根据权利要求1所述的一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法,其特征在于:所述步骤2)中超声的功率为400W,频率为35 KHz。
4.根据权利要求1所述的一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法,其特征在于:所述步骤3)中使用的反相硅胶C18粒径40-60μm,孔径120Å。
5.根据权利要求1所述的一种从Raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法,其特征在于:所述步骤3)中梯度洗脱比例为甲醇:水体积比1:9,2:8,3:7, 4:6, 6:4,7:3, 8:2,9:1。
6.根据权利要求1所述的一种从Raffaelea lauricola中提取半日花烷型二萜类化合物的方法,其特征在于:所述步骤4)中梯度洗脱比例为石油醚:乙酸乙酯体积比30:1,20:1,15:1,石油醚:氯仿体积比8:1,6:1,4:1。
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